TWI388668B - 評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途 - Google Patents

評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI388668B
TWI388668B TW099125309A TW99125309A TWI388668B TW I388668 B TWI388668 B TW I388668B TW 099125309 A TW099125309 A TW 099125309A TW 99125309 A TW99125309 A TW 99125309A TW I388668 B TWI388668 B TW I388668B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
atopic dermatitis
single nucleotide
individual
severity
risk
Prior art date
Application number
TW099125309A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201204837A (en
Inventor
Wei Chiao Chang
Chih Hung Lee
Suh Hang Juo
Wei Chiao Chen
Hsin Su Yu
Original Assignee
Univ Kaohsiung Medical
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Kaohsiung Medical filed Critical Univ Kaohsiung Medical
Priority to TW099125309A priority Critical patent/TWI388668B/zh
Priority to US13/193,472 priority patent/US20120028827A1/en
Publication of TW201204837A publication Critical patent/TW201204837A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI388668B publication Critical patent/TWI388668B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性rs12313273(C/T)作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性rs12313273(C/T)作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途
本發明係關於評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，且特別關於利用核苷酸多型性(SNP) rs12313273(C/T)作為異位性皮膚炎發生及/或嚴重程度之生物指標的方法。
異位性皮膚炎(atopic dermatitis)為一種反覆發生之慢性發炎的皮膚疾病，屬於基因與環境因子所共同影響的疾病，是嬰兒期及小兒期最常見的皮膚疾患之一，約占小兒人口的3~5%。目前仍有增加趨勢，常合併過敏性氣喘及過敏性鼻炎。異位性皮膚炎對社會及家庭及個人的生理、心理、及經濟負擔相當大。60%的病人會在第一年發病，30%的病人在1~5歲間發病。患有異位性皮膚炎的病人經常會合併氣喘、過敏性鼻炎的發作。大部份異位性皮膚炎的病人或其家人會有氣喘、過敏性鼻炎或過敏性皮疹，稱為異位性體質。而異位性皮膚炎患者常常具有較高的血清中IgE值，但也有部分患者之血清中IgE值仍然維持正常水平。
ORAI1基因可轉錄出鈣池調控鈣離子通道(store-operated Ca2+ channel)的通道蛋白之次單元，在非興奮性細胞中，如免疫T細胞、上皮細胞與肥大細胞，鈣池調控鈣離子通道是鈣離子進入細胞的最主要方式之一。而此鈣離子通道在人類的T淋巴細胞免疫反應中是必要的。
Feske等人(Feske,Stefan. "ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond".Immunological reviews .)對嚴重免疫缺陷症候群(severe combined immunodeficiency syndrome,SCID)患者之基因進行定序，並找尋其相關性，該團隊發現ORAI1基因的突變與嚴重免疫缺陷症候群的產生有關。此外，在Chang等人(Chang WC and Parekh AB. Close functional coupling between Ca2+ release-activated Ca2+ channels,arachidonic acid release,and leukotriene C4 secretion.J Biol Chem 2004 Jul 16;279(29):29994-9)的研究中也指出，ORAI1參與了過敏反應的發病過程。
本發明提供一種評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，包括：獲得該個體之一生物樣本；偵測該生物樣本中於ORAI1基因(序列辨識號：1)第30881個位置之單核苷酸多型性(SNP) rs12313273(C/T)的存在；以及評估一個體患有異位性皮膚炎之風險，其中偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C或基因型CC存在時，表示該個體增加罹患異位性皮膚炎之風險。
本發明也提供一種評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，包括：獲得該個體之一生物樣本；偵測該生物樣本中於ORAI1基因(序列辨識號：1)第30881個位置之單核苷酸多型性(SNP) rs12313273(C/T)的存在；以及評估該個體之嚴重程度，其中偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C存在時，表示該個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。
本發明還提供一種單核苷酸多型性rs12313273(序列辨識號：3)作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途。
本發明又提供一種單核苷酸多型性rs12313273(序列辨識號：3)作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
為了瞭解單核苷酸多型性(SNP)與異位性皮膚炎的關連性，本發明針對鈣池調控鈣離子通道之基因多型性對異位性皮膚炎發生的影響進行研究。在一實施例中，本發明選擇ORAI1基因(序列辨識號：1，其中第32519個位置為+1)之單核苷酸多型性(SNP)來研究。
在一實施例中，本發明選擇5個ORAI1基因之單核苷酸多型性(SNP)以分別分析其與異位性皮膚炎發生的關連性。上述5個ORAI1基因之單核苷酸多型性(SNP)分別為rs12320939(序列辨識號：2；位於序列辨識號1之第30567個位置至第30618個位置；以序列辨識號1之+1位置為基準則為於位於-1952~-1901)、rs12313273(序列辨識號：3；位於序列辨識號1之第30855個位置至第30906個位置；以序列辨識號1之+1位置為基準則為於位於-1664~-1613)、rs7135617(序列辨識號：4；位於序列辨識號1之第36850個位置至第36901個位置；以序列辨識號1之+1位置為基準則為於位於4332~4383)、rs6486795(序列辨識號：5；位於序列辨識號1之第43762個位置至第43813個位置；以序列辨識號1之+1位置為基準則為於位於11244~11295)與rs712853(序列辨識號：6；位於序列辨識號1之第47514個位置至第47565個位置；以序列辨識號1之+1位置為基準則為於位於14996~15047。上述5個單核苷酸多型性位於ORAI1基因的相對位置，如第1圖所示。
其中rs12320939(G/T)位於序列辨識號1之第30593個位置、rs12313273(C/T)位於序列辨識號1之第30881個位置、rs7135617(G/T)位於序列辨識號1之第36876個位置、rs6486795(C/T)位於序列辨識號1之第43788個位置與rs712853(C/T)位於序列辨識號1之第47593個位置。
在一實施例中，將健康群組與異位性皮膚炎群組之生物樣本進行上述5個單核苷酸多型性(SNP)之基因型(？)測定，並將測定結果進行統計分析，確認rs12313273(C/T)為一具潛力之評估異位性皮膚炎發生及嚴重程度之生物指標。
因此，在本發明一態樣中，本發明關於一種評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，其包括如下所述之步驟。首先獲得一個體之一生物樣本。個體可包括哺乳動物，在一實施例中，個體可包括人類。本發明之生物樣本可由任何具有染色體DNA之來源收集或分離而得。來源可包括血液及唾液等。在一實施例中，生物樣本可包括血液或唾液，例如約3-5 c.c之血液或唾液。
接著，偵測上述生物樣本中於ORAI1基因(序列辨識號：1)第30881個位置之單核苷酸多型性(SNP) rs12313273(C/T)的存在。偵測單核苷酸多型性(SNP) rs12313273的方法，可包括引子延伸法(例如，PinPoint分析、MassextendTM 、SPC-SBE、或GOOD分析)、雜交法(例如，TaqMan分析、磁珠陣列(bead arry)、或SNP晶片)、ligation(例如，組成式綠螢光轉移標誌(CFET tags))，以及酵素切割(RFLP、分析)，PCR-SSCP(單鏈構象多態性)，MRD(mismatch repair dection)，BeadArrayTM ，或SNPlexTM 。在一實施例中，本發明可以TaqMan技術鑑定單核苷酸多型性(SNP) rs12313273的基因型。在一實施例中，單核苷酸多型性rs12313273(C/T)係藉由一第一寡核苷酸與一第二寡核苷酸來偵測，且第一寡核苷酸用以偵測單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因T，而第二寡核苷酸用以偵測單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C。最後，評估上述個體患有異位性皮膚炎之風險。根據上述偵測結果，當偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C或基因型CC(兩個對偶基因皆為C)存在時，表示個體增加罹患異位性皮膚炎之風險。
在一實施例中，相較於偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因T，當偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C時，個體增加罹患異位性皮膚炎之相對風險為至少約1.4倍(危險比值(OR)為至少約1.4)，較佳為至少約1.44倍(危險比值(OR)為至少約1.44)。在另一實施例中，相較於偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型TT(兩個對偶基因皆為T)，當偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CC(兩個對偶基因皆為C)時，個體增加罹患異位性皮膚炎之相對風險為至少約2.4倍(危險比值(OR)為至少約2.4)，較佳為至少約2.48倍(危險比值(OR)為至少約2.48)。
而根據上述，清楚得知，單核苷酸多型性rs12313273(C/T)可作為異位性皮膚炎發生之一生物指標。
因此，在本發明另一態樣中，本發明關於一種單核苷酸多型性rs12313273(序列辨識號：3)作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途或一種單核苷酸多型性(SNP)rs12313273(序列辨識號：3)用於評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的用途。
而在本發明又另一態樣中，本發明關於一種評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，其包括如下所述之步驟。首先獲得患有異位性皮膚炎之個體的一生物樣本。患有異位性皮膚炎之個體可包括哺乳動物，在一實施例中，個體可包括人類。上述生物樣本可由任何具有染色體DNA之來源收集或分離而得。來源可包括血液或唾液等。在一實施例中，生物樣本可包括血液或唾液，例如約3-5 c.c之血液或唾液。
接著，偵測上述生物樣本中於ORAI1基因(序列辨識號：1)第30881個位置之單核苷酸多型性(SNP) rs12313273(C/T)的存在。偵測單核苷酸多型性(SNP) rs12313273的方法，可包括引子延伸法(例如，PinPoint分析、MassextendTM 、SPC-SBE、或GOOD分析)、雜交法(例如，TaqMan分析、磁珠陣列(bead arry)、或SNP晶片)、ligation(例如，組成式綠螢光轉移標誌(CFET tags))，以及酵素切割(RFLP、分析)，PCR-SSCP(單鏈構象多態性)，MRD(mismatch repair dection)，BeadArrayTM ，或SNPlexTM 。在一實施例中，本發明可以TaqMan技術鑑定單核苷酸多型性(SNP) rs12313273的基因型。在一實施例中，單核苷酸多型性rs12313273(C/T)係藉由一第一寡核苷酸與一第二寡核苷酸來偵測，且第一寡核苷酸用以偵測單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因T，而第二寡核苷酸用以偵測單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C。
最後，評估上述個體之異位性皮膚炎嚴重程度。根據上述偵測結果，當偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C存在時，表示上述個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。
在一實施例中，相較於偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型TT(兩個對偶基因皆為T)，當偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CT(兩個對偶基因一者為C，另一者為T)時，個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。在另一實施例中，相較於偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CT，當偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CC(兩個對偶基因皆為C)時，個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。在又另一實施例中，相較於偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型TT，當偵測到單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CC時，個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。
換句話說，具有rs12313273(C/T)之基因型為CC的患者，相較於具有rs12313273(C/T)之基因型為TT或CT的患者，具有最嚴重之異位性皮膚炎嚴重程度。在一例子中，rs12313273(C/T)之基因型為TT的個體其異位性皮膚炎之嚴重程度為約23，而rs12313273(C/T)之基因型為CT的個體其異位性皮膚炎之嚴重程度為約27，又rs12313273(C/T)之基因型為CC的個體其異位性皮膚炎之嚴重程度為約29。
而根據上述，清楚得知，單核苷酸多型性rs12313273(C/T)可作為異位性皮膚炎發生之一生物指標。
因此，在本發明再另一態樣中，本發明關於一種單核苷酸多型性rs12313273(序列辨識號：3)作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途或一種單核苷酸多型性(SNP) rs12313273(序列辨識號：3)用於患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的用途。
【實施例】
siOrsi1抑制EGF調節之COX-2基因表現
1.　轉殖siORAI1對Orai1蛋白質表現程度方法
將ORAI1 siRNA基因轉殖(Trsnsfection)入A431細胞(控制組則殖入Control siRNA)，培養48小時，接著給予濃度為25奈克/毫升的EGF刺激，再用RIPA buffer取出細胞內總蛋白質，利用西方點墨法確認細胞內ORAI1蛋白質表現量。
結果
結果如第2A圖所示，當以siOrai1對細胞進行處理時，會抑制ORAI1之基因表現。
2.siOrai1抑制EGF調節之 鈣離子通道之效率方法
以即時單細胞鈣離子成影實驗記錄鈣離子通過鈣池調控鈣離子通道(SOC)的訊號。在室溫下(20-25℃)，以Olympus Cell R螢光顯微鏡系統紀錄結果。全部實驗在黑暗中進行，細胞先加入1微莫耳Fluo-4，再加入鈣離子溶液偵測7-8分鐘(以Fluo-4為螢光劑，其螢光強度則表鈣離子的濃度)。鈣離子溶液的成分為氯化鈉145毫莫耳，氯化鉀5.4毫莫耳，氯化鈣2.0毫莫耳，硫酸鎂2毫莫耳，HEPES 20毫莫耳，D-葡萄糖5.5毫莫耳，氫氧化鈉，pH值7.4。
結果
如第2B圖所示，相較於僅加入EGF之控制組，加入EGF以及siOrai1之組別，明顯降低鈣離子通道之效率。
3.siOrai1抑制EGF調節之COX-2發炎基因表現
方法
將ORAI1 siRNA基因轉殖(Transfection)入A431細胞(控制組則殖入Control siRNA)，培養48小時，接者給予濃度為25奈克/毫升的EGF刺激，用Trizol收取細胞總RNA量，純化出mRNA後利用反轉錄套組將mRNA反轉錄成cDNA，利用SYBR Green assay偵測COX-2基因表現量。
結果
如第2C圖所示，相較於僅加入EGF之控制組，加入EGF以及siOrail之組別，明顯抑制了COX-2之基因表現。
由上述各實驗結果可明確得知，在siOrail抑制ORAI1基因之表現下，的確會經由抑制ORAI1蛋白質表現進而降低鈣離子進入鈣池調控鈣離子通道(SOC)之效率，以及抑制COX-2之基因表現，進而抑制發炎反應。換句話說，Orai1的表現確實與發炎反應的發生有相關性。
異位性皮膚炎與ORAI1基因之單核苷酸多型性(SNP)之關連性
1.　材料與方法
(a)　個體之生物樣本的DNA萃取
根據Gentra(Research Triangle,NC)公司的PuregeneTM kit所提供的標準步驟，靜脈全血5 ml存放於EDTA管中，以轉速3000 rpm/min離心10分鐘，使血漿、白血球細胞懸浮液(Buffy coat)及紅血球分離，利用微量吸管將Buffy coat吸取至1.5 ml微量離心管中，加入三倍體積的紅血球分解溶液(RBC lysis solution)，使之搖晃，讓試劑與血液充分混合，以轉速13,000-16,000 rpm/min離心1分鐘，使含有DNA的白血球細胞層沉澱，去除上清液，加入600 μl細胞分解溶液(cell lysis solution)使之完全搖晃混合，至少過一個晚上，以打破細胞膜釋出DNA隨後再加入300 μl蛋白質沈澱溶液(protein precipitation solution)混合均勻後，以轉速13,000-16,000 rpm/min離心5分鐘，將雜質沉澱下來，取出含有DNA的上清液至新的微量離心管，加入等量的異丙醇(isopropanol)稍加搖晃，以轉速13,000-16,000 rpm/min離心2分鐘，可看見底部含DNA之白色沉澱物，小心除去上清液，加入450 μl 85%酒精(ethanol)，以轉速13,000-16,000 rpm/min離心3分鐘，除去不要的鹽類，小心除去上清液，經風乾使酒精完全揮發，加入100 μl二次水(d.d. water)，置於65℃水浴中5分鐘，加速DNA的回溶。
取出DNA，以分光光度計(spectrophotometer)測定濃度及純度/吸光值(OD 260/280)，稀釋成10 ng/μl以供基因型測定時使用。
(b)　單核苷酸基因多形性選擇條件
本發明的單核苷酸基因多形性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是根據國際人類基因組單套型圖譜計畫(International Haplotype HapMap project;http://www.hapmap.org)中的資料庫Phase III。Hapmap project由美國、中國、加拿大、日本、奈及利亞和英國政府及個人共同合作建構，目的是在尋找不同種族和分布在不同地理的人群所有的SNP，涵蓋奈及利亞裔、日本裔、華裔和歐洲裔美國人，從中可以得到基因上的SNP分布在不同族群的頻率。
本發明篩選SNP的標準為r2 ≧0.8，最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)在華裔中≧10%，而且所選的SNP都是在連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)的基因組區域中具代表性的tSNP。本發明採用以上標準一共於ORAI1基因(序列辨識號：1)選出5個tSNP，分別為rs12320939(序列辨識號：2，位於序列辨識號1之第30567個位置至第30618個位置)、rs12313273(序列辨識號：3，位於序列辨識號1之第30855個位置至第30906個位置)、rs7135617(序列辨識號：4，位於序列辨識號1之第36850個位置至第36901個位置)、rs6486795(序列辨識號：5，位於序列辨識號1之第43762個位置至第43813個位置)與rs712853(序列辨識號：6，位於序列辨識號1之第47514個位置至第47565個位置)。
(c)　基因型檢定
本研究使用TaqMan技術(TaqMan Genotyping Assays products,Applied Biosystems Inc.)進行基因型檢測，此技術是以兩個探針(Minor Grove Binder probe)，其5’端各自帶有不同的螢光(FAMTM dye與VICTM dye)，依據探針設計的序列不同，專一地配對到SNP上不同的兩個對偶基因(allele)，而探針3’端上另外附著一個會吸收螢光能量的non-fluorescent quencher(NFQ)，使5’端上的螢光染劑暫時無法釋放螢光；直到聚合酶連鎖反應實驗中(Polymerase Chain Reaction,PCR)的聚合酶(AmpliTaq Gold DNA polymerase)將黏附到互補股探針上的螢光染劑和quencher分開，位於5’端的螢光染劑此時才會釋放螢光。依據偵測到的螢光不同，可區分不同的基因型。在此實驗中，以TaqMan(R)Genotyping Assays rs12320939 C__31833529_10來偵測rs12320939；以TaqMan(R) Genotyping Assays rs12313273 C__31833531_10來偵測rs12313273；以TaqMan(R) Genotyping Assays rs713561 7 C____248428_10來偵測rs7135617；以TaqMan(R) Genotyping Assays rs6486795 C___1596513_20來偵測rs6486795；以Custom Taqman(R) SNP Genotyping Assay Service rs712853來偵測rs712853。
本研究基因型測定使用即時聚合酶連鎖反應機器(real_time PCR machine，ABI 7500機型，Applied Biosystems Inc,Foster City,CA)進行聚合酶連鎖反應實驗及基因型測定。將TaqMan universal Master Mix 2.5μl加上40倍的TaqMan Genotyping Assay primer-probe Mix 0.0625 μl，在加上1 μl的DNA以及1.4375 μl的二次水，使每個樣本總體積為5μl，將混合好的樣本置於96孔反應盤中，在real-time PCR machine內進行PCR，反應條件：95℃ 10分鐘，再進行45個循環為95℃，15秒；60℃，1分鐘。利用ABI設計的軟體依據偵測到的螢光強度來判定基因型。
(d)統計學分析
本研究統計分析使用SAS軟體9.1版進行運算。以卡方檢定中的適合度檢定(Chi-square Goodness-of-fit test)檢測在各個tSNPs是否符合哈溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)，當p值大於0.05時，表示基因型分布並無偏差。以卡方檢定(Chi-square test)檢測各個基因型及對偶基因在異位性皮膚炎患者和健康對照間之分布有無顯著差異。以Student’st -test檢定異位性皮膚炎患者在不同基因型間異位性皮膚炎嚴重度評分(SCARAD指數)是否達顯著差異。
2.異位性皮膚炎之發生與ORAI1基因之單核苷酸多型性(SNP)之關連性
(a)異位性皮膚炎患者群組與健康人士群組
本發明進行一病例對照研究。選取102位異位性皮膚炎患者與715健康人士來分別進行研究。異位性皮膚炎患者群組與健康人士群組之詳細資料如表1所示。
(b)　異位性皮膚炎之發生與rs12320939的關連性分析
選取101位異位性皮膚炎患者與678健康人士來針對其rs12320939之基因型進行研究。結果如表2所示。
整體p 值(overa;;p va;ue)=0.2284
TrendP =0.3604
顯性模式P 值(dominant modelP value)=0.9438；危險性比值(OR)=0.98
隱性模式P值(Recessive modelP value)=0.1130；危險性比值(OR)=1.44
(c)異位性皮膚炎之發生與r512313273的關連性分析
選取102位異位性皮膚炎患者與687健康人士來針對其rs12313273之基因型進行研究。結果如表3所示。
整體p 值(overallp value)=0.0116
TrendP =0.0228
顯性模式P 值(dominant modelP value)=0.2023；危險性比值(OR)=1.31
隱性模式P 值(Recessive modelP value)=0.0030；危險性比值(OR)=2.39
(d)　異位性皮膚炎之發生與rs7135617的關連性分析
選取101位異位性皮膚炎患者與687健康人士來針對其rs7135617之基因型進行研究。結果如表4所示。
整體p 值(overallp value)=0.0150
TrendP =0.3706
顯性模式P 值(dominant modelP value)=0.0307；危險性比值(OR)=0.63
隱性模式P 值(Recessive modelP value)=0.2779；危險性比值(OR)=1.33
(e)　異位性皮膚炎之發生與rs6486795的關連性分析
選取93位異位性皮膚炎患者與683健康人士來針對其rs6486795之基因型進行研究。結果如表5所示。
整體p 值(overallp value)=0.0336
TrendP =0.0321
顯性模式P 值(dominant modelP value)=0.2498；危險性比值(OR)=1.31
隱性模式P 值(Recessive modelP value)=0.0096；危險性比值(OR)=1.96
(f)　異位性皮膚炎之發生與rs712853的關連性分析
選取101位異位性皮膚炎患者與689健康人士來針對其rs712853之基因型進行研究。結果如表6所示。
整體p 值(overallp value)=0.1588
TrendP =0.1984
顯性模式P 值(dominant modelP value)=0.0721；危險性比值(OR)=0.68
隱性模式P 值(Recessive modelP value)=0.9845；危險性比值(OR)=0.99
由以上結果發現，ORAI1中的多型性位點rs12313273、rs6486795及rs7135617與異位性皮膚炎的發生相關。若是rs12313273 CC基因型攜帶者與TT參考基因型攜帶者相比，其危險性比值有2.48(95%信賴區間：1.33~4.63)。攜帶rs6486795 CC基因型相較於TT基因型具有2.04倍疾病發生危險(95%信賴區間：1.14~3.68)。攜帶rs7135617 TT及GT基因型者相較於GG基因型具有0.63倍保護效應。
3.異位性皮膚炎之嚴重程度與ORAI1基因之單核苷酸多型性(SNP)之關連性
將102位異位性皮膚炎患者進行rs12313273基因型分析，將93位異位性皮膚炎患者進行rs6486795基因型分析，並將101位異位性皮膚炎患者進行rs7135617基因型分析，且之後評估各基因型之患者的異位性皮膚炎之嚴重程度。結果如表7所示。
表7顯示，攜帶rs12313273 CC基因型者相較於攜帶CT或TT基因型者(29.5 vs. 27.7 vs. 23.7;P=0.04)具有較高之疾病嚴重程度。
因此，根據以上所有分析結果，其清楚顯示ORAI1基因多型性rs12313273可作為異位性皮膚炎發生及嚴重程度的生物指標。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
【序列編號】
<110>　高雄醫學大學
<120>　評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性rs12313273(C/T)作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性rs12313273(C/T)作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途
<160>　6
<210>　1
<211>　64695
<212>　DNA
<213>　人類
<400>　1
<210>2
<211>52
<212>DNA
<213>　人類
<400>2
<210>3
<211>52
<212>DNA
<213>　人類
<400>3
<210>4
<211>52
<212>DNA
<213>　人類
<400>4
<210>5
<211>52
<212>DNA
<213>　人類
<400>5
<210>6
<211>52
<212>DNA
<213>　人類
<400>6
第1圖顯示rs12320939、rs12313273、rs7135617、rs6486795與rs712853位於ORAI1基因的相對位置。
第2A圖顯示以siOrai1抑制ORAI1之蛋白質表現的結果。
第2B圖顯示以siOrai1降低上皮生長因子活化鈣池調控離子通道之效率的結果。
第2C圖顯示以顯抑制了上皮生長因子活化COX-2基因表現的結果。

Claims (13)

  1. 一種評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，包括：體外偵測源自該個體之一生物樣本中於ORAI1基因(序列辨識號：1)第30881個位置之單核苷酸多型性(SNP)rs12313273(C/T)的存在；以及評估該個體患有異位性皮膚炎之風險，其中偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C或基因型CC存在時，表示該個體增加罹患異位性皮膚炎之風險，其中該個體為一人類。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，其中相較於偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因T，當偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C時，該個體增加罹患異位性皮膚炎之相對風險為至少約1.4倍。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，其中相較於偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型TT，當偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CC時，該個體增加罹患異位性皮膚炎之相對風險為至少約2.4倍。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，其中該生物樣本包括血液或唾液。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法，其中該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)係藉由一第一寡核苷酸與一第二寡核苷酸來偵測，且該第一寡核苷酸用以偵測該單核苷酸多型性 rs12313273(C/T)之對偶基因T，而該第二寡核苷酸用以偵測該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C。
  6. 一種評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，包括：體外偵測源自該個體之一生物樣本中於ORAI1基因(序列辨識號：1)第30881個位置之單核苷酸多型性(SNP)rs12313273(C/T)的存在；以及評估該個體之嚴重程度，其中偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C存在時，表示該個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險，其中該個體為一人類。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，其中相較於偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型TT，當偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CT時，該個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，其中相較於偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CT，當偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CC時，該個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，其中相較於偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型TT，當偵測到該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之基因型CC時，該個體具有增加異位性皮膚炎嚴重程度的風險。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，其中該生物樣本包括血液或唾液。
  11. 如申請專利範圍第6項所述之評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法，其中該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)係藉由一第一寡核苷酸與一第二寡核苷酸來偵測，且該第一寡核苷酸用以偵測該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因T，而該第二寡核苷酸用以偵測該單核苷酸多型性rs12313273(C/T)之對偶基因C。
  12. 一種單核苷酸多型性rs12313273(序列辨識號：3)作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途。
  13. 一種單核苷酸多型性rs12313273(序列辨識號：3)作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途。
TW099125309A 2010-07-30 2010-07-30 評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途 TWI388668B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW099125309A TWI388668B (zh) 2010-07-30 2010-07-30 評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途
US13/193,472 US20120028827A1 (en) 2010-07-30 2011-07-28 Method for determining a risk, for a subject, of suffering from atopic dermatitis or severity of atopic dermatitis for a subject suffering from atopic dermatitis and method for using a single-nucleotide polymorphism rs12313273 as a biomarker for determining the development or severity of atopic dermatitis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW099125309A TWI388668B (zh) 2010-07-30 2010-07-30 評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201204837A TW201204837A (en) 2012-02-01
TWI388668B true TWI388668B (zh) 2013-03-11

Family

ID=45527303

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW099125309A TWI388668B (zh) 2010-07-30 2010-07-30 評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20120028827A1 (zh)
TW (1) TWI388668B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI555848B (zh) * 2010-10-20 2016-11-01 高雄醫學大學 評估於一個體中發生腎臟結石之風險的方法、評估於一患有或曾患有腎臟結石之個體中腎臟結石復發之風險的方法與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３作為腎臟結石發生或復發之一生物指標的用途

Also Published As

Publication number Publication date
US20120028827A1 (en) 2012-02-02
TW201204837A (en) 2012-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8394587B2 (en) Single nucleotide polymorphisms and use of same predicting male-specific prenatal loss
WO2009043178A1 (en) Biomarkers for autism spectrum disorders
US20110311967A1 (en) Novel Single Nucleotide Polymorphisms and Combinations of Novel and Known Polymorphisms for Determining the Allele-Specific Expression of the IGF2 Gene
US20100092959A1 (en) Single nucleotide polymorphisms as genetic markers for childhood leukemia
EP2256193B1 (en) Identification of hypertension susceptibility gene group
TW201713776A (zh) Ｈｌａ－ｂ＊１５：０２中的單一核苷酸多型性及其用途
US20120276084A1 (en) Predicting Risk of Age-Related Macular Degeneration
TWI388668B (zh) 評估一個體患有異位性皮膚炎之風險的方法、評估患有異位性皮膚炎之個體之異位性皮膚炎嚴重程度的方法、單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎發生之一生物指標的用途與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３（Ｃ／Ｔ）作為異位性皮膚炎嚴重程度之一生物指標的用途
WO2011148715A1 (ja) 正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子及びその利用
TWI555848B (zh) 評估於一個體中發生腎臟結石之風險的方法、評估於一患有或曾患有腎臟結石之個體中腎臟結石復發之風險的方法與單核苷酸多型性ｒｓ１２３１３２７３作為腎臟結石發生或復發之一生物指標的用途
TWI351436B (en) Method for detecting a risk of the development of
Destouni et al. Single-cell high resolution melting analysis: A novel, generic, pre-implantation genetic diagnosis (PGD) method applied to cystic fibrosis (HRMA CF-PGD)
US20190316199A1 (en) Test method for evaluating the risk of anti-thyroid drug-induced agranulocytosis, and evaluation kit
JP5643933B2 (ja) Ｚｎｆ５１２ｂ遺伝子の一塩基多型に基づく筋萎縮性側索硬化症の検査方法
CA2427390A1 (en) Methods of using a nod2/card15 haplotype to diagnose crohn&#39;s disease
CN107502668B (zh) 一种人Y染色体标签位点sY1291的检测方法及其应用
US10770183B2 (en) Methods of assessing a risk of developing necrotizing meningoencephalitis
WO2009103992A1 (en) Genetic variation associated with coeliac disease
WO2006069592A2 (en) Method for diagnosing an/or predicting preeclampsia and/or related disorders
JP6082693B2 (ja) 喫煙感受性加齢黄斑変性易罹患性の判定方法及び判定キット
JP2017006074A (ja) 末梢動脈疾患検査方法及び検査用試薬
WO2010047240A1 (ja) 滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法
US10697017B2 (en) Genetic factors in blood pressure
JP4533979B2 (ja) アレルギー疾患の遺伝的素因マーカーとしてのヒトトル様レセプター３遺伝子多型およびその使用
Orloff Analysis of genes associated with focal segmental glomerular sclerosis