CN106148504A - 检测显性遗传性脑动脉病相关基因的引物及试剂盒和用途 - Google Patents

Abstract

一种引物对，检测显性遗传性脑动脉病相关基因的引物及试剂盒和用途。由具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列的正向引物，以及具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列的反向引物组成。本发明提供的引物对适用于检测伴有皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)相关基因，判断NOTCH3基因的p.C201Y位点是否突变，并为临床诊断提供参考。

Description

检测显性遗传性脑动脉病相关基因的引物及试剂盒和用途

技术领域

本发明涉及一种疾病相关基因的检测技术，尤其涉及一种检测CADASIL相关基因的引物，以及检测试剂盒及其用途。

背景技术

伴有皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(Cerebral AutosomalDominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leucoencephalopathy，CADASIL)是一种较为少见的，在成人时发病且以显性方式遗传的小动脉血管病变。患者常有包括脑血管阻塞造成的脑梗死或短暂性脑缺血发作、痴呆症、先兆性偏头痛，以及精神方面的问题(中国卒中杂志，2010,5(7),573～8)。

研究发现，位于染色体19p13.1-13.2区域的NOTCH3基因的突变是造成该疾病的致病病因。NOTCH3有33个外显子，且与致病有关的集中在2号～24号外显子的突变体。在亚洲人群中，4号外显子突变率最高，占40％以上(中国卒中杂志，2012,7(2),136～140)。

中国发明专利ZL 200510098513.1提供了一种与CADASIL相关的基因突变类型及其检测方法，在外显子Exon4中的密码子134的TGC突变为TAC，在Exon4中的密码子141的CGC突变为TGC，在Exon3中的密码子90的CGT突变为TGT，在Exon4中的密码子117的TGC突变为CGC，在Exon4中的密码子169的CGC突变为TGC，在Exon4中的密码子182的CGC突变为TGC。

在临床病例中，仍有病患无法依据上述技术进行确诊。为此，仍有必要对CADASIL相关基因进行探索。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种检测CADASIL相关基因的引物，以实现对NOTCH3基因突变的确定，利于临床防治手段的实施。

本发明的另一个目的在于提供一种检测试剂盒，以检测CADASIL相关基因，为临床诊断提供判断的参照依据。

本发明的再一个目的在于提供一种引物对，其在检测CADASIL相关基因的应用。

本发明提供的一种引物对，其正向引物具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列，反向引物具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列。

本发明引物对能用于判断NOTCH3基因4号外显子上的201位密码子是否由TGT突变为TAT，所获得DNA片段长度为536bp。

本发明引物对在检测CADASIL相关基因中的应用，判断NOTCH3基因的p.C201Y位点是否突变。

本发明提供的引物对，还包括在其5’端结合标记物，如：但不仅限于荧光标记物(TAMRA、FAM、FITC、Dansyl和Biotin等)和同位素标记物等。

本发明引物对用于制作检测CADASIL相关基因的试剂盒。

本发明提供的一种检测试剂盒，包括由具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列的正向引物和具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列的反向引物组成的引物对。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的引物对适用于检测CADASIL相关基因的新的突变位点，为该病症的诊断提供有益参考，与其它诊断手段一起互相应证，而利于患者的临床确诊，还对该病症的诊疗方案的确定和实施提供依据。

本发明提供的引物进行常规的分子生物学操作即可获得突变位点的DNA片段，操作简单、所需的试剂种类少，便于应用。

附图说明

图1为本发明引物对检测CADASIL相关基因而获得的电泳图，其中，“M”表示marker，四条条带从下至上分别对应200、500、750和1200，“E04”表示获得的目标DNA片段。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明涉及分子生物学实验，若没有特别注明，可参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。此外，根据不同实验目的，本领域技术人员在各种商品化试剂盒(Kit)所附带的操作手册的指导下完成相应的实验或委托专业化的公司进行，如：基因测序、质粒测序和确定分子量等。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛－奥德里奇(Sigma－Aldrich)。

患者男性，64岁，反复脑梗死3次，表现出智能下降(简易智能量表MMSE评分为20分)，头颅核磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)显示双侧脑白质病变，磁敏感加权成像(Susceptibility weighted imaging，SWI)显示脑干、双侧基底节区多量微出血灶。

从该患者处取得血液试样，并将具有SEQ ID No 1所示序列的正向引物和具有SEQ IDNo 2所示序列的反向引物进行基因检测，具体步骤如下：

1，血液提取：

采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)，提取血液DNA。具体步骤为：

1)取500μl抗凝血，加入700ul的细胞裂解液CL，静置5min。

2)12,000rpm离心3min，吸去上清，留下细胞核沉淀，加入200μlGS，振荡混匀，加入20ul Proteinase K溶液，混匀。

3)加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。

4)加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。

5)将上一步得到的溶液转入一个CB3吸附柱中，12000rpm离心30s后去除废液。

6)利用试剂盒的GD和PW依次洗脱柱子，室温放置7min晾干。

7)加入100μl的洗脱缓冲液TB，静置3min后离心，收集洗脱液。

8)紫外分光光度计测OD值，检测DNA浓度和纯度，保证DNA浓度>50ng/ml。

9)保存于-20℃备用。

2.PCR扩增

反应体系为：

反应条件为：

3.PCR产物鉴定

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，测序或通过标记物判断是否获得目标基因(参见图1)。

结果显示该患者的NOTCH3基因第4号外显子突变，突变位点为p.C201Y，由此初步判断其症状与CADASIL有关。

Claims (10)

1.一种引物对，其特征在于由具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列的正向引物，以及具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列的反向引物组成。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于所述的引物对还包括标记物。

3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于所述的引物对还包括标记物，所述的标记物选自于荧光标记物和同位素标记物。

4.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于所述的引物对用于对NOTCH3基因第4号外显子进行PCR扩增而获得的DNA为536bp。

5.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于所述的引物对用于检测NOTCH3基因4号外显子上的201位密码子TGT突变为TAT。

6.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于所述的引物对用于判断NOTCH3基因的p.C201Y位点突变与否。

7.根据权利要求1所述的引物对在检测CADASIL相关基因中的应用。

8.根据权利要求1所述的引物对在诊断CADASIL中的应用。

9.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物对。

10.根据权利要求9所述的试剂盒在检测CADASIL相关基因中的应用。