CN106399581A - 检测人comp基因突变的引物组及其试剂盒 - Google Patents

检测人comp基因突变的引物组及其试剂盒 Download PDF

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CN106399581A CN201611168778.9A CN201611168778A CN106399581A CN 106399581 A CN106399581 A CN 106399581A CN 201611168778 A CN201611168778 A CN 201611168778A CN 106399581 A CN106399581 A CN 106399581A
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鲁艳芹
韩金祥
李公超
尹小丽
代运章
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马翔
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明涉及检测人COMP基因突变的引物组及其试剂盒，包括：上述用于检测COMP基因突变的由第1至第19外显子的PCR扩增引物组成的引物组；PCR扩增试剂；PCR产物纯化试剂；含有上述用于检测COMP基因突变的测序引物组的DNA测序试剂。本发明采用特异性引物组，针对COMP基因的第1到第19外显子进行突变检测，确保了测定结果的准确性与特异性。

Description

检测人COMP基因突变的引物组及其试剂盒
技术领域
本发明涉及检测人COMP基因突变的引物组及其试剂盒，具体涉及COMP基因突变所导致的遗传性疾病假性软骨发育不良与I型多发性骨骺发育不良的基因检测，属于遗传性骨病基因检测技术领域。
背景技术
软骨寡聚基质蛋白COMP同源五聚体细胞外基质糖蛋白，为钙结合蛋白，是软骨非胶原蛋白的主要成分。COMP每个亚单位均由1个富含半胱氨酸的氨基端、4个类表皮生长因子区、8个类钙调蛋白重复序列和1个C端球状区组成。COMP是透明软骨的主要成分，羧基端可以连接I型、II型与IX型胶原等。该基因突变会导致两种罕见常染色体显性遗传疾病假性软骨发育不全与I型多发性骨骺发育不良的发生。两种疾病的COMP基因突变多发生在第8至第19外显子。其中假性软骨发育不全多分布在外显子8到外显子14，以13外显子的突变为主，位于第3个类该条蛋白重复序列结构域中。I型多发性骨骺发育不良突变多以11号外显子突变为主。
假性软骨发育不全的患儿一般在1-3岁出现肢体短缩，头颅与颜面正常，手指与足趾短粗，韧带松弛。患者一般存在轻度的胸腰椎后凸畸形，下肢成角畸形常见。多发性骨骺发育不良临床表现为长骨骨骺端不规则，不同程度的椎体扁平，关节疼痛与僵直，身体轻微与中等程度短小，手脚短小，存在早发性骨性关节炎。
如中国专利文献CN101932935A(申请号200880103506.8)公开了用于治疗类风湿性关节炎和相关关节炎性皮疹等炎性关节病的新的方法和药物产品。所述方法和产品使用骨和软骨代谢或破坏的各种血清标记，包括软骨寡聚基质蛋白(COMP)和NFB受体激活蛋白配体(RANKL)，作为评价炎性关节病中IL-17A拮抗剂对关节破坏的效果的生物标记。
目前假性软骨发育不全与I型多发性骨骺发育不良的检测多集中在常见高发频率，对于低发频率突变检测以及COMP8到14号外显子以外其它外显子区域的突变检测少有报道。COMP基因突变检测方法有荧光定量PCR、高通量测序分析、单链构象多态性变化等等。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供检测人COMP基因突变的引物组及其试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测COMP基因突变的引物组，该引物组包括14对特异性扩增COMP基因第1至第19外显子的引物；
所述的COMP基因外显子1与外显子2的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的引物FP1与核苷酸序如SEQ ID NO.2所示的引物RP1；
所述的COMP基因外显子3的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FP2与核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的引物RP2；
所述的COMP基因外显子4的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物FP3与核苷酸序如SEQ ID NO.6所示的引物RP3；
所述的COMP基因外显子5的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物FP4与核苷酸序如SEQ ID NO.8所示的引物RP4；
所述的COMP基因外显子6与外显子7的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示的引物FP5与核苷酸序如SEQ ID NO.10所示的引物RP5；
所述的COMP基因外显子8的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物FP6与核苷酸序如SEQ ID NO.12所示的引物RP6；
所述的COMP基因外显子9的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物FP7与核苷酸序如SEQ ID NO.14所示的引物RP7；
所述的COMP基因外显子10的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的引物FP8与核苷酸序如SEQ ID NO.16所示的引物RP8；
所述的COMP基因外显子11与外显子12的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示的引物FP9与核苷酸序如SEQ ID NO.18所示的引物RP9；
所述的COMP基因外显子13的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物FP10与核苷酸序如SEQ ID NO.20所示的引物RP10；
所述的COMP基因外显子14与外显子15的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示的引物FP11与核苷酸序如SEQ ID NO.22所示的引物RP11；
所述的COMP基因外显子16的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物FP12与核苷酸序如SEQ ID NO.24所示的引物RP12；
所述的COMP基因外显子17的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的引物FP13与核苷酸序如SEQ ID NO.26所示的引物RP13；
所述的COMP基因外显子18与外显子19的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示的引物FP14与核苷酸序如SEQ ID NO.28所示的引物RP14。
一种用于检测COMP基因突变的测序引物组，该引物组包括14条第1至第19外显子的测序引物引物；包括：
外显子1与外显子2的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物FP1；
外显子3的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3的引物FP2；
外显子4的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.5的引物FP3；
外显子5的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7的引物FP4；
外显子6与外显子7的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.9的引物FP5；
外显子8的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.11的引物FP6；
外显子9的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.13的引物FP7；
外显子10的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.15的引物FP8；
外显子11与外显子12的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.17的引物FP9；
外显子13的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.19的引物FP10；
外显子14与外显子15的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.21的引物FP11；
外显子16的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.23的引物FP12；
外显子17的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.25的引物FP13；
外显子18与外显子19的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.27的引物FP14。
一种用于检测COMP基因突变的试剂盒，包括：
上述用于检测COMP基因突变的由第1至第19外显子的PCR扩增引物组成的引物组；
PCR扩增试剂；
PCR产物纯化试剂；
含有上述用于检测COMP基因突变的测序引物组的DNA测序试剂。
根据本发明优选的，所述PCR扩增试剂包括：2.5mM dNTP，含Mg2+的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；
所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为：200μM dNTP，1×PCR缓冲液，0.025U/μlTaq DNA聚合酶，上游引物和下游引物均为0.4μM，模板浓度为2.5～5ng/μl。
根据本发明优选的，所述PCR产物纯化试剂包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase与DNase水；
PCR产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。
根据本发明优选的，所述DNA测序试剂包括：上述用于检测COMP基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase酶与DNase酶水。
根据本发明进一步优选的，所述测序引物中的测序引物的工作浓度为0.64pMol/L。
有益效果
1、本发明采用特异性引物组，针对COMP基因的第1到第19外显子进行突变检测，确保了测定结果的准确性与特异性。与传统的单一突变位点的检测而言，扩大了检测突变范围至COMP外显子区所有位点，覆盖已报道的突变位点与可能的突变位点。与传统的通过荧光定量PCR采用探针法检测相比，降低了检测成本，同时PCR产物通过DNA序列测定以及后续序列比对完成，其准确性要高于荧光定量PCR。与高通量测序相比较，直接对COMP致病基因进行检测，避免了高通量测序中因原始数据筛选、阈值设定等问题而可能出现的假阳性与假阴性问题；
2、本发明所涉及的每对引物的PCR扩增与DNA测序条件完全一致，可以同时进行扩增测序，极大降低了检测过程的工作量；
3、本发明提供的COMP基因突变组及其检测试剂盒可用于COMP基因突变所导致的遗传性疾病假性软骨发育不良与I型多发性骨骺发育不良的基因突变检测，进而辅助临床确诊该类疾病，同时还为研究COMP基因突变与基因功能之间的关系以及基因型与表型之间的相互关系奠定基础。
附图说明
图1是全血基因组DNA不同引物对对COMP基因第1到第19外显子PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是本发明实施例中三例假性软骨发育不全患者血液样本COMP基因测序峰图；
其中：A、患者1的检测结果图；B、患者2的检测结果图；C、患者3的检测结果图；
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现的目的及效果，具体实施方式说明如下。
试剂来源
全血基因组DNA提取试剂盒购自Omega公司；
2.5mM dNTP混合物、5U/μl Taq DNA聚合酶、10×PCR反应缓冲液均来自TakaRa公司；
1U/μl SAP与10U/μlExoI购自NEB公司，BigDye 3.1测序溶液、Na2EDTA﹒2H20与Hi-Di甲酰胺均购自ThermoFisher Scientific公司；
无水乙醇购自国药集团；
去RNase与DNase水购自Life Technologies；
琼脂糖为西班牙进口，引物由华大基因合成。
实施例1
根据NCBI GeneBank数据库分析FGFR3基因序列(NM_000095.2)，进行第1到第19外显子扩增引物的设计。扩增区域包括COMP全部外显子及其外显子与内含子交界处不少于50bp的内含子序列。PCR扩增中所采用引物核苷酸序列如表1所示。
表1
实施例2
一种用于检测COMP基因突变的试剂盒，包括：
上述用于检测COMP基因突变的由第1至第19外显子的PCR扩增引物组成的引物组；
所述PCR扩增试剂包括：2.5mM dNTP，含Mg2+的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；
所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为：200μM dNTP，1×PCR缓冲液，0.025U/μlTaq DNA聚合酶，上游引物和下游引物均为0.4μM，模板浓度为2.5～5ng/μl。
所述PCR产物纯化试剂包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase与DNase水；
PCR产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。
所述DNA测序试剂包括：上述用于检测COMP基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase与DNase水；
所述测序引物组中的测序引物工作浓度为0.64pMol/L。
本试剂盒于-20保存，尽量减少反复冻融。
实施例3
利用上述用于检测COMP基因突变的试剂盒进行人COMP基因突变检测方法，步骤如下：
(1)外周血基因组DNA的提取
采集患者外周血5ml，采用Omega公司DNA提取试剂盒(D3392-01)进行全血基因组DNA的提取，采用NanoDrop 2000/2000c分光光度计进行DNA浓度和纯度测定；具体操作步骤条件参见产品说明书；
(2)PCR扩增
PCR反应体系为20μl，其中包括：
10×PCR Buffer 2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，Taq DNA聚合酶0.1μl，上游引物1.6μl，下游引物1.6μl，DNA模板50ng-100ng，去RNase酶与DNase酶水补足至20μl。
采用BIO-RAD公司PIC-200型PCR仪，进行降落PCR，PCR反应条件如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性20秒，62℃退火30秒，退火温度每一循环降低0.5℃，72℃延伸40秒，循环次数14；然后，94℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，循环次数21；72℃终延伸5分钟。
(3)PCR产物纯化
PCR纯化体系为20μl，其中包括：
PCR产物8μl，1U/μl SAP酶1μl，10U/μl ExoI酶1μl，H2O 10μl。
反应条件为：37℃消化60分钟，然后65℃灭活15分钟。产物纯化后经1％琼脂糖凝胶电泳或是微量核酸定量仪进行浓度测定。
(4)DNA测序反应及纯化
DNA测序反应的体系为10μl，包括4μl BigDye，3.2pMol/L测序引物2μl，5～20ng纯化的PCR产物，用去RNase酶与DNase酶水补足至10μl。
反应条件为：
96℃1分钟变性，96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟，共28个循环反应，PCR循环完并冷却到4℃，取下并马上进行短时间离心。
测序反应结束后将反应产物中加入2.5μl 0.125M的EDTA溶液,然后加入30μl无水乙醇，颠倒混匀后室温放置15分钟。在12000g离心10分钟后，移除上清。加入60μl70％乙醇，4℃12000g离心15分钟后，移除上清。重复一次后，待乙醇挥发干净后将沉淀溶于10μlHi-Di甲酰胺。95℃变性4分钟后采用ABI3130XL测序仪进行测序分析。
(5)测序结果分析
测序结果采用Mutation Survey软件进行突变位点的识别。
实验例
采用实施例1至实施例3所述方法，对来自山东省立医院的3例临床诊断为疑似假性软骨发育不全的患者进行了COMP基因检测，患者1为女性，5岁6月，身高85cm,体重14kg；患者2女性，9岁1月，身高95cm，体重16cm。患者3男性，身高128cm，体重50kg。三例假性软骨发育不全患者血液样本COMP基因测序峰图如图2所示。患者1存在c.1573G>A杂合突变，引起525位氨基酸残基由谷氨酸为赖氨酸所替代(图2A)。患者2存在c.249G>C杂合突变，该突变导致317位天冬氨酸到组氨酸的替代(图2B)。患者3存在c.818A>T杂合突变，该突变导致273位天冬氨酸被缬氨酸所替代(图2C)。
该三个患者均具有身材矮小、手指与足趾短而粗、腰椎轻度前凸、膝外翻畸形、其中两患者存在扁平足。假性软骨发育不全患者同软骨发育不全患者在临床表型上部分重叠，故对于非典型患者在临床诊断上有时难以区分，根据本实验例的检测方法，能够成功的识别临床疑似假性软骨发育不全患者，辅助临床确诊，为疾病确诊与产前筛查奠定基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省医药生物技术研究中心
<120> 检测人COMP基因突变的引物组及其试剂盒
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (7)

1.一种用于检测COMP基因突变的引物组，该引物组包括14对特异性扩增COMP基因第1至第19外显子的引物；
所述的COMP基因外显子1与外显子2的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物FP1与核苷酸序如SEQ ID NO.2所示的引物RP1；
所述的COMP基因外显子3的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FP2与核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的引物RP2；
所述的COMP基因外显子4的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物FP3与核苷酸序如SEQ ID NO.6所示的引物RP3；
所述的COMP基因外显子5的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物FP4与核苷酸序如SEQ ID NO.8所示的引物RP4；
所述的COMP基因外显子6与外显子7的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物FP5与核苷酸序如SEQ ID NO.10所示的引物RP5；
所述的COMP基因外显子8的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物FP6与核苷酸序如SEQ ID NO.12所示的引物RP6；
所述的COMP基因外显子9的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物FP7与核苷酸序如SEQ ID NO.14所示的引物RP7；
所述的COMP基因外显子10的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的引物FP8与核苷酸序如SEQ ID NO.16所示的引物RP8；
所述的COMP基因外显子11与外显子12的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示的引物FP9与核苷酸序如SEQ ID NO.18所示的引物RP9；
所述的COMP基因外显子13的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物FP10与核苷酸序如SEQ ID NO.20所示的引物RP10；
所述的COMP基因外显子14与外显子15的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示的引物FP11与核苷酸序如SEQ ID NO.22所示的引物RP11；
所述的COMP基因外显子16的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物FP12与核苷酸序如SEQ ID NO.24所示的引物RP12；
所述的COMP基因外显子17的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的引物FP13与核苷酸序如SEQ ID NO.26所示的引物RP13；
所述的COMP基因外显子18与外显子19的PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示的引物FP14与核苷酸序如SEQ ID NO.28所示的引物RP14。
2.一种用于检测COMP基因突变的测序引物组，该引物组包括14条第1至第19外显子的测序引物引物；包括：
外显子1与外显子2的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物FP1；
外显子3的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3的引物FP2；
外显子4的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.5的引物FP3；
外显子5的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7的引物FP4；
外显子6与外显子7的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.9的引物FP5；
外显子8的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.11的引物FP6；
外显子9的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.13的引物FP7；
外显子10的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.15的引物FP8；
外显子11与外显子12的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.17的引物FP9；
外显子13的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.19的引物FP10；
外显子14与外显子15的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.21的引物FP11；
外显子16的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.23的引物FP12；
外显子17的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.25的引物FP13；
外显子18与外显子19的PCR测序引物核苷酸序列为SEQ ID NO.27的引物FP14。
3.一种用于检测COMP基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1所述用于检测COMP基因突变的由第1至第19外显子的PCR扩增引物组成的引物组；
PCR扩增试剂；
PCR产物纯化试剂；
含有权利要求2所述用于检测COMP基因突变的测序引物组的DNA测序试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括：2.5mM dNTP，含Mg2+的10×PCR缓冲液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase与DNase水；
所述PCR扩增体系中各组分的工作浓度为：200μM dNTP，1×PCR缓冲液，0.025U/μl TaqDNA聚合酶，上游引物和下游引物均为0.4μM，模板浓度为2.5～5ng/μl。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR产物纯化试剂包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase与DNase水；
PCR产物纯化体系中各组分的工作浓度为：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA测序试剂包括：上述用于检测COMP基因突变的测序引物组、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、无水乙醇、体积百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase与DNase水。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述测序引物中的测序引物的工作浓度为0.64pMol/L。
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