CN111424081B - 基于多重荧光定量pcr技术检测软骨发育不全fgfr3基因突变的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

基于多重荧光定量pcr技术检测软骨发育不全fgfr3基因突变的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于多重荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因突变的引物、探针、试剂盒和检测方法，能全面覆盖与软骨发育不全相关的FGFR3基因的四个常见致病位点，共6种突变类型：c.742C>T(rs12193482)，c.1118A>G(rs121913485)，c.1138G>A/G>C(rs28931614)，c.1620C>A/C>G(rs28933068)。本发明结果准确可靠，操作简单实用，低成本，设备要求低，能满足当前临床迫切需要一种简单、快速、精准的产前诊断检测方法的需求。

Description

基于多重荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因突变的引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因诊断技术领域，具体涉及一组基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因热点突变的检测引物、探针、试剂盒和检测方法。
背景技术
软骨发育不全(achondroplasia，ACH)是一种最常见的人类侏儒症，以不成比例的身材矮小，四肢短粗，手指短小成“三叉戟”样为主要特征，成常染色体显性遗传，其发病率为1/10000～1/70000，超过80％患者为散发型。软骨发育不全与FGFR3基因突变密切相关，由于缺乏有效地治疗办法，患儿预后较差。因此，FGFR3基因热点突变的检测是目前疑似ACH胎儿产前诊断的最直接快速的方法之一。
目前，国内外检测FGFR3基因热点突变的方法有PCR结合Sanger测序、限制性片段长度多态性分析、变性高效液相色谱分析、高分率熔解曲线分析、基因芯片等。上述每种方法均有其优缺点。最为常用的基因诊断策略是对FGFR3基因外显子区域进行PCR扩增及Sanger测序，但该方法存在耗时长、操作繁琐、实验周期长的缺点，且可能发生由于引物区突变所致的漏诊。由于ACH胎儿多在孕25周后出现四肢长骨生长明显滞后等超声异常表现，发现时已为妊娠晚期，临床对于确诊的时效性要求较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测FGFR3基因热点突变的检测引物、探针、试剂盒和检测方法，全面检测FGFR3基因热点突变，以满足当前临床迫切需要一种简单、快速、精准的产前诊断检测方法的需求。
本发明研究团队发现在中国人群中与软骨发育不全相关的FGFR3基因常见致病位点只有四个位点，包含6种突变类型，分别是：c.742C>T(rs12193482)，c.1118A>G(rs121913485)，c.1138G>A/G>C(rs28931614)，c.1620C>A/C>G(rs28933068)。
针对上述的FGFR3基因热点突变四个位点及6种突变类型，本发明首次建立了一种基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测FGFR3基因热点突变的检测方法，并提供用于该检测方法的检测引物、探针、试剂盒。
本发明通过以下技术方案来实现：
一组基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因热点突变的检测引物及探针为如下所示：
针对FGFR3基因c.742C>T(rs12193482)位点：
Forward引物：5'-GCCCCTGAGCGTCATCTG-3'；
Reverse引物：5'-CACCGCCGTCTGGTTGG-3'；
FGFR3基因野生型位点c.742C探针：5'-CACAGAGCGCTCCC-3'，探针的5'端带有ROX
报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
FGFR3基因突变型位点c.742T探针：5'-CACAGAGTGCTCCC-3'，探针的5'端带有Cy5报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
针对FGFR3基因c.1118A>G(rs121913485)位点：
Forward引物：5'-GAGGAGCTGGTGGAGGCT-3'；
Reverse引物：5'-GCGGCAGAGCGTCACAG-3'；
FGFR3基因野生型位点c.1118A探针：5'-CAGTGTGTATGCAGGC-3'，探针的5'端带有FAM报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
FGFR3基因突变型位点c.1118G探针：5'-CAGTGTGTGTGCAGGC-3'，探针的5'端带有HEX报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
针对FGFR3基因c.1138G>A/G>C(rs28931614)位点：
Forward引物：5'-GAGGAGCTGGTGGAGGCT-3'；
Reverse引物：5'-GCGGCAGAGCGTCACAG-3'；
FGFR3基因野生型位点c.1138G探针：5'-CCACCCCGTAGCTGA-3'，探针的5'端带有FAM报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
FGFR3基因突变型位点c.1138A探针：5'-CCACCCTGTAGCTGA-3'，探针的5'端带有ROX报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
FGFR3基因突变型位点c.1138C探针：5'-CCACCCGGTAGCTGA-3'，探针的5'端带有Cy5报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
针对FGFR3基因c.1620C>A/C>G(rs28933068)位点：
Forward引物：5'-GGAGATGATGAAGATGATCGGGAA-3'；
Reverse引物：5'-ACCTACCGCCCTGCGT-3'；
FGFR3基因野生型位点c.1620C探针：5'-CATCATCAACCTGCTGG-3'，探针的5'端带有HEX报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
FGFR3基因突变型位点c.1620A探针：5'-CATCATCAAACTGCTGG-3'，探针的5'端带有ROX报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
FGFR3基因突变型位点c.1620G探针：5'-CATCATCAAGCTGCTGG-3'，探针的5'端带有FAM报告荧光基团，3'端带有MGB淬灭荧光基团。
本发明提供了一种基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因热点突变的检测试剂盒，该试剂盒含有上述的检测引物和检测探针。
本发明提供了一种基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因热点突变的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
(1)分别采集胎儿的绒毛/脐带血/羊水细胞或EDTA/柠檬酸钠抗凝的受检者外周血，提取基因组DNA，并检测DNA浓度和纯度，保证基因组DNA浓度和纯度达到较好水平；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用上述的检测引物及探针进行多重实时荧光定量PCR；
(3)根据荧光定量结果判读胎儿或受检者是否携带FGFR3基因热点突变。
步骤(1)所述的DNA浓度，优选为20～160ng/μL。
步骤(1)所述的DNA纯度，优选为OD260/280＝1.7～2.0。
步骤(2)所述的利用上述的检测引物及探针进行基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR，是将上述的检测引物及探针组合后进行多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR。
所述的将上述的检测引物及探针组合，具体为：将c.742C>T和c.1118A>G两个位点引物及探针组合后进行多重实时荧光定量PCR，将c.1138G>A/G>C位点引物及探针组合后进行多重实时荧光定量PCR，将c.1620C>A/C>G位点引物及探针组合后进行多重实时荧光定量PCR。
所述的组合后进行多重荧光PCR，其扩增体系优选为：对于c.742C>T和c.1118A>G位点，其扩增体系共20μL，包括Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，c.742 Forward引物(10μM)0.75μL，c.742 Reverse引物(10μM)0.75μL，c.1118 Forward引物(10μM)0.25μL，c.1118Reverse引物(10μM)0.25μL，c.742C探针(10μM)1.5μL，c.742T探针(10μM)1.5μL，c.1118A探针(10μM)0.5μL，c.1118G探针(10μM)0.5μL，Betaine(5M)2μL，模板DNA 2μL；
对于c.1138G>A/G>C位点，其扩增体系共20μL，包括Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，c.1138 Forward引物(10μM)0.5μL，c.1138 Reverse引物(10μM)0.5μL，c.1138G探针(10μM)1μL，c.1138A探针(10μM)1μL，c.1138C探针(10μM)1μL，Betaine(5M)2μL，模板DNA 2μL，ddH2O 2μL；
对于c.1620C>A/C>G位点，其扩增体系共20μL，包括Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，c.1620 Forward引物(10μM)0.5μL，c.1620 Reverse引物(10μM)0.5μL，c.1620C探针(10μM)1μL，c.1620A探针(10μM)1μL，c.1620G探针(10μM)1μL，Betaine(5M)2μL，模板DNA 2μL，ddH2O 2μL。
步骤(2)所述的多重荧光PCR，其扩增条件优选为：64℃1min(采集荧光)，循环数1；95℃2min，循环数1；95℃20sec，64℃45sec(采集荧光)，循环数50；64℃1min(采集荧光)，循环数1。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明提供一种基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测FGFR3基因热点突变的检测引物、探针、检测试剂盒以及检测方法，能全面覆盖与软骨发育不全相关的FGFR3基因的四个常见致病位点，共6种突变类型：c.742C>T(rs12193482)，c.1118A>G(rs121913485)，c.1138G>A/G>C(rs28931614)，c.1620C>A/C>G(rs28933068)。与以往限制性片段长度多态性分析、变性高效液相色谱分析、高分率熔解曲线分析等快速检测方法相比较，本发明能更为全面的覆盖FGFR3基因热点突变。
(2)目前，国内外检测FGFR3基因突变最常用的基因诊断策略是对FGFR3基因外显子区域进行PCR扩增及Sanger测序，但该方法存在耗时长、操作繁琐、实验周期长的缺点。本发明使用多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术，操作简单，只需将受检者DNA标本分别加入3个反应检测体系，同步上机检测，约1.5小时即可获取检测结果，无需凝胶电泳、纯化回收以及测序等后PCR处理，结果准确可靠，操作简单实用，低成本，设备要求低，可实现自动化和标准化，能满足当前临床迫切需要一种简单、快速、精准的产前诊断检测方法的需求。
附图说明
图1为针对FGFR3基因c.742C>T和c.1118A>G位点的多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR结果图，其中，图1A为FGFR3基因c.742及c.1118位点均为野生型的PCR结果图，图1B为FGFR3基因c.742C>T杂合突变及c.1118野生型的PCR结果图，图1C为FGFR3基因c.742野生型及c.1118A>G杂合突变的PCR结果图。
图2为针对FGFR3基因c.1138G>A/G>C位点的多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR结果图，其中，图2A为FGFR3基因c.1138位点野生型的PCR结果图，图2B为FGFR3基因c.1138G>A杂合突变的PCR结果图，图2C为FGFR3基因c.1138G>C纯合突变的PCR结果图。
图3为针对FGFR3基因c.1620C>A/C>G位点的多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR结果图，其中，图3A为FGFR3基因c.1620位点为野生型的PCR结果图，图3B为FGFR3基因c.1620C>A杂合突变的PCR结果图，图3C为FGFR3基因c.1620C>G杂合突变的PCR结果图。
图4为Sanger测序验证FGFR3基因c.742位点情况。图4A为FGFR3基因c.742位点野生型的Sanger测序结果图，图4B为FGFR3基因c.742C>T杂合突变的Sanger测序结果图。
图5为Sanger测序验证FGFR3基因c.1118位点情况。图5A为FGFR3基因c.1118位点野生型的Sanger测序结果图，图5B为FGFR3基因c.1118A>G杂合突变的Sanger测序结果图。
图6为Sanger测序验证FGFR3基因c.1138位点情况。图6A为FGFR3基因c.1138位点野生型的Sanger测序结果图，图6B为FGFR3基因c.1138G>A杂合突变的Sanger测序结果图，c.1138G>C阳性对照DNA为人工合成的质粒DNA(未行测序验证)。
图7为Sanger测序验证FGFR3基因c.1620位点情况。图7A为FGFR3基因c.1620位点野生型的Sanger测序结果图，图7B为FGFR3基因c.1620C>A杂合突变的Sanger测序结果图，图7C为FGFR3基因c.1620C>G杂合突变的Sanger测序结果图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
本发明的FGFR3基因c.742C>T，c.1118A>G，c.1138G>A，c.1620C>A/C>G阳性对照DNA为临床软骨发育不全的胎儿的绒毛/脐带血/羊水细胞或EDTA/柠檬酸钠抗凝的受检者外周血的基因组DNA，c.1138G>C纯合突变阳性对照DNA为人工合成的质粒DNA。
所用的检测引物及探针如下：
Figure BDA0002448611520000081
Figure BDA0002448611520000091
一种基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因热点突变的检测方法，包括以下步骤：
1、分别采集胎儿的绒毛/脐带血/羊水细胞或EDTA/柠檬酸钠抗凝的受检者外周血；
2、使用Qiamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒(德国QIAGEN公司生产)提取所采集胎儿的绒毛/脐带血/羊水细胞基因组DNA，使用试剂盒(Lab-Aid 820核酸提取Mini试剂，购自厦门致善生物科技股份有限公司)或者核酸自动提取仪(Lab-Aid 820核酸提取仪，购自厦门致善生物科技股份有限公司)提取所采集的受检者外周血基因组DNA，并测定DNA浓度、OD260/280和OD260/230，保证核酸浓度为20～160ng/μL，纯度为OD260/280＝1.7～2.0；
3、配制多重荧光PCR反应体系如下：
体系(1)：c.742C>T和c.1118A>G位点
Figure BDA0002448611520000092
Figure BDA0002448611520000101
体系(2)：c.1138G>A/G>C位点
Premix Ex Taq 10μL
PrimerF(10μM) 0.5μL(c.1138)
PrimerR(10μM) 0.5μL(c.1138)
Probe(10μM) 1μL(c.1138G)+1μL(c.1138A)+1μL(c.1138C)
Betaine(5M) 2μL
Template 2μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 2μL
Total 20μL
体系(3)：c.1620C>A/C>G
Figure BDA0002448611520000102
Figure BDA0002448611520000111
4、扩增反应程序如下：
Figure BDA0002448611520000112
*表示采集荧光
5、结果判读
荧光定量PCR结束后，使用软件进行数据分析处理，可以得到每个受检者的结果图，通过判断受检者每个检测位点对应野生型和突变型特异性探针的扩增峰是否出现(图1-图3)，可以初步判断受检者是否携带FGFR3基因致病位点。
6、Sanger测序验证
对所有应用荧光定量检测FGFR3基因致病位点的样本进行相应位点Sanger测序验证。荧光定量结果为c.742野生型和c.742C>T杂合突变，c.1118野生型和c.1118A>G杂合突变，c.1138野生型和c.1138G>A杂合突变，c.1620野生型和c.1620C>A杂合或c.1620C>G杂合突变样本对应Sanger测序峰图见图4-图7。验证结果提示荧光定量结果符合Sanger测序结果。本次验证实验验证了本发明结果的准确性与特异性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省妇幼保健院
<120> 基于多重荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因突变的引物、探针和试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcccctgagc gtcatctg 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccgccgtc tggttgg 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggagctgg tggaggct 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggcagagc gtcacag 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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gcggcagagc gtcacag 17
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<212> DNA
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ccaccctgta gctga 15
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccacccggta gctga 15
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catcatcaac ctgctgg 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catcatcaaa ctgctgg 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
catcatcaag ctgctgg 17

Claims (4)

1.一种基于多重TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术检测软骨发育不全FGFR3基因热点突变的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含体系1，所述体系1包含如下所示的检测引物和检测探针；
检测引物：
针对FGFR3基因c.742C>T位点：
Forward引物：5'-GCCCCTGAGCGTCATCTG-3 '；
Reverse引物：5 '-CACCGCCGTCTGGTTGG-3'；
针对FGFR3基因c.1118A>G位点：
Forward引物：5'-GAGGAGCTGGTGGAGGCT-3 '；
Reverse引物：5 '-GCGGCAGAGCGTCACAG-3'；
检测探针：
针对FGFR3基因c.742C>T位点：
FGFR3基因野生型位点c .742C探针：5'-CACAGAGCGCTCCC-3 '；
FGFR3基因突变型位点c .742T探针：5'-CACAGAGTGCTCCC-3 '；
针对FGFR3基因c.1118A>G位点：
FGFR3基因野生型位点c .1118A探针：5'-CAGTGTGTATGCAGGC-3 '；
FGFR3基因突变型位点c .1118G探针：5'-CAGTGTGTGTGCAGGC-3 '；
所述探针的5'端带有报告荧光基团，3'端带有淬灭荧光基团。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含体系2，所述体系2包含如下所示的检测引物和检测探针；
针对FGFR3基因c.1138G>A/G>C位点：
Forward引物：5'-GAGGAGCTGGTGGAGGCT-3 '；
Reverse引物：5 '-GCGGCAGAGCGTCACAG-3'；
FGFR3基因野生型位点c .1138G探针：5'-CCACCCCGTAGCTGA-3 '；
FGFR3基因突变型位点c .1138A探针：5'-CCACCCTGTAGCTGA-3 '；
FGFR3基因突变型位点c .1138C探针：5'-CCACCCGGTAGCTGA-3 '。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含体系3，所述体系3包含如下所示的检测引物和检测探针；
针对FGFR3基因c.1620C>A/C>G位点：
Forward引物：5'-GGAGATGATGAAGATGATCGGGAA-3 '；
Reverse引物：5 '-ACCTACCGCCCTGCGT-3'；
FGFR3基因野生型位点c .1620C探针：5'-CATCATCAACCTGCTGG-3 '；
FGFR3基因突变型位点c .1620A探针：5'-CATCATCAAACTGCTGG-3 '；
FGFR3基因突变型位点c .1620G探针：5'-CATCATCAAGCTGCTGG-3 '。
4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的报告荧光基团为ROX、Cy5、FAM或HEX，所述的淬灭荧光基团为MGB。
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