KR102175930B1 - Cux2 유전자의 인핸서 인자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Cux2 유전자의 인핸서 인자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서; 상기 인핸서를 포함하는 대뇌 피질 특이적 목적 유전자 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 숙주 유기체, 상기 벡터가 도입된 뇌 신경발달 동물모델; 상기 인핸서 검출용 프라이머 세트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 신경발달장애를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 뇌 신경발달에 있어서 대뇌의 II-IV층 신경세포에 특이적으로 Cux2 유전자의 발현을 조절할 수 있는 인핸서 인자를 처음으로 규명함에 따라, 이를 이용하여 대뇌 피질에 특이적으로 유전자 발현을 유도할 수 있는 벡터 제조가 가능하며, 이러한 재조합 발현 벡터를 이용하여 뇌 신경발달을 연구할 수 있는 동물 모델을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 인핸서 영역의 유전자 변이를 검출함으로써 자폐 장애, 조현병, 아스퍼거 장애와 같은 신경발달장애(특히, 뇌 발달 장애)를 조기에 진단할 수 있다.

Description

Cux2 유전자의 인핸서 인자 및 이의 용도{Enhancer Element of the Cux2 Gene and Uses Thereof}

본 발명은 Cux2 유전자의 인핸서 인자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서; 상기 인핸서를 포함하는 대뇌 피질 특이적 목적 유전자 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 숙주 유기체, 상기 벡터가 도입된 뇌 신경발달 동물모델; 상기 인핸서 검출용 프라이머 세트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 신경발달장애를 진단하는 방법에 관한 것이다.

포유류 대뇌의 정확한 층판(lamination)은 뇌의 고차 기능에 중요하다. 지난 수십 년 동안, 마커는 포유 동물 대뇌의 층상 구조를 식별하는데 도움이되었으며, 이 중 일부는 특정 층에서 피라미드 뉴런(pyramidal neurons)의 동정에 중요한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 대뇌 피질층 V에서 특별하게 발현되어지는 Fezf2는 피질척수로 형성에 중요하고, Tbr1 및 Sox5는 Fezf2의 전사를 억제함으로써 정상적인 피질척수로 형성에 기여한다. 또한, Sox4 및 Sox11은 Fezf2의 E4 인핸서에 결합하여 피질척수로 형성을 유도한다. 대뇌 피질층 II-IV에서 발현되는 Cux1과 Cux2는 Xlr3b와 Xlr4b의 발현을 직접 제어함으로써 시냅스 형성, 수지상 가지 및 척추 발달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 궁극적으로 이러한 조절 네트워크에 이상이 발생하는 경우 자폐증, 정신 분열증 및 정신 지체와 같은 신경발달장애를 유발할 수 있다. 또한, 대뇌 피질층 II-IV에서 Cux1과 Cux2의 중첩에도 불구하고, 각각의 넉아웃 마우스에서 시냅스 발생 및 수지상 발생 문제가 발생한다.

Cut/Cux/CDP 패밀리 구성원으로 알려진 Cux1 및 Cux2는 cut homeodomain을 포함하여 4 개의 DNA 결합 도메인을 갖는다. Cux1은 발달 동안 면역 세포, 신장, 폐 및 대뇌 피질과 같은 다양한 조직에서 발현되며 세포주기의 주요 조절자로서 작용한다. Cux1과 마찬가지로 Cux2는 대뇌 피질, 특히 피질층 II-IV의 피라미드 뉴런(pyramidal neurons)에서 높게 발현된다. Cux1과 달리, Cux2의 기능은 최근에 대뇌 피질 뉴런의 시냅스 생성 및 수지상 발생과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.

Cux1과 Cux2는 지난 수십 년 동안 수많은 피질발생(corticogenesis) 연구에서 대뇌 피질의 층 II-IV 마커로 사용되었지만, 그들의 세포 타입 특이적 발현을 조절하는 메커니즘은 알려져 있지 않다.

한편, 인핸서(enhancer)는 전통적으로 프로모터에서 멀리 떨어진 위치에서 유전자의 전사(transcription)를 조절하는 DNA 염기서열을 말한다. 인핸서의 위치를 찾는 문제는 생명정보를 연구하는 학자들이 한번쯤 도전해본 과제로 수많은 알고리즘 및 실험방법이 개발되어왔으며, 시퀀싱 기술의 발전에 맞추어 끊임없이 진화해왔다. 하지만, 지놈상에 산재하는 인핸서의 위치와, 타겟 유전자와의 거리도 다변하기 때문에 인핸서 연구에 어려움이 있다(분자세포생물학뉴스레터 ‘인핸서(enhancer) 이야기’, 원경재).

이러한 배경 하에, 본 발명자는 신경발달에 있어서 대뇌 피질층 II-IV 발달에 관여하는 Cux2 유전자의 인핸서 영역을 밝히기 위하여 노력하였으며, 그 결과 5개의 추정 인핸서 인자(Cux2-E1 ~ E5)를 동정하였고, 이중 특정 인핸서(Cux2-E1)가 도입된 형질전환 마우스의 배 발달 과정에서 Cux2 mRNA 발현과 유사한 패턴으로 발현되는 것을 확인하였다. 또한, Cux2-E1 인핸서는 시험관 내에서 LHX2에 의해 전사적으로 활성화되며, Cux2-E1 인핸서 영역에서 LHX2 결합 부위를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1342522호 한국등록특허 제10-1175156호

따라서 본 발명의 목적은 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 인핸서 인자를 포함하는 대뇌 피질에 특이적인 목적 유전자 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 유기체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 뇌 신경발달 동물 모델을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 인핸서 인자를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프라이머 세트 및 인핸서 서열의 정보를 이용하여 신경발달장애를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자로서 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 134번째 내지 140번째 위치가 전사인자 결합 부위일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인핸서는 뇌 신경발달에 있어서 대뇌의 II-IV층 신경세포에 특이적으로 Cux2 유전자의 발현을 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자; 및 목적 유전자를 포함하는, 대뇌 피질에 특이적인 목적 유전자 발현 카세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 신경세포에서 대뇌 피질에 특이적으로 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 유기체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 뇌 신경발달 동물 모델을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리된 대상 시료로부터 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서를 증폭시키는 단계; 및 b) 상기 a) 단계를 통해 증폭된 산물의 염기서열을 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 비교하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는, 신경발달장애를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계에서 유전자 변이 여부는 서열번호 1의 134번째부터 140번째의 염기서열 부위에서 염기의 치환, 결실 또는 삽입 여부를 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경발달장애는 자폐 장애, 조현병, 아스퍼거 장애, 소아기 붕괴성 장애(Childhood Disintegrative Disorder), 레트 장애(Rett's Disorder), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 엔젤만증후군(Angelman Syndrome), 결절성경화증(tuberous sclerosis complex), 및 펠란-맥더미드 증후군(Phelan McDermid Syndrome)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 뇌 신경발달에 있어서 대뇌의 II-IV층 신경세포에 특이적으로 Cux2 유전자의 발현을 조절할 수 있는 인핸서 인자를 처음으로 규명함에 따라, 이를 이용하여 대뇌 피질에 특이적으로 유전자 발현을 유도할 수 있는 벡터 제조가 가능하며, 이러한 재조합 발현 벡터를 이용하여 뇌 신경발달을 연구할 수 있는 동물 모델을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 인핸서 영역의 유전자 변이를 검출함으로써 자폐 장애, 조현병, 아스퍼거 장애와 같은 신경발달장애(특히, 뇌 발달 장애)를 조기에 진단할 수 있다.

도 1은 Cux2-mCherry BAC 형질전환 마우스의 생성 및 P0(postnatal day 0)에서의 mCherry 발현을 분석한 것이다. 1A는 2 개의 Cux2 BAC 클론(RP23-403O16 및 RP23-51M11)의 게놈 구조 및 시작 코돈과의 연관을 나타낸 것이다. 1B는 재조합된 Cux2-mCherry BAC 리포터의 개략도를 나타낸 것이다. 1C에서 mCherry (적색)는 Cux2-mCherry BAC-1 형질전환 마우스의 대뇌 피질 상층 (별표)에서 피질 상층 마커 CUX1 (녹색)에 대한 면역염색 패턴과 유사하게 발현되었다. mCherry⁺ 피질-피질간 축삭은 뇌량(화살표)에 존재하였다. Scale bar, 0.2 mm. Ctx, cortex; CC, corpus callosum; Str, striatum.
도 2는 P0(postnatal day 0)에서 Cux2-mCherry BAC-1 형질전환 마우스에서의 mCherry 발현의 특성을 나타낸 것이다. 2A는 P0에서, CUX1 (녹색) 및 mCherry (빨간색)는 Cux2-mCherry BAC-1 마우스의 대뇌 피질층 II-IV에서 공동 발현 (병합)되었지만, 심층 마커 (CTIP2, 층 V 마커; FOG2, 층 VI 마커)는 오버랩되지 않았다. 스케일 바, 100 μm. Cux2-mCherry BAC-1 마우스는 표지된 상층 뇌량투영(화살촉)를 요약한다. 2B는 L1 (pan neuronal marker)을 갖는 Cux2-mCherry BAC-1 마우스의 공동-면역 염색은 해마교련(HC, 열린 화살촉)에 있어서 mCherry 양성 축삭이 아니며, 또는 전측교련(AC, 화살표)도 아니다. Scale bar, 0.2 mm. CC, corpus callosum; Str, striatum; AC, anterior commissure.
도 3은 대뇌피질-특이적 Cux2 인핸서의 동정을 나타낸 것이다. 3A는 추정 인핸서 (Cux2-E1 ~ E5, 적색 박스)의 위치를 나타내는 마우스 Cux2 게놈 유전자 좌 위치의 개략도이다. 3B는 X-gal 염색된 Cux2-E1-LacZ, Cux2-E2-LacZ, Cux2-E3-LacZ, Cux2-E4-LacZ 및 Cux2-E5-LacZ 형질전환 마우스 E14.0 배아의 전조직 표본 (상부 패널)과 시상단면 (하부 패널)을 나타낸 것이다. Scale bar, 70 μm.
도 4는 마우스 대뇌피질 발달에서 Cux2 mRNA와 Cux2-E1-LacZ 이식 유전자의 발현 패턴 비교한 것이다. E14.5 마우스 피질에서 Cux2-E1-LacZ 형질전환 배아의 LacZ 발현 (A)은 Cux2 mRNA 발현(B)과 패턴이 유사하다. in situ hybridization 이미지는 Eurexpress database (www.eurexpress.org)에서 얻었다.
도 5는 인 비트로(in vitro) 상에서 전사인자에 해당하는 Lhx2가 Cux2-E1 인핸서를 활성화시키는 것을 나타낸 것이다. 5A는 본 발명의 추정 인핸서 (E1 ~ E5)의 위치를 표시한 것이다. 5B는 7 종의 포유 동물로부터의 Cux2-E1 염기서열의 정렬하여 비교한 것으로, 7종에 보전된 LHX2 결합 부위(LHX2 binding site) 및 Cux2-E1 인핸서 활성을 시험하기 위하여 상기 결합 부위의 결손 돌연변이체를 나타낸 것이다. 5C는 neuro2a 세포에 pCAGEN-Lhx2 발현 플라스미드 및 Cux2-E1 내지 E5 리포터 플라스미드의 공동-형질 감염을 통해 각각의 추정 인핸서의 활성화 정도를 비교한 결과이다. Cux2-E1 (≥2.5-fold) 및 Cux2-E3 (≥4-fold)에서 강한 활성화가 나타난 반면, Cux2-E2, E4 및 E5에서는 활성화되지 못하는 것으로 나타났다. 5D는 neuro2a 세포에 pCAGEN-Lhx2 발현 플라스미드 및 Cux2-E1-m1 내지 Cux2-E1-m2 리포터 플라스미드의 공동-형질 감염을 통해 각각의 돌연변이체의 활성화 정도를 비교한 결과이다. Cux2-E1-m1은 Cux2-E1에서 LHX2 결합 부위가 결손된 돌연변이를 의미하며, Cxu2-E1-m2는 Cux2-E1에서 LHX2 결합 부위가 아닌 다른 부위의 결손 돌연변이를 의미한다.

본 발명은 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "대뇌 피질에 특이적인"의 의미는 프로모터와 기능적으로 연계되어 대뇌 피질에서 유전자의 발현을 유도하지만 모든 조직이나 모든 세포의 유형에서 유전자의 발현을 유도하지는 않는다는 의미이다.

본 발명에서 용어, "인핸서 인자"란 프로모터의 인접 부위에 위치하고 전사 인자가 결합함으로써 전사 정도를 높일수 있는 핵산 서열을 의미한다. 달리 표현하면 그것이 있을 때의 프로모터의 전사 활성을 그것이 없을 때의 프로모터의 전사 활성보다 높일 수 있는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서 용어, "프로모터"란 당업계에 알려진 통상의 의미를 따르는데, 어떤 유전자의 해독 개시 코돈의 상위에 위치하고, DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시점, 전사 개시와 관련된 단백질의 결합 부위 등을 포함하는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 상기 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자이다.

본 발명의 인핸서 인자 염기서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법 및 부위특이적 돌연변이법 등에 의하여 당업자에 의하여 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 상기 인핸서 인자는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90 % 이상, 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 보다 더욱 구체적으로는 98 % 이상, 가장 구체적으로는 99 % 이상의 상동성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열도 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 인핸서 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "단리된 핵산 분자"는 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드, 생물체 특히 마우스에서 분리된 폴리뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드를 함유한 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 의미로서, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA의 중합체를 의미한다. 그러므로 상기 "단리된 핵산 분자"에는 cDNA 뿐만 아니라 뉴클레오티드들을 화학적으로 중합시킨 폴리뉴클레오티드, 나아가 생물체 특히 마우스에서 분리된 gDNA를 포함한다. 본 명세서가 개시하는 서열번호 1의 염기서열과 공지기술에 기초할 때, 상기 화학적 합성되는 폴리뉴클레오티드의 제조, cDNA 제조와 분리, 및 상기 gDNA의 분리 등은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속할 것이다.

본 발명의 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열번호 1의 134번째 내지 140번째 위치가 Lhx2 전사인자 결합 부위인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 본 발명에 따른 Cux2의 유전자 서열은 Gene ID: 13048와 같다.

본 발명의 상기 인핸서 인자는 뇌 신경발달에 있어서 대뇌의 II-IV층 신경세포에 특이적으로 Cux2 유전자의 발현을 조절할 수 있다.

서열번호 1의 염기서열의 연속된 일부로 이루어진 단편이 그것에 기능적으로 연결된 프로모터의 전사 활성을 높이는가 여부의 검정은 본 명세서의 실시예가 개시하는 내용에 기초하여 당업계의 통상의 지식에 따라 수행이 가능하다. 예컨대 당업자는 서열번호 1의 염기서열의 단편을 프로모터(최소 프로모터, 코어 프로모터 또는 TATA box)와 그리고 공지된 마커 유전자(항생제 내성 유전자, 제초제 내성 유전자 등) 및/또는 리포터 유전자(녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 루시퍼라제 유전자, GUS 유전자, lacZ 유전자 등)를 포함하는 발현벡터에 기능적으로 연결시켜 적합한 숙주 유기체에 형질전환시키고 그 마커 유전자 및/또는 그 리포터 유전자의 발현 여부나 발현 정도를 확인함으로써 가능할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자; 및 목적 유전자를 포함하는, 대뇌 피질에 특이적인 목적 유전자 발현 카세트를 제공한다.

본 발명의 상기 발현 카세트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자; 및 목적 유전자 이외에 TATA box 또는 코어 프로모터(core promoter)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “TATA box”란 일반적인 전사인자 단백질 및 히스톤이 결합할 수 있는 코어 프로모터(core promoter) 영역 내의 DNA 서열 (5'-TATAAA-3 ')을 의미한다.

본 발명에서 용어, “코어 프로모터(core promoter)”란 프로모터 중 전사가 일어나기 위해 필요한 최소한의 부분으로서, 전사시작지점으로부터 앞쪽으로 약 50-100bp의 DNA 서열을 의미한다. 이곳에 RNA 중합효소와 일반적인 전사 조절인자들이 결합하게 된다.

본 발명에서 용어, "목적 유전자"는 목적하는 생성물을 암호화하는 일정 길이의 핵산 서열로서 정의될 수 있다. 목적하는 생성물은 그 자체가 생물학적으로 활성인 단백질이거나 전사 후 특정 유전자의 불활성에 관여하는 RNA(예컨대 RNAi에 관여하는 siRNA)일 수 있다. 목적 유전자는 일반적으로 센스 방향으로 벡터 내에 존재할 것이지만, 특정 유전자를 불활성화시키기 위하여 안티센스 방향으로 존재할 수도 있다. 목적 유전자는 본 발명의 인핸서 인자에 의해서 그 발현이 촉진되는 Cux2 유전자이거나 전술한 바의 항생제 내성 유전자, 리포터 유전자일 수 있다. 그 목적 유전자가 생물학적으로 활성을 띠는 단백질인 경우 그 유전자는 통상 5' 비번역리더서열(5'UTR), 코딩 서열 및 3'비번역서열(3'UTR)을 포함할 수 있다.

또한, 목적 유전자는 절단된 형태의 단백질, 융합된 형태의 단백질, 태그된 형태의 단백질을 암호화하는 서열일수 있으며, cDNA 또는 gDNA일 수 있고, 천연 형태의 생성물을 암호화하는 서열이거나 원하는 돌연변이 형태의 생성물을 암호화하는 서열일 수 있다. 이러한 목적 유전자는 그 목적 생성물이 인간에게 직·간접적으로 유용한 것이라면 임의의 것이라도 무방하다. 또한 이러한 목적 유전자는 임의의 것으로부터 기원할 수 있는데, 예컨대 식물, 세균, 동물, 바이러스 등으로부터 기원할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자; 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 코어 프로모터; 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 목적 유전자(LacZ gene); 및 서열번호 6으로 표시되는 폴리A 시그널을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 발현 카세트를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명에서 용어, "재조합 발현 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 상기 목적 유전자에 작동가능하게 연결된 조절 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조절 핵산서열은 그것에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사/번역에 영향을 줄 수 있는, 전사 개시 부위의 상위 또는 하위에 존재하는 임의의 핵산서열을 말한다. 예컨대 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위, 복제개시점 등을 말한다.

본 발명의 발현벡터는 바람직하게는 형질전환된 숙주 유기체의 선별을 가능·용이하게 하기 위하여 선택 마커유전자를 하나 이상 포함하거나, 발현시키고자 하는 목적 유전자의 발현 여부를 정성적·정량적으로 분석하기 위하여 리포터 유전자를 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 선택 마커 유전자나 리포터 유전자는 전술한 바와 같이 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자; 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 코어 프로모터; 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 목적 유전자(LacZ gene); 및 서열번호 6으로 표시되는 폴리A 시그널(PolyA signal)로 이루어진 발현 카세트를 pBluescriptSK 벡터에 삽입하여 제조될 수 있으며, 이러한 재조합 발현 벡터는 서열번호 7로 표시될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 유기체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "숙주 유기체"란 인위적으로 특정의 핵산 분자, 바람직하게는 본 발명의 전술한 바의 발현벡터가 도입되는 대상이 되거나 도입된 유기체로서, 동물, 동물 유래의 세포(진핵세포), 조직 등을 포함하는 개념이다. 예를 들어, 동물 자체, 동물 유래의 세포(진핵세포), 동물 유래의 조직, 동물의 수정란 등을 포함할 수 있다. 상기 동물은 인간, 생쥐, 래트, 마우스, 토끼, 초파리, 돼지 또는 원숭이 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 발현벡터로 숙주 유기체를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 그러한 공지된 방법으로서 칼슘 포스페이트 침전법(calcium phosphate precipitation), DEAE-덱스트란이 매개하는 형질전환법(DEAE-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 뉴클레오펙션 (nucleofection), 리포좀이 매개하는 형질전환법(liposome-mediated transfection), 마이크로 주입법(microinjection) 등을 들 수 있다.

본 발명의 형질전환 숙주 유기체는 본 발명의 Cux2 유전자의 인핸서 인자의 존재를 특징으로 하며, 또한 그 인핸서 인자에 작동가능하게 연결된 TATA box 및 목적 유전자의 존재를 특징으로 한다. 이러한 목적 유전자로부터 발현된 RNA 전사체, 단백질 등은 형질전환된 숙주 유기체의 표현형을 변화시킬 수 있다.

이러한 목적 유전자는 동종성 유전자나 이종성 유전자일 수 있다. 여기서 "동종성 유전자"란 숙주 유기체 또는 그와 동일한 생물종의 내인성 유전자를 의미하며, "이종성 유전자"란 그것이 형질전환되는 유기체에서는 존재하지 않는 유전자를 말한다. 예컨대 본 발명에서 리포터 유전자로 사용된 lacZ 유전자는 대장균에 있어서는 동종성 유전자이지만 마우스에서는 이종성 유전자가 된다.

바람직하게는 본 발명의 형질전환 숙주 유기체는 대장균 등의 세균, 동물 유래의 세포, 또는 동물의 수정란일 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 적당한 숙주 유기체에 형질전환되었을 때 숙주 유기체의 게놈에 통합되어 복제되거나 숙주 유기체의 게놈과 무관하게 복제되어 존재할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 숙주 유기체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환된 숙주 유기체의 제조 방법은 1) 전술한 바의 발현벡터를 제작하는 단계, 및 2) 그 발현 벡터를 숙주 유기체에 도입하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명의 형질전환된 숙주 유기체의 제조 방법에 있어서, 숙주 유기체가 마우스 등 동물의 수정란인 경우 그 수정란을 대리모 등에 이식하여 배아로 발생시키는 단계가 추가로 포함될 수 있다.

본 발명은 또한, 재조합 발현 벡터가 도입된 뇌 신경발달 동물 모델을 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자를 통해, 대뇌 피질에 특이적으로 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는바, 뇌 신경발달을 연구할 수 있는 동물 모델로 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 동물모델은 대뇌피질의 특정 신경세포군을 형광단백질과 같은 표지자 발현을 통해 시각화하거나, 목적 유전자의 대뇌피질 특이적 발현에 따른 대뇌신경발달 양상을 살펴보는데 활용할 수 있는 동물모델이다.

본 발명은 또한, 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 용어, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 영역을 증폭할 수 있도록 고안된 프라이머이다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 조성물은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성되는 프라이머 세트 이외에 추가로 증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트(서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성됨)를 포함하는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자 검출을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 증폭반응용 프라이머 세트뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 DNA 증폭을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 본 발명의 프라이머 세트 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 및 멸균증류수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, a) 개체로부터 분리된 대상 시료로부터 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서를 증폭시키는 단계; 및 b) 상기 a) 단계를 통해 증폭된 산물의 염기서열을 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 비교하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는, 신경발달장애를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 대상 시료로부터 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트를 통해 증폭된 산물의 염기서열과 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 비교하여 유전자 변이가 있는 경우, 신경발달장애로 예측하거나 진단할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 b) 단계에서 유전자 변이 여부는 서열번호 1의 134번째부터 140번째의 염기서열 부위에서 염기의 치환, 결실 또는 삽입 여부를 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 b) 단계는 서열번호 1의 134번째 위치; 서열번호 1의 135번째 위치; 서열번호 1의 136번째 위치; 서열번호 1의 137번째 위치; 서열번호 1의 138번째 위치; 서열번호 1의 139번째 위치 및 서열번호 1의 140번째로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있다.

본 발명에서 용어, “신경발달장애”는 일반적으로 중추신경계의 발달 지연 또는 손상과 관련된 정신장애를 포함하는 질환을 의미한다. 신경발달장애는 심리사회적인 문제보다는 뇌의 발달장애로 인해 발생하는 질환으로 알려져 있다.

상기 신경발달장애는 지적장애, 의사소통장애, 학습장애, 운동장애, 주의력결핍 행동과잉장애, 자폐 장애, 조현병, 아스퍼거 장애, 소아기 붕괴성 장애(Childhood Disintegrative Disorder), 레트 장애(Rett's Disorder), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 엔젤만증후군(Angelman Syndrome), 결절성경화증(tuberous sclerosis complex), 및 펠란-맥더미드 증후군(Phelan McDermid Syndrome) 등을 예시할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

BAC 클론의 구입

마우스 Cux2(GeneID: 23316) genomic locus 309Kbp 중 일부 영역을 포함하고 있는 Cux2 BAC RP23-403O16 및 Cux2 BAC RP23-51M11 클론을 BACPAC Resources Center (https://bacpacresources.org/)로부터 구입하였다. Cux2 BAC RP23-403O16는 chr5:121,904,052-122,114,026 (209,975 bp)에 위치하며, Cux2 BAC RP23-51M11은 chr5:121,807,711-122,058,388 (250,678 bp)에 위치한다(도 1A 참조).

본 발명에서는 Cux2 BAC RP23-403O16를 ‘BAC-1’로 약칭하였으며, Cux2 BAC RP23-51M11를 ‘BAC-2’로 약칭하였다.

BAC 형질전환 마우스 제조

모든 동물 실험은 충북대학교 기관 동물관리 및 사용위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. BAC 형질전환 마우스는 이전에 기술한 내용에서 약간의 변형을 통해 제조되었다.

간략하게는, 마우스 Cux2 BACs (RP23-403O16, RP23-51M11)에 mCherry 리포터 유전자를 포함하는 BAC 리포터 구축물을 제조하기 위하여, mCherry를 PCR을 통해 증폭하고 PL452 셔틀 벡터 내로 클로닝하였다. 이후, 300~500 bp 길이를 갖는 2개의 호몰로지 암(homology arm)을 이용하여 PL452-mCherry 셔틀 벡터를 Cux2 유전자의 시작코돈에 타켓팅하였다. BAC-말단 시퀀싱으로 210-kbp 삽입을 함유하는 클론 RP23-403O16 및 250-kbp 삽입 클론 RP23-51M11을 확인하였다. 왼쪽 호몰로지 암(homology arm)은 chr5:121,921,350-121,921,786에 해당하고, 오른쪽 호몰로지 암(homology arm)은 chr5:121,921,027-121,921,346에 해당한다. Cux2 BACs (RP23-403O16, RP23-51M11)으로 형질전환된 SW102 Escherichia coli는 42℃에서 상동재조합을 유도하고 선형화된 PL452-mCherry 셔틀 벡터로 전기천공되었다. 네오마이신 선별 후, CRE recombinase (NEB, MA, USA)를 적용하여 네오마이신 카세트를 제거하였다(도 1B 참조). 통합된 BAC 동정은 게노믹 DNA를 사용한 PCR를 통해 확인하였다.

형질전환 마우스 제조를 위해 ICR female을 대리모로 사용하기 위해 정관수술을 한 ICR male과 Pseudo-mating을 한 후 vaginal plug이 확인된 female을 선별하였다. 다량의 수정란을 얻기 위해서 Gonadotropin을 주입한 후 교배시킨 C57BL/6 female에서 1-cell 단계의 수정란을 난관에서 회수하였다. 수정란을 회수하는 과정에서 M2 배지에 Hyaluronidase를 처리하여 수정란을 둘러싸고 있는 cumulus cell들을 제거하고 세척을 한 다음, M16배지에 옮겨 4시간 동안 CO₂ 배양기에서 수정란을 안정화시켰다. 그런 다음 microinjector를 이용하여 BAC transgene(Cux2-mCherry BAC-1 또는 Cux2-mCherry BAC-2)들을 수정란에 주입하였다. 이 수정란을 다시 CO₂ 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양을 한 수정란 중에 1-cell에서 2-cell로 분화된 수정란만을 선별해 준비한 ICR 대리모의 난관에 이식하였다. 수정란 이식이 끝난 대리모에서 약 19일 경과 후에 새끼들이 태어나면 발톱이나 꼬리에서 DNA를 추출하고 genomic PCR (Cherry-Fwd: 5’-catggccatcatcaaggagt-3’, Cherry-Rev: 5’- agcttcaccttgtagatgaa-3’ PCR product-360bp)을 이용하여 원하는 형질전환 마우스인지를 확인하였다.

BAC 형질전환 마우스의 제조를 위한 프라이머

Primer name	Sequence
Cux2-L-arm	포워드	5'- ctgagctacatagcaagac -3'
	리버스	5'- cgctctgattccctgaaaga -3'
Cux2-R-arm	포워드	5'- gtagctccggtgctgaagag -3'
	리버스	5'- taacaagggccacgaagtct -3'
mCherry	포워드	5'- atgttgagcaagggcgaggag -3'
	리버스	5'- ctacttgtacagctcgtccatgc -3'

클로닝 및 돌연변이유발

Lhx2 유전자의 발현을 위해, 전장 cDNA (마우스 Lhx2, BC055741)의 PCR-증폭산물을 pCAGEN로 서브 클로닝하였다. 루시퍼라제 또는 LacZ 리포터 DNA, PCR 증폭산물(Cux2-E1 ~ E5, Cux2-E1-m1, Cux2-E1-m2)을 pGL4 (Promega, WI, USA) 또는 βgnLacZpA 벡터에 삽입하였다. 148-bp Cux2-E1-m1은 Cux2-E1 (포워드) 및 Cux2-E1-m1 (리버스) 프라이머로 증폭하였으며, 97-bp 단편은 Cux2-E1 (리버스) 및 Cux2-E1-m1 (포워드) 프라이머로 증폭하였다. 이렇게 생성된 2개의 부분적으로 상보적인 PCR 단편을 어닐링하고 Cux2-E1 (포워드) 및 Cux2-E1 (리버스) 프라이머로 추가적인 PCR의 주형으로서 사용하였다. 동일한 절차를 사용하여 Cux2-E1-m2를 생성하였다. PCR 프라이머의 모든 서열은 하기 표 2 내지 4에서 자세히 나타내었다.

Cux2 인핸서 프라이머

Primer name	Sequence
Cux2-E1	포워드	5'- aggaatgggagttgccttgc -3'
	리버스	5'- ccgtgagctcagagatcgggac -3'
Cux2-E2	포워드	5'- gcacacggagccaagacagca -3'
	리버스	5'- tggaacatcactgggaacttc -3'
Cux2-E3	포워드	5'- aagacccaacactaattcttc -3'
	리버스	5'- gattgagagcctacactcac -3'
Cux2-E4	포워드	5'- ggaaagagacagtccccttct -3'
	리버스	5'- tcactaccactgaaggaatgc -3'
Cux2-E5	포워드	5'- gtgggagggattctggtgccat -3'
	리버스	5'- tctcaaggagggagttgggggtg -3'

Cux2-E1 돌연변이 생성 프라이머

Primer name	Sequence
Cux2-E1-m1	포워드	5'- ctccccagatggttatgcacgcgtctgggatg -3'
	리버스	5'- catcccagacgcgtgcataaccatctggggag -3'
Cux2-E1-m2	포워드	5'- ctgggctggctctgggccagatggttatgtat -3'
	리버스	5'- atacataaccatctggcccagagccagcccag -3'

Lhx2 cDNA의 증폭을 위한 프라이머

Primer name	Sequence
Lhx2	포워드	5'- atgctgttccacagtctgtc -3'
	리버스	5'- ttagaaaaggttggtaagagtcgt -3'

전조직 표본 X-gal 염색 및 면역조직화학염색

전조직 표본 염색은 E14.0(Embryonic day 14.0)의 배아를 가지고 X-gal 염색을 수행하였다. 배아의 경우는 자궁에서 분리한 뒤 1x PBS에서 씻어주고, 고정용액(KPP-100 mM, GDA-0.2 %, EGTA-5 mM, MgCl2-2 mM)에서 30분간 고정하였다. 고정화가 끝나면 세포막의 투과성을 높여주기 위해 detergent가 포함된 세척용액(KPP-100 mM, Na-deoxycholate-0.01 %, NP-40-0.02 %, EGTA-5 mM, MgCl2-2 mM)에서 20분씩 3번 씻어준 뒤 β-galactosidase의 기질인 X-gal (0.5 mg/ml)이 첨가된 완충용액을 넣어서 37 oC에서 5~8시간동안 반응시킨 후 염색의 정도를 확인하였다.

면역조직화학염색은 이전에 공지된 내용을 약간 변형하여 수행되었다. 간략하게는, 뇌를 해부하고 4 % PFA에서 4℃에서 밤새 고정시키고 vibratome (Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 절편화하였다. 5% normal donkey serum (Jackson Immunoresearch Labs, PA, USA), 0.3 % TritionX-100 (Sigma), 0.2 % 리신 (Sigma), 0.2 % 글리신 (Sigma) 및 1 % 소혈청알부민을 함유하는 PBS로 절편을 블락시켰다. 절편을 블로킹 버퍼 내에 pan-neuronal marker L1 cell adhesion molecule (L1-CAM) (rat, 1:300, Millipore, USA), mCherry (rat, 1:500, ThermoFisher Scientific, IL, USA; rabbit, Abcam, Cambridge, UK), CUX1 (rabbit, 1:150, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), CTIP2 (rat, 1:250, Santa Cruz Biotechnology), FOG2 (rabbit, 1:250, Santa Cruz Biotechnology), and GFP (Chicken, 1:3000, Abcam)를 인식하는 1차 항체와 반응시키고, 2차 항체(Jackson Immunoresearch Labs)로 적정하고, 공초점현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 분석하였다.

루시퍼라아제 에세이

Neuro2a 세포를 L-글루타민 (Gibco BRL, NY, USA), 10% 소태아혈청 (Hyclone) 및 페니실린/스트렙토 마이신 (Gibco BRL)이 보충된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Hyclone, UT, USA)에서 배양하였다. 루시페라아제 리포터 구축물 및 0.5 μg의 발현 구축물은 리포펙타민 2000 (Invitrogen, CA, USA)으로 형질감염시켰다. 공동-형질감염된 Renilla 루시퍼라제 리포터 (형질 감염 당 10 ng)를 사용하여 형질 감염 효율을 정상화시켰다. 상기 분석에 사용된 대조군 TATA-box 프로모터 요소를 함유하는 루시퍼라제 리포터 구축물은 pGL4 벡터(Promega, WI, USA)에 삽입되었다. 대조군 루시퍼라제 리포터로 서브 클로닝함으로써 Cux2의 추정적 인핸서 영역에 의해 구동되는 루시퍼라아제 리포터가 생성되었다. 루시퍼라제 활성은 제조사의 지시에 따라 Dual Luciferase Assay Kit (Promega)를 사용하여 측정하였다.

통계분석

정량적 데이터는 개별 실험 결과의 평균±표준 편차(SD)로 나타내었다(n = 3).

2. 결과

Cux2-mCherry BAC 형질전환 마우스는 대뇌 피질에서 내인성 Cux2 발현을 재현함

마우스 Cux2 유전자는 염색체 5에 위치하고 있으며 크기는 187kb이다. 잠재적 인핸서를 포함하는 것으로 간주되는 모든 비 코딩(non-coding) DNA는 약 250kbps이다(도 1A 참조). 그러므로, Cux2의 대뇌 피질 발현을 조절하는 인핸서가 있는지 여부를 테스트하기 위하여, 본 실험에서는 Cux2 게노믹 DNA 250 kbp를 커버하기 위하여 RP23-403O16 및 RP23-51M11 BAC DNA 속에 mCherry 리포터 유전자를 삽입한 2개의 BAC 재조합체를 생산하였다(도 1A 및 1B 참조). mCherry의 대뇌 피질의 발현은 Cux2-mCherry-BAC-1 형질전환 마우스에서 생후일자 0에서 확인되었다(도 1C 참조), 그러나 Cux2-mCherry-BAC-2 (based on RP23-51M11)에서는 mCherry 발현의 검출되지 않았다. 이러한 결과는 Cux2 대뇌 피질 인핸서가 RP23-403O16 게놈 DNA에 존재하며, Cux2 인핸서는 RP23-403O16 및 RP23-51M11 사이의 비-중첩 영역에 위치에 있는 것을 가리킨다.

Cux2-mCherry BAC 형질전환 마우스의 특징

유전자 이식 연구는 예상하지 못한 이소성 발현(ectopic expression)의 문제를 야기한다. Cux2-mCherry-BAC-1 마우스에서 내인성 Cux2 뿐만 아니라 대뇌 피질층 II-IV의 postmitotic 뉴런에서 제한적으로 mCherry를 발현하는지 확인하기 위해, 본 발명자는 Cux2-mCherry-BAC-1 P0 뇌 단면에서 CUX1, CTIP2, FOG2와 같은 잘 알려진 대뇌 피질층 마커로 면역조직화학분석을 수행하였다. 본 실험에서는 mCherry 발현되는 뉴런이 대뇌 피질층 II-IV 마커인 CUX 1과 거의 겹치는 것을 확인하였다(도 2A 참조). 대조적으로 V층 마커는 CTIP2와 겹치지 않고, VI층 마커인 FOG2 및 FoxP2와 겹치지 않았다(도 2A 참조). 대뇌 피질층 II-IV 뉴런은 뇌량을 통해 반대 대뇌 피질의 영역으로 프로젝트(project)하기 때문에, 본 실험에서는 Cux2-mCherry-BAC-1 마우스에서 mCherry가 뇌량을 통과하는 축삭에 발현되는지 여부를 평가하였다. 본 실험에서는 pan-neuronal maker L1에 관해서 mCherry가 뇌량에서 발현되는 것을 확인하였다(도 2B 참조). 상기와 같은 결과는 Cux2-mCherry-BAC-1 마우스가 내인성 Cux2의 대뇌 피질 발현을 나타낸다.

발달되는 마우스 대뇌 피질에서 발현을 조절하는 Cux2 인핸서 동정

다음으로, RP23-403O16 게놈 DNA에서 대뇌 피질 발달에 관여하는 Cux2의 인핸서를 동정하기 위해, 우리는 먼저 RP23-403O16과 RP23-51M11 사이에 겹치지 않는 대략 41kbps의 서열의 인간과 마우스 간의 비교 게놈 분석을 수행하였다(도 1A 참조). 그 결과 5 개의 부위(E1 ~ E5)가 스크리닝되었다(도 3A 참조). 대뇌 피질의 상층 뉴런은 신경발생 동안 E13.5(embryonic day 13.5)에서 생겨나기 때문에, 본 실험에서는 5 개의 추정 인핸서 영역(도 3A 참조)을 LacZ 리포터 발현 벡터로 서브 클로닝하고 E13.5와 E14.5 사이의 마우스 배아에서 발현시켰다. 그 결과, Cux2-E1가 이식된 마우스 배아에서만 발달중인 태아의 대뇌피질 특이적으로 LacZ가 발현되는 것을 확인하였다(도 3B 참조). 또한, 후속 실험으로서 Cux2-E1 유전자 이식 마우스 배아에서 LacZ 발현이 발달중인 대뇌 피질의 내인성 Cux2 유전자 발현과 유사한지 여부를 확인하기 위하여, 형질전환 배아에서 Cux2 mRNA 발현을 비교하였다. 그 결과 Cux2-E1 유전자 이식 마우스의 LacZ 발현이 E13.5-14.5 배아의 피질판에서 Cux2 mRNA 발현과 유사하다는 것을 발견하였다(도 4 참조). 상기와 같은 결과는 본 발명의 Cux2-E1 인핸서가 Cux2의 대뇌 피질 발현을 조절하는 시스 조절 요소(발생에 필요한 유전자들의 발현을 조절하는 비코딩(non-coding) DNA 영역)라는 것을 시사한다.

Cux2-E1 인핸서는 시험관 내에서 LHX2에 의해 전사적으로 활성화됨

이전의 연구는 LIM 호메오박스 전사인자의 구성원인 Lhx2가 Cux2와 같이 대뇌 피질층 II-IV에서 발현됨을 보여주었다. 흥미롭게도, Cux2의 발현은 Nestin-Cre로 시험했을 때 Lhx2 cKO 마우스 피질에서 현저하게 감소했다. 따라서 본 발명자는 LHX2가 Cux2의 대뇌 피질의 발현을 조절하는 업스트림 조절자로 작용한다는 가설을 세웠다. 이를 입증하기 위하여, 본 발명의 5 개의 추정 인핸서(E1 ~ E5)를 루시퍼라제 벡터에 클로닝하고 Lhx2와 함께 Neuro2a 세포에 공동-형질 감염시켰다. 그 결과 Cux2-E1가 도입된 세포에서 이전 인비보(in vivo) 리포터 분석에서와 같이 Lhx2에 의해 Cux2-E1이 활성화되는 것으로 나타났다(도 5A 및 5C 참조). 또한, 본 발명에서는 Cux2-E1 서열 내에 LHX2 결합 부위가 존재하는지를 조사하였으며, 그 결과 JASPAR (http://jaspar.genereg.net)에 기초한 하나의 Lhx2 결합 부위를 찾을 수 있었다(도 5C 참조). 후속 연구로, Neuro2a 세포에서 Lhx2와 함께 LHX2 결합 부위가 결손된 돌연변이체를 루시퍼라제 벡터에 삽입함으로써 루시퍼라제 벡터를 공동 형질 감염시켰다. 그 결과, 본 발명에서 규명한 Lhx2 결합 부위를 결손시킨 Cux2-E1-m1 돌연변이체에서, Lhx2 유전자 발현이 두드러지게 감소되는 것으로 나타난 반면, 다른 부위를 결손시킨 Cux2-E1-m2 돌연변이체에서는 Lhx2 유전자 발현이 크게 감소하지 않는 것으로 나타났다(도 5B 및 5D 참조). 상기와 같은 결과는 Lhx2 및 Cux2-E1의 커플링에 의해 Cux2의 대뇌 피질 발현이 활성화될 수 있음을 시사한다.

결과적으로 본 실험은 마우스 대뇌피질 발달에서 Cux2-E1 인핸서에 의해 Cux2 피질 상층 발현이 조절된다는 것을 보여주며, 시험관내 리포터 분석의 증거는 Lhx2가 양성 트랜스 액팅 요소(유전자 발현을 조절하기 위하여 cis-acting sequences에 결합하는 단백질)일 수 있음을 시사한다.

포유류 대뇌피질 발달은 매우 정교한 과정이다. 특히 피질층 표지자 유전자의 표현은 피질의 신경생성 동안 공간적으로 엄격하게 규제된다. 현재까지, 잠재적 cis-regulatory 요소가 존재하는 비코딩 DNA가 너무 커서 식별이 어려울 정도로 크기 때문에, 이러한 과정들의 기초가 되는 유전적 규제 메커니즘에 대한 연구는 불충분하게 이루어지고 있다. 이러한 문제를 극복할 수 있는 방법의 대표적인 예로서, Fezf2의 cis-regulatory 요소는 BAC DNA를 사용하여 동정되었다. BAC DNA는 유전자의 거의 모든 비코딩 DNA를 커버할 수 있기 때문에 내인성 유전자 발현을 모사할 수 있는 강력한 도구이다. 이 기법의 또 다른 장점은 기존의 유전적 접근방식의 이소성 발현 문제를 우회할 수 있다는 것이다. 여기서 본 발명자는 Cux2 유전자의 모든 비코딩 영역을 커버할 수 있는 두 개의 BAC DNA(Cux2 BAC RP23-403O16 및 Cux2 BAC RP23-51M11)에 mCherry 리포터를 삽입하여 유전자이식 마우스를 만들었다. 이를 통해 약 250kbp에 해당하는 추정 인핸서 후보 지역을 약 41kbp로 좁혔다(도 1 참조).

최근 연구에서는 Cux2의 intronic 인핸서가 Lmx1a에 의한 cortical hem을 변형시킨다고 보고된바 있다. 상기 인핸서는, Cux2 발현은 발달 초기 단계의 cortical hem에 제한되었다. 또한, 본 발명에서 사용된 Cux2-mCherry-BAC-2 형질전환 마우스는 이전 연구에서 발견된 intronic 인핸서를 포함했음에도 불구하고 cortical hem을 제외한 피질 어디에서 발현되지 못하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 종합하면, Cux2의 피질 발현은 발달 초기에 intronic 인핸서와 Lmx1a의 상호작용에 의해 조절되고, 이어서 대뇌피질의 신경발달 동안 새롭게 동정된 본 발명의 Cux2-E1에 의해 조절된다고 사료된다.

흥미롭게도, 본 발명의 Cux2-E1의 보존 수준은 비교 게놈 분석으로 확인된 다른 4개의 추정 인핸서(E2 ~ E5)보다 낮았다(도 5A 참조). 특히 Cux2-E2와 Cux2-E4는 Chick 게놈과의 비교적 높은 수준의 보존에도 불구하고 인 비보(in vivo) 및 인 비트로(in vitro) 리포터 평가에서 유의미한 인핸서 활성을 보이지 않았다(도 5A 및 5C 참조). 이러한 결과는 피질에서 Cux2의 기능이 비 포유류에서 포유류로 진화하면서 Cux2-E1 시퀀스 생성에 의해 새롭게 획득되었음을 시사한다.

이전의 연구는 Lhx2 cKO(조건부 넉아웃) 생쥐에서 Cux2의 발현이 줄어든 것을 보여주었는데, 이는 피질 상층의 Cux2 발현과 유사하다. 뇌 발달 초기 Lhx2 기능에 대한 많은 연구가 수행되었지만, 대뇌피질 포스트미토 뉴런으로 표현되는 Lhx2의 기능은 잘 이해되지 않았다. 따라서 이전의 연구를 바탕으로, 본 발명에서는 Cux2와 같은 상위 계층에서 발현된 Lhx2가 Cux2 발현을 긍정적으로 조절하는 상위 조절자 가능성을 조사하였다. 인 비트로(in vitro)에서 Lhx2는 Cux2-E1과 선택적으로 반응하며, Cux2-E1 시퀀스에 존재하는 Lhx2 결합 시퀀스 돌연변이(E1-m1)에서 인핸서 활성 변화가 감소하는 것으로 확인되었다(도 5B 및 5D 참조). 따라서, 본 실험 결과는 Lhx2가 Cux2의 트랜스액션 요소(유전자 발현을 조절하기 위하여 cis-actiong sequences에 결합하는 단백질) 역할을 할 수 있다는 개념을 뒷받침하는 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Cux2: Cut Like Homeobox 2
LHX2: LIM Homeobox 2
BAC: Bacterial Artificial Chromosome
P0: postnatal day 0

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Enhancer Element of the Cux2 Gene and Uses Thereof <130> NPDC-81088 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of Cux2-E1 enhancer <400> 1 aggaatggga gttgccttgc accgtggagg agagatggcc gggtgccagc attgggctct 60 gctactaaga acatatgact ccatatgtcc acaggctggg ctggctctgg gccaccctcc 120 ccagatggtt atgtataatt cacgcgtctg ggatgccgtg tctgcttcac tgctcagcct 180 tcggctaaca gactgacagt cccgatctct gagctcacgg 220 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cux2-E1 forward primer <400> 2 aggaatggga gttgccttgc 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cux2-E1 reverse primer <400> 3 ccgtgagctc agagatcggg ac 22 <210> 4 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core Promoter <400> 4 gatgggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctagcct 60 gcaggtcgag gagcgcagcc ttccagaagc agagcgcggc g 101 <210> 5 <211> 2908 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacZ gene <400> 5 ccatggtatg attacggatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 60 tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 120 cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg 180 ctttgcctgg tttccggcac cagaagcggt gccggaaagc tggctggagt gcgatcttcc 240 tgaggccgat actgtcgtcg tcccctcaaa ctggcagatg cacggttacg atgcgcccat 300 ctacaccaac gtaacctatc ccattacggt caatccgccg tttgttccca cggagaatcc 360 gacgggttgt tactcgctca catttaatgt tgatgaaagc tggctacagg aaggccagac 420 gcgaattatt tttgatggcg ttaactcggc gtttcatctg tggtgcaacg ggcgctgggt 480 cggttacggc caggacagtc gtttgccgtc tgaatttgac ctgagcgcat ttttacgcgc 540 cggagaaaac cgcctcgcgg tgatggtgct gcgttggagt gacggcagtt atctggaaga 600 tcaggatatg tggcggatga gcggcatttt ccgtgacgtc tcgttgctgc ataaaccgac 660 tacacaaatc agcgatttcc atgttgccac tcgctttaat gatgatttca gccgcgctgt 720 actggaggct gaagttcaga tgtgcggcga gttgcgtgac tacctacggg taacagtttc 780 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tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 360 tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 420 tcatcaatgt atcttatcat gtct 444 <210> 7 <211> 6640 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant expression vectors <400> 7 gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120 ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240 tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300 ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360 tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420 atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540 caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600 ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660 ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720 ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780 ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840 gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900 ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960 taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020 agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140 aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200 caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260 ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320 cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 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ttggagtgac 3180 ggcagttatc tggaagatca ggatatgtgg cggatgagcg gcattttccg tgacgtctcg 3240 ttgctgcata aaccgactac acaaatcagc gatttccatg ttgccactcg ctttaatgat 3300 gatttcagcc gcgctgtact ggaggctgaa gttcagatgt gcggcgagtt gcgtgactac 3360 ctacgggtaa cagtttcttt atggcagggt gaaacgcagg tcgccagcgg caccgcgcct 3420 ttcggcggtg aaattatcga tgagcgtggt ggttatgccg atcgcgtcac actacgtctg 3480 aacgtcgaaa acccgaaact gtggagcgcc gaaatcccga atctctatcg tgcggtggtt 3540 gaactgcaca ccgccgacgg cacgctgatt gaagcagaag cctgcgatgt cggtttccgc 3600 gaggtgcgga ttgaaaatgg tctgctgctg ctgaacggca agccgttgct gattcgaggc 3660 gttaaccgtc acgagcatca tcctctgcat ggtcaggtca tggatgagca gacgatggtg 3720 caggatatcc tgctgatgaa gcagaacaac tttaacgccg tgcgctgttc gcattatccg 3780 aaccatccgc tgtggtacac gctgtgcgac cgctacggcc tgtatgtggt ggatgaagcc 3840 aatattgaaa cccacggcat ggtgccaatg aatcgtctga ccgatgatcc gcgctggcta 3900 ccggcgatga gcgaacgcgt aacgcgaatg gtgcagcgcg atcgtaatca cccgagtgtg 3960 atcatctggt cgctggggaa tgaatcaggc cacggcgcta atcacgacgc 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cttttgattt 6540 ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 6600 taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag 6640

Claims (12)

1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자로서 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자.
2. 제1항에 있어서,
   상기 서열번호 1의 134번째 내지 140번째 위치가 전사인자 결합 부위인 것을 특징으로 하는, 인핸서 인자.
3. 제1항에 있어서,
   상기 인핸서는 뇌 신경발달에 있어서 대뇌의 II-IV층 신경세포에 특이적으로 Cux2 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는, 인핸서 인자.
4. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 단리된 핵산 분자; 및
   목적 유전자를 포함하는, 대뇌 피질 특이적인 목적 유전자 발현 카세트.
5. 제4항의 발현 카세트를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
6. 제5항에 있어서,
   상기 벡터는 신경세포에서 대뇌 피질에 특이적으로 목적 유전자의 발현을 유도하기 위한, 벡터.
7. 제5항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 유기체.
8. 제5항의 재조합 발현 벡터가 도입된 뇌 신경발달 동물 모델.
9. 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 대뇌 피질에 특이적인 Cux2 유전자의 인핸서 인자 검출용 프라이머 세트.
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