CN102839189A

CN102839189A - 利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法

Info

Publication number: CN102839189A
Application number: CN2012102486335A
Authority: CN
Inventors: 樊惠英; 廖明; 陈春丽; 叶昱; 张�杰
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2012-12-26

Abstract

本发明公开了一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法，该方法包括以下步骤：抽提PCV 2病毒的DNA，扩增得到PCV 2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段；将扩增片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap；将重组质粒转化大肠杆菌ArcticExpress Escherichia coli，然后低温诱导表达，表达产物经纯化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白。本发明的方法能成功克服PCV 2 Cap蛋白在大肠埃希菌中不表达或是表达量极低的难题；本发明方法所表达的Cap蛋白主要以可溶性形式存在、纯化方法简单可行、纯化效果很好、具有很好的免疫学反应原性，可以应用于流行病学诊断方法的建立及疫苗的研究。

Description

利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用pCold-sumo表达载体高效表达猪圆环病毒2型（PCV2）的缺失核定位信号肽的Cap蛋白的方法。

背景技术

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是近年来新发现的一种重要病原微生物，该病毒被认为是断乳仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原(Allan,Meehan et al.1998)。PCV2的感染，会使动物机体产生免疫抑制，使机体的免疫抵抗力下降，造成其它病原的继发感染，从而引起更加严重的临床症状。

PCV2除了引起PMWS而外，还可导致猪皮炎/肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy sundrome，PDNA）、猪呼吸道病复合症（Porcine respiratory disease complex，PRDC）等相关疾病(Allan,McNeilly et al.2000;Kim,Chung et al.2003;Ramamoorthy and Meng2009)。PMWS自1991年首次在加拿大被发现，目前多个国家和地区存在该病的流行(Kennedy and Allan1998)。PCV2感染引起的相关疾病在我国的流行情况也十分严重(朗洪武,张广川等.2000;张朝霞,刘长明等.2008)。虽然目前市场上开始出现可以预防PCV2感染的疫苗，但是其价格高昂，大部分猪场无力使用，并且其质量参差不齐，猪场仍然无控制和消灭PCV2感染的有效措施。所以PCV2给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

PCV2基因组为单股环状负链DNA，全长为1767bp或1768bp。PCV2的基因组共编码11个开放阅读框架（open reading frames，ORFs），其中功能上重要的是ORF1和ORF2。ORF1编码与病毒DNA滚环复制相关的Rep蛋白(Mankertz,Mankertz et al.1998)。ORF2共有702个核苷酸，位于基因组互补链上，编码病毒的核衣壳蛋白，即Cap蛋白。Cap蛋白是PCV2病毒粒子唯一的结构蛋白，蛋白分子量大小约32kDa，同时也是PCV2主要的免疫原性蛋白。

Cap蛋白的N端65~87aa、113~147aa、157~183aa区域及C端4个氨基酸为病毒的主要抗原位点。其中N端69~83aa和117~131aa两个抗原位点具有针对PCV2型特异性，能被PCV2多抗所识别，N端157~183aa抗原位点为PCV1和PCV2共同具有。虽然PCV1和PCV2的Cap蛋白存在一个共同的抗原位点，但血清学实验结果显示，两种血清型的Cap蛋白之间不存在抗原交叉性，这可能是因为整个Cap蛋白掩盖了其共同的抗原位点。

Cap蛋白经体外表达后，能自我组装成类病毒样颗粒，具有PCV2病毒粒子的免疫学特性，在流行病学诊断及疫苗的研究中具有十分重要地位，因此Cap蛋白在体外的高效表达是PCV2的研究热点。

Cap蛋白的N端有一段由41个氨基酸组成的核定位信号肽（nuclear localization signal，NLS）(Liu,Tikoo et al.2001)，该NLS核酸序列含有约30%的大肠埃希菌（E.co1i）稀有密码子(Trundova and Celer2007)，严重阻碍Cap蛋白在大肠埃希菌表达系统中的有效表达(Lou,Li et al.2011)。另外，目前Cap蛋白在原核表达系统中的表达情况多以包涵体形式表达(Kong,Kong et al.2011;赵玲,朱玲等.2011)，对蛋白的纯化带来不便，其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以，目前Cap蛋白的体外有效表达、纯化是Cap蛋白应用于流行病学诊断及疫苗的研究中急需攻克的难点。

发明内容

为了克服现有方法中Cap蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷，本发明的目的在于提供一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV2缺失核定位信号肽的Cap蛋白的方法，该方法能够高效表达可溶性的猪圆环病毒2型缺失核定位信号肽的Cap蛋白，并且表达产物的免疫学反应活性更佳。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）抽提PCV2病毒的DNA；根据PCV 2 ORF2的序列设计引物，扩增得到PCV2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段；

（2）将步骤（1）扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap；

（3）将重组质粒pCold-SUMO-dCap转化大肠杆菌ArticExpress Escherichia coli，得到重组大肠杆菌Artic Exp.E.coli／pCold-Sumo-dCap；然后对重组大肠杆菌Artic Exp.E.coli／pCold-Sumo-dCap低温诱导表达，表达产物经纯化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白；

步骤（1）所述的引物，其序列为：

引物P1：5’-ATCA_GGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG-3’；

引物P2：5’-ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3’；

步骤（2）所述的将步骤（1）扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，是将扩增片段插入到pCold-SUMO质粒的BamHI与PstI克隆位点；

步骤（3）所述的重组大肠杆菌Artic Exp.E.coli/pCold-Sumo-dCap已于2012年5月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC 6080，分类命名是大肠埃希氏菌Escherichia coli；

步骤（3）所述的低温优选15℃；

步骤（3）所述的纯化是用NI-NTA树脂纯化。

本发明的机理是：由于PCV2主要抗原位点均不在Cap蛋白的NLS区域，NLS对PCV2主要起细胞核内定位作用，因而在表达Cap蛋白的过程中，本发明通过将NLS序列截除以实现Cap蛋白的有效表达。为了实现异源性蛋白在E.co1i中的可溶性表达，各种表达元件被应用在蛋白表达过程中，包括增加启动子、融合标签，优化菌体生长环境，密码子优化等。其中融合标签的作用效果较为明显，例如SUMO标签及pET表达载体中的Nus、Trx、GST标签等。本发明通过选择带有SUMO标签的pCold-sumo表达载体以实现Cap蛋白在E.co1i中的高效可溶性表达。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的方法能成功克服PCV2 Cap蛋白在大肠埃希菌中不表达或是表达量极低的难题。

2、本发明方法表达的Cap蛋白主要以可溶性形式存在。

3、本发明方法表达的Cap蛋白的纯化方法简单可行，纯化效果很好。

4、Westernblot分析结果证明，本发明方法表达的Cap蛋白具有很好的免疫学反应原性，可以应用于流行病学诊断方法的建立及疫苗的研究。

附图说明

图1是PCV2去NLS的Cap蛋白基因片段的PCR扩增凝胶电泳图；其中，M1-DNA Marker DL2000；1-PCR扩增产物（约579bp）。

图2是pCold-SUMO-dCap质粒的菌液PCR鉴定和双酶切鉴定凝胶电泳图；其中，M1-DNA Marker DL2000；M2-DNA Marker DL15000；1-菌液PCR扩增产物（约579bp）；2-BamHI、PstI双酶切pCold-SUMO-dCap产物。

图3是重组蛋白SUMO-dCap的SDS-PAGE分析图；其中，M-蛋白相对分子质量标准；1-pCold-SUMO-dCap未诱导对照；2-诱导的pCold-SUMO空载体对照；3、4-pCold-SUMO-dCap诱导后菌体裂解沉淀；5-pCold-SUMO-dCap诱导后的菌体裂解上清；6-pCold-SUMO-dCap诱导后的菌体蛋白；7-纯化后的SUMO-dCap融合蛋白。

图4是重组蛋白SUMO-dCap的Western Blot鉴定结果图；其中，M-蛋白相对分子质量标准；1-诱导的pCold-SUMO空载体上清；2-纯化的SUMO-dORF2融合蛋白；3-纯化的dORF2可溶性蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

一、重组表达载体pCold-sumo-dCap的构建

1、PCV2的DNA的提取

将PCV2毒株接种于无PCV污染的PK15细胞，于37℃的CO₂培养箱培养，收集并处理细胞，根据OMEGA公司的Blood DNA Kit试剂盒说明书抽提PCV2的DNA，作为模板DNA。

2、PCR引物设计

根据PCV2 ORF2序列设计一对特异性引物，引物序列如下：

引物P1：5’-ATCAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG-3’；

引物P2：5’-ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3’；

扩增去核定位信号肽（NLS）的ORF2基因（579bp）。其中上游引物包含BamHI位点，下游引物包含PstI位点。引物由Invitrogen公司合成。

3、去NLS的ORF2基因的扩增

PCR反应体系为50μL，其中模板DNA 1.5μL，引物P1、P2（20pmol／L）各1μL，dNTP s(2.5mmol／L)4μL，10×Ex Taq^TM Buffer 5μL，Ex Taq^TM DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，去离子水37μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min；进入PCR循环，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸40s，进行30个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果（图1），并对PCR 产物进行胶回收纯化。

4、重组质粒pCold-SUMO-dCap构建

对纯化的PCR产物和pCold-SUMO质粒分别进行BamHI、PstI双酶切，回收纯化酶切产物。用T4DNA Ligase酶连接去NLS的ORF2基因和pCold-SUMO质粒，将连接产物转化DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定、双酶切鉴定、DNA测序鉴定筛选阳性重组质粒，获得pCold-SUMO-dCap质粒（图2）。

二、融合蛋白SUMO-dCap的诱导表达与纯化

将阳性重组质粒pCold-SUMO-dCap转入表达宿主菌大肠杆菌ArcticExpress Escherichia coli（购自Invitrogen公司）感受态细胞，挑选生长良好的单菌落，接入含100mg／L氨苄青霉素的2mL LB液体培养基，37℃振荡培养10h，菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的培养物（即重组大肠杆菌Artic Exp.E.coli／pCold-Sumo-dCap）按1:100接种于含100mg／L氨苄青霉素的100mL LB液体培养基，37℃ 180r／min振荡培养至OD_600nm约0.6，取出培养物冷却至15℃，再静置30min，加入适量IPTG至终浓度为0.4mM，15℃180r/min振荡培养20~24h。

离心收集菌体沉淀，加5mL的菌体重悬缓冲液（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl）重悬菌体沉淀，冰上静置30min，超声破碎菌体，超声破碎后产物12000r/min离心20min，收集上清。将上清进行Ni-NTA树脂亲和柱层析，加入30mL杂蛋白洗脱缓冲液A（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，20mM咪唑）洗去部分杂蛋白，再加入4mL杂蛋白洗脱缓冲液B（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，80mM咪唑）洗去其它杂蛋白，最后用3mL蛋白洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，200mM Imidazole咪唑）洗脱得到SUMO-dCap融合蛋白，质量浓度约1.2mg/mL。

结果显示构建成功的pCold-SUMO-dCap质粒能够高效表达去NLS的Cap蛋白，并且可溶性的SUMO-dCap融合蛋白表达量高，经过NI-NTA树脂亲和柱层析后纯化后，可以得到纯度较高的SUMO-dCap融合蛋白（图3）。Western blot分析表明SUMO-dCap融合蛋白具有很好的反应原性（图4）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（3）将重组质粒pCold-SUMO-dCap转化大肠杆菌ArticExpress Escherichiacoli，得到重组大肠杆菌Artic Exp.E.coli／pCold-Sumo-dCap；然后对重组大肠杆菌Artic Exp.E.coli／pCold-Sumo-dCap低温诱导表达，表达产物经纯化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白；

步骤（1）所述的引物，其序列为：

引物P1：5’-ATCAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG-3’；

引物P2：5’-ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3’。

2.根据权利要求1所述的利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法，其特征在于：步骤（2）所述的将步骤（1）扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，是将扩增片段插入到pCold-SUMO质粒的BamHI与PstI克隆位点。

3.根据权利要求1所述的利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法，其特征在于：步骤（3）所述的低温为15℃。

4.根据权利要求1所述的利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法，其特征在于：步骤（3）所述的纯化是用NI-NTA树脂纯化。