KR101750293B1 - 이산화탄소로부터의 아세톤 생성능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는, 향상된 아세톤 생성능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주, 이를 이용한 아세톤의 생산방법 및 이산화탄소 제거방법이 개시된다. 일 측면에 있어서, 본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주는, 이산화탄소를 탄소원으로 사용하여, 높은 선택도로 아세톤을 생산할 수 있다. 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주는 대기 중에 존재하는 이산화탄소를 탄소원으로 사용하여, 고부가 가치의 아세톤을 생산할 수 있어 경제적이고, 추가적인 촉매반응을 요구하지 않으므로 간편하다. 또한, 미생물을 사용하여, 대기 중의 이산화탄소를 제거 또는 저감하는데 활용될 수 있으므로, 친환경적이다.
Description
본 명세서에는 향상된 아세톤 생성능을 갖는 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주, 이를 이용한 아세톤의 생산방법 및 이산화탄소 제거방법이 개시된다.
최근 전 세계적으로 화석연료의 자원고갈 및 환경오염에 대한 우려가 증가하고 있으며, 유가의 변동과 기후변화협약 발효 등으로 에너지 문제가 커다란 사회적 이슈로 부각되고 있다. 특히, 산업 전 분야에 걸쳐서 사용되는 석유의 고갈이 예상되면서 에너지 문제는 국가 안보 및 생존에 위협요인이 되고 있다. 따라서, 화석연료를 대체할 수 있는 바이오 연료에 대한 관심이 꾸준히 높아지고 있는 실정이다.
바이오연료(Biofuel)는 바이오매스(Biomass)에서 얻는 연료로, 살아 있는 유기체뿐 아니라 동물의 배설물 등 대사활동에서 나오는 부산물을 모두 포함하며, 화석연료와는 다른 신재생에너지를 의미한다. 최근 우리나라도, 생명공학의 발달과 맞물려 미생물을 이용한 바이오연료 개발에 대한 연구가 왕성해지고 있으며, 바이오에탄올, 바이오부탄올 및 바이오디젤 등 영역을 넓혀나가려는 시도가 증가하고 있다.
Lee TS, Krupa RA, Zhang F, Hajimorad M, Holtz WJ, Prasad N, Lee SK, Keasling JD (2011b) BglBrick vectors and datasheets: a synthetic biology platform for gene expression. J Biol Eng 5:12
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 아세톤 생성능이 향상된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 시네코코커스 일롱게투스 균주를 이용하여, 앙세톤을 대량 생산하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 시네코코커스 일롱게투스 균주를 이용하여, 이산화탄소를 제거하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 30℃ 및 5%의 이산화탄소 공급 조건에서, 균주가 생산하는 생산물의 총생산량 중 아세톤 생산량의 몰(mole)비율로 정의되는 아세톤 선택도가 0.8 이상인, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 아세톤 생산방법이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이산화탄소 제거방법이다.
일 측면에 있어서, 본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주는, 이산화탄소를 탄소원으로 사용하여, 높은 선택도로 아세톤을 생산할 수 있다. 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주는 대기 중에 존재하는 이산화탄소를 탄소원으로 사용하여, 고부가 가치의 아세톤을 생산할 수 있어 경제적이고, 추가적인 촉매반응을 요구하지 않으므로 간편하다. 또한, 미생물을 사용하여, 대기 중의 이산화탄소를 제거 또는 저감하는데 활용될 수 있으므로, 친환경적이다.
도 1은 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 아세톤 대사 경로를 보이는 도이다.
도 2는 pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 2a), 아세톤 생산량(도 2b), 아세테이트 발생량(도 2c)를 보이는 도이다.
도 3은 pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 3a), 아세톤 생산량(도 3b), 아세테이트 발생량(도 3c)를 보이는 도이다.
도 4는 pSe1Bb1s-nphT7-atoDA-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 4a), 아세톤 생산량(도 4b), 아세테이트 발생량(도 4c)를 보이는 도이다.
도 5는 pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 5a), 아세톤 생산량(도 5b), 아세테이트 발생량(도 5c)를 보이는 도이다.
도 6은 atoB 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 7은 nphT7 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 8은 atoDA 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 9는 ctfAB 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 10은 adc 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 11은 차례대로 pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
도 12는 차례대로 pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
도 13은 차례대로 pSe1Bb1s-nphT7-atoDA-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
도 14는 차례대로 pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
도 2는 pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 2a), 아세톤 생산량(도 2b), 아세테이트 발생량(도 2c)를 보이는 도이다.
도 3은 pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 3a), 아세톤 생산량(도 3b), 아세테이트 발생량(도 3c)를 보이는 도이다.
도 4는 pSe1Bb1s-nphT7-atoDA-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 4a), 아세톤 생산량(도 4b), 아세테이트 발생량(도 4c)를 보이는 도이다.
도 5는 pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB-adc 벡터로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 광학밀도(도 5a), 아세톤 생산량(도 5b), 아세테이트 발생량(도 5c)를 보이는 도이다.
도 6은 atoB 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 7은 nphT7 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 8은 atoDA 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 9는 ctfAB 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 10은 adc 유래 유전자 서열을 보이는 도이다.
도 11은 차례대로 pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
도 12는 차례대로 pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
도 13은 차례대로 pSe1Bb1s-nphT7-atoDA-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
도 14는 차례대로 pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB-adc 벡터의 서열을 보이는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus)는, 시아노박테리아(cyanobacteeria)의 일종이다. 원핵세포인 시아노박테리아는 유전자 조작이 용이하여, 대사경로를 바꾸거나 대사물질을 인위적으로 조절하는데 유리하다. 본 발명자들은 시아노박테리아의 이러한 특성과 합성생물학/대사공학적 기법을 이용하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
일 측면에서, 본 발명은, 30℃ 및 5%의 이산화탄소 공급 조건에서, 아세톤 선택도가 0.8 이상인, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주이다.
본 명세서에서 아세톤 선택도란, 시네코코커스 일롱게투스 균주가 생산하는 생산물의 총생산량 중 아세톤 생산량의 몰비율로 정의된다.
구체적으로, 아세톤 선택도는 0.7이상, 0.75이상, 0.8이상, 0.81이상, 0.83이상, 0.85이상, 0.87이상, 0.89이상, 0.91이상, 0.93이상, 0.95이상, 0.97이상, 0.98이상, 0.99이상 또는 1 일 수 있다. 또한, 상기 온도는, 예컨대 10 내지 50℃, 10 내지 45℃, 10 내지 40℃, 10 내지 35℃, 15 내지 50℃, 20 내지 45℃, 25 내지 40℃, 또는 30 내지 40℃일 수 있다. 또한, 상기 이산화탄소 농도는 1 내지 10%일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 0.01% 이상, 0.05% 이상, 0.07% 이상, 0.09%이상, 1%이상, 2%이상, 4%이상, 6% 이상, 8%이상, 9%이상, 11%이상, 13%이상, 15% 이상, 17%이상, 20%이상, 25%이상, 30%이상, 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70%이상, 80%이상 또는 90%이상일 수 있으며, 91%이하, 85% 이하, 80% 이하, 76% 이하, 71% 이하, 66% 이하, 61% 이하, 56% 이하, 51% 이하, 46% 이하, 41% 이하, 36% 이하, 31% 이하, 25% 이하, 19% 이하, 15% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 9% 이하, 7% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하일 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주는, 아세틸코에이 전이효소(acetyl-Co A transferase) 유전자 및 아세틸코에이 합성효소(acetyl-Co A syntherase) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상; 아세토아세틸코에이 전이효소(acetoacetyl-Co A transferase) 유전자; 및 아세토아세테이트 데카르복실라제(acetoacetate decarboxylase) 유전자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 아세틸 코에이 전이효소(acetyl-Co A transferase) 유전자는, 아세틸 코에이 전이효소를 코딩하는 유전자를 의미하며, 예컨대, 대장균 K-12 MG1655 균주의 아세틸코에이 아세틸트렌스퍼라제 B 유전자(acetyl-CoA acetyltransferase B 유전자, atoB)로부터 유래된 것일 수 있다.
본 명세서에서, 아세틸코에이 합성효소(acetyl-Co A syntherase) 유전자는, 아세틸 코에이합성효소를 코딩하는 유전자를 의미하며, 예컨대, 스트렙토미세스(Streptomyces sp.) 균주의 아세토아세틸 코에이 합성효소 NphT7 유전자(acetoacetyl CoA synthase NphT7 유전자, nphT7)로부터 유래된 것일 수 있다.
또한, 본 명세서에서, 아세토아세틸코에이 전이효소(acetoacetyl-Co A transferase)유전자는, 아세토아세틸코에이 전이효소를 코딩하는 유전자를 의미하며, 예컨대, 대장균 K-12 MG1655 균주의 아실 코에이:아세테이트/3-케토산 코에이 트렌스퍼라제 알파 및 베타 서브유닛 유전자(acyl CoA:acetate/3-ketoacid CoA transferase 알파 및 베타 서브유닛 유전자, atoDA)로부터 유래된 것일 수 있다. 또는, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 균주의 코에이 트렌스퍼라제 AB 유전자(CoA transferase AB 유전자, ctfAB)로부터 유래된 것일 수 있다.
또한, 본 명세서에서, 아세토아세테이트 데카르복실라제(acetoacetate decarboxylase) 유전자는, 아세토아세테이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 유전자를 의미하며, 예컨대, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 균주의 아르기닌 데카르복실라제 유전자(arginine decarboxylase 유전자, adc)로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 관점인, 시네코코커스 일롱게투스 균주에 있어서, 상기 아세틸코에이 전이효소 유전자는 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있고, 상기 아세틸코에이 합성효소 유전자는 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있으며, 상기 아세토아세틸코에이 전이효소 유전자는, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열을 포함할 수 있고, 상기 아세토아세테이트 데카르복실라제 유전자는 서열번호 5의 서열을 포함할 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 본 명세서에서, 서열번호 1은, atoB 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 아세틸코에이 전이효소 유전자이고, 서열번호 2는, nphT7 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 아세틸코에이 합성효소 유전자이다. 또한, 서열번호 3은, atoDA 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 아세토아세틸코에이 전이효소 유전자이고, 서열번호 4는, ctfAB 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 아세토아세틸코에이 전이효소 유전자이다. 아울러, 서열번호 5는, adc 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 아세토아세테이트 데카르복실라제 유전자이다.
상기와 같은 관점에서, 상기 시네코코커스 일롱게투스 균주는, atoB 유전자 또는 nphT7 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자; atoDA 유전자 또는 ctfAB 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자; 및 adc 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 모든 벡터 내의 유전자들은 서로 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하다는 것의 의미는 타겟 유전자가 정상적으로 발현될 수 있음을 의미하는 것이다.
또한, 상기 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주는, 벡터가 모균주인 시네코코커스 일롱게투스 PCC7942(ATCC® 33912TM)에 형질전환된 것일 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 벡터는, pUC 복제 개시점; 복제 개시점 전 후에 위치하는 뉴트럴 사이트(neutral site); 선별 마커로서 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자; lac I 리프레서, tetR 리프레서 및 AraC로 이루어진 군으로부터 선택된 리프레서; trc 프로모터, tetA 프로모터 또는 변형된 tetA 프로모터, BAD 프로모터, 및 cbbL 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터; 및 제한효소 부위인 Bg1II 부위, BamHI 부위, EcoRI 부위 및 XhoI 부위를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 뉴트럴 사이트(neutral site)는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) PCC 7942로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 뉴트럴 사이트는, NSIa 및 NSIb을 포함할 수 있다. 상기 벡터는, 뉴트럴 사이트를 통해 시네코코커스 일롱게투스 PCC 7942의 지놈 상에 삽입될 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 벡터는 타겟 유전자를 포함할 수 있으며, 타겟 유전자는 예컨대, atoB 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자(본명세서에서, atoB 유래 유전자), nphT7 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자(본명세서에서, nphT7 유래 유전자), atoDA 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자(본명세서에서, atoDA 유래 유전자), ctfAB 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자(본명세서에서, ctfAB 유래 유전자) 및 adc 유전자로부터 유래된 서열을 포함하는 유전자(본명세서에서, adc 유래 유전자)일 수 있다. 상기 유전자들은 각각 다른 벡터로부터 유래된 것일 수 있고, 상기 각각 다른 벡터는 타겟 유전자 양측에 BglII 부위 및 BamHI 부위를 가질 수 있으며, 제한 효소 처리에 의해 한 벡터의 BglII 부위와 다른 벡터의 BamHI 부위의 상보적 결합이 일어나 2개의 타겟 유전자가 하나의 벡터에 포함된 것일 수 있다. 예컨대, SyneBrick 벡터인 pSe1Bb1s-GFP의 GFP 부분을 EcoRI-BamHI 제한효소를 이용하여 제거한 후 그 자리에 합성 주문한 atoB 유래 유전자 또는 nphT7 유래 유전자의 DNA 시퀀스를 삽입하였다. 이렇게 완성된 pSe1Bb1s-atoB 유래 유전자, pSe1Bb1s-nphT7 유래 유전자 벡터에 BamHI-XhoI 제한효소 처리 후 BglII-XhoI 제한효소로 처리된 atoDA 유래 유전자 또는 ctfAB 유래 유전자의 DNA 시퀀스를 삽입하였다. 이로써 ‘atoB 유래 유전자-atoDA 유래 유전자’ 포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-atoB-atoDA 벡터라고 한다), ‘atoB 유래 유전자-ctfAB 유래 유전자’ 포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-atoB-ctfAB 벡터라고 한다), ‘nphT7 유래 유전자-atoDA 유래 유전자’ 포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-nphT7-atoDA 벡터라고 한다), ‘nphT7 유래 유전자-ctfAB 유래 유전자’ 포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB 벡터라고 한다)의 4가지 벡터가 완성되었고, 마지막으로 역시 BamHI-XhoI 처리 후 BglII-XhoI 제한효소로 처리된 adc 유래 유전자의 DNA 시퀀스를 삽입하였다: 그 결과, ‘atoB 유래 유전자-atoDA 유래 유전자-adc 유래 유전자’포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc 벡터라고 한다), ‘atoB 유래 유전자-ctfAB 유래 유전자-adc 유래 유전자’포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc 벡터라고 한다), ‘nphT7 유래 유전자-atoDA 유래 유전자-adc 유래 유전자’포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-nphT7-atoDA-adc 벡터라고 한다) 및 ‘nphT7 유래 유전자-ctfAB 유래 유전자-adc 유래 유전자’포함 벡터(본 명세서에서, pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB-adc 벡터라고 한다)의 4가지 벡터를 얻을 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 BglII 부위 및 BamHI 부위는, 상기 타겟 유전자 양측에 위치하는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 타겟 유전자와 제한효소 부위의 순서는, EcoRI -> BglII 부위 -> 타겟 유전자 -> BamHI 부위 -> XholI 부위일 수 있다.
본 발명의 일 관점인, 시네코코커스 일롱게투스 균주에 있어서, 상기 벡터는, 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나의 서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로 서열번호 6은, atoB 유래 유전자-atoDA 유래 유전자-adc 유래 유전자를 포함하는 벡터이고, 서열번호 7은, atoB 유래 유전자-ctfAB 유래 유전자-adc 유래 유전자를 포함하는 벡터이고, 서열번호 8은, nphT7 유래 유전자-atoDA 유래 유전자-adc 유래 유전자를 포함하는 벡터이며, 서열번호 9는, nphT7 유래 유전자-ctfAB 유래 유전자-adc 유래 유전자를 포함하는 벡터이다.
본 발명의 일 관점인, 시네코코커스 일롱게투스 균주에 있어서, 상기 균주는, 기탁번호 KCTC12758BP, 기탁번호 KCTC12759BP, 기탁번호 KCTC 12760BP 또는 기탁번호 KCTC12761BP일 수 있다. 구체적으로, 상기 기탁번호 KCTC12758BP 균주는, 서열번호 6의 벡터로 형질전환된 것이고, 기탁번호 KCTC12759BP 균주는, 서열번호 7의 벡터로 형질전환된 것이며, 기탁번호 KCTC 12760BP 균주는, 서열번호 8의 벡터로 형질전환된 것이고, 기탁번호 KCTC12761BP 균주는, 서열번호 9의 벡터로 형질전환된 것이다.
또한, 상기 균주는, 이산화탄소를 흡수하여 고정하는 것일 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 배양하는 단계를 포함하는 아세톤 생산방법이다.
상기와 같은 관점에서, 상기 아세톤 생산방법은, 균주에 이산화탄소를 공급하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 아세트산 칼륨(potassium acetate)을 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주는, 이산화탄소 외에 아세트산 칼륨을 더 공급받을 경우, 생산하는 아세톤의 양이 더 많다. 또한, 상기 아세트산칼륨은 1 내지 30mM 공급될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 0.5 내지 40nM, 1 내지 30mM, 3 내지 25mM, 5 내지 20mM, 8 내지 15mM 또는 9 내지 13mM일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이산화탄소 제거방법이다. 상기 균주는 이산화탄소를 탄소원으로 사용하므로, 대기 중의 이산화탄소를 제거 또는 저감하는데 유용할 수 있다.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시에는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 아세톤 생산 전략의 수립
아세톤 생성능이 뛰어난 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 제작하기 위하여, 도 1과 같은 대사경로를 디자인하였다.
[실시예 2] 벡터의 제작
먼저 pBbE1c-RFP(Lee TS, Krupa RA, Zhang F, Hajimorad M, Holtz WJ, Prasad N, Lee SK, Keasling JD (2011b) BglBrick vectors and datasheets: a synthetic biology platform for gene expression. J Biol Eng 5:12)와 Invitrogen의 pSyn_1를 사용하였다. 구체적으로, pBbE1c-RFP의 lacI, ptrc, RFP 부분을 PCR하였고, pSyn_1 의 스펙티노마이신 저항성 유전자(Spectinomycin resistance gene), NSIa, NS1b, pUC 복제 개시점(origin) 부분을 PCR 하였다. 이후 CPEC 클로닝 방법(Quan J, Tian J (2009) Circular Polymerase Extension Cloning of Complex Gene Libraries and Pathways. PLoS ONE 4(7): e6441. doi:10.1371/journal.pone.0006441) (CPEC Ref. http://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html)을 통해 이 두 조각의 PCR 산물을 합쳐 새로운 벡터를 완성하였다. 이 벡터의 RFP 부분을 GFP로 대체하기 위해 EcoRI/XhoI 제한효소를 이용하여 RFP를 제외시킨 후 또 다른 BglBrick 벡터인 pBbB5k-GFP(Lee TS, Krupa RA, Zhang F, Hajimorad M, Holtz WJ, Prasad N, Lee SK, Keasling JD (2011b) BglBrick vectors and datasheets: a synthetic biology platform for gene expression. J Biol Eng 5:12)의 GFP 부분을 EcoRI/XhoI 제한효소와 라이게이즈 효소를 이용해 삽입하였다. 상기 벡터를 E. coli HIT-DH5α(Cat# RH617-J80, RBC Bioscience)에 형질전환 한 후에 mini-prep을 하여 벡터를 추출하였다. 조립된 벡터는 PCR을 통해 만들어진 것이므로 돌연변이가 일어날 확률이 있기 때문에 전체 서열을 확인하기 위해 플라스미드 시퀀싱(plasmid sequencing)을 통해 서열을 확인하였다. 이렇게 DNA 서열이 확인된 벡터를 pSe1Bb1s-GFP로 명명하였다. 이후, GFP 부분을 EcoRI-BamHI 제한효소를 이용하여 제거한 후 그 자리에 합성 주문한 atoB 유래 유전자 또는 nphT7 유래 유전자의 DNA 시퀀스를 삽입하였다. 이렇게 완성된 pSe1Bb1s-atoB 유래 유전자, pSe1Bb1s-nphT7 유래 유전자 벡터는 BamHI-XhoI 제한효소 처리 후 BglII-XhoI 제한효소로 처리된 atoDA 유래 유전자 또는 ctfAB 유래 유전자의 DNA 시퀀스를 삽입하였다. atoB 유래 유전자는 대장균 K-12 MG1655 균주로부터 유래된 것이고, nphT7 유래 유전자는 스트렙토미세스(Streptomyces sp.) 균주로부터 유래된 것이며, atoDA 유래 유전자는 대장균 K-12 MG1655 균주로부터 유래된 것이고, ctfAB 유래 유전자와 adc 유래 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 균주로부터 유래된 것이었다. 상기 벡터에 삽입되는 유전자들은, 모두 GenescriptR에서 주문 제작하였다.
이로써 pSe1Bb1s-atoB-atoDA 벡터, pSe1Bb1s-atoB-ctfAB 벡터, pSe1Bb1s-nphT7-atoDA 벡터, pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB 벡터의 4가지 벡터가 완성되었고 마지막으로 역시 BamHI-XhoI 처리 후 BglII-XhoI 제한효소로 처리된 adc 유전자의 DNA 시퀀스를 삽입하여 최종적으로 4가지 아세톤 생산 벡터를 완성하였다: pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc 벡터(서열번호 6), pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc 벡터 (서열번호 7), pSe1Bb1s-nphT7-atoDA-adc 벡터 (서열번호 8), pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB-adc 벡터 (서열번호 9).
[실시예 3] 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 제작
실시예 2의 서열번호 6 내지 9의 벡터들은 시네코코커스 일롱게투스(S.elongatus) PCC7942 야생형 균주(PCC7942(ATCC® 33912TM)의 뉴트랄 사이트-I(Neutral Site-I)에 자연형질전환(Natural transformation, Golden et al. 1987, Grigorieva and Shestakov 1982)을 이용하여 각각 삽입되었다. 형질전환 여부는 PCR(5’->3’ 프라이머 시퀀스: Forward(서열번호 10)-CTGATTGTTCTAGGCGCTG / Reverse(서열번호 11)-TTTGGCAATCTGAAGACCCG)을 통해 확인하였다.
[실시예 4] 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 균주의 아세톤 생산능 확인
실시예 3의 형질전환된 균주를 이산화탄소 환경에서 배양하여 아세톤이 생산되는지 확인하였다. 구체적인 배양 조건은 100 ml 병에 10 mM MOPS(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid) 버퍼가 포함된 BG-11 배지 100 ml을 넣고 제작한 아세톤 생산 균주를 처음 배양시 광학밀도(O.D) 0.6으로 희석하여 넣어주었다. 또한 스펙티노마이신(Spectinomycin) 10 ug/ml와 10 mM 아세트산칼륨(Potassium acetate)를 넣어준 후 정치배양기 30 ℃, 100 uE·m-2·s-1, 5 % CO2를 연속하는 공급하는 조건 하에 배양하였다. 배양 시작 1일 후에는 유전자 발현에 필요한 인듀서 0.1 mM IPTG를 넣어주었고 배양 후 5일이 지날 때까지 세포의 730nm 파장에서의 광학밀도(Optical density)와 아세테이트(acetate)발생량, pH 및 아세톤 생산량을 측정하였다.
pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc 벡터(서열번호 6)로 형질전환된 균주는 배양시간동안 최대 3.6 mg/L의 아세톤을 생산하였다(도 2b). pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc 벡터 (서열번호 7)로 형질전환된 균주는 배양시간동안 최대 134 mg/L 아세톤을 생산하였다(도 3b). pSe1Bb1s-nphT7-atoDA-adc 벡터(서열번호 8)로 형질전환된 균주는 최대 152mg/L 아세톤을 생산하였고(도 4b), pSe1Bb1s-nphT7-ctfAB-adc 벡터(서열번호 9)로 형질전환된 균주는 최대 116 mg/L 아세톤을 생산하였다(도 5b).
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> TRANSFORMED SYNECHOCOCCUS ELONGATUS HAVING CAPABILITY OF
PRODUCING ACETONE
<130> 15P042IND
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atoB gene
<400> 1
atgaaaaact gcgtgatcgt gagcgccgtg cgcaccgcca tcggcagctt taacggcagc 60
ctggccagca ccagcgccat cgatctgggc gccaccgtga tcaaagccgc catcgaacgc 120
gccaaaatcg atagccagca cgtggatgaa gtgatcatgg gcaacgtgct ccaggccggc 180
ctgggccaga accccgcccg ccaggccctg ctgaaaagcg gcctggccga aaccgtgtgc 240
ggctttaccg tgaacaaagt gtgcggcagc ggcctgaaaa gcgtggccct ggccgcccag 300
gccatccagg ccggccaggc ccagagcatc gtggccggcg gcatggaaaa catgagcctg 360
gccccctacc tgctggatgc caaagcccgc agcggctacc gcctgggcga tggccaggtg 420
tacgatgtga tcctgcgcga tggcctgatg tgcgccaccc acggctacca catgggcatc 480
accgccgaaa acgtggccaa agaatacggc atcacccgcg aaatgcagga tgaactggcc 540
ctgcacagcc agcgcaaagc cgccgccgcc atcgaaagcg gcgcctttac cgccgaaatc 600
gtgcccgtga acgtggtgac ccgcaaaaaa acctttgtgt ttagccagga tgaatttccc 660
aaagccaaca gcaccgccga agccctgggc gccctgcgcc ccgcctttga taaagccggc 720
accgtgaccg ccggcaacgc cagcggcatc aacgatggcg ccgccgccct ggtgatcatg 780
gaagaaagcg ccgccctggc cgccggcctg acccccctgg cccgcatcaa aagctacgcc 840
agcggcggcg tgccccccgc cctgatgggc atgggccccg tgcccgccac ccagaaagcc 900
ctccagctgg ccggcctcca gctggccgat atcgatctga tcgaagccaa cgaagccttt 960
gccgcccagt ttctggccgt gggcaaaaac ctgggctttg atagcgaaaa agtgaacgtg 1020
aacggcggcg ccatcgccct gggccacccc atcggcgcca gcggcgcccg catcctggtg 1080
accctgctgc acgccatgca ggcccgcgat aaaaccctgg gcctggccac cctgtgcatc 1140
ggcggcggcc agggcatcgc catggtgatc gaacgcctga actag 1185
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nphT7 gene
<400> 2
atgaccgatg tgcgctttcg catcatcggc accggcgcct acgtgcccga acgcatcgtg 60
agcaacgatg aagtgggcgc ccccgccggc gtggatgatg attggatcac ccgcaaaacc 120
ggcatccgcc agcgccgctg ggccgccgat gatcaggcca ccagcgatct ggccaccgcc 180
gccggccgcg ccgccctgaa agccgccggc atcacccccg aacagctgac cgtgatcgcc 240
gtggccacca gcacccccga tcgcccccag ccccccaccg ccgcctacgt gcagcaccac 300
ctgggcgcca ccggcaccgc cgcctttgat gtgaacgccg tgtgcagcgg caccgtgttt 360
gccctgagca gcgtggccgg caccctggtg taccgcggcg gctacgccct ggtgatcggc 420
gccgatctgt acagccgcat cctgaacccc gccgatcgca aaaccgtggt gctgtttggc 480
gatggcgccg gcgccatggt gctgggcccc accagcaccg gcaccggccc catcgtgcgc 540
cgcgtggccc tgcacacctt tggcggcctg accgatctga tccgcgtgcc cgccggcggc 600
agccgccagc ccctggatac cgatggcctg gatgccggcc tgcagtactt tgccatggat 660
ggccgcgaag tgcgccgctt tgtgaccgaa cacctgcccc agctgatcaa aggctttctg 720
cacgaagccg gcgtggatgc cgccgatatc agccactttg tgccccacca ggccaacggc 780
gtgatgctgg atgaagtgtt tggcgaactg cacctgcccc gcgccaccat gcaccgcacc 840
gtggaaacct acggcaacac cggcgccgcc agcatcccca tcaccatgga tgccgccgtg 900
cgcgccggca gctttcgccc cggcgaactg gtgctgctgg ccggctttgg cggcggcatg 960
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<211> 1333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atoDA gene
<400> 3
atgaaaacca aactgatgac cctccaggat gccaccggct tttttcgcga tggcatgacc 60
atcatggtgg gcggctttat gggcatcggc acccccagcc gcctggtgga agccctgctg 120
gaaagcggcg tgcgcgatct gaccctgatc gccaacgata ccgcctttgt ggataccggc 180
atcggccccc tgatcgtgaa cggccgcgtg cgcaaagtga tcgccagcca catcggcacc 240
aaccccgaaa ccggccgccg catgatcagc ggcgaaatgg atgtggtgct ggtgccccag 300
ggcaccctga tcgaacagat ccgctgcggc ggcgccggcc tgggcggctt tctgaccccc 360
accggcgtgg gcaccgtggt ggaagaaggc aaacagaccc tgaccctgga tggcaaaacc 420
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accctgggca acctgaccta ccagctgagc gcccgcaact ttaaccccct gatcgccctg 540
gccgccgata tcaccctggt ggaacccgat gaactggtgg aaaccggcga actccagccc 600
gatcacatcg tgacccccgg cgccgtgatc gatcacatca tcgtgagcca ggaaagcaaa 660
tagttaaaga ggagaatact agatggatgc caaacagcgc atcgcccgcc gcgtggccca 720
ggaactgcgc gatggcgata tcgtgaacct gggcatcggc ctgcccacca tggtggccaa 780
ctacctgccc gaaggcatcc acatcaccct ccagagcgaa aacggctttc tgggcctggg 840
ccccgtgacc accgcccacc ccgatctggt gaacgccggc ggccagccct gcggcgtgct 900
gcccggcgcc gccatgtttg atagcgccat gagctttgcc ctgatccgcg gcggccacat 960
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ctgcaccatg cccctgaccg cccagcacgc cgtgcacatg ctggtgaccg aactggccgt 1200
gtttcgcttt atcgatggca aaatgtggct gaccgaaatc gccgatggct gcgatctggc 1260
caccgtgcgc gccaaaaccg aagcccgctt tgaagtggcc gccgatctga acacccagcg 1320
cggcgatctg tag 1333
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ctfAB gene
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atcatgatcg gcggctttct gaactgcggc acccccacca aactgatcga ttttctggtg 120
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caaaaacttt aaaatcacct ttcagagcga aaacggcatc gtgggcatgg gcgccagccc 840
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gcccgatggc accttttttg atagcagcgt gagctttagc ctgatccgcg gcggccacgt 960
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<223> adc gene
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gaaatcatgg ccatgcacga taccagcggc ctgggctgct acaccgaaag cggccaggcc 240
atccccgtga gctgcaacgg cgtgaaaggc gattacctgc acatgatgta cctggataac 300
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aaactgtttg tggatagcga taccctggtg ggcaccctgg attacggcaa actgcgcgtg 420
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gattacctga aatag 735
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSe1Bb1s-atoB-atoDA-adc vector
<400> 6
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 60
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 120
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 180
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 240
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 300
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 360
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 420
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 480
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 540
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 600
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 660
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 720
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<211> 8452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSe1Bb1s-atoB-ctfAB-adc vector
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cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 3060
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 3120
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 3180
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 3240
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 3300
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 3360
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 3420
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 3480
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 3540
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 3600
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 3660
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 3720
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 3780
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 3840
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 3900
agttagcgcg aattgatctg gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct 3960
tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca 4020
taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat 4080
aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa 4140
tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc agaattcaaa agatctaaag aggagaaata 4200
ctagatgacc gatgtgcgct ttcgcatcat cggcaccggc gcctacgtgc ccgaacgcat 4260
cgtgagcaac gatgaagtgg gcgcccccgc cggcgtggat gatgattgga tcacccgcaa 4320
aaccggcatc cgccagcgcc gctgggccgc cgatgatcag gccaccagcg atctggccac 4380
cgccgccggc cgcgccgccc tgaaagccgc cggcatcacc cccgaacagc tgaccgtgat 4440
cgccgtggcc accagcaccc ccgatcgccc ccagcccccc accgccgcct acgtgcagca 4500
ccacctgggc gccaccggca ccgccgcctt tgatgtgaac gccgtgtgca gcggcaccgt 4560
gtttgccctg agcagcgtgg ccggcaccct ggtgtaccgc ggcggctacg ccctggtgat 4620
cggcgccgat ctgtacagcc gcatcctgaa ccccgccgat cgcaaaaccg tggtgctgtt 4680
tggcgatggc gccggcgcca tggtgctggg ccccaccagc accggcaccg gccccatcgt 4740
gcgccgcgtg gccctgcaca cctttggcgg cctgaccgat ctgatccgcg tgcccgccgg 4800
cggcagccgc cagcccctgg ataccgatgg cctggatgcc ggcctgcagt actttgccat 4860
ggatggccgc gaagtgcgcc gctttgtgac cgaacacctg ccccagctga tcaaaggctt 4920
tctgcacgaa gccggcgtgg atgccgccga tatcagccac tttgtgcccc accaggccaa 4980
cggcgtgatg ctggatgaag tgtttggcga actgcacctg ccccgcgcca ccatgcaccg 5040
caccgtggaa acctacggca acaccggcgc cgccagcatc cccatcacca tggatgccgc 5100
cgtgcgcgcc ggcagctttc gccccggcga actggtgctg ctggccggct ttggcggcgg 5160
catggccgcc agctttgccc tgatcgaatg gtagggatct aagaggagaa atactagatg 5220
aacagcaaaa tcatccgctt tgaaaacctg cgcagctttt ttaaagatgg catgaccatc 5280
atgatcggcg gctttctgaa ctgcggcacc cccaccaaac tgatcgattt tctggtgaac 5340
ctgaacatca aaaacctgac catcatcagc aacgatacct gctaccccaa caccggcatc 5400
ggcaaactga tcagcaacaa ccaggtgaaa aaactgatcg ccagctacat cggcagcaac 5460
cccgataccg gcaaaaaact gtttaacaac gaactggaag tggaactgag cccccagggc 5520
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ctgctggaac tgcccctgac cgccgatatc gccctgatca aaggcagcat cgtggatgaa 5700
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gccaaaaccg tgatcgtgga agccgaaaac ctggtgagct gcgaaaaact ggaaaaagaa 5820
aaagccatga cccccggcgt gctgatcaac tacatcgtga aagaacccgc ctaaaatgat 5880
caacgataaa aacctggcca aagaaatcat cgccaaacgc gtggcccgcg aactgaaaaa 5940
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aaactttaaa atcacctttc agagcgaaaa cggcatcgtg ggcatgggcg ccagccccaa 6060
aatcaacgaa gccgataaag atgtggtgaa cgccggcggc gattacacca ccgtgctgcc 6120
cgatggcacc ttttttgata gcagcgtgag ctttagcctg atccgcggcg gccacgtgga 6180
tgtgaccgtg ctgggcgccc tccaggtgga tgaaaaaggc aacatcgcca actggatcgt 6240
gcccggcaaa atgctgagcg gcatgggcgg cgccatggat ctggtgaacg gcgccaaaaa 6300
agtgatcatc gccatgcgcc acaccaacaa aggccagccc aaaatcctga aaaaatgcac 6360
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ttgtttgtcg gtgaacgctc tctactagag tcacactggc tcaccttcgg gtgggccttt 7440
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aaacaaacca cgggcattga tctggcgaaa tccctaccgg gtcaatccga ctcgcccgct 7680
gcgaagtcct aagagatagc gatgtgaccg cgatcgcttg tcaagaatcc cagtgatccc 7740
gaaccatagg aaggcaagct caatgcttgc ctcgtcttga ggactatcta gatgtctgtg 7800
gaacgcacat ttattgccat caagcccgat ggcgttcagc ggggtttggt cggtacgatc 7860
atcggccgct ttgagcaaaa aggcttcaaa ctggtgggcc taaagcagct gaagcccagt 7920
cgcgagctgg ccgaacagca ctatgctgtc caccgcgagc gccccttctt caatggcctc 7980
gtcgagttca tcacctctgg gccgatcgtg gcgatcgtct tggaaggcga aggcgttgtg 8040
gcggctgctc gcaagttgat cggcgctacc aatccgctga cggcagaacc gggcaccatc 8100
cgtggtgatt ttggtgtcaa tattggccgc aacatcatcc atggctcgga tgcaatcgaa 8160
acagcacaac aggaaattgc tctctggttt agcccagcag agctaagtga ttggaccccc 8220
acgattcaac cctggctgta cgaataaggt ctgcattcct tcagagagac attgccatgc 8280
cc 8282
<210> 10
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<212> DNA
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<220>
<223> PRIMER(FORWARD)
<400> 10
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<212> DNA
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<220>
<223> PRIMER(REVERSE)
<400> 11
tttggcaatc tgaagacccg 20
Claims (15)
- 삭제
- 삭제
- 30℃ 및 5%의 이산화탄소 공급 조건에서, 균주가 생산하는 생산물의 총생산량 중 아세톤 생산량의 몰(mole)비율로 정의되는 아세톤 선택도가 0.8 이상인, 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주로서,
상기 균주는,
서열번호 1의 서열로 표시되는 아세틸코에이 전이효소(acetyl-Co A transferase) 유전자 및 서열번호 2의 서열로 표시되는 아세틸코에이 합성효소(acetyl-CoA syntherase) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고,
서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열로 표시되는 아세토아세틸코에이 전이효소(acetoacetyl-CoA transferase) 유전자를 포함하며,
서열번호 5의 서열로 표시되는 아세토아세테이트 데카르복실라제(acetoacetate decarboxylase) 유전자를 포함하는, 균주. - 제3항에 있어서,
상기 균주는,
서열번호 1의 서열로 표시되는 아세틸코에이 아세틸트렌스퍼라제 B 유전자(acetyl-CoA acetyltransferase B 유전자, atoB) 또는 서열번호 2의 서열로 표시되는 아세토아세틸 코에이 합성효소 NphT7 유전자(acetoacetyl CoA synthase NphT7 유전자, nphT7);
서열번호 3의 서열로 표시되는 아실 코에이:아세테이트/3-케토산 코에이 트렌스퍼라제 알파 및 베타 서브유닛 유전자(acyl CoA:acetate/3-ketoacid CoA transferase 알파 및 베타 서브유닛 유전자, atoDA) 또는 서열번호 4의 서열로 표시되는 코에이 트렌스퍼라제 AB 유전자(CoA transferase AB 유전자, ctfAB); 및
서열번호 5의 서열로 표시되는 아르기닌 데카르복실라제 유전자(arginine decarboxylase 유전자, adc)를 포함하는 벡터로 형질전환된 것인, 균주. - 제4항에 있어서,
상기 균주는, 상기 벡터가 모균주인 시네코코커스 일롱게투스 PCC7942(ATCC 33912)에 형질전환된 것인, 균주. - 제4항에 있어서,
상기 벡터는,
복제 개시점으로서 pUC 복제 개시점;
복제 개시점 전 후에 위치하는 뉴트럴 사이트(neutral site);
선별 마커로서 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자;
lac I 리프레서, tetR 리프레서 및 AraC로 이루어진 군으로부터 선택된 리프레서;
trc 프로모터, tetA 프로모터 또는 변형된 tetA 프로모터, BAD 프로모터, 및 cbbL 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터; 및
제한효소 부위인 Bg1II 부위, BamHI 부위, EcoRI 부위 및 XhoI 부위를 더 포함하는, 균주. - 제4항에 있어서,
상기 atoB 유전자, nphT7 유전자, atoDA 유전자, ctfAB 유전자 및 adc 유전자는, 제한효소 부위인 Bg1II 부위 및 BamHI 부위 사이에 위치하는 것인, 균주. - 제4항에 있어서,
상기 벡터는, 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나의 서열로 표시되는 것인, 균주. - 제4항에 있어서,
상기 균주는, 기탁번호 KCTC12758BP, 기탁번호 KCTC12759BP, 기탁번호 KCTC 12760BP 또는 KCTC12761BP인, 균주. - 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 균주는, 이산화탄소를 흡수하여 고정하는 것인, 균주. - 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 배양하는 단계를 포함하는 아세톤 생산방법.
- 제11항에 있어서,
상기 방법은, 균주에 이산화탄소를 공급하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제12항에 있어서,
상기 방법은, 아세트산칼륨을 공급하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제13항에 있어서,
상기 아세트산칼륨은, 1 내지 30mM인, 방법. - 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 이산화탄소 제거방법.
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