CN1496405A - 提高泛酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用具有改变的泛酸生物合成酶活性的微生物制备泛解酸和泛酸的改进方法。尤其是，本发明公开了降低副产物形成和增加期望产物的产量和纯度的方法。也公开了重组微生物和其培养条件。也公开了由这种微生物制备的组合物。

Description

提高泛酸产量的方法
相关申请
本发明要求2001年1月19日提交的在先申请临时专利申请系列号60/262,995(未决)的利益。本发明也与2000年9月21日申请的美国专利申请系列号09/667,569(未决)相关，它是1999年9月21日申请的美国专利申请系列号09/400,494(放弃)的部分继续申请。美国专利申请系列号09/667,569还要求在先提交的(2000年6月7日申请的)临时专利申请系列号60/210,072，(2000年7月28日申请的)临时专利申请系列号60/221,836，和(2000年8月24日申请的)临时专利申请系列号60/227,860的利益。上面提及的每个申请的完整内容均引入这里作为参考。
发明背景
泛酸盐，也称为泛酸或维生素B5，是维生素B复合体的一个成员，且为哺乳动物(包括家畜和人)营养所需(如，来自食物来源，作为水溶性维生素补充剂或作为饲料添加剂)。在细胞中，泛酸主要用于生物合成辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)。这些辅酶在酰基部分的代谢中起作用，酰基部分与这些分子的4’-磷酸泛酰巯基乙胺部分的巯基形成硫酯。这些辅酶在所有细胞中均很重要，在细胞代谢中参与100多种不同的中间反应。
合成泛酸(尤其是生物活性D异构体)的传统方法是从大量化学品出发通过化学方式合成，此方法被过多底物费用以及需要外消旋中间体的旋光拆分所阻碍。因此，研究者们近来在寻找能产生在泛酸生物合成过程中有用的酶的细菌或微生物系统(因为细菌本身能够合成泛酸)。尤其是，生物转化方法已经被评价为泛酸优选异构体的有利制备方法。而且，直接微生物合成方法近来经检验是利于D-泛酸制备的方法。
然而，仍有改进泛酸制备方法的显著需要，尤其是，有必要优化微生物方法以制备更高产量的期望产物。
发明概述
本发明涉及制备泛酸的改进方法(如微生物合成)。具体地，本发明人发现在微生物中泛酸生物合成途径的去调节和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径的去调节，除了导致产生显著增加的泛解酸和/或泛酸滴度外，还导致替代产物合成，所述替代产物即[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸或3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)，这里可交换称作“β-丙氨酸2-(R)-羟基异戊酸”，“β-丙氨酸2-羟基异戊酸”，“β-丙氨酰-α-羟基异戊酸”和/或“fantothenate”。产生HMBPA的途径(这里称作“HMBPA生物合成途径”)涉及与泛酸和/或异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成常规相关的某些酶，当它们过表达时能够另外参与HMBPA生物合成途径。具体地，该途径包括α-酮异戊酸转变为[R]-2-羟基异戊酸(α-HIV)(由还原酶活性(如PanE1，PanE2和/或IlvC活性)催化)，及随后α-HIV与β-丙氨酸缩合(由PanC活性催化)。由于HMBPA生物合成替代途径与泛酸生物合成竞争关键前体，即α-酮异戊酸(α-KIV)和β-丙氨酸，并竞争泛酸生物合成常规相关的酶，因而为了有效增加泛酸生物合成，可能期望减少或消除HMBPA的生物合成。
因此，在本发明的一个方面公开了制备无HMBPA的泛酸组合物的方法，包括在使无HMBPA的泛酸组合物产生的条件下培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物。在另一个方面，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanB活性受到调节致使产生无HMBPA的泛酸组合物。本发明的又一个方面公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanE活性受到调节致使产生无HMBPA的泛酸组合物。在另一个方面，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的IlvC活性受到调节致使产生无HMBPA的泛酸组合物。在另一个方面，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanB和PanE活性受到调节致使产生无HMBPA的泛酸组合物。在另一个方面，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanB和IlvC活性受到调节致使产生无HMBPA的泛酸组合物。本发明还公开了根据上述方法制备的组合物，及所述方法中利用的微生物。也公开了选择性混合的泛酸：HMBPA组合物的制备方法。
本发明的其它特征和优点将由如下详述和权利要求书而更加明显。
附图简述
图1是泛酸和异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成途径的示意图解表示。泛酸生物合成酶以粗体描述，其相应基因以斜体字表示。异亮氨酸/缬氨酸(ilv)生物合成酶以粗斜体描述，其相应基因以斜体字表示。
图2是在枯草芽孢杆菌中引起[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)形成的生物合成途径的示意图。
图3是[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)结构的示意图。
图4是14L PA824发酵培养物的样品的HPLC色谱结果。
图5是质谱图，显示了3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸的相对单一同位素质量(relative monoisotopic mass)。
图6显示了已知或推测的PanB蛋白的C末端氨基酸比对。
图7是构建质粒pAN624的示意图。
图8是构建质粒pAN620的示意图。
图9是构建质粒pAN636的示意图。
图10是允许使用氯霉素进行单或多拷贝选择的质粒pAN637的构建示意图。
发明详述
本发明至少部分基于重组微生物中生物合成替代途径的发现，该途径利用某些泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶和前体产生称作[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的副产物或次要产物。具体地，已经发现经改造具有去调节的泛酸生物合成和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的细菌能够从α-酮异戊酸(α-KIV，异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的关键产物和泛酸生物合成途径的前体)产生HMBPA。在细菌中制备HMBPA至少利用泛酸生物合成酶酮泛解酸还原酶(panE基因产物)、panE2基因产物和/或乙酰羟基异构还原酶(ilvC基因产物)，HMBPA由α-KIV还原形成的[R]-2-羟基异戊酸(α-HIV)与β-丙氨酸缩合得到，在后反应可以由泛酸生物合成酶泛酸合成酶(panC基因产物)催化。底物α-KIV和β-丙氨酸既可用于泛酸制备又可用于HMBPA制备，β-丙氨酸可通过例如饲喂和/或增加门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)活性提供。
为了减少或消除对泛酸生物合成前体和/或生物合成酶的竞争，可能期望选择性地调节某些酶使生产方向背离HMBPA合成而移向泛解酸/泛酸合成。优选，进一步改造具有去调节的泛酸生物合成途径和/或去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，使PanB和/或PanE被选择性调节。对PanB和或PanE的选择性调节包括优化这些酶的水平使生产流向泛解酸/泛酸。
具体地，本发明涉及其中泛酸与HMBPA的比率增加的组合物的制备方法，优选无HMBPA的泛酸组合物的制备方法。这里使用的短语“无HMBPA的泛酸组合物”描述无HMBPA和/或基本无HMBPA的包含泛酸的组合物，这样所述组合物包括无关紧要量的HMBPA(即，如果HMBPA存在，它将以相对于泛酸的水平或浓度足够低的水平或浓度存在，从而使得从技术、科学和/或工业的目的可以认为该组合物无HMBPA)。优选，无HMBPA的泛酸组合物包括泛酸和，如果存在HMBPA，以10∶100(即，例如当用HPLC分析产物样品时按比较峰面积测定，10％HMBPA∶90％泛酸)或更低的比率存在的HMBPA。更优选，无HMBPA的泛酸组合物包括泛酸和，如果存在HMBPA，以9∶100(即9％HMBPA∶91％泛酸)或更低的比率存在的HMBPA。甚至更优选，无HMBPA的泛酸组合物包括泛酸和，如果存在HMBPA，以8∶100(即8％HMBPA∶92％泛酸)或更低，7∶100(即7％HMBPA∶93％泛酸)或更低，6∶100(即6％HMBPA∶94％泛酸)或更低或5∶100(即5％HMBPA∶95％泛酸)或更低的比率存在的HMBPA。甚至更优选，无HMBPA的泛酸组合物包括泛酸和，如果存在HMBPA，以0.5∶100(即0.5％HMBPA∶99.5％泛酸)或更低，0.2∶100(即0.2％HMBPA∶99.8％泛酸)或更低或0.1∶100(即0.1％HMBPA∶99.9％泛酸)或更低的比率存在的HMBPA。本文所述值中所包括的值和范围和/或这些值的中间值也旨在本发明的范围内。
在一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸的制备方法，包括在使无HMBPA的泛酸组合物产生的条件下培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物。术语“泛酸生物合成途径”包括涉及泛酸形成或合成中利用的泛酸生物合成酶(如编码生物合成酶的基因所编码的多肽)、化合物(如底物、中间体或产物)、辅因子等等的生物合成途径。术语“泛酸生物合成途径”包括在微生物中(如，在体内)引起泛酸合成的生物合成途径和在体外引起泛酸合成的生物合成途径。
如这里使用的，“具有去调节的泛酸生物合成途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)(两个术语如这里定义)的泛酸生物合成酶以致使泛酸产量增加(如，与所述微生物在所述生物合成酶去调节之前的泛酸产量相比或与野生型微生物相比)的微生物。术语“泛酸(panthothenate)”包括游离酸形式的泛酸，也称作“泛酸(pantothenicacid)”，以及其任何盐(如，通过用阳离子，例如钙、钠、钾、铵替代泛酸的酸性氢得到的盐)，也称作“泛酸盐(panthothenate salt)”。术语“泛酸”也包括泛酸的醇衍生物。优选的泛酸盐是泛酸钙或泛酸钠。优选的醇衍生物是羟泛酸。本发明的泛酸盐和/或醇包括可以从这里描述的游离酸通过常规方法制备的盐和/或醇。在另一个实施方案中，泛酸盐由本发明的微生物直接合成。本发明的泛酸盐也可以用常规方法转变为游离酸形式的泛酸。优选，“具有去调节的泛酸生物合成途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)的泛酸生物合成酶以致使泛酸产量达1g/L或更高的微生物。更优选，“具有去调节的泛酸生物合成途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)的泛酸生物合成酶以致使泛酸产量达2g/L或更高的微生物。
术语“泛酸生物合成酶”包括在泛酸生物合成途径的化合物(如，中间体或产物)的形成中利用的任何酶。例如，泛解酸从α-酮异戊酸(α-KIV)通过中间体酮泛解酸合成。酮泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanB或酮泛解酸羟甲基转移酶(panB基因产物)催化。泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanE1或酮泛解酸还原酶(panE1基因产物)催化。从门冬氨酸合成β-丙氨酸由泛酸生物合成酶PanD或门冬氨酸-α-脱羧酶(panD基因产物)催化。从泛解酸和β-丙氨酸(如，缩合)形成泛酸由泛酸生物合成酶PanC或泛酸合成酶(panC基因产物)催化。泛酸生物合成酶也可以执行备选功能作为这里所述的HMBPA生物合成途径中的酶。
因此，在一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有至少一个去调节(如，去调节以致使泛酸产量增加)的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶选自例如PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)、PanE1(或酮泛解酸还原酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有至少两个去调节的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶选自例如PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)和PanE1(或酮泛解酸还原酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有至少三个去调节的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶选自例如PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)和PanE1(或酮泛解酸还原酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有至少四个去调节的泛酸生物合成酶的微生物，例如，具有去调节的PanB(或酮泛解酸羟甲基转移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或门冬氨酸-α-脱羧酶)和PanE1(或酮泛解酸还原酶)的微生物。
在另一个方面，本发明公开了无HMBPA的泛酸的制备方法，包括在使无HMBPA的泛酸组合物产生的条件下培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物，其中所述微生物还具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括涉及在丙酮酸转变为缬氨酸或异亮氨酸的形成或合成过程中利用的异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶(如编码生物合成酶的基因所编码的多肽)、化合物(如底物、中间体或产物)、辅因子等等的生物合成途径。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径”包括在微生物中(如，在体内)引起缬氨酸或异亮氨酸合成的生物合成途径以及在体外引起缬氨酸或异亮氨酸合成的生物合成途径。
如这里使用的，“具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径”的微生物包括具有至少一个去调节(如，过表达)(两个术语如这里定义)的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶致使异亮氨酸和/或缬氨酸和/或缬氨酸前体(α-酮异戊酸(α-KIV))产量增加(如，与所述微生物在所述生物合成酶去调节之前的异亮氨酸和/或缬氨酸和/或α-KIV产量相比，或与野生型微生物相比)的微生物。图1包括异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径的图解表示。异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶以粗斜体描述，其相应基因用斜体字表示。术语“异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶”包括在异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径的化合物(如，中间体或产物)的形成中利用的任何酶。根据图1，从丙酮酸通过中间体(乙酰乳酸、α，β-二羟基异戊酸(α，β-DHIV)和α-酮异戊酸(α-KIV))前行合成缬氨酸。从丙酮酸形成乙酰乳酸由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸合成酶(ilvBN基因产物，或alsS基因产物)催化。从乙酰乳酸形成α，β-DHIV由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶乙酰羟酸异构还原酶(ilvC基因产物)催化。从α，β-DHIV合成α-KIV由异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶二羟酸脱水酶(ilvD基因产物)催化。而且，通过支链氨基酸转氨酶，缬氨酸和异亮氨酸可与它们各自的α-酮化合物进行相互转化。异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶也可以执行备选功能作为这里所述的HMBPA生物合成途径中的酶。
因此，在一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有至少一个去调节(如，去调节以致使缬氨酸和/或异亮氨酸和/或α-KIV产量增加)的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，所述酶选自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羟酸合成酶)、IlvC(或乙酰羟酸异构还原酶)和IlvD(或二羟酸脱水酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有至少两个去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，所述酶选自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羟酸合成酶)、IlvC(或乙酰羟酸异构还原酶)和IlvD(或二羟酸脱水酶)。在另一个实施方案中，本发明公开了无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有至少三个去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，例如，具有去调节的IlvBN或AlsS(或乙酰羟酸合成酶)、IlvC(或乙酰羟酸异构还原酶)和IlvD(或二羟酸脱水酶)的所述微生物。
如这里提及，已经发现泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径的酶在[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)合成或[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途径中具有备选活性。术语“[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途径”包括涉及HMBPA形成或合成中利用的与泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径常规相关的生物合成酶和化合物(如底物等)的生物合成替代途径。术语“HMBPA生物合成途径”包括在微生物中(如，在体内)引起HMBPA合成的生物合成途径和在体外引起HMBPA合成的生物合成途径。
术语“HMBPA生物合成酶”包括在HMBPA生物合成途径的化合物(如，中间体或产物)的形成中利用的任何酶。例如，从α-酮异戊酸(α-KIV)合成2-羟基异戊酸(α-HIV)由panE1或panE2基因产物(PanE1这里可替换称作酮泛解酸还原酶)和/或由ilvC基因产物(这里可替换称作乙酰羟酸异构还原酶)催化。从β-丙氨酸和α-HIV形成HMBPA由panC基因产物(这里可替换称作泛酸合成酶)催化。
术语“[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionic acid)(“HMBPA”)”包括游离酸形式的HMBPA，也称作“[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionate)”，及其任何盐(如，通过用阳离子，例如，钙、钠、钾、铵替代3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸的酸性氢得到的盐)，也称作“3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸盐(propionic acid salt)”或“HMBPA盐”。优选的HMBPA盐是HMBPA钙或HMBPA钠。本发明的HMBPA盐包括可以通过常规方法从这里所述的游离酸制备的盐。本发明的HMBPA盐也可以通过常规方法转变为游离酸形式的3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸。
至少部分基于如下发现，即泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径的过表达或去调节可导致替代产生HMBPA(与期望的泛酸产生相对而言)，本发明公开了无HMBPA的泛酸的制备方法，包括培养不仅其中的泛酸生物合成途径和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径被去调节，而且其中的某些酶被选择性调节以利于无HMBPA的泛酸组合物产生的微生物。如这里定义，术语“选择性调节”包括以使泛酸产生比HMBPA产生更有利的方式选择性地调节或靶向一个或多个特定酶(即，来自泛酸生物合成途径或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径并已知参与泛酸和HMBPA合成的酶)。优选被选择或靶向进行调节的酶包括PanE1，PanE2，PanB和域IlvC。
在一个实施方案中，PanE1被选择性调节。例如，本发明人已经发现PanE1过表达可催化HMBPA前体形成，因此选择性调节其量或活性(如，稍微降低PanE1的水平或活性)可使产物形成从HMBPA产生移向泛酸产生(即，利于泛酸产生超过HMBPA产生)。而且，已经发现PanE2利于HMBPA产生。因此，另一个实施方案涉及缺失或调节panE2。
同样，本发明人已经发现增加的PanB活性可使产物形成从HMBPA生物合成替代途径移向泛酸生物合成途径，因此选择性调节PanB的量或活性可使泛酸比HMBPA能更有利地产生。在一个实施方案中，通过过表达或去调节PanB基因而增加PanB活性。在另一实施方案中，PanB活性通过表达多拷贝PanB基因来增加。降低对PanB的反馈抑制可增加PanB活性。尤其是，已经发现调节(如，选择性调节)泛酸激酶-从泛酸形成辅酶A(CoA)的过程中的关键酶-可增加PanB活性(如见，美国专利申请系列号09/09/667,569)。对泛酸激酶进行调节(如，降低泛酸激酶的活性或水平)可降低CoA产量，而这又可以降低对PanB的反馈抑制并利于泛酸积累。在一个实施方案中，通过缺失CoaA和下调CoaX活性(在某些微生物中CoaA和CoaX都能够催化CoA生物合成的第一步)，使泛酸激酶活性降低(进而使PanB活性增加)。在另一个实施方案中，通过缺失CoaX和下调CoaA使泛酸激酶活性降低(进而使PanB活性增加)。在另一个实施方案中，通过下调CoaA和CoaX活性使泛酸激酶活性降低(进而使PanB活性增加)。
在本发明的再一个方面公开了无HMBPA的泛酸的制备方法，包括在选择的利于泛酸产生超过HMBPA产生的培养条件下培养微生物。具体地，已经发现有些条件可以使泛酸比HMBPA更有利地产生，这些条件包括但不限于，降低稳态葡萄糖，增加稳态溶解氧和/或使丝氨酸过量。术语“降低稳态葡萄糖”包括使稳态葡萄糖水平少于或低于常规用于培养所述微生物的水平。例如，在本实施例中描述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0.2-1.0g/L稳态葡萄糖存在下进行。因此，降低稳态葡萄糖水平优选包括使稳态葡萄糖的水平少于0.2g.L。术语“增加稳态溶解氧”包括使稳态溶解氧水平增加或高于常规用于培养所述微生物的水平，并且例如，与降低的稳态葡萄糖水平逆相关。例如，在本实施例中描述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约10-30％溶解氧存在下进行。因此，增加的稳态溶解氧可包括使溶解氧水平达到30％以上，优选高至95％的溶解氧。术语“丝氨酸过量”包括使丝氨酸水平增加或高于常规培养所述微生物所用的水平。例如，在本实施例中描述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0-2.5g/L丝氨酸存在下进行。因此，过量丝氨酸水平可包括高于2.5g/L丝氨酸的水平，优选在大约2.5和20g/L丝氨酸之间。
在再一个实施方案中，通过增加如这里定义的泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的前体和/或中间体(如，在过量β-丙氨酸，缬氨酸和/或α-KIV存在下培养微生物)，或备选地，在缺乏β-丙氨酸进料时培养能够产生相当高水平的β-丙氨酸的微生物(即，β-丙氨酸独立性微生物，如美国专利申请系列号09/09/667,569所述)来促进HMBPA产生。
在下列分部中进一步详细描述本发明的各个方面。
I.靶向编码各种泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或HMBPA生物合成酶的基因
在一个实施方案中，本发明涉及对泛酸和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)和/或HMBPA生物合成途径中的各种生物合成酶进行打靶或修饰。具体地，本发明涉及了通过修饰或改变编码所述生物合成酶的基因而改变与所述途径相关的各种酶活性。
这里使用的术语“基因”包括在生物体中可以通过基因间DNA(即在生物的染色体DNA中天然位于基因侧翼和/或分开基因的间插或间隔DNA)与另一个基因或其它基因分开的核酸分子(如，DNA分子或其片段)。或者，一个基因可以些微重叠另一个基因(如，第一个基因的3’端与第二个基因的5’端重叠)，这些重叠基因通过基因间DNA与其它基因分开。基因可以指导酶或其它蛋白分子的合成(如，可以包括编码序列，例如，编码蛋白的连续开放阅读框架(ORF))或本身可以在生物体中起作用。生物体中的基因可以簇集在操纵子中(见本文中的定义)，所述操纵子通过基因间DNA与其它基因和/或操纵子分开。这里使用的“分离的基因”包括基本不含有在该基因所来源的生物的染色体DNA中天然位于该基因侧翼的序列(即，不含编码第二个或不同蛋白的相邻编码序列或相邻结构序列等)的基因，但该基因可以任选包括5’和3’调节序列，例如启动子序列和/或终止序列。在一个实施方案中，分离的基因主要包括蛋白质的编码序列(如，编码芽孢杆菌蛋白的序列)。在另一个实施方案中，分离的基因包括编码蛋白的序列(如，编码芽孢杆菌蛋白的序列)和来自该基因的来源生物的染色体DNA的相邻5’和/或3’调节序列(如，相邻5’和/或3’芽孢杆菌调节序列)。优选，分离的基因含有少于大约10kb，5kb，2kb，1kb，0.5kb，0.2kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的在该基因的来源生物的染色体DNA中天然位于该基因侧翼的核苷酸序列。
术语“操纵子”包括至少两个相邻基因或ORF，它们任选在至少一个基因或ORF的5’或3’端串联重叠。术语“操纵子”包括含有与一个或多个相邻基因或ORF(如，编码酶，例如，生物合成酶的结构基因)关联的启动子和可能的调节元件的基因表达协调单位。例如，可以通过调节蛋白与调节元件结合或通过抗转录终止协调调节基因(如结构基因)的表达。操纵子的基因(如结构基因)可转录为编码所有蛋白的单一mRNA。
这里使用的“具有突变的基因”或“突变基因”包括具有包含至少一个改变(如置换、插入、缺失)的核苷酸序列的基因，其中所述改变致使由所述突变体编码的多肽或蛋白显示出与野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白不同的活性。在一个实施方案中，例如当在相似条件下测定(如，在相同温度下培养的微生物中测定)时，具有突变的基因或突变基因编码与野生型基因编码的多肽或蛋白相比活性增加的多肽或蛋白。这里使用的“活性增加”或“酶活性增加”是指比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少高5％的活性，优选至少高5-10％，更优选至少高10-25％，甚至更优选比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少高25-50％，50-75％或75-100％的活性。上面引用值的中间范围，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本发明中。这里使用的“活性增加”或“酶活性增加”也可以包括比野生型基因编码的多肽或蛋白的活性至少高1.25倍的活性，优选至少高1.5倍，更优选至少高2倍，甚至更优选比野生型基因编码的多肽或蛋白的活性至少高3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍的活性。
在另一个实施方案中，例如，当在相似条件下测定时(如，在相同温度下培养的微生物中测定时)，具有突变的基因或突变基因编码与野生型基因编码的多肽或蛋白相比活性降低的多肽或蛋白。突变基因也可不编码多肽或编码产量水平降低的野生型多肽。这里使用的“活性降低”或“酶活性降低”是指比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少低5％的活性，优选至少低5-10％，更优选至少低10-25％，甚至更优选比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性至少低25-50％，50-75％或75-100％的活性。上面引用值的中间范围，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本发明中。这里使用的“活性降低”或“酶活性降低”也可以包括活性被消除或“剔除”(如，比野生型核酸分子或基因编码的多肽或蛋白的活性低大约100％的活性)。
可以根据任何被很好接受用于测定感兴趣的特定蛋白的活性的试验来确定活性。可以直接测定或检测活性，例如，测定从细胞或微生物分离或纯化的蛋白的活性。可供选择地，可在细胞或微生物内或细胞外介质内测定或检测活性。例如，可以通过使突变基因在微生物例如，具有温度敏感性酶的突变微生物中表达，然后检测突变基因弥补温度敏感性(Ts)突变体的酶活性的能力，对突变基因(即，所述编码降低的酶活性的突变体)进行检测。编码“增加的酶活性”的突变基因可以是能比例如相应野生型基因更有效地弥补Ts突变体的基因。编码“酶活性降低”的突变基因是在弥补Ts突变体方面不如例如相应野生型基因有效的基因。
本领域技术人员明了，与相应野生型多肽或蛋白相比，核酸或基因序列中甚至单一置换(如，在相应氨基酸序列中编码一个氨基酸改变的一个碱基置换)也可戏剧性地影响所编码多肽或蛋白的活性。这里定义的突变基因(如，编码突变多肽或蛋白)可容易地与编码蛋白同系物(homologue)的核酸或基因区别，因为突变基因编码活性改变的蛋白或多肽，并且任选地在表达所述突变基因或产生所述突变蛋白或多肽的微生物(如，突变微生物)中可观察到与表达野生型基因的相应微生物不同或明显不同的表型。相反地，蛋白同系物可具有等同或基本相似的活性，任选地当在微生物中产生时与表达野生型基因的相应微生物相比无可区别的表型。因此，不是由例如核酸分子、基因、蛋白或多肽间的序列等同程度来区分同系物和突变体，而是由所编码的蛋白或多肽的活性来区分同系物和突变体：同系物可以具有例如低序列等同性(如，30-50％序列等同性)然而具有基本等同的功能活性，而突变体可以例如享有99％序列等同性然而具有大大不同或改变的功能活性。
本领域技术人员也将领会到用于本发明的核酸分子，基因，蛋白或多肽可来自具有HMBPA生物合成途径，ilv生物合成途径或泛酸生物合成途径的任何微生物。本领域技术人员可以使用已知技术如同源性筛选，序列比较等等鉴定这种核酸分子，基因，蛋白或多肽，并且本领域技术人员可以对这些核酸分子，基因，蛋白或多肽进行修饰以使其能在重组微生物中表达或产生(如，通过使用适当启动子、核糖体结合位点、表达或整合载体，修饰基因序列使转录增加(考虑优选密码子使用)等，根据这里所述的技术和本领域已知的那些技术来实现)。
在一个实施方案中，本发明的基因来自革兰氏阳性微生物生物体(如，由于生物体外围绕存在革兰氏阳性壁而保持碱性染色，例如，结晶紫的微生物)。术语“来自”(如“来自”革兰氏阳性微生物)是指在此微生物中天然存在的基因(如革兰氏阳性微生物的天然基因)。在优选实施方案中，本发明的基因来自属于选自芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Cornyebacterium)(如谷氨酸棒杆菌(Cornyebacterium glutamicum))、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(lactococci)和链霉菌(Streptomyces)属的属的微生物。在更优选实施方案中，本发明的基因来自芽孢杆菌属的微生物。在另一个优选实施方案中，本发明基因来自选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、缓病芽孢杆菌（Bacillus lentimorbus))、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus))、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、泛酸芽孢杆菌(Bacilluspantothenticus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、苏云金芽孢杆菌(Baciilus thuringiensis)、耐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)和其它1组芽孢杆菌种(例如，以16S rRNA型表征的种)的微生物。在另一个优选实施方案中，基因来自短芽孢杆菌(Bacillus brevis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。在另一个优选实施方案中，本发明的基因来自选自地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的微生物。在特别优选的实施方案中，基因来自枯草芽孢杆菌(如，是枯草芽孢杆菌来源的)。术语“来自枯草芽孢杆菌”或“枯草芽孢杆菌来源的”包括在枯草芽孢杆菌微生物中天然发现的基因。在本发明范围内包括芽孢杆菌来源的基因(如，枯草芽孢杆菌来源的基因)，例如，芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌coaX基因，serA基因，glyA基因，coaA基因，pan基因和/或ilv基因。
在另一个实施方案中，本发明的基因来自革兰氏阴性(不接受碱性染色)微生物。在优选实施方案中，本发明的基因来自属于选自沙门氏菌属(Salmonella)(如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))，埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙雷氏菌属(Serratia)和变形杆菌属(Proteus)的属的微生物。在更优选的实施方案中，本发明的基因来自埃希氏菌属的微生物。在甚至更优选的实施方案中，本发明的基因来自大肠杆菌(Escherichia coli)。在另一个实施方案中，本发明的基因来自酵母属(Saccharomyces)(如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
II.重组核酸分子和载体
本发明还公开了包括这里所述的基因(如分离的基因)的重组核酸分子(如重组DNA分子)，所述基因优选芽孢杆菌基因，更优选枯草芽孢杆菌基因，甚至更优选枯草芽孢杆菌泛酸生物合成基因和/或异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成基因和/或HMBPA生物合成基因。术语“重组核酸分子”包括经改变，修饰或改造(如一个或多个核苷酸插入、缺失或置换)在核苷酸序列方面不同于其所来源的天然或自然核酸分子的核酸分子(如，DNA分子)。优选，重组核酸分子(如，重组DNA分子)包括可操作连接调节序列的本发明的分离基因。短语“可操作连接调节序列”意思是感兴趣的基因的核苷酸序列与调节序列以允许基因进行表达(如，增强的，增加的，组成的，基础的，衰减的，减少的或阻碍的表达)，优选以允许该基因编码的基因产物表达(如，当将如这里定义的重组核酸分子包括在重组载体中并导入微生物中时)的方式连接。
术语“调节序列”包括影响(如，调制或调节)其它核酸序列(即基因)表达的核酸序列。在一个实施方案中，调节序列被包括在重组核酸分子中，其相对于感兴趣的特定基因的位置和方向与两者在天然情况下显示的位置和/或方向相似或等同，如为天然位置和/或方向。例如，感兴趣基因可包括在重组核酸分子中与如下调节序列可操作连接，所述调节序列在天然生物中伴随或邻近此感兴趣基因(如，可操作连接“天然”调节序列(如，连接“天然”启动子))。可供选择地，感兴趣基因可包括在重组核酸分子中与如下调节序列可操作连接，该调节序列在天然生物中伴随或邻近另一个(如，不同的)基因。可供选择地，感兴趣基因可包括在重组核酸分子中与来自另一个生物的调节序列可操作连接。例如，可以使来自其它微生物的调节序列(如，其它细菌调节序列，噬菌体调节序列等等)与特定感兴趣基因可操作连接。
在一个实施方案中，调节序列是非自然或非天然存在的序列(如，已经被修饰，突变，置换，衍化，缺失的序列，包括化学合成的序列)。优选的调节序列包括启动子、增强子、终止信号、抗终止信号和其它表达控制元件(如，阻遏物或诱导物结合的序列和/或转录和/或翻译调节蛋白的结合位点，例如，在转录的mRNA中)。例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual。第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中描述了这种调节序列。调节序列包括指导核苷酸序列在微生物中组成型表达的那些序列(如，组成型启动子和强组成型启动子)，指导核苷酸序列在微生物中可诱导表达的那些序列(如，诱导型启动子，例如，木糖诱导型启动子)和衰减或抑制核苷酸序列在微生物中的表达的那些序列(如，衰减信号或阻遏序列)。通过去除或缺失调节序列来调节感兴趣基因的表达也包括在本发明的范围内。例如，可去除参与转录负调节的序列以使感兴趣基因表达增强。
在一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括可操作地连接启动子或启动子序列的编码至少一个细菌基因产物(如，泛酸生物合成酶，异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶和/或HMBPA生物合成酶)的核酸序列或基因。本发明优选的启动子包括芽孢杆菌启动子和/或噬菌体启动子(如，感染芽孢杆菌的噬菌体)。在一个实施方案中，启动子是芽孢杆菌启动子，优选强芽孢杆菌启动子(如，芽孢杆菌中与生物化学管家基因关联的启动子或芽孢杆菌中与糖酵解途径基因关联的启动子)。在另一个实施方案中，启动子是噬菌体启动子。在优选实施方案中，启动子来自噬菌体SP01。在尤其优选实施方案中，启动子选自P15，P26或Pveg，具有例如下列各序列：GCTATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGTACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(SEQ ID NO：1)，GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGCAGGACGC(SEQ ID NO：2)，和GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCAATG(SEQ IDNO：3)。其它优选的启动子包括tef(翻译延伸因子(TEF)启动子)和pyc(丙酮酸羧化酶(PYC)启动子)，它们可以启动在芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)中高水平表达。其它优选的启动子，例如，当用于革兰氏阳性微生物时，包括但不限于amy和SPO2启动子。其它优选的启动子，例如，当用于革兰氏阴性微生物时，包括但不限于cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIQ，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL。
在另一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括一个或多个终止序列(如，转录终止序列)。术语“终止序列”包括起终止mRNA转录作用的调节序列。终止序列(或串联转录终止子)可进一步起稳定mRNA(如，通过给mRNA添加结构)的作用，以例如抗核酸酶。
在再一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括这样的序列，该序列使得含有它的载体能得以检测，即，可检测和/或可选择标记，例如，编码抗生素抗性序列或能克服营养缺陷突变的基因，例如，trpC，药物标记，荧光标记，和/或比色标记(如，lacZ/β-半乳糖苷酶)。在再一个实施方案中，本发明的重组核酸分子包括人工核糖体结合位点(RBS)或可转录为人工RBS的序列。术语“人工核糖体结合位点(RBS)”包括mRNA分子内(如，DNA内编码的)与核糖体结合(如，以启动翻译)的位点，该位点与天然RBS(如，天然基因中发现的RBS)至少有一个核苷酸不同。优选的人工RBS包括大约5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24，25-26，27-28，29-30或更多个核苷酸，其中大约1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-15或更多个核苷酸与天然RBS(如，感兴趣基因的天然RBS，例如，天然panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO：4)或天然panD RBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG(SEQ ID NO：5))不同。
优选，对差异核苷酸进行置换使它们等同于最佳比对进行比较时理想RBS中的一个或多个核苷酸。理想RBS包括，但不限于，AGAAAGGAGGTGA(SEQ ID NO：6)，TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG(SEQ ID NO：7)，TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG(SEQ IDNO：8)，AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG(SEQ ID NO：9)，和AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG(SEQ ID NO：10)。人工RBS可用于替代与特定基因关联的天然存在的或天然RBS。优选人工RBS增强特定基因的翻译。优选的人工RBS(如，增加panB，例如，芽孢杆菌panB翻译的RBS)包括CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO：11)和CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO：12)。优选的人工RBS(如，增加panD，例如，芽孢杆菌panD翻译的RBS)包括TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG(SEQ ID NO：13)，TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG(SEQ ID NO：14)，TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG(SEQ ID NO：15)，TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG(SEQ ID NO：16)，ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG(SEQ ID NO：17)，ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG(SEQ IDNO：18)和ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG(SEQ IDNO：19)。
本发明进一步公开了包括这里所述的核酸分子(如，基因或包含所述基因的重组核酸分子)的载体(如重组载体)。术语“重组载体”包括已经被改变，修饰或改造从而含有与此重组载体所来源的天然或自然核酸分子中所包含的序列相比较多，较少或不同的核酸序列的载体(如，质粒、噬菌体、噬粒、病毒、粘粒或其它纯化的核酸载体)。优选，重组载体包括可操作地连接如这里定义的调节序列(例如，启动子序列，终止序列和/或人工核糖体结合位点(RBS))的编码生物合成酶的基因或包含所述基因的重组核酸分子。在另一个实施方案中，本发明的重组载体包括可以增强在细菌中的复制的序列(如，增强复制序列)。在一个实施方案中，增强复制序列在大肠杆菌中起作用。在另一个实施方案中，增强复制序列来自pBR322。
在另一个实施方案中，本发明的重组载体包括抗生素抗性序列。术语“抗生素抗性序列”包括促进或使宿主生物(如，芽孢杆菌)抵抗抗生素的序列。在一个实施方案中，抗生素抗性序列选自cat(氯霉素抗性)序列，tet(四环素抗性)序列，erm(红霉素抗性)序列，neo(新霉素抗性)序列，kan(卡那霉素抗性)序列和spec(壮观霉素抗性)序列。本发明的重组载体可进一步包括同源重组序列(如，设计以允许感兴趣基因重组到宿主生物的染色体中的序列)。例如，bpr，vpr，或amyE序列可用作同源靶标以实现向宿主染色体中的重组。本领域技术人员也将领会到载体的设计可根据如选择的待被遗传改造的微生物，期望的基因产物表达水平等等因素来载定。
IV.重组微生物
本发明进一步公开了包括如这里所述的载体或基因(如，野生型和/或突变基因)的微生物，即重组微生物。这里使用的术语“重组微生物”包括已经被遗传改变、修饰或改造(如遗传工程化)以致与它所来源的天然微生物相比显示出改变、修饰或不同的基因型和/或表型(如，当遗传学修饰影响该微生物的编码核酸序列时)的微生物(如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)。
在一个实施方案中，本发明的重组微生物是革兰氏阳性生物(如，由于存在革兰氏阳性壁围绕生物体而保持碱性染色，例如，结晶紫的微生物)。在优选实施方案中，重组微生物是属于选自芽孢杆菌属、棒杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属和链霉菌属的属的微生物。在更优选实施方案中，重组微生物是芽孢杆菌属的微生物。在另一个优选实施方案中，重组微生物选自枯草芽孢杆菌，缓病芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌，泛酸芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，耐芽孢杆菌和其它1组芽孢杆菌种(例如，以16S rRNA型表征的种)。在另一个优选实施方案中，重组微生物来自短芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一个优选实施方案中，重组微生物选自地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。
在另一个实施方案中，重组微生物是革兰氏阴性(不接受碱性染色)生物。在优选实施方案中，重组微生物是选自沙门氏菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，沙雷氏菌属和变形杆菌属的属的微生物。在更优选实施方案中，重组微生物是埃希氏菌属的微生物。在甚至更优选的实施方案中，重组微生物是大肠杆菌。在另一个实施方案中，重组微生物是酵母属微生物(如，酿酒酵母(S.cerevisiae))。
本发明优选的“重组”微生物是具有去调节的泛酸生物合成途径或酶，去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径或酶和/或修饰的HMBPA生物合成途径或酶的微生物。术语“去调节的”或“去调节”包括改变或修饰微生物的至少一个编码生物合成途径中的酶的基因，使微生物中的该生物合成酶的水平或活性改变或变动。优选，改变或修饰至少一个编码生物合成途径中的酶的基因使基因产物增多或增加。短语“去调节的途径”也可以包括这样的生物合成途径，其中一个以上编码生物合成途径中的酶的基因被改变或修饰，以致一个以上的生物合成酶的水平或活性发生改变或变动。使微生物的生物学途径“去调节”的能力(如同时去调节给定生物合成途径中的一个以上基因)在有些情况下源自微生物的一种特殊现象，即微生物中一个以上的酶(如，两个或三个生物合成酶)可以由术语称作“操纵子”(见这里的定义)的连续基因物质上彼此邻近存在的基因编码。由于包括在操纵子中的基因的协调调节，单一启动子和/或调节元件的改变或修饰即可导致该操纵子编码的每个基因产物的表达都发生改变或变动。调节元件的改变或修饰可包括，但不限于，去除内源性启动子和/或调节元件，添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子或去除调节序列使基因产物表达被改变，改变操纵子在染色体中的位置，改变与操纵子相邻的或位于操纵子内的核酸序列如核糖体结合位点，增加操纵子的拷贝数量，修饰参与操纵子转录和/或操纵子的基因产物翻译的蛋白(如，调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活物等等)，或本领域中使基因表达去调节的任何其它常规方法(包括但不限于反义核酸分子的使用，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。去调节也可涉及改变一个或多个基因的编码区，以得到例如可抵抗反馈作用或具有更高或更低的比活性的酶。
在另一个优选实施方案中，设计或改造重组微生物使至少一个泛酸生物合成酶、至少一个异亮氨酸-缬氨酸生物合成酶和/或至少一个HMBPA生物合成酶过表达。术语“过表达的”或“过表达”包括基因产物(如生物合成酶)的表达水平比该微生物操作前的表达水平高或比未接受操作的可比较微生物中的表达水平高。在一个实施方案中，微生物可被遗传设计或改造以过表达基因产物，从而使基因产物水平比没有被改造的可比较微生物中的表达水平高。
遗传学改造可包括，但不限于，改变或修饰与特定基因表达关联的调节序列或位点(如，添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子或去除调节序列使表达成为组成型的)，改变特定基因的染色体位置，改变与特定基因邻近的核酸序列如核糖体结合位点，增加特定基因的拷贝数量，修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白(如，调节蛋白、抑制因子、增强子、转录激活物等等)，或本领域中使特定基因表达去调节的其它任何常规方法(包括但不限于反义核酸分子的使用，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。遗传学改造也可包括缺失基因，例如，以阻断生物学途径或去除阻遏蛋白。
在另一个实施方案中，可从物理上或环境上操作微生物以过表达基因产物，使基因产物水平高于微生物操作前的表达水平或高于没有被操作的可比较微生物中的表达水平。例如，可以在存在已知或猜测可以增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的试剂时培养微生物或用这些试剂处理微生物，使转录和/或翻译增强或增加。可供选择地，可以在能增加特定基因转录和/或特定基因产物翻译的选择温度下培养微生物，使转录和/或翻译增强或增加。
V.重组微生物的培养和发酵
术语“培养”包括使本发明的活微生物维持和/或生长(如，使培养物或菌株维持和/或生长)。在一个实施方案中，在液体培养基中培养本发明的微生物。在另一个实施方案中，在固体或半固体培养基中培养本发明的微生物。在优选实施方案中，在包含对微生物的维持和/或生长而言必需或有益的营养物质(如，碳源或碳底物，例如碳水化合物，碳氢化合物，油，脂，脂肪酸，有机酸和醇；氮源，例如，胨，酵母提取物，肉膏，麦芽汁，尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如，磷酸，其钠和钾盐；微量元素，例如，镁，铁，锰，钙，铜，锌，硼，钼，和/或钴盐；以及生长因子如氨基酸，维生素，生长促进剂等等)的培养基(如，无菌的液体培养基)中培养本发明的微生物。
优选，在受控pH下培养本发明的微生物。术语“受控pH”包括可以引起期望产物(如，泛解酸和/或泛酸)产生的任何pH。在一个实施方案中，在大约pH7培养微生物。在另一个实施方案中，在6.0和8.5之间的pH培养微生物。期望的pH可以通过本领域技术人员所知的任何方法维持。
也优选，在受控通气下培养本发明的微生物。术语“受控通气”包括足以导致期望产物(如，泛解酸和/或泛酸)产生的通气(如，氧气)。在一个实施方案中，通风由调节培养物中的氧水平来控制，例如，由调节溶解在培养基中的氧量来控制。优选，通过搅拌培养物来控制培养物的通气。搅拌可以用螺旋桨或类似机械搅拌装置，用旋转或摇动培养容器(如，管或烧瓶)或用各种泵装置来提供。可以使无菌空气或氧气通过培养基(如，通过发酵混合物)进一步控制通气。也优选，在没有过量泡沫(如，通过添加消泡剂)的条件下培养本发明的微生物。
此外，可在受控温度下培养本发明的微生物。术语“受控温度”包括可以引起期望产物(如，泛解酸和/或泛酸)产生的任何温度。在一个实施方案中，受控温度包括15℃和95℃之间的温度。在另一个实施方案中，受控制温度包括15℃和70℃之间的温度。优选温度是20℃至55℃，更优选30℃至50℃。
可以在液体培养基中培养(如维持和/或生长)微生物，优选利用常规培养方法如固定培养、试管培养、摇动培养(如，旋转摇动培养，摇瓶培养等)、通风旋转培养或发酵，连续或间断地培养。在优选实施方案中，在摇瓶中培养微生物。在更优选实施方案中，在发酵罐中(如，发酵方法)培养微生物。本发明的发酵方法包括但不限于分批发酵、补料分批发酵和连续发酵过程或方法。短语“分批方法”或“分批发酵”是指培养基、养料、补充添加剂等等的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行改变的系统，然而，可以尝试控制如pH和氧气浓度等因素以防止过度培养基酸化和/或微生物死亡。短语“补料分批方法”或“补料分批”发酵是指随着发酵的进行添加(如，递增或连续添加)一种或多种底物或补充物的分批发酵。短语“连续方法”或“连续发酵”是指这样的系统，其中将规定的发酵培养基连续添加到发酵罐中同时移去等量使用过的培养基或“条件”培养基，优选用于回收期望产物(如泛解酸和/或泛酸)。已经开发出多种此类方法，且它们是本领域熟知的。
短语“在使期望化合物产生的条件下培养”包括在适宜或足以产生期望化合物或使所生产的特定化合物达到期望量的条件下(如，温度，压力，pH，持续时间等)对微生物进行维持和/或生长。例如，可以使培养持续足以产生期望量化合物(如，泛解酸和/或泛酸)的时间。优选，培养持续足以基本达到适当化合物产量的时间(如，足以达到适当的泛解酸和/或泛酸浓度或适当的泛解酸和/或泛酸：HMBPA比率的时间)。在一个实施方案中，持续培养大约12至24小时。在另一个实施方案中，持续培养24至36小时，36至48小时，48至72小时，72至96小时，96至120小时，120至144小时，或超过144小时。在再一个实施方案中，在可导致大约36小时内产生至少大约5至10g/L化合物，大约48小时内产生至少大约10至20g/L化合物，或大约72小时内产生至少大约20至30g/L化合物的条件下培养微生物。在再一个实施方案中，在能够于大约36小时内产生至少大约5至20g/L化合物，大约48小时内产生至少大约20至30g/L化合物，大约72小时内产生至少大约30至50或60g/L化合物的条件下培养微生物。在另一个实施方案中，在使HMBPA∶HMBPA+泛酸比率达到0.1∶100或更低(即，0.1％HMBPA∶99.9％泛酸，例如，按使用HPLC分析产物样品时比较峰面积所确定的)的条件下培养微生物，优选此比率达到0.2∶100或更低(0.2％HMBPA∶99.8％泛酸)，更优选达到0.5∶100或更低(0.5％HMBPA∶99.5％泛酸)。在再一个实施方案中，在使HMBPA∶HMBPA+泛酸比率达到1∶100或更低(即，1％HMBPA∶99％泛酸，例如，当用HPLC分析产物样品时比较峰面积所测定的)的条件下培养微生物，优选此比率达到2∶100或更低(2％HMBPA∶98％泛酸)，更优选达到3∶100或更低(3％HMBPA∶97％泛酸)，更优选达到4∶100或更低(4％HMBPA∶96％泛酸)，5∶100或更低(5％HMBPA∶95％泛酸)，6∶100或更低(6％HMBPA∶94％泛酸)，7∶100或更低(7％HMBPA∶93％泛酸)，8∶100或更低(8％HMBPA∶92％泛酸)，9∶100或更低(9％HMBPA∶91％泛酸)或10∶100或更低(10％HMBPA∶90％泛酸)。
本发明的方法还可以包括回收期望化合物(如，泛解酸和/或泛酸)的步骤。术语“回收”期望化合物包括从培养基中提取，收获，分离或纯化化合物。可根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法回收化合物，这些方法包括但不限于用传统树脂处理(如，阴离子或阳离子交换树脂，非离子吸收树脂等)，用传统吸附剂处理(如，活性炭，硅酸，硅胶，纤维素，矾土等)，改变pH，溶剂提取(如，用常规溶剂如醇、乙酸乙酯、己烷等等)，透析，过滤，浓缩，结晶，重结晶，pH调节，冷冻干燥等等。例如，从培养基中回收化合物可以通过首先从培养物中移出微生物来进行。然后可以使培养基通过或加载于阳离子交换树脂上以去除阳离子，然后通过或加至阴离子交换树脂上以去除无机阴离子和比感兴趣化合物具有更强酸性的有机酸。所得化合物可随后转变成如这里所述的盐(如，钙盐)。
优选，“提取”、“分离”或“纯化”本发明的期望化合物使所得制品基本上不含其它培养基成分(如，不含培养基成分和/或发酵副产物)。短语“基本上不含其它培养基成分”包括其中期望化合物与产生它的培养物中的培养基成分或发酵副产物已相分离的期望化合物制品。在一个实施方案中，该制品中有多于大约80％的期望化合物(干重)(如，少于大约20％的其它培养基成分或发酵副产物)，更优选多于大约90％的期望化合物(如，少于大约10％的其它培养基成分或发酵副产物)，再更优选多于大约95％的期望化合物(如，少于大约5％的其它培养成分物或发酵副产物)，和最优选多于大约98-99％的期望化合物(如，少于大约1-2％的其它培养基成分或发酵副产物)。当期望化合物已经衍生为盐时，优选该化合物进一步不含与形成该盐相关的化学污染物。当期望化合物已经衍生为醇时，优选该化合物进一步不含与醇形成相关的化学污染物。
在可供选择的实施方案中，并不从微生物中纯化期望化合物，例如，当微生物在生物学上无危险性(如，安全)时。例如，可将全部培养基(或培养上清)用作产物(如，粗产物)来源。在一个实施方案中，使用未经修饰的培养物(或培养上清)。在另一个实施方案中，浓缩培养物(或培养上清)。在另一个实施方案中，干燥或冷冻干燥培养物(或培养上清)。
优选，本发明的制备方法导致期望化合物以显著高的产量产生。短语“显著高的产量”包括产量或产出水平足够增高或超过可比较制备方法通常的产量，例如，增高到足以商业化制备期望产物(如，以商业上可行性费用制备产物)的水平。在一个实施方案中，本发明公开了制备方法，包括在使期望产物(如泛解酸和/或泛酸)以高于2g/L的水平产生的条件下培养重组微生物。在另一个实施方案中，本发明公开了制备方法，包括在使期望产物(如泛解酸和/或泛酸)以高于10g/L的水平产生的条件下培养重组微生物。在另一个实施方案中，本发明公开了制备方法，包括在使期望产物(如泛解酸和/或泛酸)以高于20g/L的水平产生的条件下培养重组微生物。在另一个实施方案中，本发明公开了制备方法，包括在使期望产物(如泛解酸和/或泛酸)以高于30g/L的水平产生的条件下培养重组微生物。在另一个实施方案中，本发明公开了制备方法，包括在使期望产物(如泛解酸和/或泛酸)以高于40g/L的水平产生的条件下培养重组微生物。在另一个实施方案中，本发明公开了制备方法，包括在使期望产物(如泛解酸和/或泛酸)以高于50g/L的水平产生的条件下培养重组微生物。在另一个实施方案中，本发明公开了制备方法，包括在使期望产物(如泛解酸和/或泛酸)以高于60g/L的水平产生的条件下培养重组微生物。本发明进一步公开了制备期望化合物的方法，包括在可导致于商业期望时间内产生足够增高水平的化合物的条件下培养重组微生物。
根据所操作的生物合成酶或生物合成酶的组合，为了产生期望化合物，可能期望或需要给本发明微生物提供(如，饲喂)至少一个生物合成前体。术语“生物合成前体”或“前体”包括这样的试剂或化合物，当提供、接触微生物，或包括在微生物的培养基中时其起增强或增加期望产物的生物合成的作用。在一个实施方案中，生物合成前体或前体是门冬氨酸。在另一个实施方案中，生物合成前体或前体是β-丙氨酸。优选添加的门冬氨酸或β-丙氨酸量是可以导致培养基中的浓度足够增加微生物的生产力(如，导致的浓度足以增加泛解酸和/或泛酸产量)的量。本发明的生物合成前体可以以浓缩溶液或悬浮液形式(如，在适宜溶剂，如水或缓冲液中)或固体形式(如，粉末形式)添加。此外，本发明的生物合成前体可以以单份额添加，连续或间断给予给定的一段时间。术语“β-丙氨酸过量”包括使β-丙氨酸水平增加或高于常规用于培养所论微生物的水平。例如，本实施例中所述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0-0.01g/L β-丙氨酸存在下进行。因此，过量β-丙氨酸水平可包括大约0.01-1，优选大约1-20g/L的水平。
在另一个实施方案中，生物合成前体是缬氨酸。在另一个实施方案中，生物合成前体是α-酮异戊酸。优选，缬氨酸或α-酮异戊酸以导致培养基中的浓度足以引起期望化合物(如泛解酸和/或泛酸)产生的量添加。术语“α-KIV过量”包括使α-KIV水平增加或高于常规用于培养所述微生物的水平。例如，本实施例中所述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0-0.01g/L α-KIV存在下进行。因此，过量α-KIV水平可包括大约0.01-1，优选大约1-20g/L α-KIV。术语“缬氨酸过量”包括使缬氨酸水平增加或高于常规用于培养所述微生物的水平。例如，本实施例中所述的芽孢杆菌微生物的培养常规在大约0-0.5g/L缬氨酸存在下进行。因此，过量缬氨酸水平可包括大约0.5-5g/L，优选大约5-20g/L缬氨酸。生物合成前体这里也称作“补充的生物合成底物”。
本发明的另一个方面包括以这里所述的重组微生物为特征的生物转化方法。术语“生物转化方法”，这里也称作“生物转变方法”，包括导致适当底物和/或中间化合物生成(如，转化或转变成)期望产物(如，泛解酸和/或泛酸)的生物学方法。
生物转化反应中使用的微生物和/或酶以允许它们执行预期功能(如，产生期望化合物)的形式存在。微生物可以是整个细胞，或可以仅仅是获得期望的最终结果所需的那些细胞部分。可以将微生物悬浮(如，在适当溶液如缓冲溶液或培养基中)，洗涤(如，洗涤使微生物不含培养基)，丙酮干燥，固定(如，用聚丙烯酰胺凝胶或κ-角叉菜胶或在合成载体，例如，珠，基质等等上)，固着，交联或透化处理(如，透化处理膜和/或壁以便化合物，例如，底物、中间体或产物可更容易通过所述膜或壁)。
VI.泛酸和HMBPA的选择性混合组合物的制备方法
本发明进一步公开了用于制备泛酸和HMBPA的选择性混合组合物的微生物和方法。这里定义的短语“选择性混合组合物”包括以使泛酸与HMBPA比率是受控制特征的形式制备的组合物，即，泛酸与HMBPA的比率是选定的。可以通过操作制备组合物的微生物(即，制备菌株)使一个组分较另一个更有利产生来进行选择。
在一个方面，本发明公开了选择性混合的泛酸：HMBPA组合物的制备方法，包括在使选择性混合的泛酸：HMBPA组合物产生的条件下培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物。在一个实施方案中，在利于泛酸产生的条件下培养微生物。在另一个实施方案中，在利于HMBPA产生的条件下培养微生物。在另一个实施方案中，在利于泛酸产生的稳态葡萄糖受控条件下培养微生物。在另一个实施方案中，在利于HMBPA产生的稳态葡萄糖受控条件下培养微生物。在另一个实施方案中，在利于泛酸产生的稳态溶解氧受控条件下培养微生物。在另一个实施方案中，在利于HMBPA产生的稳态溶解氧受控条件下培养微生物。在另一个实施方案中，在利于泛酸产生的丝氨酸水平受控条件下培养微生物。在一个实施方案中，该组合物以75mol泛酸比25mol HMBPA或更高的比率包括泛酸和HMBPA。在另一个实施方案中，该组合物以90mol泛酸比10mol HMBPA或更高的比率包括泛酸和HMBPA。在另一个实施方案中，该组合物以75molHMBPA比25mol泛酸或更高的比率包括泛酸和HMBPA。在另一个实施方案中，该组合物以90mol HMBPA比10mol泛酸或更高的比率包括泛酸和HMBPA。本文所述值中包括的范围和值和/或这些值的中间值也旨在包括在本发明的范围内。
用下列实施例进一步阐述本发明，这些实施例不应该解释为限制本发明。贯穿本申请引用的所有参考文献，专利和出版的专利申请的内容引入这里作为参考。
                            实施例
实施例I：[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)生物合成途径的发现和表征
在开发芽孢杆菌菌株用于制备泛酸的过程中，对参与泛酸生物合成途径和异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径(图1)的基因和酶进行了各种遗传学操作，如美国专利申请系列号09/400,494和美国专利申请系列号09/667,569所述。例如，具有去调节的panBCD操纵子和/或具有去调节的panE1的菌株显示出泛酸产量增加(当在β-丙氨酸和α-酮异戊酸(α-KIV)存在下培养时)。进一步具有去调节的ilvBN和ilvD的菌株在仅有β-丙氨酸存在时即显示出泛酸产生增加。而且，进一步使panD去调节后可以不用依赖β-丙氨酸。
示例性菌株是PA824，色氨酸原养型微生物，Spec和Tet抗性，在panBCD座位有去调节的panBCD，在panE1座位有去调节的panE1(枯草芽孢杆菌基因组中的两个基因与大肠杆菌panE同源，panE1和panE2，前者编码参与泛酸产生的主要酮泛解酸还原酶，而panE2对泛酸合成没有贡献(美国专利申请系列号09/400,494))，在ilvD座位有去调节的ilvD，在amyE座位ilvBNC盒过表达，而在bpr座位panD过表达。
在下列发酵条件下，PA824常规产生大约20-30g/L泛酸。在这个实施例中用PA824制备泛酸是在14L发酵罐容器中完成的。分批和补料培养基的组成如下。
                 分批
    材料     g/L(最终)
    1     酵母提取物     10
    2     谷氨酸钠     5
    3     (NH4)2SO4     8
    4     KH2PO4     5
    5     K2HPO4     7.6
       灭菌并冷却后添加
    1     葡萄糖     2.5
    2     CaCl2     0.1
    3     MgCl2     1
    4     柠檬酸钠     1
    5     FeSO4·7H2O     0.01
    6     SM-1000X     1ml
分批培养基的终体积是6L。微量元素溶液SM-1000X具有下列组成：0.15g Na2MoO4·2H2O，2.5g H3BO3，0.7g CoCl2·6H2O，0.25g CuSO4·5H2O，1.6g MnCl2·4H2O，0.3g ZnSO4·7H2O，溶于水中(终体积1L)。
将60ml摇瓶PA824培养物(OD＝10在SVY培养基中：740ml H2O水中含Difco小牛肉浸汁25g，Difco酵母提取物5g，谷氨酸钠5g，(NH4)2SO4 2.7g，高压灭菌；添加200ml无菌1M K2HPO4(pH7)和60ml无菌50％葡萄糖溶液(终体积1L))接种于分批培养基中。作为葡萄糖限制的补料分批培养，发酵在43℃运行，空气流速12L/分钟。指数生长期消耗第一批葡萄糖(2.5g/L)。随后通过连续补给如下补料溶液，使葡萄糖浓度维持在0.2-1g/L之间。
          补料
    材料     g/L(最终)
    1     葡萄糖     550
    2     CaCl2     0.1
    3     SM-1000X     3ml
可变补料速度泵由计算机控制且通过算法与罐中的葡萄糖浓度相关联。在这个实施例中，总补料是6L。
发酵过程中，pH设置在7.2。通过与计算机控制连接的pH测定来达到控制。通过补给25％NH3溶液或20％H3PO4溶液维持pH值。NH3同时作为发酵的N源。通过调节搅拌和通气速度，将溶解氧浓度[pO2]设置在30％。添加硅氧烷油控制泡沫。补料溶液添加停止后，在这个实施例中48小时后，继续发酵直到[pO2]值达到95％。接着，通过灭菌30分钟杀死微生物以终止发酵。将发酵肉汤培养物的样品铺在琼脂平板上证实已成功的灭菌。灭菌和离心去除细胞后，发酵肉汤培养物中泛酸滴度是21.7g/L(HPLC分析测定)。
对于HPLC分析，用无菌水稀释发酵肉汤培养物样品(1∶40)。将5μl这种稀释液注射到HPLC柱中(Aqua C18，5μm，150×2.0mm，PhenomenexTM)。柱的温度保持在40℃。流动相A是14.8mM H3PO3，流动相B是100％乙腈。流速恒定为0.5mL/分钟。梯度应用：
开始：      2％流动相B
0-3分钟     线性增加到3％流动相B
3-3.5分钟   线性增加到20％流动相B
UV检测器(210nm)进行检测。运行时间是7分钟，另外3分钟分析后时间(posttime)。泛酸的截留时间是3.9分钟。图4给出了上面提及样品的HPLC色谱。
与截留时间47分钟的峰相关的化合物的鉴定
除了产生显著量的泛酸，在这个系统中还发现具有大约4.7分钟的截留时间的第二种洗脱化合物。发酵中形成的此第二种突出产物被证实是3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)(这里也称作“β-丙氨酸2-(R)-羟基异戊酸”，“β-丙氨酸2-羟基异戊酸”，“β-丙氨酰基-α-羟基异戊酸”和/或“fantothenate”)。反相急骤层析(流动相10mM KH2PO4，其中乙腈含量递增(1-50％))纯化后，通过质谱(图5；相对单一同位素质量189)和1H-和13C-NMR(数据未显示)对其进行了鉴定。通过与[R]-泛酸类比，推测该化合物的不对称碳具有R构型。
为了证实该化合物的身份，按如下特意合成外消旋β-丙氨酸2-羟基异戊酸。将β-丙氨酸(2.73g/30mmol)和甲醇钠(5.67g，甲醇中30％溶液/31.5mmol)溶于甲醇(40mL)中。加入2-羟基异戊酸甲基酯(2-羟基-3-甲基丁酸甲基酯)(3.96g/30mmol)并回流18小时。然后，通过rotavap去除甲醇并用叔丁醇(50mL)替代。添加叔丁醇钾(50mg)并回流26小时。在真空中去除溶剂，将残余物溶解于水中(50mL)并使之通过强酸性离子交换树脂(H+-形式LewatiteTM S 100 G1；100mL)。再加入些水用以洗涤离子交换树脂。合并含水洗脱物，在真空中去除水。残余物接受急骤层析(硅胶；在醋酸乙酯中的2％醋酸作为洗脱剂)并蒸发产物馏分得到固体残余物。残余物从醋酸乙酯/甲苯(分别是10mL/20mL)中再结晶，得到分析纯HMBPA(β-丙氨酸2-羟基异戊酸)，它在质谱仪中显示190(189+H-)的相对单一同位素质量并显示出与发酵得到的产物相同的1H-NMR共振。
图2显示了导致HMBPA产生的生物合成途径。图3描述了[R]-3-(2-羟基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的化学结构。如图2所示，HMBPA是[R]-α-羟基异戊酸(α-HIV)和β-丙氨酸的缩合产物，由PanC酶催化产生。α-HIV是α-KIV还原产生的，该反应是由α-酮还原酶PanE(如，PanE1和/或PanE2)和/或IlvC催化的反应。
基于化学结构和引起HMBPA产生的生物合成途径，本发明人制定了下列模型以描述以前已知的泛酸和异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径和新表征的HMBPA生物合成途径之间的相互作用。该模型在至少一个方面显示了在微生物中存在至少两个途径竞争α-KIV(生物合成酶PanB的底物)，这两个途径即泛酸生物合成途径和HMBPA生物合成途径。(竞争α-KIV的第三个和第四个途径是导致从α-KIV产生缬氨酸或亮氨酸的途径，见如图1)。泛酸生物合成途径和HMBPA生物合成途径至少还产生竞争酶PanC的底物，即α-HIV和泛解酸。HMBPA的产生对泛酸的产生有显著影响。最重要地，HMBPA途径与泛酸途径竞争前体(α-KIV和β-丙氨酸)和一些酶(PanC，PanD，PanE1和/或IlvC)。另外，因为HMBPA的结构与泛酸的结构相似，它可能具有负面调节泛酸途径中一个或多个步骤的不受欢迎的性能。该模型预示，使泛酸生物合成过程与HMBPA生物合成过程相比能更有利地利用底物(α-KIV和β-丙氨酸)和/或酶（PanC，PanD，PanE1和/或IlvC)的任何方法均可改进或优化泛酸的制备。
最大化泛解酸和/或泛酸产量同时最小化HMBPA产量的优选方法是增加细胞中PanB的活性，因为这将降低可用于α-HIV合成的α-KIV量，同时促进酮泛解酸和泛解酸的合成。增加活性的方法包括过表达panB基因，增加此基因的拷贝数量，通过突变或通过降低辅酶A水平增加酶的比活性和/或减轻对酶的抑制。较高的泛解酸水平通过与α-HIV竞争蠃得PanC又可以增加泛酸合成和降低HMBPA合成。
最大化泛酸合成的另一个方法是优化panE1表达水平。这里证明，PanE1产生增加将导致以泛酸为代价增加HMBPA的合成。因此，引起PA824或PA668中panE1表达水平适度降低(即，精确调节panE1表达水平)将导致HMBPA合成降低和泛酸合成增加。而且，如实施例II所示，panE2缺失可显著降低HMBPA合成。
与HMBPA合成相对立增加泛解酸和/或泛酸合成的其它方法包括优化细胞中α-KIV的产生水平和/或分离增加优选泛解酸作为底物的改变的PanC蛋白。
下列实施例为这里所述的模型提供了实验支持并进一步示例了基于此模型而增加泛解酸和/或泛酸产量(相对于HMBPA水平)的方法。
实施例II-VIII：
对于实施例II-VI，泛酸和/或HMBPA的定量按如下进行。在注射到Phenomenex AquaTM 5μC18 HPLC柱(250x 4.60mm，125A)上前于水中或5％乙腈中将发酵培养物等分试样1∶100稀释而将试管培养物等分试样1∶10稀释。流动相是A＝5％乙腈，用磷酸调节到pH2.5的50mM磷酸一钠缓冲液；和B＝95％乙腈，5％H2O。
线性梯度如下。
  分钟   溶剂A   溶剂B
  016172021   100％100％0％0％100％   0％0％100％100％0％
另外的参数和装置如下：流速＝1.0ml/分钟；注射体积＝20μl；检测器＝Hewlett Packard 1090系列DAD UV检测器-3014，信号A＝197nm，ref.＝450nm，固件版E；柱加热器＝烤箱温度40℃；硬件＝Hewlett PackardKayakTM XA；和软件＝Hewlett Packard Chemstation PlusTM家庭版A.06.03[509]。
在这个系统中，HMBPA在大约13分钟洗脱。
实施例II：从泛酸制备菌株中缺失PanE2来降低HMBPA合成
如实施例I所述，在过表达panE1的微生物中首次观察到HMBPA产生，表明酮泛解酸还原酶不仅能够催化酮泛解酸还原为泛解酸，而且能够催化α-酮异戊酸还原为2-羟基异戊酸。如前提及，枯草芽孢杆菌基因组中的两个基因与编码酮泛解酸还原酶的大肠杆菌panE基因同源，这两个基因被命名为panE1和panE2。在芽孢杆菌中，已经证明panE1基因编码参与泛酸产生的主要酮泛解酸还原酶，而panE2对泛酸合成没有贡献。而且，pAN238中P26panE2盒使panE2(SEQ ID NO：25)的过表达可以引起泛酸滴度下降(如见，美国专利申请系列号09/400,494)。考虑到PanE2和panE1基因产物之间的同源性和panE2过表达可造成生产方向背离泛解酸/泛酸合成的事实，我们就panE2是否能以任何显著方式对HMBPA产生作出贡献进行了测试。推测，panE2基因产物是能够将α-KIV还原为α-HIV的酶，但是其不能明显将酮泛解酸还原为泛解酸。
为了检验该假说，用来自菌株PA248(ΔpanE2∷cat)(如SEQ ID NO：24所示，构建参见美国专利申请系列号09/400,494)的染色体DNA的ΔpanE2∷cat盒转化泛酸生产株PA824(如实施例I所述)，从中缺失panE2得到菌株PA919。生长在SVY加β-丙氨酸的测试管培养基中的三个PA919分离株与PA824就泛酸和HMBPA的产量进行比较。
表1.在SVY葡萄糖+β-丙氨酸5的48小时测试管培养物中43℃生长的PA824和PA880衍生物产生的泛酸和HMBPA.
菌株      新性状                      亲本  OD600  [pan]g/l  [HMBPA]g/l
PA824     -PA880     ΔcoaX                      PA824PA894     ΔcoaX，coaA(S151L)，cat    PA880PA911-5   P26，anB@vpr，ΔcoaX       PA880PA911-8   P26，anB@panB，ΔcoaX      ″PA919-1   ΔpanE2∷cat                P824PA919-2   ″                          ″PA919-3   ″                          ″  13.916.414.913.413.813.214.818.0  4.35.14.95.36.14.23.85.5  0.640.480.470.400.450.150.130.14
如表1数据显示，PA919的所有三个菌株比PA824产生低大约4倍的HMBPA，证明panE2基因产物对HMBPA产生有贡献且证明简单缺失panE2可至少部分消除HMBPA的产生，而泛酸的产生没有损失。
实施例III.HMBPA生产和泛酸生产反向相关。
从PA365(PA377的RL-1谱系等同物，美国专利申请系列号09/667,569中描述)构建如下菌株，该菌株缺失P26panBCD盒并含有在vpr座位扩增的P26panC*D盒，和在bpr座位扩增的野生型P26panB盒(PA666)或P26ΔpanB盒(PA664)，其构建方式如下。图6显示了已知或推测的PanB蛋白的C末端氨基酸比对。鉴定到具有保守或半保守氨基酸残基的称作1，2和3的三个区域，这些区域在图顶部以箭头指出。枯草芽孢杆菌PanB蛋白(RBS02239)以下划线显示。两个PanB蛋白(RCY14036和CAB56202.1)缺失区域3，后一个PanB蛋白还缺失区域2且无保守氨基酸残基占据区域1。
创建缺失区域1，2和3的枯草芽孢杆菌PanB变异体。设计3’PCR引物扩增枯草芽孢杆菌PanB基因使区域3，区域2和3，或所有三个区域从最终产物中缺失，从而创建期望变异体。产生PCR产物并克隆入大肠杆菌表达载体pASK-1BA3中，分别产生质粒pAN446，pAN447和pAN448。接着用这些质粒转化含有panB6突变的大肠杆菌株SJ2以检测互补作用。仅缺失区域3的pAN446能够互补。这表明区域3对于枯草芽孢杆菌PanB活性不是必需的，但区域2是活性或稳定性所必需的。
这个分析中的下一步是从pAN446将panB基因转移到枯草芽孢杆菌表达载体中，然后将其导入适合测试编码的PanB蛋白在枯草芽孢杆菌中的活性的菌株中。为此，首先创建缺失了P26panBCD操纵子的菌株。这是通过首先在恰位于panB RBS上游的BseRI位点和位于panD中的BglII位点之间插入cat基因，创建质粒pAN624(SEQ ID NO：20)(图7)而完成的。去除了所有panB和panC的所得缺失-置换突变(ΔpanBCD∷cat624)通过转化交换进入PA354，在补充1mM泛酸的平板上选择氯霉素抗性。保留一个转化体并命名为PA644。PCR分析从PA644分离的染色体DNA，证明含有此缺失-置换突变。如所期望的，PA644生长需要泛酸，但其保留了PA354中最初存在的改造的ilv基因(P26ilvBNC P26ilvD)以及P26pan E1基因。因此，除PanB外，该菌株过量产生参与泛解酸合成的所有酶。将含有最短panB缺失的基因插入到枯草芽孢杆菌表达载体pOTP61(美国专利申请系列号09/667,569描述)中，创建质粒pAN627。同时，将野生型panB对照基因插入到pOTP61中，创建质粒pAN630。连接缺少大肠杆菌载体序列的每个质粒的NotI片段并转化PA644，选择四环素抗性。
每次转化保留一个转化体并进一步用来自PA628的染色体DNA转化，选择Pan+。PA628含有整合在vpr座位的多拷贝P26panC*D表达质粒(pAN620)。为了确定panB基因突变对泛酸生产的直接影响，图8所示质粒pAN620(SEQ ID NO：21)提供了泛酸合成所需的剩余两个酶(PanC和PanD)。每次转化后分离四个转化体，在含10g/L门冬氨酸的SVY培养基中生长48小时，然后检测泛酸产量。具有3’缺失的panB基因的转化体命名为PA664，那些含有野生型基因的命名为PA666。数据表明PA664中3’缺失的panB基因编码活性大大降低的panB蛋白。为了检测HMBPA产量，PA365、PA666和PA664的测试管培养物在SVY+门冬氨酸培养基中生长48小时，培养基中有或没有添加α-KIV或泛解酸，然后如前所述检测HMBPA和泛酸。
表2.PanB活性和添加前体对HBPA和泛酸产量的影响，48小时测试管培养物数据，SVY+门冬氨酸(10g/L)培养基。
无添加      +α-KIV(5g/L)       +泛解酸(5g/L)
菌株 pan操纵子 panC*D   PanB质粒      质粒   [pan]    HMBPA(g/L)    峰*   [pan]    HMBPA(g/L)    峰   [pan]    HMBPA(g/L)    峰
  PA365PA666PA664   P26panBCDΔpanBCD∷catΔpanBCD∷cat 无        无pAN620    pAN630pAN620    pAN627   3.0      0.713.7      0.550.3      1.39   3.2      1.283.3      1.700.6      1.76   4.8      0.385.2      0.262.5      0.74
*HMBPA峰＝峰面积×10-3
表2提供的数据证明缺乏补充物时，PA666产生HMBPA最少，而PA664产生最多，表明PanB活性和HMBPA产生之间为反向相关。这与预言此两个途径将竞争α-KIV(PanB底物)和产生竞争PanC的底物的模型相一致；降低PanB活性预期将增加可用于α-HIV合成的α-KIV并由此降低泛解酸的合成量。当将α-KIV添加到培养基中，所有三株产生明显更多的HMBPA。这个结果暗示α-KIV是HMBPA的前体(如图2所示)，并且过量α-KIV将利于HMBPA产生。这个结果也提示造成HMBPA合成的至少部分原因是过量α-KIV产生的溢出作用。当将泛解酸添加到培养基中，所有三株的HMBPA粗略降低百分之50。相反，所有菌株都产生明显更多的泛酸。这个结果也与此两个途径产生竞争PanC的底物(α-HIV和泛解酸)的模型相一致。总之，上述结果进一步表明泛解酸合成增加应该对促进泛酸产生以及降低HMBPA水平有益。而且，降低泛解酸合成的因素也会负面影响泛酸合成。
实施例IV.增加PanB和/或调节PanE1对泛酸产量的影响
PA668是PA824的衍生物，含有在vpr或panB座位扩增的P26panB额外拷贝。PA668使用panB表达载体(pAN636，SEQ ID NO：22)构建(图9)，此载体允许用氯霉素选择多拷贝。连接无大肠杆菌载体序列的pAN636NotI限制性片段，接着用于转化PA824，在含5μg/ml氯霉素的平板上选择。分离抵抗30μg/ml氯霉素的转化体并在48小时测试管培养物中筛选泛酸产生。经证实的分离株产生少于PA824的HMBPA(相反，产生比PA824多大约百分之10的泛酸)。构建第二株，称作PA669，它是含有在vpr或panE1座位扩增的额外拷贝P26panE1的PA824。用自连接的质粒pAN637NotI片段(SEQ ID NO：23)(图10)转化PA824构建菌株PA669，选择氯霉素抗性。选择两株PA669分离株进行进一步研究；SDS-PAGE分析由两株制备的全部细胞提取物，判定PA669-5比PA669-7产生较少的PanE1。
菌株PA824、PA668-2、PA668-24和两个PA669分离株(PA669-5和PA669-7)的测试管培养物在三种不同的培养基(SVY，SVY+门冬氨酸，和SVY+门冬氨本酸+泛解酸)中生长48小时，然后检测泛酸、HMBPA和β-丙氨酸(表3)。
表3.额外拷贝的panB和panE1对PA824的泛酸和HMBPA产生的影响，48小时测试培养物数据，SVY培养基。
无添加剂 +门冬氨酸(10g/L)         +门冬氨酸(10g/L)& 泛解酸(5g/L)
菌株 PanB      Pane质粒      质粒  [pan]    [α-ala](g/L)    (g/L) HMBPA*   [pan]    [α-ala](g/L)    (g/L) HMBPA [pan]   [α-ala](g/L)   (g/L) HMBPA
  PA824PA668-2PA668-24PA669-5PA669-7 无        无pAN636    无pAN636    无无        pAN637无        pAN637  1.8      0.051.5      ＜0.041.8      0.051.8      0.041.8      0.06 ＜0.1＜0.1＜0.1＜0.1＜0.1   4.7      2.55.0      1.64.9      2.84.2      3.13.7      3.2   0.53＜0.100.340.741.41 5.6     2.54.9     1.26.1     2.65.8     2.65.2     2.5   ＜0.10＜0.10＜0.100.300.75
*HMBPA＝峰面积×10-3
在SVY培养基中，没有菌株产生可检测量的HMBPA。所有菌株产生粗略等同量的泛酸和少量β-丙氨酸，表明在这些培养物中β-丙氨酸对于泛酸和HMBPA的合成有限制作用，而且β-丙氨酸是两种化合物的前体。当在SVY+门冬氨酸培养基中生长时，两个PA669分离株产生的HMBPA比PA824产生的多，而两个PA668分离株产生的HMBPA比PA824产生的少。值得注目的是产生PanE1最多的菌株(PA669-7)产生HMBPA最多(而泛酸最少)。这提示高水平PanE1利于HMBPA产生，但代价是较低的泛酸合成。此外，有趣的是，PA668-24产生的HMBPA比PA668-2多，但两个菌株提取物的SDS-PAGE分析表明它们产生粗略等同水平的PanB。SDS-PAGE分析也表明PA668-24比PA668-2产生多得多的IlvC。基于这些数据，我们提出IlvC通过增加稳态水平的α-KIV和/或通过催化α-KIV形成α-HIV来影响HMBPA合成，由此解释了所观察到的向HMBPA产生的偏移。
表3的最后一组数据表明，向生长培养基中添加泛解酸使以前产生可检测水平的HMBPA的所有菌株现产生减少的HMBPA(通过例如使合成移向泛酸方向)。这进一步支持α-HIV和泛解酸是PanC的竞争性底物的模型。
实施例V：通过降低制备菌株中的泛酸激酶增加泛酸合成
增加泛酸产量的一个策略是降低制备菌株中泛酸激酶的活性量。泛酸激酶是从泛酸到辅酶A这一途径中的第一个酶。推测，泛酸激酶活性较低将导致稳态水平的辅酶A较低，而这又将导致较高的PanB酶活性和较高的泛酸滴度。如美国专利申请09/667,569所述，已经鉴定到枯草芽孢杆菌中都编码泛酸激酶的两个独立基因：1)coaA，它与必需大肠杆菌泛酸激酶基因同源；和2)coaX，它是一个新的细菌泛酸激酶基因。
coaA或coaX可从野生型枯草芽孢杆菌菌株中缺失而对在丰富或基本培养基上的生长没有任何明显影响。然而，不可能产生两个基因都缺失的菌株，这提示一个或另一个对生活力是必需的。因此，构建缺失coaX的菌株，然后使coaA突变以降低CoaA酶比活性。尽管具有ΔcoaX和突变coaA的菌株的表型不十分明显，但数据与限制泛酸激酶活性可增加PanB活性的假设相一致。而这又可以降低HMBPA产量并增加泛酸产量。
将ΔcoaX和突变coaA等位基因安装到PA824中。
用PA876(PY79ΔcoaX∷kan)染色体DNA转化PA824赋予卡那霉素抗性，如美国专利申请09/667,569所述，得到PA880，从而一步完成从PA824删除coaX。PA880和PA876中的coaX缺失最终来源于质粒pAN336(SEQ ID NO：26，见美国专利申请系列号09/667,569)。接下来，按如下导入野生型coaA基因对照版和coaA的两个突变等位基因。通过使用质粒转化赋予氯霉素抗性，将对照和两个突变等位基因首先导入野生型菌株PY79的染色体中，接着用这些中间菌株的染色体DNA转化PA880以赋予氯霉素抗性。用于掺入对照和突变等位基因的质粒是pAN294(SEQ IDNO：27，见美国专利申请系列号09/667,569)、pAN343和pAN344。pAN343几乎与pAN294等同，除了它在pAN294的碱基第3228位含有T到C的改变。类似，pAN344在pAN294的碱基第3217和3218位具有CC到TA的改变。所有三个质粒均具有氯霉素抗性基因(cat)置换恰位于coaA下游的未知功能的非必需基因，yqjT。通过pAN294(野生型coaA，yqjT∷cat)，pAN343(coaA2 Y155H，yqjT∷cat)，和pAN344(coaA2S151L，yajT∷cat)的双交换从PY79得到的中间菌株分别命名为PA886，PA887，和PA888。接下来，用来自PA886、PA887或PA888的染色体DNA将PA880转化为氯霉素抗性，分别得到菌株PA892(野生型coaA，cat)，PA893(coaA Y155H，cat)，和PA894(coaA S151L，cat)。对coaA基因进行PCR并实施NlaIII消化，以检测PA893的八个候选物是否获得Y155H突变，所有八个都是正确的。
检测每个新菌株(包括PA880)的几个候选物在43℃及SVY培养基加5g/lβ-丙氨酸中生长时标准测试管培养物中泛酸的产量(见表4)。
表4.在43℃，SVY葡萄糖+β-丙氨酸的48小时测试管培养物中coaX缺失且coaA突变的PA824衍生物产生的泛酸和fantothenate。
菌株     coaA          coaX  OD600  [pan]g/l  [HMBPA]g/l
PA824    wt            wtPA824    wt            wtPA880    wt            ΔPA880    wt            ΔPA892-1  wt，cat       ΔPA892-2  wt，cat       ΔPA892-3  wt，cat       ΔPA893-1  Y155H，cat    ΔPA893-2  Y155H，cat    ΔPA893-3  Y155H，cat    ΔPA893-4  Y155H，cat    ΔPA893-5  Y155H，cat    ΔPA893-8  Y155H，cat    ΔPA894-1  S151L？，cat  ΔPA894-2  S151L？，cat  ΔPA894-3  S151L？，cat  ΔPA894-4  S151L？，cat  ΔPA894-5  S151L？，cat  ΔPA894-6  S151L？，cat  ΔPA894-7  S151L？，cat  ΔPA894-8  S151L？，cat  Δ  11.111.411.612.711.713.412.910.712.011.912.811.610.011.615.612.312.211.811.213.113.2  4.44.15.55.14.54.54.84.34.54.74.34.74.74.64.55.05.04.54.74.74.8  0.770.700.330.330.260.260.250.240.250.230.200.280.250.290.270.310.270.260.270.260.32
在含β-丙氨酸的培养基中，PA894(S151L)(但非PA893(Y155H))平均产生比PA892(含野生型coaA的纯合菌株)稍高的泛酸水平。PA880比其纯合亲本PA824(4.4和4.1g/l)产生显著高的泛酸(5.5和5.1g/l)，而比PA894(平均大约4.7g/l)产生稍高的泛酸水平。可能PA892，PA893和PA894(但非PA880)中存在的ΔyqjT∷cat插入具有抵消突变coaA等位基因可能带来的任何收获的作用。
尽管从新菌株得到的泛酸滴度的范围有限，但是观察到非常显著的HMBPA产生模式。在coaX缺失的所有菌株中，HMBPA滴度比PA824低两到三倍。这与HMBPA的产生部分源自PanB活性受限的原则相一致。因此，ΔcoaX可引起panB活性增加。
实施例VI：制备菌株中通过使PanB增加并使泛酸激酶降低来增加泛酸合成
含有设计可通过氯霉素扩增的额外PanB表达盒的PA668(见实施例IV)产生比其前体PA824多的泛酸和少的HMBPA。由于从PA824中缺失coaX也可减少HMBPA产量并适度提高泛酸产量(PA880)，故构建组合此两个改变的菌株并检测泛酸产量。用NotI消化质粒pAN636(图9)，连接成环，并用于转化PA880以赋予氯霉素抗性，得到菌株PA911。用PCR检测PA911的几个分离株以确定质粒是否如期望的在vpr处整合，或在其也可进行整合的panB处整合。两种类型均被发现。在四环素(panD盒)和氯霉素(panB盒)上扩增每个类型的PA911的一个分离株，PA911-5和PA911-8，并检测生长在SVY加β-丙氨酸中的测试管培养物的泛酸产量(见表1)。两个分离株都比它们的亲本PA880产生更多泛酸和稍少HMBPA。而且，与PA668分离株一致，在panB整合了panB盒的PA911-8产生最高水平的泛酸。
实施例VII：增加可用丝氨酸量来增加泛酸产量
我们推测，调节微生物培养物中丝氨酸的可用量也可以控制泛酸与HMBPA的比率。具体地，提出增加丝氨酸可用量可使泛酸生产相对于HMBPA生产增加，而降低丝氨酸可用量将使泛酸生产相对于HMBPA生产降低。这个方法是基于PanB底物(亚甲基四氢叶酸)来自丝氨酸这一理解。因此，调节丝氨酸水平应该能有效调节PanB底物水平。为了检验这个假说，PA824在SVY葡萄糖加5g/L β-丙氨酸和±5g/L丝氨酸的测试管培养基中43℃生长48小时。
表5.添加和不添加丝氨酸时PA824产生的泛酸和HMBPA
  添加5g/L丝氨酸   OD600     [pan]g/L     [HMBPA]g/L
  --++   16.314.013.112.9     4.94.56.46.0     0.840.800.560.62
如表5提供的数据证明，添加丝氨酸可以增加泛酸产生水平，而相反地降低HMBPA产量。作为补给丝氨酸的可替代方案，为了调节泛酸产生水平而增加丝氨酸和亚甲基四氢叶酸水平的另一个方法是增加3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸羟甲基转移酶(分别是serA和glyA基因产物)的合成或活性，由此增加适当改造的微生物中丝氨酸和亚甲基四氢叶酸的生物合成。
实施例VIII：用基于大豆粉的培养基在10L发酵罐中利用PA668-2A和PA668-24菌株制备泛酸
PA668-2A和PA668-24菌株在10L发酵罐中各生长两次。培养基是PFM-155，组成如下。
                      分批
    材料     g/L(最终)
    1     Amberex 1003     5
    2     Cargill 200/20(大豆粉)     40
    3     谷氨酸钠     5
    4     (NH4)2SO4     8
    5     MgSO4·7H2O     1
    6     MAZU DF204C     1
    7     H2O     适量至4L
       灭菌并冷却后添加
  1   KH2PO4   10
  2   K2HPO4·3H2O   20
  3   H2O   适量至400ml
  1   80％葡萄糖   20
  2   CaCl2·2H2O   0.1
  1   柠檬酸钠   1
  2   FeSO4·7H2O   0.01
  3   SM-1000X   1X
              补料
  材料   g/L(最终)
  1   80％葡萄糖   800
  2   CaCl2·2H2O   0.8
  3   H2O   适量至3500ml
     灭菌并冷却后添加
  1   柠檬酸钠   2.0
  2   FeSO4·7H2O   0.02
  3   SM-1000X   2X
  4   谷氨酸钠   5.0
  5   H2O   适量至500ml
在36小时PA668-2A产生的泛酸是45g/L和51g/L，与在相同培养基中常规发酵PA824类似。36小时后，当PA824的泛酸产生常规开始变慢时，PA668-2A发酵物继续生产，在48小时得到63g/l泛酸。最值得注目的是，在48小时HMBPA的产量降低到3-5g/L，并且在发酵早期的大多数时间中不足泛酸的5％。对泛酸合成的清楚益处在PanB水平增加的菌株PA668中是明显的。菌株PA668-24以甚至更快的速度产生泛酸，36小时后两次发酵平均为58g/L。
等同物  本领域技术人员将认识到，或只需使用常规试验即能够确定本文所述的本发明具体实施方案的很多等同物。这些等同物旨在包括在下列权利要求中。
序列表
<110>巴斯福股份公司
<120>提高泛酸产量的方法
<130>BGI-148PC
<140>
<141>
<160>27
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>194
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：启动子序列
<220>
<221>-35_signal
<222>(136)..(141)
<220>
<221>-10_signal
<222>(159)..(164)
<400>1
gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa  60
tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa  120
ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg  180
gcaaccccgc ctgt                                                    194
<210>2
<211>163
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：启动子序列
<220>
<221>-35_signal
<222>(113)..(118)
<220>
<221>-10_signal
<222>(136)..(141)
<400>2
gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc  60
tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt  120
atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc                    163
<210>3
<211>127
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：启动子序列
<220>
<221>-35_signal
<222>(34)..(39)
<220>
<221>-10_signal
<222>(58)..(63)
<220>
<221>-35_signal
<222>(75)..(80)
<220>
<221>-10_signal
<222>(98)..(103)
<400>3
gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat  60
aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga  120
tgcaatg                                                            127
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>4
taaacatgag gaggagaaaa catg                                         24
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>5
attcgagaaa tggagagaat ataatatg                                     28
<210>6
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>6
agaaaggaggtga                                                      13
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<220>
<223>所有的n均为任何核苷酸
<400>7
ttaagaaagg aggtgannnn atg                                          23
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<220>
<223>所有的n均为任何核苷酸
<400>8
ttagaaagga ggtgannnnn atg                                          23
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<220>
<223>所有的n均为任何核苷酸
<400>9
agaaaggagg tgannnnnnn atg                                          23
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<220>
<223>所有的n均为任何核苷酸
<400>10
agaaaggagg tgannnnnna tg                                            22
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>11
ccctctagaa ggaggagaaa acatg                                        25
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>12
ccctctagag gaggagaaaa catg                                         24
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>13
ttagaaagga ggatttaaat atg                                           23
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>14
ttagaaagga ggtttaatta atg                                          23
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>15
ttagaaagga ggtgatttaa atg                                          23
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>16
ttagaaagga ggtgtttaaa atg                                          23
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>17
attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg                                     28
<210>18
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>18
attcgagaaa ggaggtgaat aataatg                                      27
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：核糖体结合位点
<400>19
attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg                                      28
<210>20
<211>6886
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：载体
<220>
<223>pAN624
<400>20
aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct  60
tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca  120
aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg  180
attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg  240
atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg  300
ctaacaggag gaattaacca tggatccgag ctcgacagta tcaagcactt cacaatctgg  360
gagctgaaag cccgccttat gtagctcata cttgacaaat ccaaggtcaa aatggatatt  420
gtgggcgaca aaataagcgc cgtcaagcaa ttggaatact tcttcagcaa ctgcttcaaa  480
tggctgttca ttctcgacca tttgattaga gattccagta agctgctcaa taaaagcagg  540
gattgattta tttggattaa tgtattttga aaaccgctca gtaatttgtc cattttcgat  600
tacaaccgct gcgatttgta tgattttatc gcctttcttc ggcgaattcc ctgttgtctc  660
tacatctata acaacgaacc gttgcttatt cattaaaatg gacacctcaa ttcttgcata  720
cgacaaaagt gtaacacgtt ttgtacggaa atggagcggc aaaaccgttt tactctcaaa  780
atcttaaaag aaaacccccg ataaaggggg cttttcttct acaaaattgt acgggctggt  840
tcgttcccca gcatttgttc aattttgttt tgatcattca gaacagccac tttcggctca  900
tggcttgccg cttcttgatc agacatcatt ttgtaggaaa taataatgac cttatctcct  960
tcctgcacaa ggcgtgcggc tgcaccgttt aagcatatga cgccgcttcc ccgtttacca  1020
ggaataatat acgtttcaag acgtgctcca ttattattat tcacaatttg tactttttca  1080
ttaggaagca ttcccacagc atcaatgaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag  1140
cttccgtcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt  1200
gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag  1260
tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa  1320
gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc  1380
tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcaatc ttcatccatt  1440
ccaaggtaaa tcccccttcg ccgtttctgt taccattata caccttttga accttaacgt  1500
aaacgttaag ttttaaaaaa caataaaaaa gacgagcagc atacagcacc cgtctttcac  1560
tttcctgttt aagctaaact tcccgccact gacagagact ctttttgaag gctttcagaa  1620
agcactcgat acgcgatctg gagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg  1680
ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa  1740
gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat  1800
aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt  1860
tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat  1920
ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag  1980
gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt  2040
ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt  2100
tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc  2160
cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga  2220
aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa  2280
tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct  2340
cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa  2400
tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc  2460
ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat  2520
ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa  2580
aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct  2640
tatcttgata ataagggtaa ctattgcatg ataagctgtc aaacatgaga attcccgttt  2700
tcttctgcaa gccaaaaaac cttccgttac aacgagaagg attcttcact ttctaaagtt  2760
cggcgagttt catccctctg tcccagtcct tttttggatc aaggcagact gctgcaatgt  2820
ctatctattt taataatagg tgcagttcgc aggcgatact gcccaatgga agtataccaa  2880
aatcaacggg cttgtaccaa cacattagcc caattcgata tcggcagaat agattttttt  2940
aatgccttcg ttcgtttcta aaagcagaac gccttcatca tctataccta acgccttacc  3000
gtaaaaggtt ccgtttaacg ttctggctct catattagtg ccaataccga gcgcatagct  3060
ttcccataaa agcttaatcg gcgtaaatcc gtgcgtcata taatcccggt accgtttctc  3120
aaagcatagt aaaatatgct ggatgacgcc ggcccgatca attttttccc cagcagcttg  3180
gctgaggctt gtcgcgatgt ccttcaattc atctggaaaa tcattaggct gctggttaaa  3240
cggtctccag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa  3300
atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt  3360
cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg  3420
gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga  3480
aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa  3540
atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac  3600
gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt  3660
ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct  3720
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat  3780
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc  3840
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg  3900
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg  3960
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga  4020
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta  4080
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc  4140
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc  4200
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg  4260
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc  4320
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca  4380
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct  4440
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat  4500
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg  4560
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat  4620
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact  4680
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat  4740
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc  4800
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct  4860
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg  4920
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca  4980
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc  5040
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga  5100
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac  5160
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga  5220
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag  5280
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg  5340
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag  5400
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc  5460
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc  5520
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct  5580
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct  5640
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt  5700
gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct  5760
tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt  5820
cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag  5880
gcgaagcggc atgcataatg tgcctgtcaa atggacgaag cagggattct gcaaacccta  5940
tgctactccg tcaagccgtc aattgtctga ttcgttacca attatgacaa cttgacggct  6000
acatcattca ctttttcttc acaaccggca cggaactcgc tcgggctggc cccggtgcat  6060
tttttaaata cccgcgagaa atagagttga tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg  6120
gcgataggca tccgggtggt gctcaaaagc agcttcgcct ggctgatacg ttggtcctcg  6180
cgccagctta agacgctaat ccctaactgc tggcggaaaa gatgtgacag acgcgacggc  6240
gacaagcaaa catgctgtgc gacgctggcg atatcaaaat tgctgtctgc caggtgatcg  6300
ctgatgtact gacaagcctc gcgtacccga ttatccatcg gtggatggag cgactcgtta  6360
atcgcttcca tgcgccgcag taacaattgc tcaagcagat ttatcgccag cagctccgaa  6420
tagcgccctt ccccttgccc ggcgttaatg atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcggc  6480
tggtgcgctt catccgggcg aaagaacccc gtattggcaa atattgacgg ccagttaagc  6540
cattcatgcc agtaggcgcg cggacgaaag taaacccact ggtgatacca ttcgcgagcc  6600
tccggatgac gaccgtagtg atgaatctct cctggcggga acagcaaaat atcacccggt  6660
cggcaaacaa attctcgtcc ctgatttttc accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg  6720
agaatataac ctttcattcc cagcggtcgg tcgataaaaa aatcgagata accgttggcc  6780
tcaatcggcg ttaaacccgc caccagatgg gcattaaacg agtatcccgg cagcagggga  6840
tcattttgcg cttcagccat acttttcata ctcccgccat tcagag                 6886
<210>21
<211>7140
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：载体
<220>
<223>pAN620
<400>21
tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg  60
caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct  120
ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata  180
tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa  240
attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc  300
ttaacaacag caggacgctc tagattagaa aggaggattt aaatatgaga cagattactg  360
atatttcaca gctgaaagaa gccataaaac aataccattc agagggcaag tcaatcggat  420
ttgttccgac gatggggttt ctgcatgagg ggcatttaac cttagcagac aaagcaagac  480
aagaaaacga cgccgttatt atgagtattt ttgtgaatcc tgcacaattc ggccctaatg  540
aagattttga agcatatccg cgcgatattg agcgggatgc agctcttgca gaaaacgccg  600
gagtcgatat tctttttacg ccagatgctc atgatatgta tcccggtgaa aagaatgtca  660
cgattcatgt agaaagacgc acagacgtgt tatgcgggcg ctcaagagaa ggacattttg  720
acggggtcgc gatcgtactg acgaagcttt tcaatctagt caagccgact cgtgcctatt  780
tcggtttaaa agatgcgcag caggtagctg ttgttgatgg gttaatcagc gacttcttca  840
tggatattga attggttcct gtcgatacgg tcagagagga agacggctta gccaaaagct  900
ctcgcaatgt atacttaaca gctgaggaaa gaaaagaagc gcctaagctg tatcgggccc  960
ttcaaacaag tgcggaactt gtccaagccg gtgaaagaga tcctgaagcg gtgataaaag  1020
ctgcaaaaga tatcattgaa acgactagcg gaaccataga ctatgtagag ctttattcct  1080
atccggaact cgagcctgtg aatgaaattg ctggaaagat gattctcgct gttgcagttg  1140
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aacctgaact atgtgggaag cattacaatt gatgaagatc tcattgatgc tgtgggaatg  1320
cttcctaatg aaaaagtaca aattgtgaat aataataatg gagcacgtct tgaaacgtat  1380
attattcctg gtaaacgggg aagcggcgtc atatgcttaa acggtgcagc cgcacgcctt  1440
gtgcaggaag gagataaggt cattattatt tcctacaaaa tgatgtctga tcaagaagcg  1500
gcaagccatg agccgaaagt ggctgttctg aatgatcaaa acaaaattga acaaatgctg  1560
gggaacgaac cagcccgtac aattttgtaa aggatcctgt tttggcggat gagagaagat  1620
tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc  1680
tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg  1740
tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa  1800
taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga  1860
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ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg  1980
ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct tggtaccgag acgatcgtcc  2040
tctttgttgt agcccatcac ttttgctgaa gagtaggagc cgaaagtgac ggcgtattca  2100
ttgagcggca gctgagtcgc accgacagaa atcgcttctc ttgatgtgcc cggcgatccg  2160
actgtccagc cgttcggtcc gctgttgccg tttgaggtaa cagcgacaac gccttctgac  2220
atggcccagt caagcgctgt gcttgtcgcc cagtccgggt tgtttaaaga gtttccgaga  2280
gacaggttca tcacatctgc cccgtcctgc actgcacgtt ccacgcccgc gatgacgttt  2340
tccgttgtgc cgcttccgcc aggccctaac acacgataag caagaagtgt ggcatcaggc  2400
gctacgcctt taatcgttcc gtttgcagcc acagttccgg ctacgtgtgt gccatggtca  2460
gttgcctcgc ccctcggatc gccggttggt gtttcttttg gatcgtaatc attgtccaca  2520
aaatcgtatc ctttatattg tccaaagttt ttcttcagat ctgggtgatt gtattcaacc  2580
ccagtgtcaa taatcgccac cttgatgcct tttcctgtgt agcctaaatc ccatgcatcg  2640
tttgctccga tataaggcgc actgtcatcc atttgcggag atacggcgtc ttcggagatt  2700
gtggggaatt ctcatgtttg acagcttatc atgcaatagt tacccttatt atcaagataa  2760
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<210>24
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<212>DNA
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<220>
<223>人工序列的描述：载体
<400>24
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<210>25
<211>8704
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：载体
<220>
<223>pAN238
<400>25
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<210>26
<211>6688
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：载体
<220>
<223>pAN336
<400>26
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aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc  6660
gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaa                                     6688
<210>27
<211>8803
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：载体
<220>
<223>pAN294
<400>27
tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga  60
tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga  120
ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa  180
ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctgg atgaaaagcc  240
gatgaccgct tttcaggtct gtcagcagct ttttcctgct gtatatgaaa aggaattgtt  300
tttaacgatg tcagaaacgg caggtcacct tgatgtgttg gaggctgaag aagccatcac  360
gtcatattgg gaaggaaata ccgtatactt taaaacaatg aagaggtgaa atgggtgaaa  420
catatagcgg gaaaaaggat ttggataacc ggcgcttcag gagggcttgg agaaagaatc  480
gcatacttat gcgcggctga aggagcccat gtcctgctgt cggctagacg cgaggatcgt  540
ttgatagaaa tcaaaaggaa aataaccgag gaatggagcg gacagtgtga gatttttcct  600
ctggatgtcg gccgcctaga ggatatcgcc cgggtccgcg atcagatcgg ctcgattgat  660
gtactgatta acaatgcagg cttcggtata tttgaaacgg ttttagactc tacattggat  720
gacatgaaag cgatgtttga tgtgaatgtc ttcggcctga tcgcctgtac aaaagcggtg  780
cttccgcaaa tgcttgagca aaaaaaggga catatcatca atatcgcctc tcaagcgggg  840
aaaatcgcca caccgaagtc tagcctgtat tccgcgacca aacatgccgt gttaggttac  900
tcaaacgctt tgcggatgga gctttcggga accggcattt atgtgacaac agtcaacccg  960
ggcccgattc agacggactt tttttccatt gctgataaag gcggggacta cgccaaaaat  1020
gtcggccgct ggatgcttga tcctgatgac gtggcagctc aaattacagc tgcaattttt  1080
acgaaaaagc gggagatcaa tcttccgcgt ttaatgaatg ccggcactaa gctgtatcag  1140
ctgtttccag ctcttgtaga aaagctggca ggacgcgcgc tcatgaaaaa ataatgatag  1200
aactgcctgt ggtggagtgg cttgtttctc acggggcagt ttttgatagt ggaagggaga  1260
gattgttgaa tgtcagttca ttcagaagtc cttcatgctc tgcttaaaga tccgtttatt  1320
cagaaactga ttgatgcaga gcctgtattc tgggcaaatt caggcaagaa agaggggcca  1380
ttaccccgtg cagatgagtg ggcaaccgag atagcggaag cggaaaaaag aatgcagcgg  1440
tttgcacctt acattgccga ggtgtttcct gagacgaaag gcgctaaagg aatcatcgag  1500
tctccgcttt ttgaggtgca gcatatgaag ggaaagctgg aagcggcata tcagcagcca  1560
tttcccggaa gatggctttt aaagtgcgac catgagcttc cgatttcagg atcgattaaa  1620
gcgaggggcg ggatttatga agtgttaaag tatgctgaaa atctcgcgct tcaagaagga  1680
atgcttcagg aaaccgatga ttaccgcatc ttacaggaag agcggtttac cgggtttttc  1740
tcccgctatt cgattgctgt cggttcgaca ggaaatctag gtttaagcat cggcatcatc  1800
ggcgcggcac tcgggtttcg cgtgacagtg catatgtccg ccgatgctaa gcagtggaaa  1860
aaggatctcc tccgccaaaa gggagtcact gttatggagt acgaaacaga ttacagtgaa  1920
gcggtgaacg aagggagacg gcaggcggaa caagatccat tctgttattt tattgatgat  1980
gaacattctc gtcagctgtt cttaggatat gctgttgctg caagccgatt aaaaacacag  2040
cttgactgta tgaatataaa gccaagtctt gagacgccct tgtttgtgta tctgccgtgc  2100
ggagtcggcg gaggaccggg cggtgtagca tttgggctga agcttttata cggagatgat  2160
gttcatgtgt ttttcgcaga accaactcat tcaccttgta tgctgttagg gctttattca  2220
ggacttcacg agaagatctc cgtccaggat atcggcctgg ataatcagac ggctgctgac  2280
ggacttgccg tagggaggcc gtcaggattt gtcggcaagc tgattgaacc gcttctgagc  2340
ggctgttata cggtagagga caatacgctt tatactttgc ttcatatgct ggctgtatct  2400
gaagataaat atttagagcc ctctgctctt gctggcatgt tcgggccggt tcagcttttt  2460
tcgacagaag agggaaggcg ctatgctcag aaatataaga tggaacatgc cgtacatgtc  2520
gtctggggaa cgggaggaag catggttcca aaagatgaaa tggctgcgta taaccgaatc  2580
ggtgctgatt tgctaaaaaa acgaaatgga aaataagcag acagtgaaaa ggttttccgt  2640
tacaatcttt gtaagggttt taacctacag agagtcaggt gtaaacagtg aaaaataaag  2700
aacttaacct acatacttta tatacacagc acaatcggga gtcttggtct ggttttgggg  2760
ggcatttgtc gattgctgta tctgaagaag aggcaaaagc tgtggaagga ttgaatgatt  2820
atctatctgt tgaagaagtg gagacgatct atattccgct tgttcgcttg cttcatttac  2880
atgtcaagtc tgcggctgaa cgcaataagc atgtcaatgt ttttttgaag cacccacatt  2940
cagccaaaat tccgtttatt atcggcattg ccggcagtgt cgcagtcgga aaaagcacga  3000
cggcgcggat cttgcagaag ctgctttcgc gtttgcctga ccgtccaaaa gtgagcctta  3060
tcacgacaga tggtttttta tttcctactg ccgagctgaa aaagaaaaat atgatgtcaa  3120
gaaaaggatt tcctgaaagc tatgatgtaa aggcgctgct cgaatttttg aatgacttaa  3180
aatcaggaaa ggacagcgta aaggccccgg tgtattccca tctaacctat gaccgcgagg  3240
aaggtgtgtt cgaggttgta gaacaggcgg atattgtgat tattgaaggc attaatgttc  3300
ttcagtcgcc caccttggag gatgaccggg aaaacccgcg tatttttgtt tccgatttct  3360
ttgatttttc gatttatgtg gatgcggagg aaagccggat tttcacttgg tatttagagc  3420
gttttcgcct gcttcgggaa acagcttttc aaaatcctga ttcatatttt cataaattta  3480
aagacttgtc cgatcaggag gctgacgaga tggcagcctc gatttgggag agtgtcaacc  3540
ggccgaattt atatgaaaat attttgccaa ctaaattcag gtcagatctc attttgcgta  3600
agggagacgg gcataaggtc gaggaagtgt tggtaaggag ggtatgaaat gtgctgcagc  3660
tcgagcaata gttaccctta ttatcaagat aagaaagaaa aggatttttc gctacgctca  3720
aatcctttaa aaaaacacaa aagaccacat tttttaatgt ggtctttatt cttcaactaa  3780
agcacccatt agttcaacaa acgaaaattg gataaagtgg gatattttta aaatatatat  3840
ttatgttaca gtaatattga cttttaaaaa aggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa  3900
gtaagcctcc taaattcact ttagataaaa atttaggagg catatcaaat gaactttaat  3960
aaaattgatt tagacaattg gaagagaaaa gagatattta atcattattt gaaccaacaa  4020
acgactttta gtataaccac agaaattgat attagtgttt tataccgaaa cataaaacaa  4080
gaaggatata aattttaccc tgcatttatt ttcttagtga caagggtgat aaactcaaat  4140
acagctttta gaactggtta caatagcgac ggagagttag gttattggga taagttagag  4200
ccactttata caatttttga tggtgtatct aaaacattct ctggtatttg gactcctgta  4260
aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta tacctttctg atgtagagaa atataatggt  4320
tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata cctgaaaatg ctttttctct ttctattatt  4380
ccatggactt catttactgg gtttaactta aatatcaata ataatagtaa ttaccttcta  4440
cccattatta cagcaggaaa attcattaat aaaggtaatt caatatattt accgctatct  4500
ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt tatcatgcag gattgtttat gaactctatt  4560
caggaattgt cagataggcc taatgactgg cttttataat atgagataat gccgactgta  4620
ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg ttagttgaag aaggttttta  4680
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cagctgcgct tttcggtttt tcgcatactt gaagcctgta acagccgcaa agacgacagc  4800
ggcaaatata ataaatacaa acagctgaaa catcacatca cctatattca tgttcttcac  4860
ctcatgtttg cgggagagat tcattctctt ccgtttttta tttaaagcgg cttttccaga  4920
cgggaacggt gttttgtggt ctccattttc atttgccgat aggcgaacgc taaaaatggc  4980
aggccgagca gggtaatgcc gctcaggaca gaaaaaatat aaatcggccg gccagcgcca  5040
aacaggtcta tacatatccc cccgacccaa gggccgatga cgtttccgag ctgtggaaaa  5100
ccgattgccc cgaaataagt gccttttaat cctggttttg caatctggtc tacatacaaa  5160
tccatcatag agaataaaag cacttcgccg attgtaaatg tgatgacaat catcacaatt  5220
gatggaacac cgtgtgatac ggtgaaaatg gccatgctga tgctaaccat cacattaccg  5280
agcatcagag aacaaagcgg cgaaaaccgt tttgcaaaat ggacaatggg aaattgcgtc  5340
gccaacacaa cgattgcgtt taatgtcagc atcagcccat acagcttcgt tccattgccg  5400
atcaaggggt tctgcgccat atactgaggg aatgtggaac tgaattgtga gtagccgaag  5460
gtgcatagcg taatgccgac caaagcaatg gtaaaaagat aatccttttg cgtgaccata  5520
aacgcttccc gcacgctcat atttcgggac tgggctggtg ctgataagga tggatgtttt  5580
ttaaattgga gggcaagcac aattccgtat agtccgtaaa tgactgcagg caccaaaaag  5640
ggcgtagtcg attgcgatga gccgaaatat aggccaagca caggtccgaa gacaacgccg  5700
atattaatag ccgcatagcg taaattaaaa actagcagtc tcgttttttc ttctgtcata  5760
tcagacaaca aggcctttga agcgggctca aacagtgatt tgcaaagacc gtttaatgcg  5820
tttactacaa aaaacaccca gagattagat gctgccgcaa agcctgcaaa taccagcatc  5880
catccgaaaa tcgatacaag catcatgttt tttctgccga atttatctga gatatatccg  5940
ccgtaaaagc ttgcgaggat gccgactgat gagctcgcgg cgatgaccag ccctgcatag  6000
gaagctgatg cgccttggac ggctgtcaaa taaatcgcta aaaaaggaat gctcatcgat  6060
gttgccattc tgccgaaaat ggttccgatt ataattgtac gcgttggatg catagcttga  6120
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caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta  6540
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cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt  6720
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accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat  6900
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aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa  7140
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actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt  7260
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca  7320
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca  7380
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc  7440
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa  7500
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc  7560
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca  7620
acgttgttgg cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat  7680
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag  7740
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac  7800
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tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat  8040
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca  8100
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tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taa                    8803

Claims (55)

1.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括在使无HMBPA的泛酸组合物产生的条件下培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物的至少两个泛酸生物合成酶被去调节。
3.权利要求1的方法，其中所述微生物的至少三个泛酸生物合成酶被去调节。
4.权利要求1的方法，其中所述微生物的至少四个泛酸生物合成酶被去调节。
5.权利要求4的方法，其中所述微生物具有去调节的酮泛解酸羟甲基转移酶、去调节的酮泛解酸还原酶、去调节的泛酸合成酶和去调节的门冬氨酸-α-脱羧。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述的微生物还具有去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径。
7.权利要求6的方法，其中所述微生物的至少两个异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶被去调节。
8.权利要求6的方法，其中所述微生物的至少三个异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成酶被去调节。
9.权利要求8的方法，其中所述微生物具有去调节的乙酰羟酸合成酶、去调节的乙酰羟酸异构还原酶和去调节的二羟酸脱水酶。
10.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanB活性受到调节致使无HMBPA的泛酸组合物产生。
11.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanE1活性受到调节致使无HMBPA的泛酸组合物产生。
12.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanE2活性受到调节致使无HMBPA的泛酸组合物产生。
13.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的IIvC活性受到调节致使无HMBPA的泛酸组合物产生。
14.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanB和PanE1活性受到调节致使无HMBPA的泛酸组合物产生。
15.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanB和PanE2活性受到调节致使无HMBPA的泛酸组合物产生。
16.无HMBPA的泛酸组合物的制备方法，包括培养具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)生物合成途径的微生物，其中所述微生物的PanB和IlvC活性受到调节致使无HMBPA的泛酸组合物产生。
17.权利要求10、14、15和16任一项的方法，其中通过过表达PanB增加PanB的活性。
18.权利要求10、14、15和16任一项的方法，其中通过表达多拷贝panB基因增加PanB的活性。
19.权利要求10、14、15和16任一项的方法，其中通过降低对PanB的反馈抑制增加PanB的活性。
20.权利要求10、14、15和16任一项的方法，其中通过调节泛酸激酶活性增加PanB的活性。
21.权利要求20的方法，其中泛酸激酶活性被降低。
22.权利要求21的方法，其中CoaA被缺失且CoaX被下调。
23.权利要求21的方法，其中CoaX被缺失且CoaA被下调。
24.权利要求21的方法，其中CoaX和CoaA均被下调。
25.权利要求10、14或15的方法，其中通过缺失panE2基因降低PanE活性。
26.权利要求10、14或15的方法，其中通过调节panE基因的表达降低PanE活性。
27.权利要求13或15的方法，其中通过调节ilvC基因的表达降低IlvC活性。
28.上述任一项权利要求的方法，其中在降低稳态葡萄糖的条件下培养所述微生物。
29.上述任一项权利要求的方法，其中在增加稳态溶解氧的条件下培养所述微生物。
30.上述任一项权利要求的方法，其中在丝氨酸过量的条件下培养所述微生物。
31.上述任一项权利要求的方法，其中所述微生物的泛酸生物合成途径被去调节使得泛酸的产生不依赖于β-丙氨酸的饲喂。
32.上述任一项权利要求的方法，其中所述微生物过表达panD基因致使泛酸的产生不依赖于β-丙氨酸的饲喂。
33.上述任一项权利要求的方法，其中微生物属于芽孢杆菌属。
34.上述任一项权利要求的方法，其中微生物是枯草芽孢杆菌。
35.根据上述任一项权利要求的方法合成的产物。
36.根据上述任一项权利要求的方法合成的无HMBPA的泛酸组合物。
37.由具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物合成的组合物，其中所述组合物包含泛酸且基本上不含HMBPA。
38.用于制备无HMBPA的泛酸组合物的重组微生物，所述微生物具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径，并且其PanB或PanE1被选择性地调节。
39.用于制备无HMBPA的泛酸组合物的重组微生物，所述微生物具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径，并且其PanB和PanE1被选择性地调节。
40.用于制备无HMBPA的泛酸组合物的重组微生物，所述微生物具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径，并且其PanB或PanE2被选择性地调节。
41.用于制备无HMBPA的泛酸组合物的重组微生物，所述微生物具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径，并且其PanB和PanE2被选择性地调节。
42.用于制备无HMBPA的泛酸组合物的重组微生物，所述微生物具有去调节的泛酸生物合成途径和去调节的异亮氨酸-缬氨酸(ilv)途径，并且其PanE1缺失、PanE2缺失而IlvC过表达。
43.权利要求38-42任一项的微生物，其属于芽孢杆菌属。
44.权利要求38-42任一项的微生物，其是枯草芽孢杆菌。
45.选择性混合的泛酸：HMBPA组合物的制备方法，包括在使选择性混合的泛酸：HMBPA组合物产生的条件下培养具有去调节的泛酸生物合成途径的微生物。
46.权利要求45的方法，其中在利于泛酸产生的条件下培养微生物。
47.权利要求45的方法，其中在利于HMBPA产生的条件下培养微生物。
48.权利要求45或46的方法，其中在利于泛酸产生的稳态葡萄糖受控条件下培养微生物。
49.权利要求45或47的方法，其中在利于HMBPA产生的稳态葡萄糖受控条件下培养微生物。
50.权利要求45或46的方法，其中在利于泛酸产生的稳态溶解氧受控条件下培养微生物。
51.权利要求45或47的方法，其中在利于HMBPA产生的稳态溶解氧受控条件下培养微生物。
52.权利要求45或46的方法，其中在利于泛酸产生的丝氨酸水平受控制的条件下培养微生物。
53.权利要求45或46的方法，其中微生物具有利于泛酸产生的改变。
54.权利要求45或47的方法，其中微生物具有利于HMBPA产生的改变。
55.通过权利要求45-54任一项的方法制备的产物。
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