CZ20031978A3 - Processes for enhanced production of pantothenate - Google Patents

Description

Způsoby pro zvýšení produkce panthotenátu

Související přihlášky

Předkládaný vynález uplatňuje prioritu z dříve podané prozatímní patentové přihlášky pořadové č. 60/262,995, podané 19.1.2001 (projednávaná). Předkládaný vynález také souvisí s U.S. patentovou přihláškou pořadové č. 09/667,569, podanou 21.9.2000 (projednávaná), která je částečně pokračováním U.S. patentové přihlášky pořadové č. 09/400,494, podané 21.9.1999 (zrušená). U.S. patentová přihláška pořadové č. 09/667,569 také uplatňuje prioritu z dříve podané prozatímní patentové přihlášky pořadové č. 60/210,072, podané 7.6.2000, prozatímní patentové přihlášky pořadové č. 60/221,836, podané 28.7.2000, a prozatímní patentové přihlášky pořadové č. 60/227,860, podané 24.8.2000, Celý obsah každé z výše uvedených přihlášek je zde uveden jako odkaz ve své úplnosti.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zlepšených způsobů pro produkci pantoátu a panthotenátu za použití mikroorganismů majících modifikované aktivity enzymu syntetizujícího panthotenát. Přesněji se předkládaný vynález týká způsobů pro redukci tvorby vedlejších produktů a pro zvýšení výtěžků a čistoty požadovaných produktů. Vynález se také týká rekombinantních mikroorganismů a kultivování takových mikroorganismů. Dále se vynález týká prostředků produkovaných takovými mikroorganismy.

• 4 ·· · 4 44 4 · 44 • 4 4 44 4 444 4 • » 4 44 4 4 4 · · · * ·

4 4 444 4 4 4 •4 4444 44 4444 44 4

Dosavadní stav techniky

Panthotenát, též označovaný jako kyselina pantotenová nebo vitamín B5, je členem B-komplexu vitamínů a u člověka a domácích zvířat je nutné jeho dodávání (například v potravě, ve formě vitamínového doplňku rozpustného ve vodě nebo jako potravní přísada). V buňkách je panthotenát primárně používán pro biosyntézu koenzymu A (CoA) a proteinového nosiče pro acyl (ACP). Tyto koenzymy působí v metabolismu acylových skupin, které tvoří thioestery se sulfhydrylovou skupinou 4'-fosfopantetheinové části těchto molekul. Tyto koenzymy jsou zásadní pro všechny buňky a podílejí se na více než 100 různých intermediárních reakcích v buněčném metabolismu.

Běžným způsobem pro syntetizování panthotenátu (zejména jeho biologicky aktivního D-izomeru) je chemická syntéza ze zásobních chemických sloučenin, což je proces, který je značně nákladný a vyžaduje optické štěpení racemických meziprodukty. Proto výzkumníci hledají bakteriální nebo mikrobiální systémy, které produkují enzymy použitelné v procesem pro biosyntézu panthotenátu (protože bakterie jsou schopny sami syntetizovat panthotenát). Konkrétně, biokonverzní procesy byly zkoumány jako procesy upřednostňující produkci výhodného izomeru kyseliny panthotenové. Dále byly zkoumány metody přímé mikrobiální syntézy jako postupu pro zlepšení produkce D-panthotenátu.

Stále však existuje potřeba lepších postupů pro produkci panthotenátu, zejména mikrobiálních procesů optimalizovaných pro produkci požadovaných produktů s vyšším výtěžkem.

♦ · ·· ♦.« • · · · • · · • <· » • · · • · · · · »

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká zlepšených způsobů (například, mikrobiální syntézy) pro produkci panthotenátu. Předkladatelé vynálezu zjistili, že deregulace panthotenátové biosyntetické dráhy a/nebo deregulace isoleucin-valinové (ilv) dráhy v mikroorganismech vede kromě významně vyšších titrů pantoátu a/nebo panthotenátu k syntéze alternativního produktu, konkrétně kyseliny [R]—3—(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)propionové nebo kyseliny 3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionové (HMBPA)z který je zde označován zaměnitelně jako β-alanin 2-(R)-hydroxyisolvalerát, β-alanin 2-hydroxyisolvalerát.

β-alanyl-hydroxyisovalerát a/nebo fantothenát. Dráhy vedoucí k HMBPA (označované jako HMBPA biosyntetické dráhy) zahrnují některé enzymy běžně asociované s biosyntézou panthotenátu a/nebo isoleucinu/valinu (ilv), které se mohou - jsou-li nadměrně exprimovány - dále podílet na HMBPA biosyntetické dráze. Konkrétně dráha zahrnuje konverzi α-ketoisovalerátu na R-2-hydroxyisovalerát (α-HIV), katalyzovanou reduktasovou aktivitou (například PanEl, PanE2 a/nebo IlvC aktivitami), po které následuje kondenzace a-HIV s β-alaninem, katalyzovaná PanC aktivitou. Protože alternativní HMBPA biosyntetické dráha kompetuje o klíčové prekursory biosyntézy panthotenátu, konkrétně o a-ketoisovalerát (α-KIV) a β-alanin, a také kompetuje o enzymy asociované s biosyntézou panthotenátu, je žádoucí snížit nebo eliminovat HMBPA biosyntézu, aby se účinně zvýšila biosyntéza panthotenátu.

Proto se v prvním aspektu předkládaný vynález týká způsobu pro produkci a prostředku obsahujícího panthotenát • · • · · ·· «· • · · • * * · ·'···· . ♦ · ·· * · ·♦ ♦ ··· *·· ··· ·«· ·· ···β · · ···« «· * bez ΗΜΒΡΑ, který zahrnuje kultivování a mikroorganismu majícího deregulované panthotenátové biosyntetické dráhy za takových podmínek, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez ΗΜΒΡΑ. V dalším aspektu se vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez ΗΜΒΡΑ, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má PanB aktivitu regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahujícího panthotenát bez ΗΜΒΡΑ. V ještě dalším aspektu se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez ΗΜΒΡΑ, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde tento mikroorganismus má PanE aktivitu regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez ΗΜΒΡΑ. V ještě dalším aspektu se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez ΗΜΒΡΑ, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde mikroorganismus má IlvC aktivitu regulovanou tak,, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez ΗΜΒΡΑ.

V ještě dalším aspektu se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez ΗΜΒΡΑ, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má PanB a PanE aktivity regulované tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez ΗΜΒΡΑ. V ještě dalším aspektu se * · 9 · · « 4» φ · · · · · · · * * « · 9 β · · · · · « 1 • · · · · · • » ···« φ » ·«·>

předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má PanB a IlvC aktivity regulované tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA. Prostředky produkované výše uvedenými způsoby jsou také předmětem předkládaného vynálezu, stejně jako mikroorganismy použité v uvedených způsobech. Vynález se také týká způsobů produkce selektivně smíšených prostředků obsahujících panthotenát:HMBPA.

Další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a připojených patentových nároků.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je schematické znázornění panthotenátové a isoleucin-valinové (ilv) biosyntetické dráhy. Pantothenátové biosyntetické enzymy jsou uvedeny tučně a jejich příslušné geny jsou uvedeny kurzívou. Isoleucin-valinové (ilv) biosyntetické enzymy jsou uvedeny tučně kurzívou a jejich příslušné geny jsou uvedeny kurzívou.

Obr. 2 je schématické znázornění biosyntetické dráhy vedoucí ke tvorbě kyseliny R-3-(2-hydroxy-3-methylbutyrylamino)-propionové (HMBPA) v B. subtilis.

Obr. 3 je schematické znázornění struktury kyseliny

R]-3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionové (HMBPA).

Obr. 4 je HPLC chromatogram vzorku media ze 14 1 fermentace PA824.

Obr. 5 je hmotnostní spektrum ukazující relativně monoizotopovou hmotnost kyseliny 3-(2-hydroxy-3methyl-butyrylamino)-propionové.

Obr. 6 ukazuje seřazení C-terminálních aminokyselin ze známých nebo předpokládaných PanB proteinů.

Obr. pAN624.	7	je	schématické	znázornění	konstrukce	plasmidu
Obr. pAN620,	8	je	schématické	znázornění	konstrukce	plasmidu
Obr. pAN636.	9	je	schématické	znázornění	konstrukce	plasmidu

Obr. 10 je schématické znázornění konstrukce plasmidu pAN637, který umožňuje selekci jedné nebo více kopií za použití chloramfenikolu.

Podrobný popis předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález je založen, alespoň částečně, na objevu alternativní biosyntetičké dráhy v rekombinantním mikroorganismu, která využívá některých enzymů a prekurzorů pro biosyntézu panthotenátu a/nebo isoleucinu-valinu (ilv) pro přípravu vedlejšího produktu označovaného jako kyselina [R]-3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionová (HMBPA). Konkrétně bylo zjištěno, že bakterie upravené tak, aby měly deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou

9 • » * · · · ·« • · · · · · ···· • · · ·· · 9 9 •· 9 9 94 94 9999 9 4 a/nebo isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu jsou schopné vyrábět HMBPA z a-ketoisovalerátu (α-KIV), klíčového prekurzorů isoleucin-valinové (iiv) biosyntetické dráhy a prekurzorzu panthotenátové biosyntetické dráhy. Produkce HMBPA v bakterii využívá alespoň biosyntetických enzymů pro syntézu panthotenátu ketopanthoát-reduktasy (produkt panE genu), produktu panE2 genu a/nebo acetohydroxyizomeroreduktasy (produktu ilvC genu) a probíhá kondenzaci kyseliny [R]-2-hydroxyisovalerové (α-HIV) , vzniklé redukcí α-KIV, a β-alaninu, kde poslední uvedené reakce je katalyzovaná biosyntetickým enzymem pro panthotenát panthotenát-synthetasou (produktem panG genu). Substráty α-KIV a β-alanin mohou být požity jako pro produkci panthotenátu, tak pro produkci HMBPA. β-alanin je získán, například, dodáváním a/nebo zvýšenou aktivitou aspartat-dekarboxylaxy (produktu panD genu).

Pro snížení nebo eliminaci kompetice o prekursory a/nebo biosyntetické enzymy pro syntézu panthotenátu je žádoucí selektivně regulovat některé enzymy tak, že dojde k posunu produkce od HMBPA směrem k produkci panthoátu/panthotenátu. Výhodně jsou mikroorganismy mající deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a/nebo deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu dále upraveny tak, že mají selektivně regulované PanB a/nebo PanE. Selektivní regulace PanB a/nebo PanE zahrnuje optimalizaci konctrací těchto enzymů tak, že se upřednostní produkce panthoátu/panthotenátu.

Konkrétně se vynález týká způsobů pro produkci prostředků majících zvýšený poměr panthotenátu k HMBPA, výhodně prostředků obsahujících panthotenát bez HMBPA. Fráze prostředek obsahujícího panthotenát bez HMBPA označuje • ·

4

4 4 4 » · · ' · · 4*4 »99 9 9 9 · • · 4 4 4 4 · 4 «· ·· ₄ •prostředek obsahující panthotenát, který neobsahuje HMBPA a/nebo v podstatě neobsahuje HMBPA, kdy uvedený prostředek obsahuje nevýznamná množství HMBPA (t.j., pokud je HMBPA přítomen, tak je přítomen v dostatečně nízkém množství nebo koncentraci vzhledem k množství nebo koncentraci panthothenátu, aby mohl být takový prostředek považován za prostředek neobsahující HMBPA pro technologické, vědecké a/nebo průmyslové účely). Výhodně prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA obsahuje panthotenát a, pokud je HMBPA přítomen, tak je přítomen v poměru 10:100 (t.j. 10% HMBPA versus 90% panthotenátu, například při srovnání ploch píku, když je vzorek analyzován HPLC) nebo menším. Výhodněji prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA obsahuje panthotenát a pokud je HMBPA přítomen, tak je přítomen v poměru 9:100 (t.j., 9% HMBPA versus 91% panthotenátu) nebo menším. Ještě výhodněji prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA obsahuje panthotenát a pokud je HMBPA přítomen, tak je přítomen v poměru 8:100 (t.j. 8% HMBPA versus 92% panthotenátu) nebo menším, 7:100 (t.j., 7% HMBPA versus 93% panthotenátu) nebo menším, 6:100 (t.j., 6% HMBPA versus 94% panthotenátu) nebo menším nebo 5:100 (t.j., 5% HMBPA versus 95% panthotenátu) nebo menším. Ještě výhodněji prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA obsahuje panthotenát a pokud je HMBPA přítomen, tak je přítomen v poměru 0,5:100 (t.j. 0,5% HMBPA versus 99,5% panthotenátu) nebo menším, 0,2:100 (t.j. 0,2% HMBPA versus 99,8% panthotenátu) nebo menším nebo 0,1:100 (t.j. 0,1% HMBPA versus 99,9% panthotenátu) nebo menším. Hodnoty mezi uvedenými hodnotami také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

V jednom provedení se vynález týká způsobu pro produkci panthotenátu bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou • · · ·· · φ * · φ φφφ • · · · · · · · · ·· φφφφ ·· φφφφ · biosyntetickou dráhu za takových podmínek, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA. Termín „panthotenátová biosyntetická dráha označuje biosyntetickou dráhu, na které se podílejí biosyntetické enzymy pro panthotenát (například, polypeptidy kódované geny pro biosyntetické enzymy), sloučeniny (například substráty, meziprodukty nebo produkty), kofaktory a podobně, používané při tvorbě nebo syntéze panthotenátu. Termín panthotenátová biosyntetická dráha označuje biosyntetickou dráhu vedoucí k syntéze panthotenátu v mikroorganismu (například in vivo), stejně jako biosyntetické dráhy vedoucí k syntéze panthotenátu in vitro.

Termín „mikroorganismus mající deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu označuje mikroorganismus mající deregulovaný alespoň jeden enzym pro biosyntézu panthotenátu (například nadměrně exprimovaný) (oba termíny jsou zde definované) tak, že je zvýšena produkce panthotenátu (například ve srovnání s produkcí panthotenátu v uvedeném mikroorganismu před deregulací uvedeného biosyntetického enzymu nebo ve srovnání s neupraveným mikroorganismem). Termín panthotenát označuje panthotenátu ve formě volné kyseliny, který se též označuje jako kyselina panthotenová, stejně jako panthotenát ve formě jakékoliv soli (například získaný nahrazením acidického vodíku panthotenátu nebo kyseliny panthotenové kationtem, například sodíkem, draslíkem, vápníkem nebo ammoniem, kde tato forma je označována též jako „panthotenátová sůl. Termín „panthotenát také označuje alkoholové deriváty panthotenátu. Výhodnými panthotenátovými solemi jsou kalcium-panthotenát nebo natrium-panthotenát. Výhodným alkoholovým derivátem je pantothenol.

Panthotenátové soli a/nebo alkoholy podle předkládaného • · • · • · • φ * φφφ • 9 φφφφφ

Φφφ

Φ Φ · • φ • ♦ φ • · 1 • · φ * · · » » ♦ vynálezu jsou soli a/nebo alkoholy připravené běžnými způsoby z popsaných volných kyselin. V jiném provedeni je panthotenátová sůl syntetizována přímo mikroorganismem podle předkládaného vynálezu. Panthotenátová sůl podle předkládaného vynálezu může být také přeměněna na panthotenát nebo panthotenovou kyselinu ve formě volné kyseliny za použití běžných postupů. Výhodně označuje termín mikroorganismus mající deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu mikroorganismu mající deregulovaný alespoň jeden enzym pro biosyntézu panthotenátu (například nadměrně exprimovaný) tak, že produkce panthotenátu je 1 g/1 nebo vyšší. Výhodněji označuje termín mikroorganismus mající deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu mikroorganismu mající deregulovaný alespoň jeden enzym pro biosyntézu panthotenátu (například nadměrně exprimovaný) tak, že produkce panthotenátu je 2 g/1 nebo vyšší.

Termín panthotenátové biosyntetické enzymy označuje jakýkoliv enzym využívaný pro tvorbu sloučeniny (například meziproduktu nebo produktu) panthotenátové biosyntetické dráhy. Například, syntéza panthoátu z a-ketoisovalerátu (-KIV) probíhá přes meziprodukt, ketopanthoát. Tvorba ketopanthoátu je katalyzována panthotenátým biosyntetickým enzymem PanB nebo ketopanthoát-hydroxymethyltransferasou (produktem panB genu). Tvorba panthoátu je katalyzována panthotenátovým biosyntetickým enzymem PanEl nebo ketopanthoát-reduktasou (produktem PanEl genu). Syntéza β-alaninu z aspartátu je katalyzována panthotenátovým biosyntetickým enzymem PanD nebo aspartat-dekarboxylasou (produktem panD genu). Tvorba panthotenátu z panthoátu a β-alaninu (například kondenzace) je katalyzována panthotenátovým biosyntetickým enzymem PanC nebo panthotenát-synthetasou (produktem panC genu).

• 9 také provádět HMBPA

Panthotenátové biosyntetické enzymy mohou alternativní funkce jako enzymy v popsané biosyntetické dráze.

Tak se v jednom provedení předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovaný alespoň jeden enzym pro biosyntézu panthotenátu (například deregulovaný tak, že je zvýšena produkce panthotenátu), kde uvedený enzym je vybrán, například, ze skupiny zahrnující PanB (nebo ketopanthoáthydroxymethyltransferasu), PanC (nebo panthotenátsynthetasu), PanD (nebo aspartát—dekarboxylasu), PanEl (nebo ketopanthoát-reduktasu). V jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulované alespoň dva enzymy pro biosyntézu panthotenátu, kde uvedené enzymy jsou vybrány, například, ze skupiny zahrnující PanB (nebo ketopanthoát-hydroxymethyltransferasu), PanC (nebo panthotenát-synthetasu), PanD (nebo aspartát—dekarboxylasu) a PanEl (nebo ketopanthoát-reduktasu). V jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulované alespoň tři enzymy pro biosyntézu panthotenátu, kde uvedené enzymy jsou vybrány, například, ze skupiny zahrnující PanB (nebo ketopanthoát-hydroxymethyl-transferasu), PanC (nebo panthotenát-synthetasu), PanD (nebo aspartát—dekarboxylasu) a PanEl (nebo ketopanthoát-reduktasu). V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulované ♦ φ • · • 1 φ φ • · · • · · >* ··φφ φ

φφφφ • · · • φφφ ♦ 9 9999 •99

9 alespoň čtyři enzymy pro biosyntézu panthotenátu, mapříklad mikroorganismu majícího deregulovanou PanB (nebo ketopanthoát-hydroxymethyltransferasu), PanC (nebo panthotenát-synthetasu), PanD (nebo aspartát—dekarboxylasu) a PanEl (nebo ketopanthoát-reduktasu).

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu za podmínek, při kterých je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA, kde mikroorganismus má dále deregulovanou isoleucin-valinovou biosyntetickou dráhu. Termín isoleucin-valinová biosyntetická dráha označuje biosyntetickou dráhu, na které se podílejí enzymy pro biosyntézu isoleucinu-valinu (například polypeptidy kódované geny pro biosyntetické enzymy), sloučeniny (například substráty, meziprodukty nebo produkty), kofaktory a podobně, používané při tvorbě nebo syntéze nebo konverzi pyruvátu na valin nebo isoleucin. Termín isoleucin-valinová biosyntetická dráha označuje biosyntetickou dráhu vedoucí syntéze valinu nebo isoleucinu v mikroorganismu (například in vivo), stejně jako biosyntetické dráhy vedoucí k syntéze valinu nebo isoleucinu in vitro.

Termín „mikroorganismus mající deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) dráhu označuje mikroorganismus mající deregulovaný alespoň jeden enzym pro biosyntézu isoleucinu-valinu (ilv) (například nadměrně exprimovaný) (oba termíny jsou zde definovány) tak, že je zvýšena produkce isoleucinu a/nebo valinu a/nebo prekursoru valinu,

-ketoisovalerátu (-KIV) (například ve srovnání s produkcí isoleucinu a/nebo valinu a/nebo -KIV v uvedeném • · z: .

• 44 4 • 4 mikroorganismu před deregulací uvedeného biosyntetického enzymu nebo ve srovnání s přirozeným mikroorganismem). Obr.

je schematické znázornění isoleucin-valinové biosyntetické dráhy. Enzymy pro biosyntézu isoleucinu-valinu jsou uvedeny tučně kurzívou a jejich příslušné geny jsou uvedeny kurzívou. Termín enzym pro biosyntézu isoleucinu-valinu označuje jakýkoliv enzym používaný při tvorbě sloučeniny (například meziproduktu nebo produktu) isoleucin-valinové biosyntetické dráhy. Podle obr. 1 probíhá syntéza valinu z pyruvátu přes meziprodukty acetolaktát, a,β-dihydroxyisovalerát (a, β-DHIV) a a-ketoisovalerát (a-KXV). Tvorba acetolaktátu z pyruvátu je katalyzována isoleucin-valinovým biosyntetickým enzymem acetohydroxyacid-synthetasou (produktem ilvBN genu, nebo alternativně, produktem alsS genu). Tvorba a,β-DHIV z acetolaktátu je katalyzována isoleucin-valinovým biosyntetickým enzymem acetohydroxyacid-isomeroreduktasou (produktem ilvG genu) . Syntéza α-KIV z a,β-DHIV je katalyzována isoleucin-valinovým biosyntetickým enzymem dihydroxyacid-dehydratasou (produktem ilvD genu). Dále, valin a isoleucin mohou být přeměněny na své příslušné α-keto sloučeniny transaminasami pro aminokyseliny s rozvětveným řetězcem. Isoleucin-valinové biosyntetické enzymy mohou také mít alternativní funkce jako enzymy v HMBPA biosyntetické dráze, která je zde popsaná.

V souladu s tím se vynález v jednom provedení týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovaný alespoň jeden isoleucin-valinový (ilv) biosyntetický enzym (například deregulovaný tak, že je zvýšena produkce valinu a/nebo isoleucinu a/nebo -KIV), kde uvedený enzym je vybrán ze skupiny zahrnující IlvBN, AlsS « · • 0

0 0 • 00*

(nebo acetohydroxyacid-synthetasu), IlvC (nebo acetohydroxyacid-isomeroreduktasu) a IlvD (nebo dihydroxyacid-dehydratasu). V jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovaný alespoň dva isoleucin-valinové (ilv) biosyntetické enzymy, kde uvedené enzymy jsou vybrány ze skupiny zahrnující IlvBN, AlsS (nebo acetohydroxyacid-synthetasu), IlvC (nebo acetohydroxyacidisomeroreduktasu) a IlvD (nebo dihydroxyacid-dehydratasu).

V jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovaný alespoň tři isoleucin- valinové (ilv) biosyntetické enzymy, kde uvedené enzymy jsou vybrány ze skupiny zahrnující IlvBN, AlsS (nebo acetohydroxyacidsynthetasu) , IlvC (nebo acetohydroxyacid- isomeroreduktasu) a IlvD (nebo dihydroxyacid-dehydratasu).

Již bylo zmíněno, že bylo zjištěno, že enzymy panthotenátové biosyntetické dráhy a/nebo the isoleucin-valinové (ilv) dráhy mají alternativní aktivitu v syntéze kyseliny [R]-3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)propionové (HMBPA) nebo kyseliny [R]-3-(2-hydroxy-3methyl-butyrylamino)-propionové (HMBPA). Termín „dráha syntézy kyseliny R-3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)propionové (HMBPA) označuje alternativní biosyntetickou dráhu, ve které se účastní biosyntetické enzymy a sloučeniny (například substráty a podobně) tradičně asociované s panthotenátovou biosyntetickou dráhou a/nebo isoleucinvalinovou (ilv) biosyntetickou dráhou, která vede k tvorbě nebo syntéze HMBPA. Termín HMBPA biosyntetické dráha označuje biosyntetickou dráhu vedoucí k syntéze HMBPA v * · • φ » ♦ * • ··· mikroorganismu (například in vivo), stejně jako biosyntetickou dráhu vedoucí k syntéze ΗΜΒΡΑ in vitro.

Termín ΗΜΒΡΑ biosyntetický enzym označuje enzym využívaný pro tvorbu sloučeniny (například meziproduktu nebo produktu) ΗΜΒΡΑ biosyntetické dráhy. Například, syntéza kyseliny 2-hydroxyisovalerové (α-HIV) z a-ketoisovalerátu (α-KIV) je katalyzována produkty PanEl nebo panE2 genu (PanEl je alternativně označován jako ketopanthoátreduktasa) a/nebo je katalyzována produktem ilvC genu (alternativně označovaného jako acetohydroxyacidisomeroreduktasa). Tvorba ΗΜΒΡΑ z β-alaninu a α-HIV je katalyzována produktem panG genu (alternativně označovaného jako panthotenát-synthetasa).

Termín „kyselina [R]-3-(2-hydroxy-3 -methylbutyrylamino)-propionová (,,ΗΜΒΡΑ) označuje ΗΜΒΡΑ ve formě volné kyseliny, stejně jako hydroxy-3-methyl-butyrylamino)propionát a jakékoliv jeho soli (například soli získané nahrazením acidického vodíku kyseliny 3-(2-hydroxy-3methyl-butyrylamino)-propionové nebo 3-(2-hydroxy-3methyl-butyrylamino)-propionátu kationtem, například vápníkem, sodíkem, draslíkem, ammoniem, kde tyto soli jsou také označovány jako „soli kyseliny 3-(2-hydroxy-3-methylbutyrylamino)-propionové nebo „HMBPA soli. Výhodnými ΗΜΒΡΑ solemi jsou kalcium-HMBPA nebo natrium-HMBPA. HMBPA soli podle předkládaného vynálezu zahrnují soli připravené běžnými metodami z volných kyselin popsaných v předkládaném vynálezu. HMBPA sůl podle předkládaného vynálezu může být také běžnými způsoby přeměněna na volnou kyselinu

3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)-propionovou nebo 3-(2-hydroxy-3 -methyIbutyrylamino)-propionát.

• 4 • · 4 • 4 4 « 4

4 • 4 · 4444

Částečně na základě objevu, že nadměrná exprese nebo deregulace panthotenátové biosyntetické dráhy a/nebo isoleucin-valinové (iv) dráhy může vést k alternativní produkci HMBPA (ve srovnání s požadovanou produkcí panthotenátu) se předkládaný vynález týká způsobů pro produkci panthotenátu bez HBMPA, které zahrnují kultivování mikroorganismu, který má nejen deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a/nebo isoleucin-valinovou (ilv) dráhu, ale který má také selektivně regulované některé enzymy tak, že je upřednostněna produkce prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA. Termín selektivní regulace označuje selekci pro regulaci nebo cílené ovlivnění určitého enzymu nebo enzymů z panthotenátové biosyntetické dráhy nebo z isoleucin-valinové (ilv) dráhy, o kterých je známo, že se podílejí jak na syntéze panthotenátu, tak HMBPA, kde toto ovlivnění je takové, že upřednostňuje produkci panthotenátu před produkcí HMBPA. Výhodně jsou enzymy, které jsou regulovány, vybrány ze skupiny zahrnující PanEl, PanE2, PanB a/nebo IlvC.

V jednom provedení je selektivně regulovaný Pan El. Například předkladatelé vynálezu zjistili, že nadměrná exprese PanEl může katalyzovat tvorbu HMBPA prekurzoru, a proto selektivní regulace množství nebo aktivity (například mírné snížení koncentrace nebo aktivity PanEl) může způsobit posun od produkce HMBPA k produkci panthotenátu (t.j. upřednostnit produkci panthotenátu před produkcí HMBPA).

Dále bylo zjištěno, že PanE2 upřednostňuje produkci HMBPA. Proto se v jiném provedení vynález týká deletování nebo regulování panE2.

Obdobně, předkladatelé vynálezu zjistili, že zvýšení aktivity PanB může způsobit posun z alternativní HMBPA • ·

• 4 · 4

4 4 4 4 biosyntetické dráhy k panthotenátové biosyntetické dráze, a proto selektivní regulování množství nebo aktivity PanB může upřednostnit produkci panthotenátu vůči produkci HMBPA.

V jednom provedení je PanB aktivita zvýšena nadměrným exprimováním panB genu. V jiném provedení je PanB aktivita zvýšena expresí mnoha kopií panB genu. PanB aktivita může být také zvýšena inhibováním zpětnovazebně inhibice PanB. Konkrétně, bylo zjištěno, že PanB aktivita být zvýšena regulováním (například selektivním regulováním) panthotenátkinasy, klíčového enzymu ve tvorbě koenzymu A (CoA) z panthotenátu (viz například. U.S. patentová přihláška pořadové č. 09/09/667,569). Regulace panthotenát-kínasy (například snížení aktivity nebo koncentrace panthotenátkinasy) redukuje produkci CoA, což potom snižuje zpětnovazebnou inhibici PanB, stejně jako upřednostňuje akumulaci panthotenátu. V jednom provedení je aktivita panthotenát-kínasy snížena (a PanB aktivita je potom zvýšena) delecí CoaA a snížením aktivity CoaX (CoaA a CoaX jsou oba schopné katalyzovat první stupeň v biosyntéze CoA v některých mikroorganismech). V jiném provedení je aktivita panthotenát-kinasy snížena (a PanB aktivitu je potom zvýšena) deletováním CoaX a snížením aktivity CoaA. V ještě jiném provedení je aktivita panthotenát-kinasy snížena (a PanB aktivita je potom zvýšena) snížením aktivity CoaA a CoaX.

V ještě jiném aspektu se předkládaný vynález týká způsobu pro produkci panthotenátu bez HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu za podmínek vybraných tak, že upřednostňují produkci panthotenátu před produkcí HMBPA. Konkrétně bylo zjištěno, že mezi takové podmínky patří redukovaná stabilní koncentrace glukosy, vyšší stabilní koncentrace kyslíku a/nebo nadbytek šeřinu, a tyto podmínky upřednostňují produkci panthotenátu před produkcí HMBPA. Termín redukovaná stabilní koncentrace glukosy označuje hladiny glukosy nižší než hladiny běžně používané pro kultivování daného mikroorganismu. Například, kultivování mikroorganismu Bacillus popsané v uvedených příkladech se provede za přítomnosti koncentrace glukosy přibližně 0,2-1,0 g/1. Tak jsou snížené stabilní koncentrace glukosy výhodně nižší než 0,2 g/1. Termín „vyšší stabilní koncentrace kyslíku označuje stabilní koncentrace kyslíku vyšší než jsou koncentrace běžně používané pro kultivování daných mikroorganismů, a tyto koncentrace inverzně korelují se sníženými koncentracemi glukosy. Například kultivování mikroorganismu Bacillus popsané v uvedených příkladech se provede za přítomnosti koncentrace rozpuštěného kyslíku přibližně 10-30%. V souladu s tím jsou vyšší koncentrace kyslíku koncentrace vyšší než 30% rozpuštěného kyslíku, lépe vyšší než 95% rozpuštěného kyslíku. Termín „nadbytek šeřinu označuje koncentrace šeřinu vyšší než jsou koncentrace běžně používané pro kultivování daných mikroorganismů. Například kultivování mikroorganismu Bacillus popsané v uvedených příkladech se provede za přítomnosti koncentrace šeřinu přibližně 0-2,5 g/1. Nadměrné koncentrace šeřinu jsou tedy koncentrace vyšší než 2,5 g/1 šeřinu, výhodně přibližně 2,5 až 20 g/1 šeřinu.

V ještě jiném provedení je produkce HMBPA upřednostněna zvýšením prekurzorů a/nebo meziproduktů biosyntetičké dráhy panthotenátu a/nebo isoleucin-valinu (ilv) jak jsou zde definovány (například, kultivováním mikroorganismu za přítomnosti nadbytku β-alaninu, valinu a/nebo -KIV) nebo, alternativně, kultivováním mikroorganismu schopného produkovat významná množství β-alaninu bez dodávání β-alaninu (t.j., β-alanin-independentních mikroorganismů, • · • · · » · · · • · ···· » · · ♦ · · jako jsou popsány v U.S. patentové přihlášce pořadové č.

09/09/667, 569) .

Různé aspekty předkládaného vynálezu budou nyní popsány podrobně v následujících oddílech.

I. Cílené ovlivnění genů kódujících různé panthotenátové a/nebo isoleucin-valinové a/nebo HMBPA biosyntetické enzymy

V jednom provedení se předkládaný vynález týká cíleného ovlivnění nebo modifikování různých biosyntetických enzymů e panthotenátové a/nebo isoleucin-valinové (ilv) a/nebo HMBPA biosyntetické dráhy. Konkrétně se vynález týká modifikování různých enzymatických aktivit asociovaných s uvedenými dráhami modifikováním nebo alterováním genů kódujících uvedené biosyntetické enzymy.

Termín gen, jak je zde použit, označuje molekulu nukleové kyseliny (například, DNA molekul nebo její segment), která může být v organismu separována od jiného genu nebo genů, intergenové DNA (t.j. vmezeřené nebo oddělující DNA, která za přirozeného stavu sousedí s genem · a/nebo separuje geny v chromosomální DNA organismu). Alternativně se může gen mírně přesahovat s jiným genem (například, 3' konec prvního genu se může překrývat s 5 koncem druhého genu), a překrývající se geny jsou separovány od ostatních genů intergenovou DNA. Gen může řídit syntézu enzymu nebo jiné proteinové molekuly (například může obsahovat kódující sekvence, například otevřený čtecí rámec (ORF), který kóduje protein) nebo může být sám funkční v organismu. Gen v organismu může být uspořádán v operonu, jak je zde definován, kde uvedený operon je separován od .··..··. .·· ··· ίί·*··· ····

·. .... .. · · · dalších genů a/nebo operonu intergenovou DNA. Termín „izolovaný gen, jak je zde použit, označuje gen, který v podstatě neobsahuje sekvence, které za přirozeného stavu sousedí s genem v chromosomální DNA organismu, ze kterého je gen získán (tj. gen neobsahuje sousední kódující sekvence, které kódují druhý nebo odlišný protein, sousední strukturální sekvence a podobně) a volitelně obsahuje 5 a 3 regulační sekvence, například promotorové sekvence a/nebo terminátorové sekvence. V jednom provedení obsahuje izolovaný gen především kódující sekvence pro protein (například sekvence kódující Bacillus proteiny).V jiném provedení obsahuje izolovaný gen kódující sekvence pro protein (například pro Bacillus protein) a sousední 5' a/nebo 3' regulační sekvence z chromosomální DNA organismu, ze kterého je gen získán (například Bacillus regulační sekvence lokalizované 5' a/nebo 3'). Výhodně obsahuje izolovaný gen méně než přibližně 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb,

0,5 kb, 0,2 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp nebo 10 bp nukleotidové sekvence, která v chromosomální DNA organismu sousedí s genem.

Termín operon označuje alespoň dva sousedící geny nebo ORF, volitelně s překrývající se sekvencí na 5 nebo 3 konci alespoň jendoho genu nebo ORF. Termín „operon označuje koordinovanou jednotku genové exprese, která obsahuje promotor a též regulační element asociovaný s jedním nebo více sousedícími geny nebo ORF (například strukturální geny kódující enzymy, například biosyntetické enzymy). Exprese genů (například strukturálních genů) může být koordinovaně regulována, například regulačními proteiny, které se váží na regulační element nebo anti-ukončením transkripce. Geny operonu (například strukturální geny) mohou být transkribovány za zisku jediné mRNA, která kóduje všechny • ·

• · · • φ φ • φ φ • · φφφφ • φ φ • φφφ • φφφφφ • φ φ • Φ φ proteiny.

„Gen obsahující mutaci nebo „mutantní gen je gen obsahující nukleotidovou sekvenci, která obsahuje alespoň jednu alteraci (například, substituci, inserci, deleci) takovou, že polypeptid nebo protein kódovaný uvedeným mutantním genem vykazuje aktivitu, která se liší od aktivity polypeptidu nebo protein kódovaného normální molekulovou nukleové kyseliny nebo genem. V jednom provedení kóduje gen obsahující mutaci nebo mutantní gen polypeptid nebo protein mající zvýšenou aktivitu ve srovnání s polypeptidem nebo proteinem kódovaným přirozeným genem, například při testování za stejných podmínek (například při testu v mikroorganismu kultivovaném za stejné teploty). Termín zvýšená aktivita nebo zvýšená enzymatická aktivita označuje aktivitu, která je alespoň o 5% vyšší než aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného přirozenou molekulou nukleové kyseliny nebo genem, výhodně o alespoň 5-10% vyšší, výhodněji o alespoň 10-25% vyšší a nejvýhodněji o alespoň 25-50%, 50-75% nebo 75-100% vyšší než je aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného přirozenou molekulou nukleové kyseliny nebo genem. Hodnoty mez uvedenými hodnotami, například, 75-85%, 85-90%, 90-95%, jsou také zahrnuty v předkládaném vynálezu. Termín zvýšená aktivita nebo zvýšená enzymatická aktivita také označuje aktivitu, která je alespoň 1,25-krát vyšší, než je aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného přirozeným genem, výhodně alespoň 1,5-krát vyšší, výhodněji alespoň 2-krát vyšší a nejvýhodněji alespoň 3-krát, 4-krát, 5-krát,

10-krát, 20-krát, 50-krát, 100-krát vyšší, než je aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného přirozeným genem.

V jiném provedení kóduje gen mající mutaci nebo mutantní ·

• · · • ···· gen polypeptid nebo protein mající redukovanou aktivitu ve srovnání s polypeptidem nebo proteinem kódovaným přirozeným genem, například při testování za stejných podmínek (například při testu v mikroorganismu kultivovaném za stejné teploty). Mutantní gen také může nekódovat žádný peptid nebo může mít nižší úroveň produkce přirozeného polypeptidu. Termín redukovaná aktivita nebo redukovaná enzymatická aktivita označuje aktivitu, která je alespoň o 5% nižší než je aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného přirozenou molekulou nukleové kyseliny nebo genem, výhodně o alespoň 5-10% nižší, výhodněji o alespoň 10-25% nižší a nejvýhodněji o alespoň 25-50%, 50-75% nebo 75-100% nižší než je aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného přirozenou molekulou nukleové kyseliny nebo genem. Hodnoty mezi uvedenými hodnotami, například 75-85%, 85-90%, 90-95%, také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Termín redukovaná aktivita nebo „redukovaná enzymatická aktivita také označuje aktivitu, která byla deletována nebo vyřazena (například o přibližně 100% nižší aktivitu než je aktivita polypeptidu nebo proteinu kódovaného přirozenou molekulou nukleové kyseliny nebo genem).

Aktivita může být určena jakýmkoliv přijímaným způsobem pro měření aktivity daného proteinu. Aktivita může být měřena nebo testována přímo, například měřením aktivity proteinu izolovaného nebo přečištěného z buněk nebo mikroorganismů. Alternativně může být aktivita měřena v buňce nebo mikroorganismu nebo v extracelulárním mediu. Například, testování na mutantní gen (t.j., uvedený mutant kódující redukovanou enzymatickou aktivitu) může být provedeno exprimováním mutovaného genu v mikroorganismu, například mutantním mikroorganismu, ve kterém je enzym citlivý na teplotu, a testováním mutantního genu na

mutant na zvýšenou schopnost komplementovat teplotně-sensitivní (Ts) enzymatickou aktivitu. Mutantní gen, který kóduje enzymatickou aktivitu může být takový gen, který komplementuje Ts mutant účinnější než například odpovídající přirozený gen. Mutantní gen, který kóduje redukovanou enzymatickou aktivitu je takový gen, který komplementuje Ts mutant méně účinně než například odpovídající přirozený gen. .

Odborníkům v oboru bude jasné, že i jediná substituce v sekvenci nukleové kyseliny nebo genu (například substituce baze, která kóduje změnu v příslušné aminokyselinové sekvenci) může dramaticky ovlivnit aktivitu kódovaného polypeptidu nebo proteinu ve srovnání s příslušným přirozeným polypeptidem nebo proteinem. Mutantní gen (například kódující mutantní polypeptid nebo protein), jak je zde definován, je snadno odlišitelný od nukleové kyseliny nebo genu kódujícího proteinový homolog v tom, že mutantní gen kóduje protein nebo polypeptid mající pozměněnou aktivitu, což je případně možno pozorovat v odlišném fenotypu mikroorganismu exprimujícím uvedený mutantní gen nebo produkující uvedený mutantní protein nebo polypeptid (t.j. mutantního mikroorganismu) ve srovnání s příslušným mikroorganismem exprimujícím přirozený gen. Naopak, proteinový homolog může mít identickou nebo v podstatě identickou aktivitu, volitelně fenotypově neodlišitelnou při produkci v mikroorganismu, ve srovnání se stejným mikroorganismem exprimujícím přirozený gen. Proto není stupeň identitity sekvence mezi molekulami nukleové kyseliny, geny, proteiny nebo polypeptidy tím, co odlišuje homology a mutanty, a pro toto odlišení slouží spíše aktivita kódovaného proteinu nebo polypeptidu: homology mající nízkou (například, 30-50%) identitu sekvence mohou

• · • · · • ·9« · • · · • · ·» • · · « • · · ·· ···· stále ještě mít v podstatě ekvivalentní funkční aktivity, a mutanty mající například 99% identitu sekvence mohou mít dramaticky odlišné nebo alterované funkční aktivity.

Odborníkům v oboru bude jasné, že molekuly nukleové kyseliny, geny, proteiny nebo polypeptidy pro použití v předkládaném vynálezu mohou být odvozeny od jakéhokoliv mikroorganismu majícího HMBPA biosyntetickou dráhu, ilv biosyntetickou dráho nebo panthotenátovou biosyntetickou dráho. Takové molekuly nukleové kyseliny, geny, proteiny nebo polypeptidy mohou být identifikovány odborníky v oboru za použití známých technik, jako je homologický skríning, srovnání sekvencí a podobně, a mohou být odborníkem v oboru modifikovány tak, že exprese nebo produkce těchto molekul nukleové kyseliny, genů, proteinů nebo polypeptidů probíhá v rekombinantním mikroorganismu (například za použití vhodných promotorů, vazebných místo pro ribosomy, expresních nebo integračních vektorů, modifikováním sekvence genů tak, že dojde ke zvýšení jejich transkripce (při současném využití preferenčních kodonů) atd., za použití technik popsaných v předkládaném vynálezu a známých odborníkům v oboru.

V jednom provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z Gram pozitivního mikroorganismu (například mikroorganismu, který zadržuje bazické barvivo, například krystalickou violeť, v důsledku přítomnosti Gram-pozitivní stěny obklopující mikroorganismus). Termín získaný (například získaný z Gram pozitivního mikroorganismu) označuje gen, který se za přirozeného stavu nachází v mikroorganismu (například který se přirozeně nachází v Gram pozitivním mikroorganismu). Ve výhodném provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z mikroorganismu náležícího do kmenu vybraného ze skupiny zahrnující • ·· · · ·· · · ·· ·· · · · · · · · · • · · · · · · *· · · · · · ··· · · * ··· ·· ···· ·· ···· ·· · následující kmeny: Bacillus, Corynebacterium (například Corynebacterium glutamicum), Lactobacillus, Lactococci a Streptomyces. Ve výhodnějším provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z mikroorganismu kmene Bacillus. V jiném výhodném provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z mikroorganismu vybraného ze skupiny zahrnující Bacillus subtilis, Bacillus lentimorhus, Bacillus lentus, Bacillus irmus, Bacillus pant of he nticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cere us, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus halodurans, a jiné Bacilly skupiny 1, které jsou charakterizovány, například, 16S rRNA. V jiném výhodném provedení je gen získán z Bacillus brevis nebo Bacillus stearothermophilus. V jiném výhodném provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z mikroorganismu vybraného ze skupiny zahrnující Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, a Bacillus pumilus. V zejména výhodném provedení je gen získán z Bacillus subtilis (například je získán z Bacillus subtilis). Termín získaný z Bacillus subtilis označuje geny, které se přirozeně vyskytují v mikroorganismu Bacillus subtilis. Do rozsahu předkládaného vynálezu spadají geny získané z rodu Bacillus (například geny zísakné z B. subtilis), jako jsou například geny Bacillus nebo B. subtilis coaX, serA geny, glyA geny, coaA geny, pan geny a/nebo ilv geny.

V jiném provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z Gram negativních (vylučujících bazcké barvivo) mikroorganismů. Ve výhodném provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z mikroorganismu náležícího do skupiny zahrnující kmeny Salmonella (například,

Salmonella typhimurium), Escherichia, Klebsiella, Serratia, • 4 • · · · · · · · · ··

4 4 4 4 4 4 4 9 4 ‘4 4 4. 4 4 4 4 · · 4 4444

444 444 444

4444 44 4444 44 4 a Próteus. Ve výhodnějším provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z mikroorganismu kmenu Escheríchia. V ještě výhodnějším provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány z Escheríchia coli. V jiném provedení jsou geny podle předkládaného vynálezu získány ze Saccharomyces (například Saccharomyces cerevisiae).

II. Rekombinantní molekuly nukleové kyseliny a vektory

Předkládaný vynález se dále týká rekombinantních molekul nukleové kyseliny (například rekombinantních DNA molekul), který obsahují geny popsané v předkládaném vynálezu (například izolované geny), výhodně Bacillus geny, výhodněji geny Bacillus subtilis, ještě výhodněji Bacillus subtilis geny pro biosyntézu panthotenátu a/nebo isoleucinu/valinu (ilv) a/nebo HMBPA biosyntetičké geny. Termín rekombinantní molekula nukleové kyseliny označuje molekulu nukleové kyseliny (například DNA molekulu), která byla pozměněnam modifikována nebo upravena tak, že se liší v nukleotidové sekvenci od přirozené nebo nativní molekuly nukleové kyseliny, ze které byla rekombinantní molekula nukleové kyseliny odvozena (například adicí, delecí nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů). Výhodně obsahuje rekombinantní molekula nukleové kyseliny (například rekombinantní DNA molekula) izolovaný gen podle předkládaného vynálezu operativně navázaný na regulační sekvenci. Výraz „operativně navázaný na regulační sekvenci znamená, že nukleotidová sekvence daného genu je navázaná na regulační sekvenci takovým způsobem, že umožněna exprese (například zesílená, zvýšená, konstitutivní, bazální, zeslabená, snížená nebo reprimovaná) genu, výhodně exprese genového produktu kódovaného genem (například když je rekombinantní molekula nukleové kyseliny obsažena v • · • Φ φ • φ · · · · • · · · φ · · · · • φ · · · · φφ · φφφφ ••φφ φφ φφφφ φφ φ rekombinantním vektoru, jak je zde definována, a je zavedena do mikroorganismu).

Termín regulační sekvence označuje sekvenci nukleové kyseliny, která ovlivňuje (například moduluje nebo reguluje) expresi jiných sekvencí nukleové kyseliny (t.j. genů).

V jednom provedení je regulační sekvence obsažena v rekombinantní molekule nukleové kyseliny v podobné nebo identické pozici a/nebo orientaci vzhledem k danému genu, jak je tomu v pro regulační sekvenci a gen v přirozeném stavu, tj. je v přirozené pozici a/nebo orientaci. Například může být daný gen obsažený v rekombinantní molekule nukleové kyseliny operativně navázaný na regulační sekvenci, která je spojena s daným genem v normálním organismu (například je gen operativně navázaný na nativní regulační sekvence (například na nativní promotor). Alternativně, může být požadovaný gen obsažený v rekombinantní molekule nukleové kyseliny operativně navázaný na regulační sekvenci, která je za normálního stavu spojena s jiným (například odlišným) genem v normálním organismu. Alternativně může být daným gen obsažený v rekombinantní molekule nukleové kyseliny operativně navázaný na regulační sekvenci z jiného organismu. Například mohou být regulační sekvence z jiných mikroorganismů (například jiné bakteriální regulační sekvence, bakteriofágové regulační sekvence a podobně) operativně navázané na požadovaný gen.

V jednom provedení je regulační sekvence non-nativní nebo přirozeně se nevyskytující sekvence (například sekvence, která byla modifikována, mutována, substituována, derivatizovaná, deletovaná, včetně sekvencí, které jsou syntetizované chemicky). Mezi výhodné regulační sekvence patří promotory, zesilovače transkripce, terminační signály, • · • · • · • · · • · · · · ·· · · ·· t · · ·« · ««·· • · · · · · · · · » ·· · · • · · · · · ··· ·· ···· ·· ···· ·· · anti-terminační signály a jiné elementy řídící expresi (například sekvenc, na které se váží represory nebo induktory a/nebo vazebná místa pro transkripční a/nebo translační regulační proteiny, například v transkribované mRNA). Takové regulační sekvence jsou popsány, například, v Sambrook. J., Fritsh. F. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Regulační sekvence zahrnují sekvence řídící konstitutivní expresi nukleotidové sekvence v mikroorganismu (například konstitutivní promotory a silné konstitutivní promotory), promotory řídící indukovatelnou expresi nukleotidové sekvence v mikroorganismu (například indukovatelné promotory, například, xylosou idukovatelné promotory) a ty, které zeslabují nebo reprimují expresi nukleotidové sekvence v mikroorganismu (například, atenuační signály nebo represorové sekvence). DO předkládaného vynálezu také spadá regulace exprese daného genu odstraněním nebo deletováním regulačních sekvencí. Například mohou být odstraněny sekvence podílející se na negativní regulaci transkripce, čímž se může dosáhnout zvýšení exprese požadovaného genu.

V jednom provedení obsahuje rekombinantní molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu sekvenci nukleové kyseliny nebo genu, která kóduje alespoň jeden bakteriální genový produkt (například panthotenátový biosyntetický enzym, isoleucin-valinový biosyntetický enzym a/nebo HMBPA biosyntetický enzym) operativně navázaný na promotor nebo promotorovou sekvenci. Mezi výhodné promotory podle předkládaného vynálezu patří Bacillus promotory a/nebo bacteriofágové promotory (například bakterifágu, který infikuje mikroorganismy Bacillus). V jednom provedení je • 4 • « • · 4 • 4 4 · · 4 4 4 4 4 4

4 4 44 4 · · · · • 4 4 4 4 4 4 44 4444

444 444 444

4444 44 4444 44 4 promotérem Bacillus promotor, výhodně silný Bacillus promotor (například promotor asociovaný s biochemickým „housekeeping genem v Bacillus nebo promotor asociovaný s geny glykolytické dráhy v Bacillus). V jiném provedení je promotorem bakteriofágový promotor. Ve výhodném provedení je promotor z bakteriofágový SPOI.V zejména výhodném provedení je promotor vybrán ze skupiny zahrnující P₁₅, P₂₆ nebo P_veg a má například následující sekvence:

_GCTATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGT ACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGAT CCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGT GTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT (SEQ ID NO: 1);

GCC TACC TAGC T TCCAAGAAAGATATCC TAACAGCACAAGAGC GGAAAGAT gttttgttctacatccagaacaacctctgctaaaattcctgaaaaaitttgca AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGC AGGACGC (SEQ ID NO:2); a

GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAAC GTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATA AATGTAGTGAGGTGGATGCAATG (SEQ ID NO:3). Mezi další výhodné promotory patří tef (promotor pro translační elongační faktor (TEF)) a pvc (promotor pro pyruvát-karboxylasu (PYC)), které indukují vysokou úroveň exprese v Bacillus (například Bacillus subtilis). Další výhodné promotory pro použití u Gram pozitivních mikroorganismů jsou amy a SPO2 promotory. Další výhodné promotory pro použití u Gram negativních mikroorganismů jsou například cos, tac, tip, tel, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIQ, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, -PR nebo -PL.

V jiném provedení obsahuje rekombinantní molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu terminátorovou sekvenci nebo terminátorové sekvence (například transkripční terminátorové sekvence). Termín • 4 4 4 · 44 4 4 44

4 44 4 4 4 4 4

4 4 44 4 4 44 4444

444 444 4 4 4

4444 44 4444 44 4 „terminátorové sekvence zahrnuje regulační sekvence, které slouží pro ukončení transkripce mRNA. Terminátorové sekvence (nebo tandemové transkripční terminátory) mohou dále sloužit pro stabilizaci mRNA (například přidáním struktury k mRNA), například, vůči působení nukleas.

V ještě jiném provedení obsahuje rekombinantní molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu sekvence, které umožňují detekci vektoru obsahujícího uvedené sekvence (t.j. detekovatelné a/nebo selektovatelné markéry), například, geny, které kódují resistenci na antibiotika nebo které překonávají auxotrofní mutace, například, trpC', markéry pro léky, fluorescentní markéry, a/nebo kolorimetrické markéry (například lacZ/-galaktosidasu).

V ještě jiném provedení obsahuje rekombinantní molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu artificiální vazebné místo pro ribosom (RBS) nebo sekvenci, která se transkribuje do artíficiálního RBS. Termín „artificiální vazebné místo pro ribosom (RBS) označuje místo v mRNA molekule (například kódované v DNA), na které se váží ribosomy (například pro iniciaci translace), které se liší od nativního RBS (například RBS vyskytujícího se v normálním genu) v alespoň jednom nukleotidu. Výhodná artificiální RBS mají délku přibližně 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16, 17-18, 19-20, 21-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-30 nebo více nukleotidů, ze kterých se přibližně 1-2, 3-4, 5-6, 7-8,

9-10, 11-12, 13-15 nebo více liší od nativního RBS (například nativního RBS daného genu, například nativního panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 4) nebo nativního panD RBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG (SEQ ID NO:5)). Výhodně jsou nukleotidy, které se liší, substituovány tak, že jsou identické s jedním nebo více nukleotidy ideálního RBS when optimálně seřazeného pro • 4 4

srovnání. Mezi ideální RBS patří, například, AGAAAGGAGGTGA (SEQ ID NO:6).; TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG (SEQ ID NO:7); TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG (SEQ ID NQ:8);

AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG (SEQ ID NO: 9); a

AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG (SEQ ID NO:10). Artificiální RBS mohou být použity pro nahrazení přirozených nebo nativních RBS asociovaných s konkrétním genem. Artificiální RBS výhodně zvyšují translaci konkrétního genu. Mezi výhodná artificiální RBS (například RBS pro zvýšení translace panB, například B. subtilis panB) patří CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 11) a CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (SEQ ID NO: 12). Mezi výhodná artificiální RBS (například RBS pro zvýšení translace panD, například B. subtilis panD) patří TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG (SEQ ID NO: 13); TTAGAAAGGAGG TTTAATTAATG (SEQ ID NO: 14); TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG (SEQ ID NO: 15); TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG (SEQ ID NO:16); ATTCGAGA AAGGAGGTGAATATAATATG (SEQ ID NO: 17) ATTCGAGAAAGGAG GTGAATANFAATG (SEQ ID NO: 18) a ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG (SEQ ID NO:19).

Předkládaný vynález dále zahrnuje vektory (například rekombinantní vektory), které obsahují molekulu nukleové kyseliny (například geny nebo rekombinantní molekuly nukleové kyseliny obsahující uvedené geny), jak jsou zde popsány. Termín „rekombinantní vektor označuje vektor (například, plasmid, fág, fasmid, virus, kosmid nebo jiný vektor tvořený přečištěnou nukleovou kyselinou), který byl pozměněn, alterován nebo modifikován tak, že obsahuje větší množství, menší množství nebo odlišnou sekvenci nukleové kyseliny než je sekvence přirozené molekuly nukleové kyseliny, ze které je rekombinantní vektor odvozen. Výhodně obsahuje rekombinantní vektor gen kódující biosyntetický enzym nebo rekombinantní molekulu nukleové kyseliny ·· 00 ·· ·· · • · 0 0 · 0 · 0 0 · • · · · 0 0 0 0 0 • · ·· 0 0 ·· 00000 • 0 · · 0 0 · 0

0000 00 0000 ·0 · obsahující uvedený gen, operativně navázaný na regulační sekvence, například promotorové sekvence, termínátorové sekvence a/nebo artificiální vazebná místa pro ribosom (RBS), jak jsou zde definována. V jiném provedení obsahuje rekombinantní vektor podle předkládaného vynálezu sekvence, které zesilují replikaci v bakterii (například sekvence zesilující replikaci). V jednom provedení účinkuje sekvence zesilující replikaci v E. coli. V jiném provedení jsou sekvence zesilující replikaci odvozeny od pBR322.

V ještě jiném provedení obsahuje rekombinantní vektor podle předkládaného vynálezu sekvence pro resistenci na antibiotika. Termín „sekvence pro resistenci na antibiotika označuje sekvence, které podporují nebo udílejí resistenci na antibiotika v hostitelském organismu (například,

Bacillus). V jednom provedení jsou sekvence pro resistenci na antibiotika vybrány ze skupiny zahrnující cat sekvenci (resistence na chloramfenikol), tet sekvenci (resistence na tetracyklin), erm sekvenci (resistence na erythromycin), neo sekvenci (resistence na neomycin), kan sekvenci (kanamycin resistence) a spec sekvenci (resistence na spectinomycin). Rekombinantní vektory podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat sekvence pro homologní rekombinaci (například sekvence navržené tak, aby umožnily rekombinaci daného genu do chromosomu organismu). Například bpr, vpr nebo amyE sekvence mohou být použity jako homologické cíle pro rekombinaci do chromosomu hostitelského organismu. Dále bude odborníkům v oboru jasné, že vektor může být navržen podle faktorů, jako je charakter geneticky upravovaného mikroorganismu, požadovaná úroveň exprese genového produktu a podobně.

IV. Rekombinantní mikroorganismy ·· · ·· ·· ·· ·· • · · * · · • · · · · · · • · · 9 9 9 ·· ···· ·· ····

Předkládaný vynález se dále týká mikroorganismů, t.j. rekombinantních mikroorganismů, které obsahují vektory nebo geny (například přirozené a/nebo mutované geny) podle předkládaného vynálezu. Termín „rekombinantní mikroorganismus označuje mikroorganismy (například, bakterie, kvasinky, houby atd.), které byly geneticky upraveny, modifikovány nebo zpracovány (například geneticky upraveny), tak že mají alterovaný, modifikovaný nebo odlišný genotyp a/nebo fenotyp (například když genetická modifikace postihuje kódující sekvence nukleové kyseliny mikroorganismu) ve srovnání s přirozeným mikroorganismem, ze kterého byly odvozeny.

V jednom provedení je rekombinantní mikroorganismus podle předkládaného vynálezu Gram pozitivní organismus (například mikroorganismus, který zachycuje bazické barvivo v důsledku přítomnosti Gram-pozitivní stěny obklopující mikroorganismus). Ve výhodném provedení náleží rekombinantní mikroorganismus ke kmenu vybranému ze skupiny zahrnující Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococcus a Streptomyces. Ve výhodnějšímprovedení náleží rekombinantní mikroorganismus ke kmenu Bacillus. V jiném výhodném provedení je rekombinantní mikroorganismus vybrán ze skupiny zahrnující Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus halodurans a jiné Bacilly skupiny I, jak jsou například charakterizovány 16S rRNA. V jiném výhodném provedení je rekombinantním mikroorganismem Bacillus brevis nebo Bacillus stearothermophilus. V jiném výhodném provedení ·♦ · • ···· ··· • · ♦ · · · · · • · · · · · · · ···· • · · · · ·

99 9999 99 9 je rekombinantní mikroorganismus vybrán ze skupiny zahrnující Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis a Bacillus pumilus.

V jiném provedení je rekombinantním mikroorganismem Gram negatiní (vylučující bazické barvivo) organismus.Ve výhodném provedení je rekombinantním mikroorganismem mikroorganismus náležící do rodu vybraného ze skupiny zahrnující rody Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia a Próteus. Ve výhodnějším provedení je rekombinantní mikroorganismus z rodu Escherichia. V ještě výhodnějším provedení je rekombinantní mikroorganismus Escherichia coli. V jiném provedení je rekombinantní mikroorganismus Saccharomyces (například S. cerevisiae).

Výhodným „rekombinantním mikroorganismem podle předkládaného vynálezu je mikroorganismus mající deregulovanou dráhu nebo enzym biosyntézy panthotenátu, deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu nebo enzym a/nebo modifikovanou HMBPA biosyntetickou dráhu nebo enzym. Termín deregulovanou nebo deregulace označuje alteraci nebo modifikaci alespoň jednoho genu v mikroorganismu, který kóduje enzym v biosyntetické dráze, kde tato modifikace je taková, že aktivita biosyntetického enzymu v mikroorganismu je pozměněna nebo modifikována. Výhodně je alespoň jeden gen, který kóduje enzym v biosyntetické dráze pozměněn nebo modifikován tak, že je genový produkt zvýšen nebo zesílen. Výraz „deregulovaná dráha také označuje biosyntetické dráhy ve kterých je jeden nebo více genů, které kódují enzym v biosyntetické dráze, alterován nebo modifikován tak, že dojde je změně nebo modifikaci aktivity jednoho nebo více biosyntetických enzymů. Schopnost „deregulovat dráhu (například simultánně

ΦΦ * φφ φφ φφ φφ • φφ φ φ φφ φ φ φφ φφ φ φφ φ φφφφ φ φ φ φφ φ φ φφ φφφφφ φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφφφ φφ φ deregulovat jeden nebo více genů v dané biosyntetické dráze) v mikroorganismu v některých případech vzniká z konkrétního fenoménu v mikroorganismu, při kterém jsou enzymy (například dva nebo tři biosyntetické enzymy) kódované geny vyskytujícími se zároveň na jednom úseku genetického materiálu, který se označuje jako operon (který je zde definován). V důsledku koordinované regulace genů v operonu může alterace nebo modifikace jediného promotoru a/nebo regulačního elementu vést k alteraci nebo modifikaci exprese každého genového produktu kódovaného operonem. Alterace nebo modifikace regulačního elementu může zahrnovat, například, odstranění endogenního promotoru a/nebo regulačního elementu, přidání silného promotoru, indukovatelného promotoru nebo více promotorů nebo odstranění regulačních sekvencí tak, že dojde k modifikaci exprese genového produktu, modifikaci chromosomální lokalizace operonu, alterování sekvence nukleové kyseliny sousedící s operonem nebo v operonu, jako je vazebné místo pro ribosom, zvýšení počtu kopií operonu, modifikování proteinů (například regulačních proteinů, supresorů, zesilovačů, transkripčních aktivátorů a podobně) podílejících se na transkripci operonu a/nebo translaci genových produktů operonu, nebo jakýkoliv postup běžný v oboru pro deregulování exprese genů (včetně použití molekul protismyslné nukleové kyseliny, například pro blokování exprese represorových proteinů). Deregulace může také zahrnovat alterování kódujícího regionu jednoho nebo více genů, například za zisku enzymu bez zpětnovazebně regulace nebo s vyšší nebo nižší specifickou aktivitou.

V jiném výhodném provedení je rekombinantní mikroorganismus navržen nebo upraven tak, aby byl nadměrně exprimován alespoň jeden enzym pro biosyntézu panthotenátu, alespoň jeden enzym pro biosyntézu isoleucinu-valinu a/nebo • · · ·

4 4 ··»·

9· 94 49 « • · · » 4 9 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4449 • · · 4 4 · ·· ···· ·· · alespoň jeden enzym pro biosyntézu HMBPA. Termín nadměrně exprimován nebo „nadměrná exprese označuje expresi genového produktu (například biosyntetického enzymu) v úrovni vyšší než je úroveň exprese před úpravou mikroorganismu nebo ve srovnatelném mikroorganismu, který nebyl upraven. V jednom provedení může být mikroorganismus geneticky upraven nebo modifikován tak, aby nadměrně exprimoval genový produkt, ve srovnání s expresí v normálním mikroorganismu, který nebyl upraven.

Genetické upravení může zahrnovat, například, alterování nebo modifikování regulačních sekvencí nebo míst asociovaných s expresí konkrétního genu (například přidáním silných promotorů, indukovatelných promotorů nebo více promotorů nebo odstranění regulačních sekvencí, takže je exprese konstitutivní), modifikováním chromosomální lokalizace konkrétního genu, alterování sekvencí nukleové kyseliny sousedících s konkrétním genem, jako je vazebné místo pro ribosom, zvýšením počtu kopií určitého genu, modifikováním proteinů (například regulačních proteinů, supresorů, zesilovačů transkripce, transkripčních aktivátorů a podobně) podílejících se na transkripci určitého genu a/nebo na translaci produktu konkrétního genu, nebo jakýkoliv jiný běžný způsob pro deregulováním exprese určitého genu (jako je například použití protismyslné molekuly nukleové kyseliny, například pro blokování exprese represorových proteinů). Genetické modifikace mohou také zahrnovat deleci genu, například za účelem blokování dráhy nebo pro odstranění represoru.

V jiném provedení může být mikroorganismus selektivně nebo v prostředí upraven pro nadměrnou expresi genového produktu, která je vyšší než exprese před upravením • · • ·

9 · · · · mikroorganismu nebo ve srovnatelném mikroorganismu, který nebyl upraven. Například může být mikroorganismus upraven nebo kultivován za přítomnosti činidla, o kterém je známo, že zvyšuje transkripci určitého genu a/nebo translaci produktu určitého genu tak, že transkripce a/nebo translace je zesílena nebo zvýšena. Alternativně může být mikroorganismus kultivován pří teplotě vybrané tak, aby zvyšovala transkripci určitého genu a/nebo translaci určitého genového produktu tak, že transkripce a/nebo translace jsou zesíleny nebo zvýšeny.

V. Kultivování a fermentování rekombinantních mikroorganismů

Termín kultivování označuje přechovávání a/nebo růst živých mikroorganismů podle předkládaného vynálezu (například přechovávání a/nebo kultivování kultury nebo kmene). V jednom provedení je mikroorganismus podle předkládaného vynálezu kultivován v kapalném mediu. V jiném provedení je mikroorganismus podle předkládaného vynálezu kultivován v pevném mediu nebo v semi-solidním mediu. Ve výhodném provedení je mikroorganismus podle předkládaného vynálezu kultivován v mediu (například sterilním, kapalném mediu) obsahujícím živiny zásadní nebo nutné pro udržování a/nebo kultivaci mikroorganismu (například zdroje uhlíku nebo uhlíkový substrát, například uhlovodík, uhlovodíky, oleje, tuky, mastné kyseliny, organické kyseliny alkoholy; zdroje dusíku, například pepton, kvasinkové extrakty, masové extrakty, sladové extrakty, močovinu, síran amonný, chlorid amonný, dusičnan amonný a fosforečnan amonný; zdroje fosforu, například kyselinu fosforečnou, její sodíkové a draslíkové soli; stopové prvky, například hořčík, železo, mangan, vápník, měď, zinek, bór, molybden, a/nebo kobalt, ve formě soli; stejně jako růstové faktory, jako jsou • · • · • · • · · · · · ♦ · · · • · · · · · · · · ···· • · · ··· · · · • · ·· ·· ·· ···· ·· · aminokyseliny, vitamíny, růstové promotory a podobně).

Výhodně jsou mikroorganismy podle předkládaného vynálezu kultivovány za kontrolovaného pH. Termín kontrolované pH označuje jakékoliv pH, které vede k produkci požadovaného produktu (například, panthoátu a/nebo panthotenátu).

V jednom provedení jsou mikroorganismy kultivovány při pH přibližně 7. V jiném provedení jsou mikroorganismy kultivovány při pH mezi 6,0 a 8,5. Nižší pH může být udržováno jakýmkoliv způsobem známým odborníkům v oboru.

Výhodně jsou též mikroorganismy podle předkládaného vynálezu kultivovány za řízeného přívodu vzduchu. Termín „řízený přívod vzduchu označuje dostatečný přívod vzduchu (například kyslíku) pro produkci požadovaného produktu (například panthoátu a/nebo panthotenátu). V jednom provedení je přívod vzduchu řízen regulováním hladin kyslíku v kultuře, například regulováním množství kyslíku rozpuštěného v kultivačním mediu. Výhodně je přívod vzduchu do kultury řízen míšením kultury. Míšení může být provedeno plynem nebo mechanickým zařízením, otáčením nebo třepáním kultivační nádoby (například zkumavky nebo baňky) nebo za použití různých pump. Přívod vzduchu může být dále řízen probubláváním sterilního vzduchu nebo kyslíku mediem (například fermentační směsí). Výhodně je mikroorganismus podle předkládaného vynálezu kultivován bez nadměrného pěnění (například za použití protipěnivých činidel).

Dále, mikroorganismy podle předkládaného vynálezu mohou být kultivovány za řízených teplot. Termín řízená teplota označuje jakoukoliv teplotu, která vede k produkci požadovaného produktu (například panthoátu a/nebo panthotenátu). V jednom provedení jsou řízené teploty ·

* 4 · · · · 4 · · • 4 4 44 4 4 4 4 4 · 4 4

444 444 44«

4444 44 4444 44 4 v rozmezí 15⁰C a 95°C. V jiném provedení jsou řízené teploty mezi 15°C a 70°C. Výhodné teploty jsou mezi 20°C a 55°C, výhodněji mezi 30°C a 50°C.

Mikroorganismus může být kultivován (například udržován a/nebo kultivován) v kapalném mediu a výhodně je kultivován, kontinuálně nebo přerušovaně, běžnými kultivačními metodami, jako je klidová kultura, kultivace v testovací zkumavce, kultivace na třepačce (například kultivace na rotační třepačce, kultivace v třepací baňce), kultura v provzdušňovací odstředivce nebo fermentace. Ve výhodném provedení jsou mikroorganismy kultivovány v třepacích baňkách. V ještě výhodnějším provedení jsou mikroorganismy kultivovány ve fermentoru (například při fermentaci). Fermentace podle předkládaného vynálezu zahrnuje, například, fermentaci s jednou vsádkou media, s doplňováním media a kontinuální způsoby fermentace. Výraz fermentace s jednou vsádkou media označuje systém, ve kterém jsou medium, živiny, doplňky a podobně nastaveny na začátku fermentace a během fermentace se nemění, ale upravují se faktory jako je pH a koncentrace kyslíku, aby se zabránilo nadměrnému okyselení media a/nebo smrti mikroorganismů. Výraz fermentace s doplňováním media fermentace označuje totéž co, předchozí fermentace, s tou výjimkou, že se jeden nebo více substrátů nebo doplňků přidává během fermentace (například se postupně zvyšuje koncentrace nebo se přidávání provádí kontinuálně). Fráze kontinuální proces nebo kontinuální fermentace označuje systém, ve kterém je definované fermentační medium postupně přidáváno do fermentoru a stejné množství použitého nebo „kondicionovaného media se odebírá, výhodně za účelem získání požadovaného produktu (například panthoátu a/nebo panthotenátu). V oboru jsou známé různé postupy fermentace.

Fráze kultivování za podmínek, pří kterých je produkována požadovaná sloučenina označuje kultivování mikroorganismu za podmínek (například teploty, tlaku, pH, doby atd.) vhodné nebo dostatečné pro získání produkce požadované sloučeniny nebo pro získání požadovaného výtěžku produkované sloučeniny. Například kultivování pokračuje po dobu dostatečnou pro produkci požadovaného množství sloučeniny (například panthoátu a/nebo panthotenátu).

Výhodně kultivování pokračuje po dobu dostatečnou pro produkci sloučeniny (například po dobu dostatečnou pro dosažení požadované koncentrace panthoátu a/nebo panthotenátu nebo vhodného poměru panthoátu a/nebo panthotenátu:HMBPA). V jednom provedení kultivování pokračuje po dobu přibližně 12 až 24 hodin. V jiném provedení kultivování pokračuje po dobu přibližně 24 až 36 hodin, 36 až 48 hodin, 48 až 72 hodin, 72 až 96 hodin, 96 až 120 hodin, 120 až 144 hodin, nebo delší než 144 hodin.

V ještě jiném provedení jsou mikroorganismy kultivovány za takových podmínek, že je alespoň přibližně 5 až 10 g/l sloučeniny produkováno za přibližně 36 hodin, alespoň přibližně 10 až 20 g/l sloučeniny za přibližně 48 hodin, nebo alespoň přibližně 20 až 30 g/l sloučenina za přibližně 72 hodin. V ještě jiném provedení jsou mikroorganismy kultivovány za takových podmínek, že je produkováno alespoň přibližně 5 až 20 g/l sloučeniny za přibližně 36 hodin, alespoň přibližně 20 až 30 g/l sloučeniny za přibližně 48 hodin, nebo alespoň přibližně 30 až 50 nebo 60 g/l sloučeniny za přibližně 72 hodin. V jiném provedení jsou mikroorganismy kultivovány za podmínek takových, že j dosažen poměr HMBPA:HMBPA+panthotenátu 0,1:100 nebo nižší (t.j. 0,1% HMBPA versus 99,9% panthotenátu, jak je, například, určeno stanovením plochy píků při analyzování • « • · φ · φ

9 9 ΦΦ * φφφφ • Φ · ΦΦ Φ φ Φφ φφφφ • ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ

ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ φ· Φ produktu HPLC), výhodně takových, že je dosaženo poměru 0,2:100 nebo nižšího (0,2% HMBPA versus 99,8% panthotenátu), výhodněji takových, že je dosaženo poměru 0,5:100 nebo nižšího (0,5% HMBPA versus 99,5% panthotenátu). V ještě jiném provedení jsou mikroorganismy kultivovány za takových podmínek, že je dosaženo poměru HMBPA:HMBPA+panthotenátu 1:100 nebo nižšího (t.j.. 1% HMBPA versus 99% panthotenátu, jak je, například, určeno stanovením plochy píků při analyzování produktu HPLC), výhodně takových, že je dosaženo poměru 2:100 nebo nižšího (2% HMBPA versus 98% panthotenátu), výhodněji takových, že je dosaženo poměru 3:100 nebo nižšího (3% HMBPA versus 97% panthotenátu), výhodněji alespoň 4:100 nebo nižšího (4% HMBPA versus 96%

5:100	nebo	nižšího	(5%	HMBPA	versus	95%
6:100	nebo	nižšího	(6%	HMBPA	versus	94%
7:100	nebo	nižšího	(7%	HMBPA	versus	93%
8:100	nebo	nižšího	(8%	HMBPA	versus	92%
9:100	nebo	nižšího	(9%	HMBPA	versus	91%
nebo 10:100	nebo nižšího (10%	HMBPA ·	versus 90%

panthotenátu)

Způsob podle předkládaného vynálezu může dále zahrnovat stupeň získání požadované sloučeniny (například panthoétu a/nebo panthotenátu). Termín získání požadované sloučeniny označuje extrakci, získání, izolování nebo přečištění sloučeniny z kultivačního media. Získání sloučeniny může být provedeno jakoukoliv běžnou metodou izolace nebo přečištění známou v oboru, včetně reakce s běžnou pryskyřicí (například aniontovou nebo kationtovou iontoměničovou pryskyřicí, neiontovou adsorpční pryskyřicí atd.), reakcí s běžným adsorpčním činidlem (například aktivním uhlím, kyselinou křemičitou, silíkagelem, celulosou, kamencem a podobně), změnou pH, extrakcí rozpouštědlem, (například běžným • · ♦ · · · · Β ·« ·' * · · * · ·· · · ♦· • · · ·· 9 9 19 1 • · ® ·· « · 9 9 119 9 • 91 111 119

1111 19 1111 19 1 rozpouštědlem, jako je alkohol, ethylacetát, hexan a podobně), dialýzou, filtrací, zahuštěním, krystalizaci, rekrystalizací, upravením pH, lyofilízací a podobně. Například, sloučenina může být získána z kultivačního media nejprve odstraněním mikroorganismu z kultury. Medium se potom protlačí přes iontměničovou pryskyřici a potom přes aniontovou iontoměničovou pryskyřici pro odstranění anorganických aniontů a organických kyselin majících vyšší kyselost než požadovaná sloučenina. Získaná sloučenina může být potom přeměněna na sůl (například na vápenatou sůl), jak je zde popsáno.

Výhodně je požadovaná sloučenina podle předkládaného vynálezu extrahována, „izolována nebo „přečištěna tak, že výsledný přípravek v podstatě neobsahuje další složek media (například neobsahuje další složky media a/nebo vedlejší produkty fermentace). Výraz „v podstatě neobsahující další složky media označuje přípravky požadované sloučeniny, ve kterých je sloučenina separována od složek media nebo vedlejších produktů fermentace kultury, ve které je produkována. V jednom provedení obsahuje přípravek více než přibližně80% (suché hmotnosti) požadované sloučeniny (například méně než přibližně 20% dalších složek media nebo vedlejších produktů fermentace), výhodněji více než přibližně 90% požadované sloučeniny (například méně než přibližně 10% dalších složek media nebo vedlejších produktů fermentace), ještě výhodněji více než přibližně 95% požadované sloučeniny (například méně než přibližně 5% dalších složek media nebo vedlejších produktů fermentace), a nejvýhodněji více než přibližně 98-99% požadované sloučeniny (například méně než přibližně 1-2% dalších složek media nebo vedlejších produktů fermentace). Když je požadovaná sloučenina derivatizována na sůl, tak

0· « 00 0 0000 • · 0 0 0 0 · »0 «000 0·0 000 0-0 ·

0000 00 0000 00 0 výhodně sloučenina také neobsahuje další volné chemické sloučeniny asociované s tvorbou soli. Když je požadovaná sloučenina derivatizována na alkohol, tak výhodně sloučenina také neobsahuje další volné chemické sloučeniny asociované s tvorbou alkoholu.

V alternativním provedení není požadovaná sloučenina přečištěna z mikroorganismu, například když je mikroorganismus biologicky nerizikový (například bezpečný) . Například může být celé kultura (nebo supernatant kultury) použit jako zdroj produktu (například surového produktu).

V jednom provedení je kultura (nebo supernatant kultury) použit bez modifikace. V jiném provedení je kultura (nebo supernatant kultury) koncentrována. V ještě jiném provedení je kultura (nebo supernatant kultury) sušena nebo lyofilizována.

Výhodně vede způsob produkce podle předkládaného vynálezu k produkci požadované sloučeniny ve významně vysokém výtěžku. Výraz „vysoký výtěžek označuje produkci nebo výtěžek, který je významně vyšší než je obvyklý výtěžek běžných metod, například takový výtěžek, který je zvýšen na hodnotu dostatečnou pro komerční produkci požadovaného produktu (například produkci produktu s komerčně výhodnými náklady). V jednom provedení se předkládaný vynález týká způsobu produkce, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že požadovaný produkt (například panthoát a/nebo panthotenát) je produkován v koncentraci vyšší než 2 g/1. V jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu produkce, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že požadovaný produkt (například panthoát a/nebo panthotenát) je produkován v koncentraci vyšší než 10 g/1. V • · * · · ·· · • · · · · · • · · · · « · • · · · · · • · · ··· · · ···· • · · · • · · · · • · · • · · jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu produkce, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že požadovaný produkt (například panthoát a/nebo panthotenát) je produkován v koncentraci vyšší než 20 g/1. V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu produkce, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že požadovaný produkt (například panthoát a/nebo panthotenát) je produkován v koncentraci vyšší než 30 g/1. V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu produkce, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že požadovaný produkt (například panthoát,a/nebo panthotenát) je produkován v koncentraci vyšší než 40 g/1. V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu produkce, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že požadovaný produkt (například panthoát a/nebo panthotenát) je produkován v koncentraci vyšší než 50 g/1. V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká způsobu produkce, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že požadovaný produkt (například panthoát a/nebo panthotenát) je produkován v koncentraci vyšší než 60 g/1. Vynález se dále týká způsobu produkce požadované sloučeniny, který zahrnuje kultivování rekombinantního mikroorganismu za takových podmínek, že jsou dostatečně vysoké koncentrace sloučeniny produkovány za komerčně vhodnou dobu.

Podle typu upraveného biosyntetického enzymu nebo kombinace biosyntetických enzymů může být žádoucí nebo nutné dodávat (například doplňovat) mikroorganismu podle předkládaného vynálezu alespoň jeden biosyntetický prekurzor, aby mohla být produkována požadovaná sloučenina • · · · · · ·*·· • · * * · · · ·· « · · · · • * · · · · ··· ·· ···· ·· ···· ·· · nebo sloučeniny. Termín biosyntetický prekurzor nebo prekurzor označuje činidlo nebo sloučeninu, která po vnesení do kultivačního media mikroorganismu zvyšuje nebo zesiluje biosyntézu požadovaného produktu. V jednom provedení je biosyntetickým prekurzorem nebo prekurzorem aspartát. V jiném provedení je biosyntetickým prekurzorem nebo prekurzorem β-alanin. Množství přidaného aspartátu nebo β-alaninu je výhodně takové množství, které vede k dosažení koncentrace v kultivačním mediu, která zvyšuje produktivitu mikroorganismu (například koncentrace dostatečné pro zvýšení produkce panthoátu a/nebo panthotenátu). Biosyntetické prekurzory podle předkládaného vynálezu mohou být přidány ve formě koncentrovaného roztoku nebo suspenze (například ve vhodném rozpouštědle nebo pufru) nebo ve formě pevné látky (například ve formě prášku). Dále, biosyntetické prekurzory podle předkládaného vynálezu mohou být přidávány jako podíly, kontinuálně nebo intermitentně, během dané doby.

Termín „nadbytek β-alaninu označuje koncentrace β-alaninu vyšší než koncentrace běžně používané pro kultivování daného mikroorganismu. Například kultivování mikroorganismu Bacillus popsané v příkladech provedení vynálezu se běžně provádí za přítomnosti přibližně 0-0,01 g/1 β-alaninu. Proto je nadbytkem β-alaninu koncentrace přibližně 0,01-1, výhodně přibližně 1-20 g/1.

V ještě jiném provedení je biosyntetickým prekurzorem valin. V ještě jiném provedení je biosyntetickým prekurzorem α-ketoisovalerát. Výhodně je valin nebo a-ketoisovalerát přidán v množství, které vede ke koncentraci v mediu, která je dostatečná pro produkci požadovaného produktu (například panthoátu a/nebo panthotenátu). Termín nadbytek a-KIV označuje koncentrace -KIV vyšší než koncentrace běžně • · používané pro kultivování daného mikroorganismu. Například kultivování mikroorganismu Bacillus popsané v příkladech provedení vynálezu se běžně provádí za přítomnosti přibližně 0-0,01 g/1 -KIV. Proto jsou nadměrné koncentrace -KIV koncentrace přibližně 0,01-1, výhodně přibližně 1-20 g/1 -KIV. Termín nadbytek valinu označuje koncentrace valinu vyšší než koncentrace běžně používané pro kultivování daného mikroorganismu. Například kultivování mikroorganismu Bacillus popsané v příkladech provedení vynálezu se běžně provádí za přítomnosti přibližně 0-0,5 g/1 valinu. Proto jsou nadměrné koncentrace valinu přibližně 0,5-5 g/1, výhodně přibližně 5-20 g/1 valinu. Biosyntetické prekurzory jsou zde také označovány jako doplňkové biosyntetické substráty.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká biotransformačních procesů, které se týkají rekombinantních mikroorganismů podle předkládaného vynálezu. Termín biotransformační procesy, též zde označované jako biokonversní procesy, jsou biologické procesy, které vedou k produkci (například transformaci nebo konversi) vhodných substrátů a/nebo meziproduktů na požadovaný produkt (například panthoát a/nebo panthotenát).

Mikroorganismy a/nebo enzymy použité v biotransformačních reakcích jsou v takové formě, která umožňuje jejich zamýšlenou funkci (například produkci požadované sloučeniny). Mikroorganismus může být ve formě celých buněk nebo může být ve formě pouze částí buněk nutných pro dosažení požadovaného výsledku. Mikroorganismy mohou být suspendované (například ve vhodném roztoku, jako jsou pufrované roztoky a media), mohou být vypláchnuté (například propláchnuté od kultivačního media mikroorganismu), sušené • φ φ · φ

acetonem, imobilizované (například za použití polyakrylamidového gelu nebo k-karagénu nebo na syntetickém nosiči, například korálkách, matricích a podobně), fixované, zesítěné nebo permeabilizované (například mohou mít permeabilizované membrány a/nebo stěny tak, že sloučeniny, například substráty, meziprodukty nebo produkty, mohou snadněji procházet skrz uvedené membrány nebo stěny).

VI. Způsoby pro přípravu selektivně smíšených prostředků obsahujících panthotenát a HMBPA

Předkládaný vynález se dále týká způsobů pro upravení mikroorganismů pro produkci selektivně smíšených prostředků obsahujících panthotenát a HMBPA. Termín „selektivně smíšený prostředek označuje prostředek produkovaný takovým způsobem, že je kontrolován poměr panthotenátu k HMBPA, t.j. je vybrán poměr panthotenátu k HMBPA. Výběr poměru může být proveden upravením mikroorganismu produkujícího prostředek (t.j. produkční kmen) tak, že jedna jeho složka je upřednostněna před druhou.

V jednom aspektu se vynález týká způsobu pro produkci selektivně smíšeného prostředku obsahujícího panthotenát:HMBPA, který zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu za takových podmínek, že je produkován selektivně smíšený prostředek obsahující panthotenát:HMBPA.

V jednom provedení je mikroorganismus kultivován za podmínek upřednostňujících produkci panthotenátu. V jiném provedení je mikroorganismus kultivován za podmínek upřednostňujících produkci HMBPA. V jiném provedení je mikroorganismus kultivován za řízené stabilní koncentrace glukosy, která upřednostňuje produkci panthotenátu. V jiném provedení je • · ·· ·· ·· · • · · * · · · • · · · · · · • · · ·· · ··· • · · · · · «····· ·« · • · • · • · ·· ·· mikroorganismus kultivován za řízené stabilní koncentrace glukosy, která upřednostňuje produkci HMBPA. V ještě jiném provedení je mikroorganismu kultivován za řízené stabilní koncentrace rozpuštěného kyslíku, která upřednostňuje produkci panthotenátu. V ještě jiném provedení je mikroorganismu kultivován za řízené stabilní koncentrace rozpuštěného kyslíku, která upřednostňuje produkci HMBPA. V ještě jiném provedení je mikroorganismu kultivován za řízené stabilní koncentrace šeřinu, která upřednostňuje produkci panthotenátu. V jednom provedení prostředek obsahuje panthotenát a HMBPA v poměru 75 mol panthotenátu ku 25 mol HMBPA nebo vyšším. V jednom provedení prostředek obsahuje panthotenát a HMBPA v poměru 90 mol panthotenátu ku 10 mol HMBPA nebo vyšším. V jednom provedení prostředek obsahuje panthotenát a HMBPA v poměru 75 mol HMBPA ku 25 mol panthotenátu nebo vyšším. V ještě jiném provedení prostředek obsahuje panthotenát a HMBPA v poměru 90 mol HMBPA ku 10 mol panthotenátu nebo vyšším. Hodnoty a rozsahy mezi uvedenými hodnotami také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Vynález bude dále ilustrován na následujících příkladech, které nikterak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Obsahy všech odkazů, patentů a publikovaných patentových přihlášek citovaných v předkládaném vynálezu jsou zde uvedeny jako odkazy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Objevení a charakterizace biosyntetické dráhy kyseliny R-3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)propionové (HMBPA)

Při vývoji kmenů Bacillus pro produkci panthotenátu se φφ φφ ·· φ • φφ φ φ φφ φ φ φ · • φ φ φφ φ φφφφ φ φ φ φφ φ · φφ φφφφ φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφφφ φφ φ provádějí různé genetické manipulace na genech a enzymech podílejících se na biosyntetické dráze panthotenátu isoleucinu-valinu (ilv) (Obr. 1), jak je popsáno v U.S. patentové přihlášce pořadové č. 09/400,494 a U.S. patentové přihlášce pořadové č. 09/667,569. Například, kmeny mající deregulovaný panBCD operon a/nebo mající deregulovanou panEl vykazují zvýšenou produkci panthotenátu (při kultivaci za přítomnosti β-alaninu a a-ketoisovalerátu (α-KIV)). Kmeny mající dále deregulovaný ilvBNC a ilvD vykazující zvýšenou produkci panthotenátu za přítomnosti pouze β-alaninu. Dále, je možné dosáhnout nezávislosti na β-alaninu tím, že se dále dereguluje panD.

Příkladem kmenu je PA824, tryptofanový prototrofní organismus, Spec a Tet resistentní, deregulovaný na panBCD v panBCD lokusu, deregulovaný na panEl v panEl lokusu (dva geny v genomu B. subtilís jsou homologní s E. coli panE, panEl a panE2, kde první kóduje hlavní ketopanthoátreduktasu podílející se na produkci panthotenátu, zatímco panE2 nepřispívá k syntéze panthotenátu (U.S. patentová přihláška pořadové č. 09/400,494), deregulovaný na ilvD v ilvD lokusu, nadměrně exprimující ilvBNC kazetu v amyE lokusu a nadměrně exprimující panD v hpr lokusu.

Za následujících fermentačních podmínek vede PA824 běžně k zisku přibližně 20-30 g/1 panthotenátu. Produkce panthotenátu kmenem PA824 v tomto příkladu je provedena v 14 litrovém fermentačním tanku. Složení vsádkového a doplňovaného media je následující.

Vsádka

	MATERIÁL	g/L (finální)
1	kvasinkový extrakt	10
7	Na Glutamáte	5
J	(NH4)2SO4	8
4	KiLPO,	A
5	Κ,ΗΡΟ,	7.6

• ·

Přidávání posterilizaci a ochlazení

1	Glukosa	2.5
2	CaCl,	0.1
n	MgCl,	1
4	Natrium-citrát	1
5	FeSO.,-7 H,0	0.01
5	SM-1000X	1 ml

Konečný objem vsádkového media je 6 1. Roztok stopových prvků SM-1000X má následující, složení: 0,15 g Na^oO^ H₂O, 2,5 g H3BO3, 0, 7 g CoC1₂6 H₂0, 0,25 g CuSO₄5 H₂O, 1, 6 g MnCl₂4 H₂O, 0,3 g ZnSO₄7 H₂O se rozpustí ve vodě (konečný objem je 1 1) ·

Vsádkové medium se naočkuje 60 ml kultury PA824 (OD=10 v SVY mediu: Difco Veal Infusion medium 25 g, Difco Yeast extract 5 g, natrium-glutamát 5 g, (NH₄) ₂SO₄ 2, 7 g v 740 ml H₂0, autoklávované; přidá se 200 ml sterilního 1M K₂HPO₄ (pH 7) a 60 ml sterilního 50% roztoku glukosy (konečný objem 1 1)). Fermentace probíhá při 43 °C a při průtoku vzduchu 12 1/min, protože glukosa limituje přísun živin. Počáteční množství glukosy v mediu (2,5 g/1) se spotřebuje během fáze exponenciálního růstu. Potom se koncentrace glukosy se udržují na hodnotách 0,2-1 g/1 pomocí kontinuálního dodávání FEED roztoku následujícího složení.

Doplňované medium

	MATERIÁL	g/I (finální)
1	Glukosa	550
2	CaCl,	0.1
	SM-I000X	3 ml

Pumpa s variabilní rychlostí přívodu živin se řídila počítačem podle koncentrace glukosy v tanku. V tomto příkladu byl celkový přívod živin 6 1.

Během fermentace bylo pH udržována na hodnotě 7,2. pH se udržovalo přidáváním 25% roztoku NH₃ nebo 20% roztoku H₃P0₄. NH₃působí simultánně jako zdroj dusíku pro fermentaci. Koncentrace rozpuštěného kyslíku [p0₂] byla nastavena na 30% pomocí regulování míšení a úrovně dodávání vzduchu. Tvorba pěny byla kontrolována přidáním silikonového oleje. Po ukončení přidávání živného roztoku, v tomto příkladu po 48 hodinách, fermentace pokračovala do té doby, než hodnota p0₂ dosáhla 95%. Potom se fermentace ukončila usmrcením mikroorganismů sterilizací trvající 30 minut. Úspěšnost sterilizace se ověřila umístěním vzorku fermentačního media na agárové plotny. Titr panthotenátu ve fermentačním mediu byl 21,7 g/1 po sterilizaci a odstranění buněk odstředěním (jak bylo určeno HPLC analýzou).

Pro HPLC analýzu vzorku fermentačního media se vzorek naředil sterilní vodou (1:40). 5 1 tohoto ředění se injikovalo do HPLC kolony (Aqua C18, 5 m, 150x2,0 mm, Phenomenex™). Teplota kolony se udržovala na 40°C. Mobilní fáze A byla 14,8 mM H₃PO₃, mobilní fáze B 100% acetonitril. Průtok byl konstantní 0,5 ml/min. Byl použit gradient start: 2% mobilní fáze B

0-3 min lineární zvýšení na 3% mobilní fáze B

3-3,5 min lineární zvýšení na 20% mobilní fáze B

Detekce byla provedena UV-detektorem (210 nm). Doba ·· · detekce byla 7 minut s další 3 min následující doby.

Retenční čas pro kyselinu panthotenovou byl 3,9 minut. HPLC chromatogram pro výše uvedený vzorek je uveden na Obr. 4.

Identifikace sloučeniny související s pikem s retenčním časem 4,7 minut

Kromě produkce významných množství panthotenátu byla objevena druhá sloučenina eluovaná s přibližnou retenční dobou v tomto systému 4,7 minut. Druhým hlavním produktem fermentace byla kyselina

3-(2-hydroxy-3-methyl-butyrylamino)- propionová (HMBPA) (též zde označovaná jako p-alanin-2-(R)-hydroxyisolvalerát,

P~alanin-2-hydroxyisolvalerát, β-alanyl-hydroxyisovalarát a/nebo panthotenát). Byla identifikována podle svého hmotnostního spektra (Obr. 5; relativní monoizotopová hmotnost 189) a podle ²H- a “C-NMR po chromátografickém přečištění rychlou chromatografií s reverzní fází (mobilní fáze 10 mM KH₂P0₄, se stoupajícím obsahem acetonitrilu (1-50%)) (data nejsou uvedena). Sloučenina se předpokládala za sloučeninu s R konfigurací na asymetrickém uhlíku podle analogie s [R]-panthotenátem.

Pro ověření identity sloučeniny se následujícím způsobem provedla záměrná syntéza racemického p-alanin-2hydroxyisolvalerátu, následujícím způsobem, β-alanin (2,73 g, 30 mmol) a methoxid sodný (5,67 g 30% roztoku methanolu/ 31,5 mmol) se rozpustily v methanolu (40 ml). Přidal se methyl-2-hydroxyisovalerát (methylester kyseliny

2-hydroxy-3-methylmáselné) (3,96 g/30 mmol) a provedlo se zahřívání při teplotě zpětného toku po dobu 18 hodin.

Methanol se potom odstranil na rotační odparce a nahradil se terč.butanolem (50 ml). Přidal se terč.butoxid draselný (50 • 0

0 • · • · 0 • 00 • 00 ·· • ·

0« 0000

0 0 0 • · 0 • *0 0000

mg) a provedlo se zahřívání při teplotě zpětného toku po dobu 26 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu, zbytek se rozpustil ve vodě (50 ml) a nechal se projít přes silně .. acidickou iontoměničovou pryskyřici (H+-form Lewatite™ S 100 Gl; 100 ml). Další voda se použila pro vypláchnutí iontoměničové pryskyřice. Vodné eluáty se smísily a voda se odstranila ve vakuu. Zbytek se zpracoval rychlou chromatografií (silikagel; 2% kyselina octová v ethylacetátu jako eluens) a frakce produktu se odpařily za zisku pevného zbytku. Zbytek se rekrystalizoval. z ethylacetátu/toluenu (10 ml/20 ml, v příslušném pořadí) a získal se analyticky čistý

HMBPA (P-alanin-2-hydroxyisolvalerát), který vykazoval relativní monoizotopickou hmotnost 190 (189 + H⁺) ve hmotnostním spektrometru a stejné ^-NMR rezonance jako produkt získaný fermentací.

Biosyntetická dráha vedoucí k produkci HMBPA je uvedena na obr. 2. Chemická struktura kyseliny R]-3-(2-hydroxy-3methyl-butyrylamino)-propionové (HMBPA) je uvedena na obr.

3. Jak je uvedeno na obr. 2, je HMBPA kondenzačním produktem kyseliny [R]-a-hydroxyisovalerové (α-HIV) a β-alaninu,' kde tato reakce je katalyzovaná PanC enzymem. α-HIV je generována redukcí α-HIV, kde tato reakce je katalyzovaná ketoreduktasami PanE (například PanEl a/nebo PanE2) a/nebo ilvC.

Na základě chemické struktury a biosyntetické dráhy vedoucí k produkci HMBPA předkladatelé vynálezu navrhují následující model pro popsání interakcí mezi známými dráhami panthotenátu a isoleucin/valinu (ilv) a nově charakterizovanou HMBPA biosyntetickou dráhou. V alespoň jednom aspektu model uvádí, že existují alespoň dvě dráhy v mikroorganismu, které kompetují o -KIV, substrát pro

0 ·

0 • » • 0 0 0 · · · · 0 · * • · 0 0 · · 0 0 0 0

0 0 00 0 0 00 0000

000 000 >00

0000 00 0000 00 0 biosyntetický enzym PanB, konkrétně panthotenátová biosyntetická dráha a HMBPA biosyntetická dráha (třetí a čtvrtá dráha kompetující o -KIV jsou dráhy vedoucí k produkci valinu nebo leucinu z -KIV, viz obr. 1). Alespoň panthotenátová biosyntetická dráha a HMBPA biosyntetická dráha dále produkují kompetitivní substráty pro enzym PanC, konkrétně α-HIV a panthoát. Produkce HMBPA má významný vliv na produkci panthotenátu. Důležité je to, že HMBPA dráha kompetuje s panthotenátovou dráhou o prekurzory (α-KIV a β-alanin) a o stejné enzymy (PanC, PanD, PanEl a/nebo ilvC). Dále, protože je struktura HMBPA podobná struktuře panthotenátu, může být jejím nežádoucím účinkem negativní regulování jednoho nebo více stupňů v dráze panthotenátu.

Model předpokládá, že produkce panthotenátu může bbýt zlepšena nebo optimalizována pomocí jakýchkoliv prostředků, které upřednostňují použití substrátů (α-KIV a β-alaninu) a/nebo enzymů (PanC, PanD, PanEl a/nebo ilvC) v panthotenátových biosyntetických procesech místov biosyntetických procesech vedoucích k produkci HMBPA.

Výhodným postupem pro maximalizaci produkce panthoátu a/nebo produkce panthotenátu za minimalizace produkce HMBPA je zvýšení aktivity PanB v buňkách, protože toto sníží dostupnost -KIV pro syntézu α-HIV za navození syntézy ketopanthoátu a panthoátu. Způsoby pro zvýšení aktivity zahrnují nadměrnou expresi panB genu, zvýšení počtu kopií genu, zvýšení specifické aktivity enzymu a/nebo zmírnění inhibice enzymu mutováním nebo snížením koncentrace koenzymu A. Vyšší koncentrace panthoátu nakonec zvyšují syntézu panthotenátu a snižují syntézu HMBPA pomocí kompetice a-HIV o PanC.

9 ·

8 9 9 9 9 9 9 9 9 8 |· · · * · « · · · • · · · · 9 9 98 8888

9 8 8 8 8 8 9 8

9898 99 8888 99 9

Jiným postupem pro maximalizaci syntézy panthotenátu je optimalizace úrovně exprese panEl. Bylo dokázáno, že zvýšení produkce PanEl zvyšuje syntézu HMBPA na úkor panthotenátu. Proto provedení mírného snížení úrovně exprese panEl v PA824 nebo PA668 (t.j. přesné regulování exprese panEl) vede ke snížení syntézy HMBPA a zvýšení syntézy panthotenátu. Dále, jak je uvedeno v příkladu 2, delece panE2 významně snižuje syntézu HMBPA.

Dalším způsobem pro zvýšení syntézy panthoátu a/nebo syntézy panthotenátu na úkor syntézy HMBPA je optimalizace produkce -KIV v buňkách a/nebo izolování modifikovaného PanC proteinu se zvýšenou preferencí pro panthoát jako substrát.

Následující příklady poskytují experimentální důkazy pro popsaný model a dále dokreslují způsoby pro zvýšení produkce panthoátu a/nebo panthotenátu (ve srovnání s HMBPA) založené na tomto modelu.

Příklady 2-8:

V příkladech 2-6 se kvantifikace panthotenátu a/nebo HMBPA provedla následujícím způsobem. Podíly fermentačního media se naředili 1:100 a podíly kultur se naředily 1:10 ve vodě nebo 5% acetonitrilu před tím, než se injikovaly do Phenomenex Aqua^M 5 C18 HPLC kolony (250 x 4, 60 mm, 125A) . Mobilní fáze byly A = 5% acetonitril, 50 mM natrium-fosfátový pufr s pH upraveným na pH 2,5 kyselinou fosforečnou; a B = 95% acetonitril, 5% H₂0.

Lineární gradienty byly následující:

Φ Φ ·· ·> φ · φ · φ • · · · · φφ φ φ φφ φφ φ φφ φ φφφφ φ φ φ φφ φ φ φφ φφφφφ φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφφφ φφ φ

Minuty	Rozpouštědlo A Rozpouštědlo B .
0	100%	0%
16	100%	0%
17	0%	100%
20	0%	100%
21	100%	0%

Další parametry přístroje byly následující: Průtok = 1,0 ml/min; Injekční objem = 20 i; Detektor = Hewlett Packard 1090 série DAD UV detektor-3014, Signál A = 197 nm, ref. = 450 nm, Firmware revise E: zahřívání kolony = teplota pícky 40°C; Hardware = Hewlett Packard Kayak™ XA; a Software = Hewlett Packard Chemstation Plus™ family revision A.06.03 [509].

HMBPA eluoval v tomto systému přibližně ve 13 minutách.

Příklad 2: Snížení syntézy HMBPA delecí PanE2 z pantothenátového produkčního kmenu

Jak je popsáno v příkladu 1, byla produkce HMBPA nejprve pozorována v mikroorganismech nadměrně exprimujících panEl, což naznačuje, že ketopanthoát-reduktasa je schopná katalyzovat nejen redukci ketopanthoátu na panthoát, ale též redukci α-ketoisovalerátu na 2-hydroxyisovalerát. Jak bylo uvedeno výše, dva geny v genomu B. subtilis jsou homologní k E. coli panE genu kódujícím ketopanthoátreduktasu a tyto jsou označeny jako panEl a panE2.

V Bacillus bylo prokázáno, že panEl gen kóduje hlavní ketopanthoát-reduktasu podílející se na produkci panthotenátu, zatímco panE2 nepřispívá k syntéze ♦ · φ • · · · · · · · · · · • · * φφ φ φ · φ φ • · · φ « · φ φφ φ · φ φ φ φφφ · φ φ φ · φ φφ φφφφ φφ φφφφ φφ φ panthotenátu. Dále, nadměrná exprese panE2 u P₂₆panE2 kazety v pAN238 (SEQ ID NO:25) vede ke snížení titru panthotenátu (viz například. U.S. patentová přihláška pořadové č. 09/400,494). Vzhledem k homologii mezi panE2 a panEl genovými produkty a skutečnosti, že nadměrná exprese panE2 posouvá produkci od panthoátu/panthotenátu bylo testováno, zda panE2 přispívá jakýmkoliv významným způsobem k produkci HMBPA. Předpokládalo se, že panE2 genový produkt je enzym schopný redukovat α-KIV na α-HIV, ale neschopný významně redukovat ketopanthoát na panthoát.

Pro testování této hypotézy se panE2 deletoval z produkčního panthotenátového kmene PA824 (popsaného v příkladu 1) transformováním s panE2::cat kazetou u chromosomální DNA kmene PA248 (panE2::cat) (víz SEQ ID NO:24, pro konstrukci viz například U.S. patentová přihláška pořadové č. 09/400,494) za zisku kmene PA919. Tři izoláty PA919 se srovnávaly s PA824 na produkci panthotenátu a HMBPA v testovacích zkumavkách kultivovaných v SVY plus -alanin.

· · • ·· · · ·· · · · · β · · · · · · · · • · · · · » · ·» · · · • · · · · · ·« •« · · · » · · ···· «·

Tabulka 1: Produkce panthotenátu a HMBPA deriváty PA824 a ΡA880 kultivovanými při 43 °C po dobu 48 hodin v testovacích zkumavkách s SVY glukosou + β-alaninem⁵

Kmen	Nový rys Původní kmen	ODóoii	[pan] g/í	[HM
PA824	-		13.9	4.3	0.64
PA880	AcoaX	PA824	16.4	5-1	0.48
PA894	ÁcoaX, m?A(Sl 51L), cat	PA880	14.9	4.9	0.47
PA911-5	PstpanB @ vpr, AcoaX	PA880	13.4	5.3	0.40
PA911-8	PnpanB® panB, AeoaX	ii	13.8	6.1	0.45
ΡΑ919-Ί	ApanE2::cat	PA824	13.2	4.2	0.1.5
PA919-2	n	ii	14.8	3.8	0.13
PA919-3	u	ii	18.0	5.5	0.14

Jak ukazují data v tabulce 1, produkovaly všechny tři izoláty PA919 přibližně 4-krát méně HMBPA než PA824, což dokazuje, že panE2 genový produkt přispívá k produkci HMBPA a dokazuje to, že produkci HMBPA může být alespoň částečně eliminována pouze delecí panEl bez toho, že by byla narušena produkce panthotenátu.

Příklad 3: Produkce HMBPA a panthotenátu jsou nepřímo úměrné

4 «4 • 4

4 4 4 ,· ί • 4 · ·

4 ·

4 4 • 4 4 • 4 4 4 4 4 >444

Kmeny získané z PA365. (RL-1 linie ekvivalentní PA377, popsaná v US patentové přihlášce pořadově č. 09/667,569), které mají deletovanou P_2ÉpanBCD kazetu a které obsahují P_2S panC*D kazetu amplifikovanou ve vpr lokusu a buď přirozenou P₂₆panB kazetu (PA666) nebo P₂₆panB kazetu (PA664) amplif ikovanou v bpr lokusu, se připravily následujícím, způsobem. Pořadí C-terminálních aminokyselin známých nebo předpokládaných PanB proteinů je uvedeno na Obr. 6. Tři regiony označené jako 1, 2 a 3, se identifikovali jako regiony obsahující konzervované nebo semíkonzervované aminokyselinové zbytky, které jsou označeny šipkami na horní straně obrázku. B.subtilis PanB protein (RBS02239) je podtržený. Dva PanB proteiny (RCY14036 a CAB56202.1) jsou chybějící region 3, zatímco poslední PanB protein také chybí v regionu 2 a má nekonzervované aminokyselinové zbytky v regionu 1.

B. subtilis PanB varianty se vytvořily tak, že neobsahovaly regiony 1, 2 a 3. Požadované varianty byly připraveny navržením 3 PCR primerů pro amplifikaci B. subtilis pan B genu tak, že v konečném produktu chybí region 3, regiony 2 a 3 nebo všechny tři regiony. Generovaly se PCR produkty a klonovaly se do E. coli expresního vektoru pASK-1 BA3, za zisku plasmidů pAN446, pAN447 a pAN448, v příslušném pořadí. Plasmidy se potom transformovaly do E. coli kmene SJ2, který obsahuje panB6 mutaci, pro test na komplementaci. Pouze pAN446, ve kterém chybí region 3, byl schopen komplementace. Toto ukazuje, že region 3 není esenciální pro PanB aktivitu B. subtilis, ale že region 2 je nutný pro aktivitu nebo stabilitu.

Dalším krokem v této analýze byl přenos panB genu z « · • ·

It · · «« * ···« • 9 · · * · · 4« · · · ·

V · · · · «4«

9 99 9 9 99 99 9 9 9 9 » pAN446 do B. subtilis expresního vektoru a potom jeho vložení do kmenu vhodného pro testování aktivity kódovaného PanB proteinu v B. subtilis. Pro provedení tohoto cíle se nejprve vytvoří kmen, který je deletován na P₂₆panBCD operon. Toto se provede insercí cat genu mezi BseRI místo umístěné před panB RBS a Bg/II místo umístěné v panD, za zisku plasmidu pAN624, SEQ ID NO:20 (Obr. 7). Získaná deleční/substituční mutace (panBCD::cat624), která odstraňuje celé panB a panC, se překříží do PA354 pomocí transformace, se selekcí na resistenci na chloramfenikol na plotnách doplněných 1 mM panthotenátu. Jeden z těchto transformantů se uloží a označi se jako PA644. Chromosomální DNA izolovaná z PA644 se analyzovala PCR a zjistilo se, že obsahuje deleční-substituční mutaci. Jak se předpokládalo, vyžaduje PA644 pro růst panthotenát, ale zachovává si ilv geny (P₂₆ilvBNC P₂₆ilvD), stejně jako P₂₆panEl gen původně přítomný v PA354. Tak jsou nadměrně produkovány všechny enzymy podílející se na syntéze panthoátu, kromě PanB. Gen obshaující nej kratší panB deleci se insertoval do B. subtilis expresního vektoru pOTP61 (popsaného v US patentové přihlášce pořadové č. 09/667,569), za zisku plasmidu pAN627. Ve stejnou dobu se přirozený panB kontrolní gen insertoval do pOTP61, za zisku plasmidu pAN630. Notl fragmenty každého plasmidu, bez E. coli vektorových sekvencí, se ligovaly a transformovaly do PA644, se selekcí na resistenci na tetracyklin.

Jeden transformant z každé transformace se uložil a dále se transformoval chromosomální DNA z PA628 se selekcí na Pan. PA628 obsahoval více kopií P_2SpanC*D expresního plasmidu (pAN620) integrovaných do vpr lokusu. Pro určení efektů mutace panB genu přímo na produkci panthotenátu, se plasmid pAN620, SEQ ID N0:21, který je zobrazen na Obr. 8, použil «· · · · · 9 · ···

0 0 » 0 » · * · · · » 9 · « · · · · 9 · • 0 9 9 9 9 9 · · · · · · ·

9 9 » 9 9 9 9 » »9 ···· ·· ···· ·* · pro dodáni zbývajících dvou enzymů pro syntézu panthotenátu (PanC a PanD). Čtyři transformanty z každé transformace se izolovaly, kultivovaly se ve SVY mediu obsahujícím 10 g/1 aspartátu po dobu 48 hodin a potom se testovaly na produkci panthotenátu. Transformanty s 3 deletovaným panB genem se označily jako PA664 a ty, které obsahovaly přirozený gen, se označily PA666. Data ukazují, že 3' deletovaný panB gen v PA664 kóduje PanB protein se značně redukovanou aktivitou. Pro testování na produkci HMBPA se kultury PAS65, PA666 a PA664 kultivovaly v SVY + aspartát mediu s nebo bez přidání -KIV nebo panthoátu po dobu 48 hodin a potom se testovaly na HMBPA a panthotenát, jak bylo popsáno výše.

» 9 9999 » * 9

9 9

Tabulka 2: Efekt aktivity PanB a adice prekursoru na produkci HMBPA a panthotenátu, data

Data uvedená v tabulce 2 ukazují, že za nepřítomnosti doplňků produkuje PA666 nejméně HBMPA, zatímco PA664 nejvíce, což ukazuje na nepřímou úměru mezi aktivitou PanB a

4 4 · 4 4 ·* .444 • 4 4 4 · 4 · 4 4 «4 • 4 · 44 · 444«

4 4 4« 4 4 44 44444

444 444 444

4444 4 · 4444 .· 4 · produkcí ΗΒΜΡΆ. Toto je v souladu s modelem, který předpokládá, že dvě dráhy kompetují o -KIV, substrát pro PanB, a produkují kompetitivní substráty pro PanC; předpokládá se, že snížení aktivity PanB bude zvyšovat dostupnost α-KIV pro syntézu a-HIV a odpovídajícím způsobem sníží produkci panthoátu. Když se α-KIV přidá do media, tak všechny tři kmeny produkují významně více HMBPA. Tyto výsledky naznačují, že α-KIV je prekurzorem pro HMBPA, jak je uvedeno na obr. 2, a že nadbytek α-KIV upřednostňuje produkci HMBPA. Tyto výsledky také naznačují, že syntéza HMBPA je alespoň částečně způsobena nadměrnou produkcí α-KIV. Když se do media přidá panthoát, tak se HMBPA sníží přibližně o 50% ve všech třech kmenech. Naopak, každý kmen potom produkuje významně více panthotenátu. Tento výsledek je také v souladu s modelem, který předpovídá, že dvě dráhy produkují kompetující substráty pro PanC (α-HIV a pantoát) . Dohromady výše uvedené výsledky dále naznačují, že zvýšená syntéza panthoátu je výhodná v tom, že podporuje syntézu panthotenátu a redukuje syntézu HMBPA. Dále, faktory, které snižují syntézu panthoátu, negativně ovlivňují syntézu panthotenátu.

Příklad 4: Efekt zvýšení PanB a/nebo regulování PanEI na produkci pantothenátu

PA668 je derivátem PA824, který obsahuje další kopie P_2apanB amplifikované ve vpr nebo panB lokusu. ΡΆ668 byl konstruován za použití panB expresního vektoru (pAN636, SEQ ID NO:22), který umožňuje selekci více kopií za použití chloramfenikolu (Obr. 9}. pAN636 Notl restrikční fragment, bez E. coli vektorových sekvencí, se ligoval a potom se použil pro transformaci PA824 se selekcí na plotnách • Φ β · 9 9 Φ · * · 9

9 9 · · · * * · · 9

9 · ·· « · Φ 9 φ • · Φ · · * * ♦ · » ·· ·

Φ · Φ ΦΦΦ Φ»φ φφ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ Φ obsahujících 5 g/ml chloramfenikolu. Transformanty resistentní na 30 g/ml chloramfenikolu se izolovaly a testovaly se na produkci panthotenátu ve 48 hodinových zkumavkových kulturách. Izoláty vykazovaly produkci menšího množství HMBPA než PA824 (produkovaly o přibližně 10% více panthotenátu než PA824). Připravil se druhý kmen, označený jako PA669, ve kterém byl PA824 s extra kopiemi P_2epanEl amplifikován ve vpr nebo panEl lokusu. Kmen PA669 se konstruoval transformováním PA824 se samo-ligováným Notl fragmentem plasmidu pAN637, SEQ ID NO:23 (Obr. 10), se selekcí na resistenci na chloramfenikol. Dva izoláty PA669 se vybraly pro další pokusy; ΡΆ669-5 produkoval méně PanEl než PA669-7, jak bylo potvrzeno SDS-PAGE analýzou extraktů z celých buněk získaných z těchto dvou kmenů.

Zkumavky obsahující kultury kmenů PA824, PA668-2, PA668-24, a dvou izolátů PA669 (PA669-5 a PA669-7), se kultivovaly ve třech různých mediích (SVY, SVY + aspartát a SVY + aspartát + panthoát) po dobu 48 hodin a potom se testovaly na panthotenát, HMBPA, a β-alanin (Tabulka 3).

*

OQ

Žádný z kmenů neprodukoval detekovatelná množství HMBPA • · · · · * ·· ♦ · * * ·· · ♦ 9 9 · ♦ * · • « 9 9 9 9 9 9 9

9 · · ♦ ♦ 9 99 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99·· 99 9999 ·· 9 ve SVY mediu. Všechny kmeny produkovaly zhruba stejná množství panthotenát a nízká množství β-alaninu, což ukazuje, že β-alanin je limitující pro syntézu panthotenátu i HMBPA v těchto kulturách a že β-alanin je prekurzor pro obě sloučeniny. Při kultivaci v SVY + aspartátovém mediu produkovaly PA669 izoláty více HMBPA než PA824, zatímco oba PA668 izoláty produkovaly méně HBMPA než PA824. Je zajímavé, že kmen, který produkuje nejvíce PanEl (PA669-7), produkuje nejvíce HMBPA (a nejméně panthotenátu). Toto naznačuje, že vysoké hladiny PanEl upřednostňují produkci HMBPA na úkor syntézy panthotenátu. Je také zajímavé, že PA668-24 produkuje více HMBPA než PA668-2, i když SDS-PAGE analýza extraktů z obou kmenů ukázala, že produkují přibližně stejné hladiny PanB. SDS-PAGE analýza také ukázala, že PA668-24 vytváří mnohem více IlvC než PA668-2. Podle těchto dat se usuzuje, že IlvC ovlivňuje syntézu HMBPA zvýšením rovnovážných koncentrací -KIV a/nebo katalyzování tvorby α-HIV z a-KIV, což je příčinou pozorovaného posunu produkce směrem k HMBPA.

Poslední sada dat v tabulce 3 ukazuje, že přidání panthoátu ke kultivačnímu mediu snižuje produkci HMBPA ve všech kmenech, které předtím produkovaly detekovatelné koncentrace, například posunem syntézy směrem k panthotenátu. Tato skutečnost dále podporuje model, že a-HIV a panthoát jsou kompetitivní substráty pro PanC.

Příklad 5: Zvýšení syntézy panthotenátu snížením pantothenát kinasy v produkčních kmenech

Jednou strategií pro zvýšení produkce panthotenátu je snížení aktivity panthotenát-kinasy v produkčních kmenech.

Panthotenát-kinasa je prvním enzymem v dráze od panthotenátu • · «

9 9

9999

9 9 9 9 9 · ·· 9 · 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99 99 9 ke. koenzymu A. Předpokládá se, že aktivita panthotenátkinasy vede k nižším rovnovážným koncentracím koenzymu A, což nakonec vede k vyšší aktivitě PanB enzymu a vyšším titrům panthotenátu. Jak je popsáno v US patentové přihlášce 09/667,569, byly v B.subtilis identifikovány dva enzymy, které oba kódují panthotenát-kinasu: 1) coaA, který je homologní k esenciálnímu genu E. coli pro panthotenátkinasu, a 2) coaX, který reprezentuje novou třídu bakteriálních genů pro panthotenát-kinasu.

CoaA i coaX mohou být deletovány z normálního kmenu B. subtilis bez jakéhokoliv zjevného vlivu na růst v minimálním nebo obohaceném mediu. Nicméně, není možné generovat kmeny s delecí obou genů, což naznačuje, že jeden nebo druhý gen je nutný pro životaschopnost. Proto byl konstruován kmen mající deletovaný coaX a potom byl coaA mutován tak, aby byla redukována specifická aktivita CoaA enzymu. Ačkoliv jsou fenotypy coaX, mutovaný coaA kmenů slabé, jsou data v souladu s hypotézou, že PanB aktivita může být zvýšena restrikcí aktivity panthotenát-kinasy. Toto nakonec snižuje produkci HMBPA a zvyšuje produkci panthotenátu.

Instalace coaX a mutované coaA alely do P4824.

Delece coaX z PA824 se provedla v jednom stupni transformováním PA824 do plasmidu pro resistenci na kanamycin s chromosomální DNA z PA876 (PY79 coaX::kan), jak je popsáno v U.S. patentové přihlášce 09/667,569, za zisku PA880. CoaX delece v PA880 a PA876 byla připravena z plasmidu pAN336 (SEQ ID NO:26, viz U.S. patentová přihláška pořadové č. 09/667,569). Potom se kontrolované verze přirozeného coaA genu a dvě mutované alely coaA vložily následujícím způsobem. Kontrolovaná a dvě mutované alely se ·· » ·· ·· ·« ·« ·« ϊ «·*· ··«· • · · · · « « ·« «·»· «·· ·«· ·· · »· ··♦· ·« «··· ·· · nejprve vložily do chromosomu přirozeného kmene PY79 za použití transformace pro resistenci na chloramfenikol pomocí plasmidů, a potom se chromosomální DNA z těchto dvou meziproduktových kmenů použily pro transformaci PA880 pro resistenci na chloramfenikol. Plasmidy použité pro integrování kontrolních a mutovaných alel byly pAN294 (SEQ ID NO:27, viz U.S. patentová přihláška pořadové č. 09/667,569), pAN343 a pAN344. pAN343 je téměř identický s pAN294, s tou výjimkou, že obsahuje substituci T na C v bázi číslo 3228 pAN294. Obdobně, pAN344 obsahuje CC na TA změnu v bazích číslo 3217 a 3218 pAN294. Všechny tři plasmidy mají gen pro resistenci na chloramfenikol (cat) substituovaný za postradatelný gen neznámé funkce, yqjT, který je umístěn těsně za coaA. Meziproduktové kmeny získané z PY79 dvojitým křížením pAN294 (přirozený coaA.yqjT::cat) , pAN343 (coaA.5 Y155H, yqjT::cat) a pAN344 (coaA2 S151L, yqjT::cat) jsou označeny PA886, PA887 a PA888, v příslušném pořadí. Potom se PA880 transformoval na resistenci na chloramfenikol za použití chromosomální DNA z PA886, PA887, nebo PA888, za zisku kmenů PA892 (přirozený coaA, cat), PA893 (coaA Y155H, cat), a PA894 (coaA S151, cat), v příslušném pořadí. Osm kandidátů na PA893 se testovalo pro ověření získání Y155H mutace za použití PCR coaA genu a trávení NlalII, a všech osm mělo uvedenou mutaci.

Několik kandidátů pro každý nový kmen, včetně PA88O, se testovalo na produkci panthotenátu ve standardních kulturách při 43° za použití SVY media plus 5 g/1 β-alaninu (viz tabulka 4).

4 4

4 4

4 4 4

4 4444

4 4

4

Tabu! ka 4. Produkce panthotenátu a fanthotenátu deriváty

PA824, které mají deletovaný coaX a mutovaný coaA, a které byly kultivovány při 43 °C ve zkumavkách po dobu 48 hodin ve

SVY glukose + β-alaninu.

• · · · • 4 4 ♦

4 · • 44

4 4

4 44 44

44

4 4 4

4 ·

4 4 4

4 4

44 44

Kmen	caaA	coaX | OD60o	[pan] g/1	[HMBPA] g/1 i
PA824	vvt	wt	11.1	4.4	0.77
PA824	wt	wt	I Í.4	4.1	. 0.70
PA880	wt	Δ	11.6	5.5	0.33
PA 880	wt	Δ	12.7	5.1	0.33
PA 892-!	wt. cal	Δ	11.7	4.5	0.26
PA892-2	Wt. cat	Δ	13.4	4.5	0.26
PA892-3	wt. cal	Δ	12.9	4.8	0.25
PA893-I	Y1 55H, cal	Δ	10.7	4.3	0.24
PA893-2	Y1 55H, cat	Δ	12.0	4.5	0.25
PA893-3	YI55H, cal	Δ	11.9	4.7	0.23
PA893-4	Y155H, cat	Δ	12.8	4.3	0.20
ΡΛ893-5	YI55H. cal	Δ	1 1.6	4.7	0.28
PA893-8	Y155H, cat	Δ	10.0	4.7	0.25
PA894-1	S151L?, c///	Δ	11.6	4.6	0.29
PA894-2	S151L 2. cat	Δ	15.6	4.5	0.27
PA894-3	S15IL ?.cal	A	12.3	5.0	0.31
PA894-4	S151L Icat	Δ	12.2	5.0	0.27
PA894-5	S1 5 Ϊ L ?. cal	Δ	11.8	4.5	0.26
PA 894-6	S151L ?, cat	Δ	11.2	4.7	0.27
PA894-7	S ! 51L ?. cal	Δ	13.1	4.7	0.26
PA894-8	S151L ?.«//	Δ	13.2	4.8	0.32

0 ·

ΊΟ • 0 * 00 0 0000 0 0 0 · 0 0 0 00 0000

000 000 000 00 0000 00 0000 00 0

V mediu obsahujícím -alanin produkoval PA894 (S151L), ale ne PA893 (Y155H), průměrně o něco málo vyšší hladiny panthotenátu než PA892 (isogenní kmen s přirozeným coaA.) . PA880 produkoval významně více panthotenátu (5,5 a 5,1 g/1) než jeho isogenní protějšek, PA824 (4,4 a 4,1 g/1), a o něco více panthotenátu než PA894 (průměrně přibližně 4,7 g/1). Je možné, že yqjT::cat inserce přítomná v PA892, PA893 a PA894 (ale ne PA880), má efekt, který působí proti jakémukoliv zisku vznikajícímu v důsledku mutace coaA alel.

I přes úzké rozmezí titrů panthotenátu v nových kmenech byl pozorován signifikantní posun v produkci HMBPA. Ve všech kmenech, ve kterých by deletován coaX, byl titr HMBPA 2- až 3-krát nižší než v PA824. Toto je v souladu s principem, že produkce HMBPA je částečně omezena aktivitou PanB. Tak má coaX zvýšenou aktivitu PanB.

Příklad 6: Zvýšení syntézy panthotenátu kombinovaným zvýšením PanB a redukcí panthotenát-kinasy v produkčních kmenech

PA668, který obsahuje extra-PanB expresní kazetu, která je navržena tak, aby byla amplifikovaná chloramfenikolem (viz příklad IV), produkuje více panthotenátu a méně HMBPA než původní kmen, PA824. Protože delece coaX z PA824 také snižuje produkci HMBPA a mírně zlepšuje produkci panthotenátu (PA880), byl připraven kmen s kombinací těchto dvou modifikací a tento kmen byl testován na produkci panthotenátu. Plasmid pAN636 (Obr. 9) byl tráven Notl, byl ligóván do kruhu a byl použit pro transformaci PA880 na resistenci na chloramfenikol za zisku kmene PA911. Několik izolátů PA911 se testovalo PCR pro určení toho, zda «

4 4

4 4

4 4 •4 4444

4444 • · 4 • 4444 má plasmid integrovaný ve vpr, jak bylo zamýšlefto, nebo v panB, kam může být také integrován. Byly zjištěny oba typy. Jeden izolát z každého typu PA911, PA911-5 a PA911-8 byl amplifikovén na tetracklin (panD kazeta) a chloramfenikol (panB kazeta) a byl testován na produkci panthotenátu ve zkumavkových kulturách kultivovaných v SVY plus β-alanin (viz tabulka 1). Oba izoláty produkovaly více panthotenátu a něco méně HMBPA než původní kmen, PA880.

Dále, stejně jako PA668 izoláty produkoval PA91-8, který má panB kazetu integrovanou v panB, vyšší hladiny panthotenátu.

Příklad 7: Zvýšení produkce panthotenátu zvýšením dostupnosti serínu

Předpokládá se, že poměr produkce panthotenátu k produkci HMBPA může být kontrolován regulováním dostupnosti šeřinu v kulturách mikroorganismu. Konkrétně se předpokládá, že zvýšení dostupnosti šeřinu může zvýšit produkci panthotenátu vzhledem k produkci HMBPA, zatímco snížení dostupnosti šeřinu bude snižovat produkci panthotenátu vzhledem k produkci HMBPA. Tento postup je založen na zjištění, že PanB substrát, methylentetrahydrofolát, je odvozen od šeřinu. Proto by mělo regulování koncetrací serínu účinně regulovat koncentrace PanB substrátu. Pro testování této hypotézy se PA824 kultivovaly ve zkumavkových kulturách s SVY glukosou plus 5 g/1 β-alaninu a ± 5 g/1 šeřinu po dobu 48 hodin při 43°C.

Tabulka 5: Produkce panthotenátu a HMBPA kmenem PA824 s a bez přidání šeřinu

serine added at 5 g/L	ODňno	[pan] g/L	[HMBPA] g/L
	16.3	4.9	0.84
-	14.0	4.5	0.80
__	í - 1	A 4	ji ÍA

a « • · • « · • ·· · ·

Jak ukazují data v tabulce 5, zvyšuje přidání šeřinu produkci panthotenátu a zároveň snižuje produkci HMBPA. Alternativní metodou k přidávání šeřinu, která vede ke zvýšení koncentrace šeřinu a methylentetrahydrofolátu a vede k regulaci produkce panthotenátu, je zvýšení syntézy nebo aktivity 3-fosfoglycerátdehydrogenasy nebo serinhydroxymethyltransferasy {produktů serA a glyA genů, v příslušném pořadí), čímž dojde ke zvýšení biosyntézy šeřinu a methylentetrahydrofolátu ve vhodně upraveném mikroorganismu.

Příklad 8: Produkce panthotenátu v kmenech PA668-2A a

ΡΆ668-24 v 10-litrových fermentačních tancích s mediem na bázi sójové moučky

Kmeny PA668-2A a PA668-24 se kultivovaly dvakrát v 10-litrových fermentačních tancích. Medium bylo PEM-155 a

	MATERIÁL | g/L (finální)
1	Amberex 1003 J 5
O	Cargill 200/20 (S0SsJEÍ) 40
1	Na Glutamát	5
4	(NH4),SO4	8
5	MgSO/7H2O	1
6	MAZU DF204C	1
7	H,0	qs .. 4 L

Přidávání po sterilizaci a ochlazení

I	80% Glukose.	20
2	CaCk2H,0	0.1
i	Natrium-citrát	1
2	FeSO/7HO	0.01
3	SM-1000X	1 X

FEED

	MATERIÁL	g/L (finální)
1	80% Glukosa	800
2	CaCl,-2H2O	0.8
-i	H,0	qs > 3500 ml

a i i i . rPřidávání po sterilizaci a ochlazení

1	Natrium-citrát	2.0
2	FeS0/7H,0	0.02
o	SM-1000X	2X
i i
I 4	Glutamát · Na	5.0
í L-5	H,0	qs ) 500 ml

Produkce panthotenátu PA668-2A byla 45 g/1 a 51 g/1 během 36 hodin, podobně jako při rutinních PA824 fermentacich ve stejném mediu. Po 36 hodinách, kdy se produkce panthotenátu obvykle u PA824 zpomaluje, pokračovala v obou PA668-2A fermentacích produkce za zisku 63 g/1 panthotenátu v 48 hodinách. Nejvýznamnější je to, že produkce HMPBA ve 48 hodinách byla redukovaná na 3-5 g/1 a byla menší než 5% panthotenátu během většiny časné fermentace. Jasný posun ve prospěch syntézy panthotenátu je ·· ·· 44 4· 44 · • 4 4 · 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4444 • 4 4 44 4 4 44 4444

444 444 44 4

4444 44 4444 44 4 patrný ze zvýšení hladiny PanB ve kmenu PA668. Kmen PA668-24 produkoval panthotenát ještě rychleji, při obou fermentacích průměrně 58 g/1 po 36 hodinách.

Ekvivalenty

Odborníkům v oboru budou jasné, nebo budou schopni zjistit běžnými pokusy, mnohé ekvivalenty specifických provedení popsaných v předkládaném vynálezu. Takové ekvivalenty spadají do rozsahu následujících patentových nároků.

·· *

0 0

0 0 · • 00000

0 0 ·

• 0 00 » · 0 0 • 0 ···» «000

Seznam sekvencí <110> Omnigene Bioproducts < 12 o > Způsoby pro zlepšenou produkci panthotenátu ' <130> BGI-148PC <140>

<141>

<160> 27 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 194 <212> DNA <21³> Artificiální sekvence¹ <220>

<223> Popis artificiální sekvence: promotorové sekvence r <220>

<221> -35_signal <222> (136)..(141) <220>

<221> -10_signal <222> (159)..(164) <400> 1

gctattgacg	acagctatgg	ttcactgtcc	accaaccaaa	actgtgctca	gtaccgccaa	60
tatttctccc	ttgaggggta	caaagaggtg	tccctagaag	agatccacgc	tgtgtaaaaa	120
ttttacaaaa	aggtattgac	tttccctaca	gggtgtgtaa	taatttaatt	acaggcgggg	180
gcaaccccgc	ctgt					194

<210> 2 <211> 163 <212> DNA <213> Artificiální sekvence s <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: promotorova sekvence <220>

<221> -35_sígnal <222> (113)..(118) <220>

<221> -10_sígnal <222> (136)..(141) ·« • · • · • · · • · ·· ·· ·· • · • · • · • * *· • · • · «· ·· « · · · • · · • · 9 • · · ·· ····

<400> 2 gcctacctag	cttccaagaa	agatatccta	acagcacaag	agcggaaaga	•tgttttgttc	60
tacatccaga	acaacctctg	ctaaaattcc	tgaaaaattt	tgcaaaaagt	tgttgacttt	120
atctacaagg	tgtggtataa	taatcttaac	aacagcagga	cgc		163

<210> 3 <211> 127 <212> DNA ^{< 213 >} Artificiální sekvence ‘ <220>

<223> [ Popis artificiální sekvence: promotorové sekvence <220>

<221> -35_signal <222> (34) . .(39) <220>

<221> -10_signal <222> (58)..(63) <220>

<221> -35_signal <222> (75)..(80) <220>

<221> -10_signal <222> (98)..(103) <400> 3 gaggaatcat aatttaaatt tgcaatg agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgca gtgaggtgga

120

127 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <²¹³ > Artificiální sekvence⁽ <220>

<^{2 2 3} > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 4 taaacatgag gaggagaaaa catg 24 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificiální sekvence s «

• » • · · · · « 4 4 · ··· • · · <220>

<223> Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 5 attcgagaaa tggagagaat ataatatg <210> 6 <2U> 13 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 6 agaaaggagg tga 13 <210> 7 <211> 23 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <22 0 >

<223> Popis artificiální sekvence: ribosomální ⁵ vazebné místo <220>

< 2 2 3 > všechny n = jakýkoliv nukleotid <400> 7 ttaagaaagg aggtgannnn atg <210> 8 <211> 23 <212> DNA < 213 > i Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <220>

< 2 2 3 > , všechny n = jakýkoliv nukleotid ;

<400> 8 ttagaaagga ggtgannnnn atg <210> 9 <211> 23 <212> DNA ^{< 213 >} ‘ Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > p_Opi_s artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo ·· ···· <220>

< 2 2 3 > všechny n = jakýkoliv nukleotid <400> 9 agaaaggagg tgannnnnnn atg <210> 10 <211> 22 <212> DNA ^{< 213 >} Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <220>

< 2 2 3 > všechny n = jakýkoliv nukleotid <400> 10 agaaaggagg tgannnnnna tg <210> 11 <211> 25 <212> DNA ^<213> Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 11 ccctctagaa ggaggagaaa acatg <210> 12 <211> 24 <212> DNA ^{< 213 >} Artificiální sekvence ' <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 12 ccctctagag gaggagaaaa catg <210> 43 <211> 23 <212> DNA ^<213> Artificiální sekvence¹ <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 13 ttagaaagga ggatttaaat atg <210> 14 <211> 2 3 <212> DNA ···« i

<213> Artificiální sekvence s <220> . , < 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomalm vazebné místo <400> 14 ttagaaagga ggtttaatta atg <210> 15 <211> 23 <212> DNA < ²¹³ > Artificiální sekvence¹' <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 15 ttagaaagga ggtgatttaa atg <210> 16 <211> 23 <212> DNA ·<²¹3^> Artificiální sekvence <220>

< ^{2 2 3} > Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 16 ttagaaagga ggtgtttaaa atg <210> 17 <211> 28 <212> DNA c 2¹3 > Artificiální sekvence ‘ <220>

^{<: 2 2 3} ' Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 17 attcgagaaa ggaggtgaat ataatatg <210> 18 <211> 27 <212> DNA <2i3> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <4C0> 18 attcgagaaa ggaggtgaat aataatc <210> 19 <211> 2 8 <Z12> uMA • » ^<213> Artificiální sekvence) <220>

<223> Popis artificiální sekvence: ribosomální vazebné místo <400> 19 attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28 <210> 20 <211> 6886 <212> DNA ^<213> Artificiální sekvence <220>

<223> Popis artificiální sekvence: vektor j <220>

<223> pAN624 <400> 20 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccaťgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240 atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg 300 ctaacaggag gaattaacca tggatccgag ctcgacagta tcaagcactt cacaatctgg 360 gagctgaaag cccgccttat gtagctcata cttgaeaaat ccaaggtcaa aatggatatt 420 gtgggcgaca aaataagcgc cgtcaagcaa ttggaatact tcttcagcaa ctgcttcaaa 48Q tggctgttca ttctcgacca tttgattaga gattccagta agctgctcaa taaaagcagg 540 gattgattta tttggattaa tgtattttga aaaccgctca gtaatttgtc cattttcgat 600 tacaaccgct gcgatttgta tgattttatc gcctttcttc ggcgaattcc ctgttgtctc 660 tacatctata acaacgaacc gttgcttatt cattaaaatg gacacctcaa ttcttgcata 720 cgacaaaagt gtaacacgtt ttgtacggaa atggagcggc aaaaccgttt tactctcaaa 780 atcttaaaag aaaacccccg ataaaggggg cttttcttct acaaaattgt acgggctggt 840 tcgttcccca gcatttgttc aattttgttt tgatcattca gaacagccac tttcggctca 900 tggcttgccg cttcttgatc agacatcatt ttgtaggaaa taataatgac cttatctcct 960 tcctgcacaa ggcgtgcggc tgcaccgttt aagcatatga cgccgcttcc ccgtttacca 1020 ggaataatat acgtttcaag acgtgctcca ttatcattat tcacaatttg tactttttca 1080 ttaggaagca ctcccacagc atcaatgaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 1140 cttccgtcga cgctccccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 1200 gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag 1260 tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa 1320 gtggcgagcc cgatcctccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc 1380 tgtggcgccg gtgatgccgg. ccacgatgcg tccggcgtag aggatcaatc ttcatccatt 1440 ccaaggtaaa tcccccttcg ccgtttctgt taccattata cacctr.ttga accttaacgt 1500 aaacgttaag ttttaaaaaa caataaaaaa gacgagcagc atacagcacc cgtctttcac 1560 tttcctgttt aagctaaact tcccgccact gacagagact ctttttgaag gctttcagaa 1620 agcactcgat acgcgatctg gagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 1680 ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 1740 gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 1800 aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 1860 tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 1920 ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 1980 gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 2040 ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 2100 tagaracacc aicaaaaatt grataaagtg gctctaactt atcccaataa ccraactctc 2160 cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagcrg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 2220 aaataaatgc agggtaaaat ítataícct: cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 2230 • · • · • 9 tatcaatttc cttttctctt tttttatcta tcttttaaaa ccaattttcg aatgtggtct tatcttgata tcttctgcaa cggcgagttt ctatctattt aatcaacggg aatgccttcg gtaaaaggtt ttcccataaa aaagcatagt gctgaggctt cggtctccag atcagaacgc cccacctgac gtctccccat aagactgggc atccgccggg gcccgccata ttgcgtttct catgagacaa tcaacatttc tcacccagaa ttacatcgaa ttttccaatg cgccgggcaa ctcaccagtc tgccataacc gaaggagcta ggaaccggag aatggcaaca acaattaata tccggctggc cattgcagca gagtcaggca taagcattga tcatttttaa c.cctt.aacgt ttcttgagat accagcggtg cttcagcaga cttcaagaac tgctgccagt taaggcgcag gacctacacc agggagaaag ggagcttcca acttgagcgt caacgcggcc tgcgttatcc tcgccgcagc gatgcggtat cagtacaatc gactgggtca tgtctgctcc cagaggtrtt tgtggttata ccaattgtct aagtgaattt gtcaatatta tttgttgaac tttgtgtttt ataagggtaa gccaaaaaac catccctctg taataatagg cttgtaccaa ttcgtttcta ccgtttaacg agcttaatcg aaaatatgct gtcgcgatgt cttggctgtt agaagcggtc cccatgccga gcgagagtag ctttcgtttt agcggatttg aactgccagg acaaactctt taacccrgat cgtgtcgccc acgctggtga ctggatctca atgagcactt gagcaactcg acagaaaagc atgagtgata accgcttttt ctgaatgaag acgttgcgca gactggatgg tggtttattg ctggggccag actatggatg taactgtcag tttaaaagga gagttttcgt cctttttttc gtttgtrtgc gcgcagatac tctgtagcac ggcgataagt cggtcgggct gaactgagat gcggacaggt gggggaaacg cgatttttgt tttttacggt cctgattctg cgaacgaccg ttrctcctta tgctctgatg tggctgcgcc cggtatttgc ctaaaagtcg aaatcaattt aggaggctta ctgtaacata taatgggtgc tttaaaggat ctattgcatg cttccgttac tcccagtcct tgcagttcgc cacattagcc aaagcagaac ttctggctct gcgtaaatcc ggatgacgcc ccttcaattc ttggcggatg tgataaaaca actcagaagt ggaactgcca atctgttgtt aacgttgcga catcaaatta tttgtttatt aaatgcttca ttattccctt aagtaaaaga acagcggtaa ctaaagttct gtcgccgcat atcttacgga acactgcggc tgcacaacat ccataccaaa aactattaac aggcggataa ctgataaatc atggtaagcc aacgaaatag accaagttta tctaggtgaa tccactgagc tgcgcgtaat cggatcaaga caaatactgt cgcctacata cgtgt cttac gaacgggggg acctacagcg atccggtaag cctggtatct gatgctcgtc tcctggcctt tgaataaccg agcgcagcga cgcatctgtg ccgcatagtt ccgacacccg C či C 3 CÍ 5 C a a 5. C C p či S íi. C C tttgttggtt tattaaagtt cttgtctgct aatatatatt tttagttgaa ttgagcgtag ataagctgtc aacgagaagg tttttggatc aggcgatact caattcgata gccttcatca catattagtg gtgcgtcata ggcccgatca atctggaaaa agagaagatt gaatttgcct gaaacgccgt ggcatcaaat tgtcggtgaa agcaacggcc agcagaaggc tttctaaata ataatattga ttttgcggca tgctgaagat gatccttgag gctatgtggc acactattct tggcatgaca caacttactt gggggatcat cgacgagcgt tggcgaacta agttgcagga tggagccggt ctcccgtatc acagatcgct ctcatatata gatccttttt gtcagacccc ctgctgcttg gctaccaact ccttctagtg cctcgctctg cgggttggac ttcgtgcaca tgagctatga cggcagggtc ttatagtcct aggggggcgg ttgctggcct tattaccgcc gtcagtgagc cggtatttca aagccagtat ccaacacccg gctgtgaccg caaataatga catttgatat ttcttcatta ttaaaaatat gaataaagac cgaaaaatcc aaacatgaga attcttcact aaggcagact gcccaatgga tcggcagaat tctataccta ccaataccga taatcccggt attttttccc tcattaggct ttcagcctga ggcggcagta agcgccgatg aaaacgaaag cgctctcctg cggagggtgg catcctgacg cattcaaata aaaaggaaga ttt.tgccttc cagttgggtg agttttcgcc gcggtattat cagaatgact gtaagagaat ctgacaacga gtaactcgcc gacaccacga cttactctag ccacttctgc gagcgtgggt gtagttatct gagataggtg ctttagattg gataatctca gtagaaaaga caaacaaaaa ctttttccga tagccgtagt ctaatcctgt tcaagacgat cagcccagct gaaagcgcca agaacaggag gtcgggtttc agcctatgga tttgctcaca tttgagtgag gaggaagcgg caccgcatat acactccgct ctgacgcgcc tctccgggag agatcaattc • 9 9 9

9 9

9 9 9

9 9 9 »· ·· · · 9 9 ttaaatatct gcctcctaaa gaatcaatcc cccactttat cacattaaaa ttttctttct attcccgttt ttctaaagtt gctgcaatgt agtataccaa agattttttt acgccttacc gcgcatagct accgtttctc cagcagcttg gctggttaaa tacagattaa· gcgcggtggt gtagtgtggg gctcagtcga agtaggacaa cgggcaggac gatggcct tt tgtatccgct gtatgagtat

Ctgtttttgc cacgagtggg ccgaagaacg cccgtgttga tggttgagta tatgcagtgc tcggaggacc ttgatcgttg tgcctgtagc cttcccggca gctcggccct ctcgcggtat acacgacggg cctcactgat atttaaaact tgaccaaaat tcaaaggat c aaccaccgct aggtaactgg taggccacca taccagtggc agttaccgga tggagcgaac cgcttcccga agcgcacgag gccacctctg aaaacgccag tgttctttcc ctgataccgc aagagcgcct ggtgcactct atcgctacgt ctgacgggct ctgcatgtgt gcgcgcgaag » · · ·

9 9 9 9

99 99999

9 9 · O ·

2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 294 0 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4 320 4380 4 4 4 0 4500 4560 4 620 4680 4 740 4 800 4860 4 920 4 980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 54 60 5520 5580 564 0 57 00 5760 5820 5880 • · · • ·

« φ · φ • φ · · φ φ · · φ • φφφφ * • φ · φφφ

Φ· φφφφ φφφφ·· gcgaagcggc atgcataatg tgcctgtcaa atggacgaag cagggattct gcaaacccta 5940 tgctactccg tcaagccgtc aattgtctga ttcgttacca attatgacaa cttgacggct 6000 acatcattca ctttttcttc acaaccggca cggaactcgc tcgggctggc cccggtgcat 6060 tttttaaata cccgcgagaa atagagttga tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg 6120 gcgataggca tccgggtggt gctcaaaagc agcttcgcct ggctgatacg ttggtcctcg 6180 cgccagctta agacgctaat ccctaactgc tggcggaaaa gatgtgacag acgcgacggc 6240 gacaagcaaa catgctgtgc gacgctggcg atatcaaaat tgctgtctgc caggtgatcg 6300 ctgatgtact gacaagcctc gcgtacccga ttatccatcg gtggatggag cgactcgtta 6360 atcgcttcca tgcgccgcag taacaattgc tcaagcagat ttatcgccaa cagctccgaa 6420 tagcgccctt ccccttgccc ggcgttaatg atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcgac 6480 tggtgcgctt catccgggcg aaagaacccc gtattggcaa atattgacgg ccagttaagc 6540 cattcatgcc agtaggcgcg cggacgaaag taaacccact ggtgatacca ttcgcgagcc 6600 tccggatgac gaccgtagtg atgaatctct cctggcggga acagcaaaat atcacccggt 6660 cggcaaacaa attctcgtcc ctgatttttc accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg 6720 agaatataac ctttcattcc cagcggtcgg tcgataaaaa aatcgagata accgttggcc 6780 tcaatcggcg ttaaacccgc caccagatgg gcattaaacg agtatcccgg cagcagggga 6840 tcattttgcg cttcagccat acttttcata ctcccgccat tcagag 6886 <210> 21 <211> 7140 <212> DNA ^J> Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: vektor , <220>

<223> pAN620 <400> 21 tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60 caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120 ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180 tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240 attcctgaaa aatttcgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300 ttaacaacag caggacgctc tagattagaa aggaggattt aaatatgaga cagattactg 360 atatttcaca gctgaaagaa gccataaaac aataccattc agagggcaag tcaatcggat 420 ttgttccgac gatggggttt ctgcatgagg ggcatttaac cttagcagac aaagcaagac 480 aagaaaacga cgccgttatt atgagtattt ttgtgaatcc tgcacaatcc ggccctaatg 540 aagattttga agcatatccg cgcgatattg agcgggatgc agctcttgca gaaaacgccg 600 gagtcgatat cctttttacg ccagatgctc atgatatgta tcccggtgaa aagaatgtca 660 cgattcatgt agaaagacgc acagacgtgt tatgcgggcg ctcaagagaa ggacattttg 720 acggggtcgc gatcgtactg acgaagcttt tcaatctagt caagccgact cgtgcctatt 780 tcggtttaaa agatgcgcag caggtagctg ttgttgatgg gttaatcagc gacttcttca 840 tggatattga attggttcct gtcgatacgg tcagagagga agacggctta gccaaaagct 900 ctcgcaatgt atacttaaca gctgaggaaa gaaaagaagc gcctaagctg tatcgggccc 960 ttcaaacaag tgcggaactt gtccaagccg gtgaaagaga tcctgaagcg gtgataaaag 1020 ctgcaaaaga catcattgaa acgactagcg gaaccataga ctatgtagag ctttattcct 1080 atccggaact cgaacctgtg aatgaaattg ctggaaagat gattctcgct gttgcagttg 1140 ctttttcaaa agcgcgttta atagataata tcattattga tattcgtaga aaggaggtga 1200 attaatatgt atcgtacgat gatgagcggc aaacttcaca gggcaactgt tacggaagca 1260 aacctgaact atgtgggaag cattacaatt gatgaagatc tcactgatgc tgtgggaatg 1320 cttcctaatg aaaaagtaca aattgtgaat aataataatg gagcacgtct tgaaacgtat 1380 attattccta gtaaacgggg aagcggcgtc atatgcttaa acggtgcagc cgcacgcctt 1440 gtgcaggaag gagataaggt cattattatt tcctacaaaa tgatgtctga tcaagaagcg 1500 gcaagccatg agccgaaagt ggctgttctg aatgatcaaa acaaaattga acaaatgctg 1560 gggaacgaac cagcccgtac aattttgtaa aggatcctgt tttggcggat gagagaagat 1620 tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc 1680 tggcggcagt agcgcagtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg 1740 tagcgcsgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa 1800 • · • ·

taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt. tatctgttgt ttgtcggtga 1860 acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc 1920 ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg 1980 ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct tggtaccgag acgatcgtcc 2040 tctttgttgt agcccatcac ttttgctgaa gagtaggagc cgaaagtgac ggcgtattca 2100 ttgagcggca gctgagtcgc accgacagaa atcgcttctc ttgatgtgcc cggcgatccg 2160 actgtccagc cgttcggtcc gctgttgčcg tttgaggtaa cagcgacaac gccttctgac 2220 atggcccagt caagcgctgt gcttgtcgcc cagtccgggt tgtttaaaga gtttccgaga 2280 gacaggttca tcacatctgc cccgtcctgc actgcacgtt ccacgcccgc gatgacgttt 2340 tccgttgtgc cgcttccgcc aggccctaac acacgataag caagaagťgt ggcatcaggc 2400 gctacgcctt taatcgttcc gtttgcagcc acagttccgg ctacgtgtgt gccatggtca 2460 gttgcctcgc ccctcggatc gccggttggt gtttcttttg gatcgtaatc attgtccaca 2520 aaatcgtatc ctttatattg tccaaagttt ttcttcagat ctgggtgatt gtattcaacc 2580 ccagtgtcaa taatcgccac cttgatgcct tttcctgtgt agcctaaatc ccatgcatcg 2640 tttgctccga tataaggcgc actgtcatcc atttgcggag atacggcgtc ttcggagatt 2700 gtggggaatt ctcatgtttg acagcttatc atgcaatagt tacccttatt atcaagataa 2760 gaaagaaaag gatttttcgc tacgctcaaa tcctttaaaa aaacacaaaa gaccacattt 2820 tttaatgtgg tctttattct tcaactaaag cacccattag ttcaacaaac gaaaattgga 2880 taaagtggga tatttttaaa atatatattt atgttacagt aatattgact tttaaaaaag 2940 gattgattct aatgaagaaa gcagacaagt aagcctccta aattcacttt agataaaaat 3000 ttaggaggca tatcaaatga actttaataa aattgattta gacaattgga agagaaaaga 3060 gatatttaat cattatttga accaacaaac gacttttagt ataaccacag aaattgatat 3120 tagtgtttta taccgaaaca taaaacaaga aggatataaa ttttaccctg catttatttt 3180 cttagtgaca agggtgataa actcaaatac agcttttaga actggttaca atagcgacgg 3240 agagttaggt tattgggata agttagagcc actttataca atttttgatg gtgtatctaa 3300 aacattctct ggtatttgga ctcctgtaaa gaatgacttc aaagagtttt atgatttata 3360 cctttctgat gtagagaaat ataatggttc ggggaaattg tttcccaaaa cacctatacc 3420 tgaaaatgct ttttctcttt ctattattcc atggacttca tttactgggt ttaacttaaa 3480 tatcaataat aatagtaatt accttctacc cattattaca gcaggaaaat tcattaataa 3540 aggtaattca atatatttac cgctatcttt acaggtacat cattctgttt gtgatggtta 3600 tcatgcagga ttgtttatga actctattca ggaattgtca gataggccta atgactggct 3660 tttataatat gagataatgc cgactgtact ttttacagtc ggttttctaa tgtcactaac 3720 ctgccccgtt agttgaagaa cgaagcggcc gcaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga 3780 tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca 3840 cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 3900 tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 3960 gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 4020 ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 4080 cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 4140 ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 4200 cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact 4260 tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat 4320 tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga 4380 tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc 4440 ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 4500 tgcctgcagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag 4560 cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 4620 gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 4680 ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 4740 acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 4800 cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 4860 atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 4920 tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 4980 tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 5040 aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 5100 aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 5160 taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 5220 taccagtggc tgctgccagt gacgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 5230 agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 5340 tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 5400 • · • ·

84^ • · • « · • · cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 5460 agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 5520 gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 5580 aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 5640 tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 5700 ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 5760 aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 5820 ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct 5880 atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc 5940 ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag 6000 ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag 6060 ctcatcagcg tggtcgtgaa gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc 6120 gttgagtttc tccagaagcg ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc 6180 ggttttttcc tgtttggtca cttgatgcct ccgtgtaagg gggaatttct gttcatgggg 6240 gtaatgatac cgatgaaacg agagaggatg ctcacgatac gggttactga tgatgaacat 6300 gcccggttac tggaacgttg tgagggtaaa caactggcgg tatggatgcg gcgggaccag 6360 agaaaaatca ctcagggtca atgccagcgc ttcgttaata cagatgtagg tgttccacag 6420 ggtagccagc agcatcctgc gatgcagatc cggaacataa tggtgcaggg cgctgacttc 6480 cgcgtttcca gactttacga aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt tgctcaggtc 6540 gcagacgttt tgcagcagca gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc 6600 taaccagtaa ggcaaccccg ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag cacgatcatg 6660 cgcacccgtg gccaggaccc aacgctgccc gagatgcgcc gcgtgcggct gctggagatg 6720 gcggacgcga tggatatgtt ctgccaaggg ttggtttgcg cattcacagt tctccgcaag 6780 aattgattgg ctccaattct tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ccggcttcca 6840 ttcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa cgcggggagg cagacaaggt 6900 atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt gctcgccgag gcggcataaa 6960 tcgccgtgac gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct ggtaagagcc gcgagcgatc 7020 cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg 7080 gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc cagcctcgcg 7140 <210> 22 <211> 6725 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence ;

<220>

<223> Popis artificiální sekvence: vektor ?

<220>

<223> pAN636 <400> 22 tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgt ccggtttttg 60 caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120 ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac tcgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180 tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240 attcctgaaa aattctgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300 ttaacaacag caggacgctc tagaaggagg agaaaacatg aaaacaaaac tggattttct 360 aaaaatgaag gagtctgaag aaccgattgt catgctgacc gcttatgatt atccggcagc 420 taaacttgct gaacaagcgg gagttgacat aattttagtc ggtgattcac ttggaatggt 480 cgtcctcggc cttgattcaa ctgtcggtgt gacagttgcg gacatgatcc atcatacaaa 540 agccgttaaa aggggtgcgc cgaatacctt tattgtgaca gatatgccgt ttatgtctta 600 tcacctgtct aaggaagata cgctgaaaaa tgcagcggct atcgttcagg aaagcggagc 660 tgacgcactg aagcttgagg gcggagaagg cgtgtttgaa tccattcgcg cattgacgct 720 tggaggcatt ccagtagtca gtcacttagg tttgacaccg cagtcagtcg gcgtactggg 780 cggctataaa gtacagggca aagacgaaca aagcgccaaa aaattaatag aagacagtat 840 aaaatgcgaa gaagcaggag ctatgatgct tgtgctggaa tgtgtgccgg cagaactcac 900 agccaaaatt gccgagacgc taagcatacc agtcattgga atcggggctg gtgtgaaagc 960 ggacggacaa gttctcgttt atcatgatat tatcggccac ggtgttgaga gaacacctaa 1020 atttgtaaag caatatacgc gcattaatga aaccatcgaa acagcaatca gcggatatgt 1080 • φ tcaggatgta agtgcttgac aagattttca ttgcctggcg cgccgtagcg tcaaataaaa ggtgaacgct acggcccgga gaaggccatc cgtcctcttt attcattgag atccgactgt ctgacatggc cgagagacag cgttttccgt caggcgctac ggtcagttgc ccacaaaatc caaccccagt catcgtttgc agattgtggg gataagaaag cattttttaa ttggataaag aaaaggattg aaaatttagg aaagagatat gatattagtg attttcttag gacggagagt tctaaaacat ttataccttt atacctgaaa ttaaatatca aataaaggta ggttatcatg tggcttttat ctaacctgcc cgtgatacgc tggcactttt aaatatgtat gaagagtatg ccttcctgtt gggtgcacga tcgccccgaa attatcccgt tgacttggtt agaattatgc aacgatcgga tcgccttgat cacgatgcct tctagcttcc tctgcgctcg tgggtctcgc tatctacacg aggtgcctca gattgattta tctcatgacc aaagatcaaa aaaaaaacca agacatcgtg ggcttgtacg gcctgataca gcagtagcgc ccgatggtag cgaaaggctc ctcctgagta gggtggcggg ctgacggatg gttgtagccc cggcagctga ccagccgttc ccagtcaagc gttcatcaca tgtgccgctt gcctttaatc ctcgcccctc gtatccttta gtcaataatc tccgatataa gaattctcat aaaaggattt tgtggtcttt cgggatattt attctaatga aggcatatca ttaatcatta ttttataccg tgacaagggt taggttattg tctctggtat ctgatgtaga atgčtttttc ataataatag attcaatata caggattgtt aatatgagat ccgttagttg ctatttttat cggggaaatg ccgctcatga agtattcaac tttgctcacc gtgggttaca gaacgttttc attgacgccg gagtactcac agtgctgcca ggaccgaagg cgttgggaac gcagcaatag cggcaacaat gcccttccag ggtatcattg acggggagtc ctgattaagc aaacrtcatt aaaatccctt ggatcttctt

C 2 CI C “ 3 C C a O ctttccctga ggggaaaata gattaaatca ggtggtccca tgtggggtct agtcgaaaga ggacaaatcc caggacgccc gcctttttgc atcacttttg gtcgcaccga ggtccgctgt gctgtgcttg tctgccccgt ccgccaggcc gttccgtttg ggatcgccgg tattgtccaa gccaccttga ggcgcactgt gtttgacagc ttcgctacgc attcttcaac ttaaaatata agaaagcaga aatgaacttt tttgaaccaa aaacataaaa gataaactca ggataagtta ttggactcct gaaatataat tctttctatt taattacctt tttaccgcta tatgaactct aatgccgact aagaacgaag aggttaatgt tgcgcggaac gacaataacc atttccgtgt cagaaacgct tcgaactgga caatgatgag ggcaagagca cagtcacaga taaccatgag agctaaccgc cggagctgaa caacaacgtt taatagactg ctggctggtt cagcactggg aggcaactat attggtaact tttaatttaa aacgtgaatt gagatccttt cggtggtttg acaaaagcat agggggggat gaacgcagaa cctgacccca ccccatgcga ctgggccttt gccgggagcg gccataaact gtttctacaa ctgaagagta cagaaatcgc tgccgtttga tcgcccagtc cctgcactgc ctaacacacg cagccacagt ttggtgtttc agtttttctt tgccttttcc catccatttg ttatcatgca tcaaatcctt taaagcaccc tatttatgtt caagtaagcc aataaaattg caaacgactt caagaaggat aatacagctt gagccacttt gtaaagaatg ggttcgggga attccatgga ctacccatta tctttacagg attcaggaat gtacttttta cggccgcaat catgataata ccctatttgt ctgataaatg cgcccttatt ggtgaaagta tctcaacagc cacttttaaa actcggtcgc aaagcatctt tgataacact ttttctgcac tgaagccata gcgcaaacta gatggaggcg tattgctgat gccagatggt ggatgaacga gtcagaccaa aaggatctag ttcgttccac 1111 ctgcgc tttgccggat tcctttcaaa cctgttttgg gcggtctgat tgccgaactc gagtagggaa cgttttatct gatttgaacg gccaggcatc actcttggta ggagccgaaa ttctcttgat ggtaacagcg cgggttgttt acgttccacg ataagcaaga tccggctacg ttttggatcg cagatctggg tgtgtagcct cggagatacg atagttaccc taaaaaaaca attagttcaa acagtaatat tcctaaattc atttagacaa ttagtataac ataaatttta ttagaactgg atacaatttt acttcaaaga aattgtttcc cttcatttac ttacagcagg tacatcattc tgtcagatag cagtcggttt tcttgaagac atggtttctt ttatttttct cttcaataat cccttttttg aaagatgctg ggtaagatcc gttctgctat cgcatacacc acggatggca gcggccaact aacatggggg ccaaacgacg ttaactggcg gataaagttg aaatctggag aagccctccc aatagacaga gtttactcac gtgaagatcc tgagcgtcag gtaatctgct caagagctac • · · • · · · · · · tgaaccagac cggatgagag aaaacagaat agaagtgaaa ctgccaggca gttgtttgtc ttgcgaagca aaattaagca ccgagacgat gtgacggcgt gtgcccggcg acaacgcctt aaagagtttc cccgcgatga agtgtggcat tgtgtgccat taatcattgt tgattgtatt aaatcccatg gcgtcttcgg ttattatcaa caaaagacca caaacgaaaa tgacttttaa actttagata ttggaagaga cacagaaatt ccctgcattt ttacaatagc tgatggtgta gttttatgat caaaacacct tgggtttaac aaaattcatt tgtttgtgat gcctaatgac tctaatgtca gaaagagcct agacgtcagg aaatacattc attgaaaaag cggcattttg aagatcagtt ttgagagttt gtggcgcggt attctcagaa tgacagtaag tacttctgac atcatgtaac agcgtgacac aactacttac caggaccact ccggtgagcg gtatcgtagt tcgctgagat atatacttta tttttgataa accccgtaga gcttgcaaac caactctttt • · * · • · · « · • · · · ···· • · ♦

I · · ·· ·

1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 32 4 0 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900

960 4020 4080 4140 4200 4260 4320

380 4 4 4 0 4500 4560 4620 4 68 0 φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φφφ φ φ φφφφ • φ ♦ · · φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφφφ ί

• · φφφφ tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 4740 gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 4800 cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 4860 acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 4920 cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 4980 cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 5040 aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 5100 gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 5160 atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 5220 tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 5280 gtgagctgat accgctcgcc gcagcčgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 5340 agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 5400 catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact 5460 ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac 5520 gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 5580 gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg 5640 taaagctcat cagcgtggtc gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc 5700 agctcgttga gtttctccag aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta 5760 agggcggttt tttcctgttt ggtcacttga tgcctccgtg taagggggaa tttctgttca 582C tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg 5880 aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg 5940 accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc 6000 cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg 6060 acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc 6120 aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat 6180 tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggr. cctcaacgac aggagcacga 6240 tcatgcgcac ccgtggccag gacccaacgc tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg 6300 agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc acagttctcc 6360 gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc 6420 ttccattcag gtcgaggtgg cccggctcca tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac 6480 aaggtatagg gcggcgccta caatccatgc caacccgttc catgtgctcg ccgaggcggc 6540 ataaatcgcc gtgacgatca gcggtccagt gatcgaagtt aggctggtaa gagccgcgag 6600 cgatccttga agctgtccct gatggtcgtc atctacctgc ctggacagca tggcctgcaa 6660 cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag aagaatcata atggggaagg ccatccagcc 6720 tcgcg 6725 <210> 23 <211> 6806 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: vekton <220>

<223> pAN637 <400> 23 tcggcggccg cttcgtcgac cgaaacagca gttataaggc atgaagctgc ccggtttttg 60 caaaagtggc tgtgactgta aaaagaaatc gaaaaagacc gttttgtgtg aaaacggtct 120 ttttgtttcc ttttaaccaa ctgccataac fccgaggccta cctagcttcc aagaaagata 180 tcctaacagc acaagagcgg aaagatgttt tgttctacat ccagaacaac ctctgctaaa 240 attcctgaaa aattttgcaa aaagttgttg actttatcta caaggtgtgg tataataatc 300 ttaacaacag caggacgctc tagacaattg agatcttaag aaaggaggtg ttaattaatg 360 aagattggaa tcattggcgg aggctccgtt ggtcttttat gcgcctatta tttgtcactt 420 tatcacgacg tgactgttgt gacgaggcgg caagaacagg ctgcggccat tcagtctgaa 480 ggaatccggc tttataaagg cggggaggaa ttcagggctg attgcagrgc ggacacgagt 540 atcaattcga actttgacct gcttgtcgtg acagtgaagc agcatcagct tcaatctgtt 600 ttttcgtcgc ttgaacgaat cgggaagacg aatatattat ttttgcaaaa cggcatgggg 660 catatccacg acctaaaaga ctggcacgtt ggccattcca tttatgttgg aatcgttgag 720

• · ·«·· ♦

cacggagctg taagaaaatc ggatacagct gttgatcata caggcctagg tgcgataaaa 780 tggagcgcgt tcgacgatgc tgaaccagac cggctgaaca tcttgtttca gcataaccat 840 tcggattttc cgatttatta tgagacggat tggtaccgtc tgctgacggg caagctgatt 900 gtaaatgcgt gtattaatcc tttaactgcg ttattgcaag tgaaaaatgg agaactgctg 960 acaacgccag cttatctggc ttttatgaag ctggtatttc aggaggcatg ccgcatttta 1020 aaacttgaaa atgaagaaaa ggcttgggag cgggttcagg ccgtttgtgg gcaaacgaaa 1080 gagaatcgtt catcaatgct ggttgacgtc attggaggcc ggcagacgga agctgacgcc 1140 attatcggat acttattgaa ggaagcaagt cttcaaggtc ttgatgccgt ccacctagag 1200 tttttatatg gcagcatcaa agcattggag cgaaatacca acaaagtggt ttactaagga 1260 tcctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga 1320 agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc 1380 atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg 1440 agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 1500 tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc 1560 ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac 1620 tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca 1680 aactcttggt accgagacga tcgtcctctt tgttgtagcc catcactttt gctgaagagt 1740 aggagccgaa agtgacggcg tattcattga gcggcagctg agtcgcaccg acagaaatcg 1800 cttctcttga tgtgcccggc gatccgactg tccagccgtt cggtccgctg ttgccgtttg 1860 aggtaacagc gacaacgcct tctgacatgg cccagtcaag cgctgtgctt gtcgcccagt 1920 ccgggttgtt taaagagttt ccgagagaca ggttcatcac atctgccccg tcctgcactg 1980 cacgttccac gcccgcgatg acgttttccg ttgtgccgct tccgccaggc cctaacacac 2040 gataagcaag aagtgtggca tcaggcgcta cgcctttaat cgttccgttt gcagccacag 2100 ttccggctac gtgtgtgcca tggtcagttg cctcgcccct cggatcgccg gttggtgttt 2160 cttttggatc gtaatcattg tccacaaaat cgtatccttt atattgtcca aagtttttct 2220 tcagatctgg gtgattgtat tcaaccccag tgtcaataat cgccaccttg atgccttttc 2280 ctgtgtagcc taaatcccat gcatcgtttg ctccgatata aggcgcactg tcatccattt 2340 gcggagatac ggcgtcttcg gagattgtgg ggaattctca tgtttgacag cttatcatgc 2400 aatagttacc cttattatca agataagaaa gaaaaggatt tttcgctacg ctcaaatcct 2460 ttaaaaaaac -acaaaagacc acatttttta atgtggtctt tattcttcaa ctaaagcacc 2520 cattagttca acaaacgaaa attggataaa gtgggatatt tttaaaatat atatttatgt 2580 tacagtaata ttgactttta aaaaaggatt gattctaatg aagaaagcag acaagtaagc 2640 ctcctaaatt cactttagat aaaaatttag gaggcatatc aaatgaactt taataaaatt 2700 gatttagaca attggaagag aaaagagata tttaatcatt atttgaacca acaaacgact 2760 tttagtataa ccacagaaat tgatattagt gttttatacc gaaacataaa acaagaagga 2820 tataaatttt accctgcatt tattttctta gtgacaaggg tgataaactc aaatacagct 2880 tttagaactg gttacaatag cgacggagag ttaggttatt gggataagtt agagccactt 2940 tatacaattt ttgatggtgt atctaaaaca ttctctggta tttggactcc tgtaaagaat 3000 gacttcaaag agrtttatga tttatacctt tctgatgtag agaaatataa tggttcgggg 3060 aaattgtttc ccaaaacacc tatacctgaa aatgcttttt ctctttctat tattccatgg 3120 acttcattta ctgggtttaa cttaaatatc aataataata gtaattacct tctacccatt 3180 attacagcag gaaaattcat. taataaaggt aattcaatat atttaccgct atccttacag 3240 gtacatcatt ctgtttgtga tggttatcat gcaggattgt ttatgaactc tattcaggaa 3300 ttgtcagata ggcctaatga ctggctttta taatatgaga taatgccgac tgtacttttt 3360 acagtcggtt ttctaatgtc actaacctgc cccgttagtt gaagaacgaa gcggccgcaa 3420 ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 3480 aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 3540 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 3600 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 3660 tccctttttt gcggcacttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 3720 aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 3780 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 3840 agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 3900 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 3960 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 4020 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 4080 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 4140 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacsacgt tgcgcaaacc 4200 attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 4260 ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 4320 ·· ♦· , ·. ♦ • .

·«·♦ • ·· taaatctgga taagccctcc aaatagacag agtttactca ggtgaagatc ctgagcgtca cgtaatctgc tcaagagcta tactgtcctt· tacatacctc tcttaccggg ggggggttcg acagcgtgag ggtaagcggc gtatctttat ctcgtcaggg ggccttttgc taaccgtatt cágcgagtca tctgtgcggt atagttaagc cacccgccaa agacaagctg aaacgcgcga tctgcctgtt ctgataaagc gtaaggggga cgatacgggt tggcggtatg ttaatacaga acataatggt agaccattca gctcgcgtat tcctcaacga tgcgccgcgt tttgcgcatt cgttagcgag acgcaacgcg ccatgtgctc taggctggta cctggacagc aatggggaag gccggtgagc cgtatcgtag atcgctgaga tatatacttt ctttttgata gaccccgtag tgcttgcaaa ccaactcttt ctagtgtagc gctctgctaa ttggactcaa tgcacacagc ctatgagaaa agggtcggaa agtcctgtcg gggcggagcc tggccttttg accgcctttg gtgagcgagg atttcacacc cagtatacac cacccgctga tgaccgtctc ggcagctgcg catccgcgtc gggccatgtt atttctgttc tactgatgat gatgcggcgg tgtaggtgtt gcagggcgct tgttgttgct cggtgattca caggagcacg gcggctgctg cacagttctc gtgccgccgg gggaggcaga gccgaggcgg agagccgcga atggcctgca gccatccagc gtgggtctcg ttatctacac taggtgcctc agattgattt atctcatgac aaaagatcaa caaaaaaacc ttccgaaggt cgtagttagg tcctgttacc gacgatagtt ccagcttgga gcgccacgct.

caggagagcg ggtttcgcca tatggaaaaa ctcacatgtt agtgagctga aagcggaaga gcatatggtg tccgctatcg cgcgccctga cgggagctgc gtaaagctca cagctcgttg aagggcggtt atgggggtaa gaacatgccc gaccagagaa ccacagggta gacttccgcg caggtcgcag ttctgctaac atcatgcgca gagatggcgg cgcaagaatt cttccattca caaggtatag cataaatcgc gcgatccttg acgcgggcat ctcgcg cggtatcatt gacggggagt actgattaag aaaacttcat caaaatccct aggatcttct accgctacca aactggcttc ccaccacttc agtggctgct accggataag gcgaacgacc tcccgaaggg cacgagggag cctctgactt cgccagcaac ctttcctgcg taccgctcgc gcgcctgatg cactctcagt ctacgtgact cgggcttgtc atgtgtcaga tcagcgtggt agtttctcca ttttcctgtt tgataccgat ggttactgga aaatcactca gccagcagca tttccagact acgttttgca cagtaaggca cccgtggcca acgcgatgga gattggctcc ggtcgaggtg ggcggcgcct cgtgacgatc aagctgtccc cccgatgccg gcagcactgg caggcaacta cattggtaac ttttaattta taacgtgagt tgagatcctt gcggtggttt agcagagcgc aagaactctg gccagtggcg gcgcagcggt tacaccgaac agaaaggcgg cttccagggg gagcgtcgat gcggcctttt ttatcccctg cgcagccgaa cggtattttc acaatctgct gggtcatggc tgctcccggc ggttttcacc cgtgaagcga gaagcgttaa tggtcacttg gaaacgagag acgttgtgag gggtcaatgc tcct.gcgatg ttacgaaaca gcagcagtcg accccgccag ggacccaacg tatgttctgc aattcttgga gcccggctcc acaatccatg agcggtccag tgatggtcgt ccggaagcga ggccagatgg tggatgaacg tgtcagacca aaaggatcta tttcgttcca tttttctgcg gtttgccgga agataccaaa tagcaccgcc ataagtcgtg cgggctgaac tgagatacct acaggtatcc gaaacgcctg ttttgtgatg tacggttcct attctgtgga cgaccgagcg tccttacgca ctgatgccgc tgcgccccga atccgcttac gtcatcaccg ttcacagatg tgtctggctt atgcctccgt aggatgctca ggtaaacaac cagcgcttcg cagatccgga cggaaaccga cttcacgttc cctagccggg ctgcccgaga caagggttgg gtggtgaatc atgcaccgcg ccaacccgtc tgatcgaagt catctacctg gaagaatcat

4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 654 0 6600 6660 6720 6780 6806 <210> 24 <211> 3867 <212> DNA ^<213> Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: vektor <400> 24 aagctttctc gtcgctagat ctcgaaaaaa ttcacgccgg atcgatggcg gctttcactg atggaagctg

3čiélCJ<3C<5ciCéi aagaagcgaa tcagcgccaa tcacgctgga aacgggaaat taaaggtgct gccgaaatga acagcggaac acaaatattt

120

180

240

300

360

420

480 caaaaaaaaa tgcgtctaaa tgatattaaa cggaaatgat tgacaatgtc acttgctgtt gtttaaatgg cgaaggcagt gaagagcaga tctaagcagg ccgtcttccc gttcttcgcg agctttatta actacgctgt ggtgttacca gatctgaacc ttaaacagct ctacatcaag gccgctatcc tggaaggctt tgaatcgaga ttaaaatcat catctcaagc ttgtagactg tcaagagttt aaagaaactt ttatgttaac aacaaaaaca acataaaatt ttccggggaa gtattttcca gcttcgccaa • · ««·* tattctccgc tctggagaag atgctgtcga catttagacc atgctgttta attacaccta gatgtgcaga ttttttgata gtggagtagg tcgtgcgcca aagggaatgt tcgttatcat ttatccatca tatttgcggc tagacaacaa ggaacggcga ctgaagtcat atcaagataa gaccacattt gaaaattgga tttaaaaaag agataaaaat agagaaaaga aaattgatat catttatttt atagcgacgg gtgtatctaa atgatttata cacctatacc ttaacttaaa tcattaataa gtgatggtta atgactggct tgtcactaac gggatcacta aaaacgttta

t.gaagcagaa aatttccgtt tatccttaga caaactcttc tcgccaaatg gtgatatagg ctgtttccac ggccattttc ttgtgcttga tcggcatatt catgcttcct cgtaatgtct acgcctgaac ggtggatcgc ccgcacctac atgctttgcc agtctgggtt tgccttttgc ttaatttggc atgcgtgttt catactggcc ·· ♦ · ··..··. «·····*· ·····.·

V·? 9 9 9 9 9 · ·

9· 9 9 9

99 9· ·· ·· ♦· acgaccaaag tgagagcttt ttacgcggtt tcttaggacg catgctgttc 540 aagtccacaa aaaagcaaat gtactttccg ggggagaaaa ggtccgctgt 600 aagcgatgct ttctggcgcc aatattttaa ttttggatga gccgaccaac 660 tagagtccat tacagcgctc aataacggct taatcagctt taaaggcgct 720 cttcccatga ccatcagttt gtgcagacca ttgccaacag aattatagaa 780 acggcatcgt cgataagcaa atgagctatg acgagttcct tgaaaatgct 840 aaaaattgac tgaactatac gccgaataaa aaagcagaga tttctctgct 900 cctaaatgtg aaaggagatc acaacatgaa atttttggtt gtcggagcag 960 cgggtatatt ggcggacggc tttcggagaa aggaaatgat gtgacatttc 1020 aaaacgagct gagcagctta aaaaaaccgg gcttgtcatc catagtgaaa 1080 atcatttcag cccgaactaa tcagtgccgg agaaacaggg caatttgatg 1140 tgcttctaaa gcatactcgc ttggtcaagt gatagaggat gtcaaaccat 1200 agaatctgtc attatccctt ttttaaatgg gtaccgccac tatgagcagc 1260 attttcaaaa gaacaggtgc tgggcggcct gtgttttata gaaagtgctt 1320 aggagaaatt catcataoga gcgcatcgca tcgttttgta tttggagaat 1380 gcgtacggag cggataagag cgcttgaaga ggcattttca ggtgtgaagg 1440 cattagcggg catatcgaga agatcccctg cagcaatagt tacccttatt 1500 gaaagaaaag gatttttcgc tacgctcaaa tcctttaaaa aaacacaaaa 1560 tttaatgtgg tctttattct tcaactaaag cacccattag ttcaacaaac 1620 taaagtggga tatttttaaa atatatattt atgttacagt aatattgact 1680 gattgattct aatgaagaaa gcagacaagt aagcctccta aattcacttt 1740 ttaggaggca tatcaaatga acttťaataa aattgattta gacaattgga 1800 gatatttaat cattatttga accaacaaac gacttttagt ataaccacag 1860 tagtgtttta taccgaaaca taaaacaaga aggatataaa ttttaccctg 1920 cttagtgaca agggtgataa actcaaatac agcttttaga actggttaca 1980 agagttaggt tattgggata agttagagcc actttat.aca atttttgatg 2040 aacattctct ggtatttgga ctcctgtaaa gaatgacttc aaagagtttt 2100 cctttctgat gtagagaaat ataatggttc ggggaaattg tttcccaaaa 2160 tgaaaatgct ttttctcttt ctattattcc atggacttca tttactgggt 2220 tatcaataat aatagtaatt accttctacc cattattaca gcaggaaaat 2280 aggtaattca atatatttac cgctatcttt acaggtacat cattctgttt 2340 tcatgcagga ttgtttatga actctattca ggaattgtca gataggccta 2400 tttataatat gagataatgc cgactgtact ttttacagtc ggttttctaa 2460 ctgccccgtt agttgaagaa ggtttttata ttacagctcc cgggagatct 2520 gtccaaacga cagaaggcga ccacctgcat ggatttttga ttgaaaaagc 2580 tctctcgctg caccagtatt aaaaaccgtt tatgcgaatc tgcaaatgta 2640 aaataaaaaa aggaggcgga aaagcctcct tttatttact taaaaagccc 2700 tctgaagata ggctctcttt tcccgtctgc cgtaattccg tcaatattca 2760 accgatcata aagtccacgt gtgtaatgct ttcatttagg ccttctttga 2820 acgagacatc tgctttccgc cttcaatatt aaaggcatag gcgcttccga 2880 atttgacgcg ttttcatcaa acagcgtgtt atagaaaaga atgtttgatt 2940 cgaatcgtaa ggaacaagtg ccacttcacc taaatagtga gaaccttcat 3000 cagttctttt aaaatatcct cacctttttc agctttaatg tcgactatac 3060 aaacgtcagg gtgaaatttt caataatatt tccgccgtag cttaatggtt 3120 taccactccg tcaaccccgt ctttttgcgg cagcgtgaac acttcttctg 3180 ggccataaac tcatggccac tttcattcac gcttcccgca cctgcccaaa 3240 aggcagctta attgttagat cagttccttc tgcttgataa tgtaaggcag 3300 ctcgttcaaa tggtcaactt tttcatgaag attttggtca tgattgatcc 3360 cgggttgtct tcatttacgc gcgtcgcttt aaaaatttct tcccacagaa 3420 ttcctcctct gatttgccag gaaacacctt gtgagcccag cctgctgatg 3480 gacagcccag ctgactttgt ctgattgaat atattgtctg tatgtatgta 3540 tgctgctttt tggaatgccg caatccgttt ggaatctata ccttttagca 3600 cgacgacaca acagaaatga aagcagctcc atttttggca agctcttctc 3660 ttcccattca ggatattctt caaatgcttc aaacggcgca agttcgtatt 3720 gacttcgtca tcctgccaat tcacggtgac gttttttgcg cccttttcat 3780 tacaattaaa cggacaaaat cccgaacgtc tgttgaagca tttacgacta 3840 tttttggaca ttaacgc 3867

90* • · ···· *« ···· <210> 25 <211> 8704 <212> DNA ^<213> Artificiální sekvence <220> .

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: vektor <220>

<223> pAN238 <400 25 gcggccgctt cgtcgaccga aacagcagtt ataaggcatg aagctgtccg gtttttgcaa 60 aagtggctgt gactgtaaaa agaaatcgaa aaagaccgtt ttgtgtgaaa acggtctttt 120 tgtttccttt taaccaactg ccataactcg aggcctacct agcttccaag aaagatatcc 180 taacagcaca agagcggaaa gatgttttgt tctacatcca gaacaacctc tgctaaaatt 240 cctgaaaaat tttgcaaaaa gttgttgact ttatctacaa ggtgtggtat aataatctta 300 acaacagcag gacgctctag aggaggagac taacatgaaa tttttggttg· tcggagcagg 360 tggagtaggc gggtatattg gcggacggct ttcggagaaa ggaaatgatg tgacatttct 420 cgtgcgccaa aaacgagctg agcagcttaa aaaaaccggg cttgtcatcc atagtgaaaa 480 agggaatgta tcatttcagc ccgaactaat cagtgccgga gaaacagggc aatttgatgt 540 cgttatcatt gcttctaaag catactcgct tggtcaagtg atagaggatg tcaaaccatt 600 tatccatcaa gaatctgtca ttatcccttt tttaaatggg taccgccact atgagcagct 660 atttgcggca ttttcaaaag aacaggtgct gggcggcctg tgttttatag aaagtgcttt 720 agacaacaaa ggagaaattc atcatacgag cgcatcgcat cgttttgtat ttggagaatg 780 gaacggcgag cgtacggagc ggataagagc gcttgaagag gcattttcag gtgtgaaggc 840 tgaagtcatc attagcgggc atatcgagaa ggacatttgg aaaaagtatc tctttattgc 900 agcgcaagcg gggatcacaa cgttatttca acgaccgctt ggcccaatcc tcgccacaga 960 agccggacgt cacacggccc aaactcttat tggggaaatt tgcactgttt tacgaaaaga 1020 aggtgttccg gctgatccgg ctcttgagga agagagcttt cgtacgatga ccagcatgtc 1080 ttaccatatg aagtcctcca tgcttcggga tatggaaaac ggccaaacga cagaaggcga 1140 ccacctgcat ggatttttga ttgaaaaagc aaaacgttta tctctcgctg caccagtatt 1200 agaaaccgtt tatgcgaatc tgcaaatgta tgaagcaaaa aaataaaaaa aggaggcgga 1260 aaagcctcct tttatttact taaaaagccc aatttccgtt tctgaagata ggctctcttt 1320 tcccgtctgc cgggatcctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt 1380 aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg 1.440 gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg 1500 gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 1560 gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac 1620 aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttac gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg 1680 acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cagatggcct 1740 ttttgcgttt ctacaaactc ttggtaccca gaaaaagcgg caaaagcggc tgttaaaaaa 1800 gcgaaatcga agaagctgtc tgccgctaag acggaatatc aaaagcgttc tgctgttgtg 1860 tcatctttaa aagtcacagc cgatgaatcc cagcaagatg tcctaaaata cttgaacacc 1920 cagaaagata aaggaaatgc agaccaaatt cattcttatt atgtggtgaa cgggattgct 1980 gttcatgcct caaaagaggt tatggaaaaa gtggtgcagt ttcccgaagt ggaaaaggtg 2040 cttcctaatg agaaacggca gctttttaag tcatcctccc catttaatat gaaaaaagca 2100 cagaaagcta ttaaagcaac tgacggtgtg gaatggaatg tagaccaaat cgatgcccca 2160 aaagcttggg cacttggata tgatggaa.ct ggcacggttg ttgcgtccat tgataccggg 2220 gtggaatgga atcatccggc attaaaagag aaatatcgcg gatataatcc ggaaaatcct 2280 aatgagcctg aaaatgaaat gaactggtat gatgccgtag caggcgaggc aagcccttat 2340 gatgatttgg ctcatggaac ccacgtgaca ggcacgatgg tgggctctga acctgatgga 2400 acaaatcaaa tcggtgtagc acctggcgca aaatggattg ctgttaaagc gttctctgaa 2460 gatggcggca ctgatgctga cattttggaa gctggtgaat gggttttagc accaaaggac 2520 gcggaaggaa atccccaccc ggaaatggct cctgatgttg tcaataactc atggggaggg 2580 ggctctggac ttgatgaatg gtacagagac atggtcaatg cctggcgttc ggccgatatt 2640 ttccctgagt tttcagcggg gaatacggat ctctttattc ccggcgggcc tggttctatc 2700 gcaaatccgg caaactatcc agaatcgttt gcaactggag c.gactgagaa ttccaattcc 2760 ccatggagag aaaagaaaat cgctaatgtt gattactttg aacttctgca tattcttgaa 2820 tttaaaaagg ctgaaagagt aaaagattgt gctgaaatat tagagtataa acaaaatcgt 2880 • · ···· • · ·· ·» • · · · ♦ · · • · · • · · • · ·· ·· gaaacaggcg tgcaactgga attaaacaaa gatggcgaag caatataaaa aataataaag tattttaaga gcaatgaaat tataaatcgg gattttatga ttacaccgta aaccttgatg gaagatggat gagtagttca tagtttatat tgaatgtaac tgccctcatt caaccaaatt tttgaacgtc ctgggtgaac atctgatcaa gtcggtaatt tcaaggggct tccaaaggaa aggagtcggt actcattcct agtaaggata attttttatg attcctgata agggaaaaat agcagggttt cgaaatcgga tggtgggata tctttctgtt aattataatc tgtttcaagt cagcttttta acttgatcaa gttattactt acattctcaa gatccttttt atacgcctat acttttcggg atgtatccgc agtatgagta cctgtttttg gcacgagtgg cccgaagaac tcccgtattg ttggttgagt ttatgcagtg atcggaggac cttgatcgtt atgcctgcag gcttcccggc cgctcggccc tctcgeggta tacacgacgg gcctcactga gatt taaaac aaagaaagtt ggagagcaat agccaacagt aattaaataa aaattaataa ataattctta atacagaaaa tagactatga atatacaatc ccgatgatga aaaggttaat acacagaaga tttctattat acaaacgggc gtggtaaaat agggttcaat attggagggt ttaatttggc tcattacctg acagccttta ttaggcatca gggtttgttg ggtgcagctg aataggggta ccagcgattg atgataacaa aaaggtcatt ttgtttacaa tttgtaaaac atacctttta gtctctatgg agtgtaatta cttgttgata agctttttaa gtatttgttt agcttgaaac tcagagggaa aggttgttac ttttcaggaa agggatttct ttataacagt ttttataggt gaaatgtgcg tcatgagaca ttcaacattt ctcacccaga gttacatcga gttttccaat acgccgggca actcaccagt ctgccataac cgaaggagct gggaaccgga caatggcaac aacaattaat ttccggctgg tcattgcagc ggagtcaggc ttaagcattg ttcattttta gtatcgagtg tggttttgta aatccaggct ttgtccaatg 2940 gaaacatggc attcagtcac aaaaggttgt tgctgaagtt 3000 tcgttggttg tttctcacat taacagttaa aaatgtttat 3060 gagtttgtca gatatggctc aaggatttcg ccgaatgatg 3120 aaatcttgtt ggttttatgc gtgcaacgga agtgacaata 3180 taatcagcac atgcatgtat tggtatgtgt ggaaccaact 3240 ctacgtgaat caaaaacaat ggattcaatt ttggaaaaag 3300 tccaaatgta aaagttcaaa tgattcgacc gaaaaataaa 3360 ggcaattgac gaaactgcaa aatatcctgt aaaggatacg 3420 agaaaagaat ttgaaacgtt tgtctgattt ggaggaaggt 3480 ctcctatggt ggtttgttaa aagaaataca taáaaaatta 3540 aggcgatttg attcatacag atgatgacga aaaagccgat 3600 tgcaatgtgg aattgggaac ggaaaaatta ttttattaaa 3660 catattgttg tataagtgat gaaatactga atttaaaact 3720 gttttaatca agtttaggag gaattaatta tgaagtgtaa 3780 taaaagaggg aagcgtatca ttaaccctat aaactacgtc 3840 gaaatgtgaa tacatcctat tcacaatcga atttacgaca 3900 tttgcatttt atcttttttt agcgtattaa atgaaatggt 3960 atattgcaaa tgattttaat aaaccacctg cgagtacaaa 4020 tgttaacctt ttccattgga acagctgtat atggaaagct 4080 aaaggttact cctatttgga attataataa attgtttcgg 4140 gccattcttt cttttcctta cttattatgg ctcgttttat 4200 catttccagc actcgtaatg gttgtagttg cgcgctatat 4260 aagcatttgg tcttattgga tcgatagtag ccatgggaga 4320 gtggaatgat agcccattat attcattggt cctatcttct 4380 ttatcactgt tccgtttctt atgaaattat taaagaaaga 4440 ttgatatcaa aggaattata ctaatgtctg taggcattgt 4500 catcatatag catttctttt cttatcgtta gcgtgctgtc 4560 atatcaggaa agtaacagat ccttttgttg atcccggatt 4620 tgattggagt tctttgtggg ggaattatat ttggaacagt 4680 ttccttatat gatgaaagat gttcaccagc taagtactgc 4740 ttttccctgg aacaatgagt gtcattattt tcggctacat 4800 gaagaggtcc tttatacgtg ttaaacatcg gagttacatt 4860 ctgcttcctt tcttttagaa acaacatcat ggttcatgac 4920 taggtgggct ttcgttcacc aaaacagtta tatcaacaat 4980 agcaggaagc tggtgc.tgga atgagtttgc ttaactttac 5040 caggtattgc aattgtaggt ggtttattat ccataccctt 5100 ctatggaagt tgatcagtca acttatctgt atagtaattt 5160 tcattgtcat tagttggctg gttaccttga atgtatataa 5220 aaatcgttaa gggatcaact ttgggagaga gttcaaaatt 5280 tcgaagcggc cgcaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg 5340 taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 5400 cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 5460 ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 5520 ccgtgtcgcc cttattcccr tttttgcggc attttgcctt 5580 aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 5640 actggatctc aacagcggta agatccttaa gagttttcgc 5700 gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 5760 agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 5820 cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 5880 catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 5940 aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 6000 gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 6060 aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 6120 agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 6180 ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 6240 actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 6300 aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 6360 gtaactatca gaccaagttt actcatatat actttagatt 6420 atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 6430

4 ····

4 4 4 4 · ·

4444 · · ·

4 4 4 4 4 ·

4444 44 4444 atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 6540 atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 6600 aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 6660 aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 6720 ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 6780 ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 6840 tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 6900 ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 6960 acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 7020 gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 7080 cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 7140 aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 7200 atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 7260 gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 7320 gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 7380 tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc 7440 tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 7500 cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 7560 gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag ctgcggtaaa 7620 gctcatcagc gtggtcgtga agcgattcac agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct 7680 cgttgagttt ctccagaagc gttaatgtct ggcttctgat aaagcgggcc atgttaaggg 7740 cggttttttc ctgtttggtc acttgatgcc tccgtgtaag ggggaatttc tgttcatggg 7800 ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca 7860 tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca 7920 gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca 7980 gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt 8040 ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt 8100 cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg 8160 ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat 8220 gcgcacccgt ggccaggacc caacgctgcc cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat 8280 ggcggacgcg atggatatgt tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa 8340 gaattgattg gctccaattc ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc 8400 attcaggtcg aggtggcccg gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg 8460 tatagggcgg cgcctacaat ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa 8520 atcgccgtga cgatcagcgg tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat 8580 ccttgaagct gtccctgatg gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg 8640 ggcatcccga tgccgccgga agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc 8700 gtcg 8704 <210> 26 <211> 6688 <212> DNA <213> Artificiální sekvence ^: <220>

<223> Popis artificiální sekvence: vektor <220>

<223> pAN336 <400> 26 tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 60 tcggtqcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 120 ttaagctggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 180 ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgcacc aggcttctca 240 ggcgctgact tagaaaacct cctgaatgaa gctgcgcttg tagcggctcg tcaaaacaag 300 aaaaaaatcg atgcgcgtga tattgacgaa gcgacgaacc gtgtaattgc cggacccgct 360 aagaagagcc gcgttatctc caagaaagaa cgcaatatcg tggcttatca cgaaggcgga 420 cacaccgtta tcggtctcgt tttagatgag gcagatatgg ttcataaagt aacgattgct 480 ·· ···· • · ·« cctcggggcc acaaagccgg attatcttcg gcaagacgaa cagtctcagg gatcaaatcg cgtgcgaaac ctgaaagttg cctgagcgta aaaacagaag ccggctgacg atccaattct atgtttgtaa ttatcgatgt aaataccgca gaggtatgaa aagctaccaa caatactgat gggggcaagg acttgcatgg ataattgtgg actttgaaaa agttcgtctt gaaataataa ccgctgcgta aaatgaaaac ggaacgggaa gcactttgaa ttgctcggaa gtgcatcagg cagccgctta aaactgggaa ggaaaagccc tgtgaaagat gtggtatgac tgtcgagcta tattttactg aagcttttta tttatatctt tcgccattcg caggcaaaac aatcagattg atgaaagaaa acttgcgtat ggggcagaga agcttcactt gggcggaggt ctatgtctct acgtgcggtt cttcacagga tgtgtcatct taccattctt aatcacaaaa agggctgaca aacgatgcct aggactaggc atgccatttt ccaaactacc gttcgaaatc 3 C C í S aad O aggctggcgg agctgcttga gtgaagtcag tggttacaga gcggtcaggt cttacgaaat aaatcctgac aaacgcttga atttctcaga aaaagaaaga ctggcagttt ggtatcgatt aaagtaaagt ggggaacacc tcaggcgata aacgagaatt gacgaagagg aagataatat cataggcagc actaatgctt tttcaaaatc agctgttttc gttataatta atggctaaaa aaagatacgg ctatatttaa aaggacatga cggcatgatg gagtatgaag ctctttcact gccgaattgg gaagacactc gaagaggaac ggcaaagtaa attgccttct ttttttgact gatgaattgt gacatctaat ttctaaaagt ccattcaggc aggacccaag tatagacatc ccgcgtagga gacggaaaag cgccatggta atgctcggcg ccgatcggag aacccgcaag ggaacaaacg caagtagaaa gagcaggttc gcggcagggg attgaacagc ccagaagaaa gtcagattcc aaaaaagaaa tgtaatgaaa cgctaagctc aagaacaatc cttggcgtaa ttatgctgtt taaaattgtc cacaggggcg attcggtatg attcttaggc tgatcaggaa tgaaaatcgt cgctgaacaa tgatgaaaag cgatacgaaa tttratgtaa tgtttacaaa agagaaacta ctgcagctcg aacccagcga ggacctttac atgaagagga atcttttata gcgcttatca gaaacccagg ggctccgtcg tggtatttaa gcttcttggg tgagaatatc aaggaatgtc aaatgacgga tgctatggct gctggagcaa atgaacaaag ccatcgacat attacttact catttaaaga ttgtcttttc gtggctttat gcgtccggtc tactggggat tttagtacct cttttctgaa tcgctagata tgcgcaactg gtcattgcga gttgatccat agtgtatagg ttcgggctta cgtggccgac ctatgctgaa ctattgtagc ttcattttga gaacgttaag tcgtttcagg cttcatcagt gctttattat gtctatctca ttttagaaga attgcccttg ttcaagatat agtacttatΰ tttagcgggt tggacgcgtt tcatggtcat atgctgccaa gagaagaccg ttatttccaa 540 ggcctcttgg gcggacgtgt tgctgaagag 600 cacaatgact tccagcgtgc gacgaatatt 660 tcagaaaaac tgggaccgtt gcaatttgga 720 cgtgatttca acaacgaaca gaactacagt 780 attcagcgca tcatcaaaga atgttatgag 840 gacaagcttg aattgattgc ccaaacgctt 900 atcaaacacc ttatcgatca tggaacatta 960 aacgatgatg tgaaagtaaa cattctgaca 1020 gagtaattcg ctttctttct aaaaaaactg 1080 atgattggct cagctgcggc ttttacaatc 1140 tgagccgctg atcgtgtatg gtattgtaga 1200 ttcaaaagtg gtgatagagg ttgttactgg 1260 agtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 1320 accatttgag gtgataggta agattatacc 1380 agaattactc tatgaagcgc catatttaaa 1440 tgaggaggca gattgccttg aatatattga 1500 tagaagatat cgccgtatgt aaggatttca 1560 atatatctat agaatgggca aagcataaaa 1620 acaataacct tatagcttgt aaattctatc 1680 atactatgtt atacgccaac tttcaaaaca 1740 ggttttagaa tgcaaggaac agtgaattgg 1800 gtatctttaa atactgtaga aaagaggaag 1860 accggaattg aaaaaactga tcgaaaaata 1920 tcctgctaag gtatataagc tggtgggaga 1980 cagccggtat aaagggacca cctatgatgt 2040 ggaaggaaag ctgcctgttc caaaggtcct 2100 tctgctcatg agtgaggccg atggcgtcct 2160 ccctgaaaag attatcgagc tgtatgcgga 2220 atcggattgt ccctatacga atagcttaga 2280 gaataacgat ctggccgatg tggattgcga 2340 tccgcgcgag ctgtatgatt ttttaaagac 2400 ccacggcgac ctgggagaca gcaacatctt 2460 tgatcttggg agaagcggca gggcggacaa 2520 gatcagggag gatatcgggg aagaacagta 2580 caagcctgat tgggagaaaa taaaatatta 2640 agatttagat gtctaaaaag ctttaactac 2700 gtacatccgc aactgtccat actctgatgt 2760 ggggtcccga gcgcctacga ggaatttgta 2820 ttgggaaggg cgaccggtgc ggtcgactgg 2880 caggaggcct ggcgccgctc attgcgaacg 2940 tcttaaccct aaaagggctg gaattgattt 3000 aggtttagta atggattatt tagtaaaagc 3060 tgcagcgaga acgactgata tggtaaatga 3120 agcatccgct gcactagacc gtacaatgac 3180 gggcgatgat aagctgaccg tgaaaatcga 3240 tgatgccaat gccaaaggag aagtcagagc 3300 tttaaatgaa caaggtaagc ttgatgtcag 3360 tgtcgtaaaa gatttaggtt tgcgcgagtt 3420 agaattagga gatgatttta cttactatct 3480 gggcgtaggt gtgctcgtaa atcctgacaa 3540 tcagctgatg ccgggaacag atgatgaaac 3600 agtagagccg atttctaagc tcatccaaaa 3660 agtcctaggc aagaaacctg agattttgga 3720 ttcaaaagaa cggttcgaaa cagccatttt 3780 gatagaagaa gatggacaag ccgaagcagt 3840 tacaaaagaa cagctggaag ggcttcgtga 3900 ttttaatttg agaaaagggg ctgaaagcag 3960 ggatgcatag cttgagtatt ctatagtgtc 4020 agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 4080 • * · • · · ««

94ί tcacaattcc acacaacata cgagccggáa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 4140 gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 4200 tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 4260 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 4320 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 4380 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 4440 tggcgttttt cgataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 4500 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 4560 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 4620 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 4680 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 4740 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 4800 ccactggtaa caggattagc ag-agcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 4860 ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 4920 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 4980 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 5040 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 5100 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 5160 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 5220 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 5280 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 5340 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 5400 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 5460 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttggcattg 5520 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 5580 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 5640 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 5700 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 5760 actcaaccaa gtcattctga gaataccgcg cccggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 5820 caatacggga taatagtgta tgacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 5880 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 5940 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 6000 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 6060 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 6120 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 6180 cccgaaaagt gccacctgta tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 6240 ccgcatcagg cgaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatatttatt 6300 aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcgccaa aatcccttat aaatcaaaag 6360 aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 6420 acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 6480 aaccatcacc caaatcaagt tttttgcggt cgaggtgccg taaagctcta aatcggaacc 6540 ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 6600 aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagcgtagcg gtcacgctgc 6660 gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaa 6688 <210> 21 <211> 8803 <212> DNA < ²¹3 > Artificiální sekvence <220>

< 2 2 3 > Popis artificiální sekvence: vektor.

<220>

<223> pAN294 <400> 27 tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca tt caggctgc gcaactgttg qgaagqgcga 60 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcaaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 120 ttaagrtggg taacgccagg gtítccccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 130 «· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· • · · · • · · ·* · • · · • · · · • · ·· ·· • · « ·· * ttgtaatacg gatgaccgct tttaacgatg gtcatattgg catatagcgg gcatacttat ttgatagaaa ctggatgtcg gtactgatta gacatgaaag cttccgcaaa aaaatcgcca tcaaacgct t ggcccgattc gtcggccgct acgaaaaagc ctgtttccag aactgcctgt gattgttgaa cagaaactga ttaccccgtg tttgcacctt tctccgcttt tttcccggaa gcgaggggcg atgcttcagg tcccgctatt ggcgcggcac aaggatctcc gcggtgaacg gaacattctc cttgactgta ggagtcggcg gttcatgtgt ggacttcacg ggacttgccg ggctgttata gaagataaat tcgacagaag gtctggggaa ggtgctgatt tacaatcttt aacttaacct ggcatttgtc atctatctgt atgtcaagtc cagccaaaat cggcgcggat tcacgacaga gaaaaggatt aatcaggaaa aaggtgtgtt ttcagtcgcc ttgatttttc gttttcgcct aagacttgtc ggccgaattt agggagacgg t cgagcsata 35tcctít a a actcactata tttcaggtct tcagaaacgg gaaggaaata gaaaaaggat gcgcggctga tcaaaaggaa gccgcctaga acaatgcagg cgatgtttga tgcttgagca caccgaagtc tgcggatgga agacggactt ggatgcttga gggagatcaa ctcttgtaga ggtggagtgg tgtcagttca ttgatgcaga cagatgagtg acattgccga ttgaggtgca gatggctttt ggatttatga aaaccgatga cgattgctgt tcgggtttcg tccgccaaaa aagggagacg gtcagctgtt tgaatataaa gaggaccggg ttttcgcaga agaagatctc tagggaggcc cggtagagga acttagagcc agggaaggcg cgggaggaag tgctaaaaaa gtaagggttt acatacttta gattgctgta tgaagaagtg tgcggctgaa tccgtttatt cttgcagaag tggtttttta tcctgaaagc ggacagcgta cgaggttgta caccttggag gatttatgtg gcttcgggaa cgatcaggag a ta tg a a a a t gcataaggtc gttacccrta á333čiCdCácl gggcgaattg gtcagcagct caggtcacct ccgtatactt ttggataacc aggagcccat aataaccgag ggatatcgcc cttcggtata tgtgaatgtc aaaaaaggga tagcctgtat gctttcggga tttttccatt tcctgatgac tcttccgcgt aaagctggca cttgtttctc ttcagaagtc gcctgtattc ggcaaccaag ggtgtttcct gcatatgaag aaagtgcgac agtgttaaag ttaccgcatc cggttcgaca cgtgacagtg gggagtcact gcaggcggaa cttaggatat gccaagtctt cggtgtagca accaactcat cgtccaggat gtcaggattt caatacgctt ctctgctctt ctatgctcag catggttcca acgaaatgga caacctacag tatacacagc tctgaagaag gagacgatct cgcaataagc atcggcattg ctgctttcgc tttcctactg tatgatgtaa aaggccccgg gaacaggcgg gatgaccggg gatgcggagg acagcttttc gctgacgaga attttgccaa gaagaagtgt ttatcaagat ά ά 3 3 C C δ C S 7 ggcccgacgt ttttcctgct tgatgtgttg taaaacaatg ggcgcttcag gtcctgctgt gaatggagcg cgggtccgcg tttgaaacgg ttcggcctga catatcatca tccgcgacca accggcattt gctgataaag gtggcagctc ttaatgaatg ggacgcgcgc acggggcagt cttcatgctc tgggcaaatt atagcggaag gagacgaaag ggaaagctgg catgagcttc tatgctgaaa ttacaggaag ggaaatctag catatgtccg gttatggagt caagatccat gctgttgctg gagacgccct tttgggctga tcaccttgta atcggcctgg gtcggcaagc tatact. ttgc gctggcatgt aaatataaga aaagataaaa aaataagcag agagtcaggt acaatcggga aggcaaaagc atattccgct atgtcaatgt ccggcagtgt gtttgcctga ccgagctgaa aggcgctgct tgtattccca atattgtgat aaaacccgcg aaagccggat aaaatcctga tggcagcctc ctaaattcag tggtaaggag aagaaagaaa cgcatgctgg atgaaaagcc 240 gtatatgaaa aggaattgtt 300 gaggctgaag aagccatcac 360 aagaggtgaa atgggtgaaa 420 gagggcttgg agaaagaatc 480 cggctagacg cgaggatcgt 540 gacagtgtga gatttttcct 600 atcagatcgg ctcgattgat 660 ttttagactc tacattggat 720 tcgcctgtac aaaagcggtg 780 atatcgcctc tcaagcgggg 840 aacatgccgt gttaggttac 900 atgtgacaac agtcaacccg 960 gcggggacta cgccaaaaat 1020 aaattacagc tgcaattttt 1080 ccggcactaa gctgtatcag 1140 tcatgaaaaa ataatgatag 1200 ttttgatagt ggaagggaga 1260 tgcttaaaga tccgtttatt 1320 caggcaagaa agaggggcca 1380 cggaaaaaag aatgcagcgg 1440 gcgctaaagg aatcatcgag 1500 aagcggcata tcagcagcca 1560 cgatttcagg atcgattaaa 1620 atctcgcgct tcaagaagga 1680 agcggtttac cgggtttttc 1740 gtttaagcat cggcatcatc 1800 ccgatgctaa gcagtggaaa 1860 acgaaacaga ttacagtgaa 1920 tctgttattt tattgatgat 1980 caagccgatt aaaaacacag 2040 tgtttgtgta tctgccgtgc 2100 agcttttata cggagatgat 2160 tgctgttagg gctttattca 2220 ataatcagac ggctgctgac 2280 tgattgaacc gcttctgagc 2340 ttcatatgct ggctgtatct 2400 tcgggccggt tcagcttttt 2460 tggaacatgc cgtacatgtc 2520 tggctgcgta taaccgaatc 2580 acagtgaaaa ggttttccgt 2640 gtaaacagtg aaaaataaag 2700 gtcttggtcc ggttttgggg 2760 tgtggaagga ttgaatgatt 2820 tgttcgcttg cttcatttac 2880 ttttttgaag cacccacatt 2940 cgcagtcgga aaaagcacga 3000 ccgtccaaaa gtgagcctta 3060 aaagaaaaat atgatgtcaa 3120 cgaatttttg aatgacttaa 3180 tctaacctat gaccgcgagg 3240 tattgaaggc attaatgttc 3300 tatttttgtt tccgatttct 3360 tttcacttgg tatttagagc 3420

ttcatatttt	cataaattta	3480
gatttgggag	agtgtcaacc	3540
gtcagatctc	attttgcgta	3600
ggtacgaaat	gtgctgcagc	3660
aggacttttc	gctacgctca	3720
ggtccttatt	cttcaactaa	3760

·» ·· «

I · · « v » · · « » · · * · » » · · ·· ··», « • · ··«· ·

* »· ·· • · » » · • * β » · · ·· ··«· agcacccatt agttcaacaa acgaaaattg gataaagtgg gatattttta aaatatatat 3840 ttatgttaca gtaatattga cttttaaaaa aggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa 3900 gtaagcctcc taaattcact ttagataaaa atttaggagg catatcaaat gaactttaat 3960 aaaattgatt tagacaattg gaagagaaaa gagatattta atcattattt gaaccaacaa 4020 acgactttta gtataaccac agaaattgat attagtgttt tataccgaaa cataaaacaa 4080 gaaggatata aattttaccc tgcatttatt ttcttagtga caagggtgat aaactcaaat 4140 acagctttta gaactggtta caatagcgac ggagagttag gttattggga taagttagag 4200 ccactttata caatttttga tggtgtatct aaaacattct ctggtatttg gactcctgta 4260 aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta tacctttctg atgtagagaa atataatggt 4320 tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata cctgaaaatg ctttttctct ttctattatt 4380 ccatggactt catttactgg gtttaactta aatatcaata ataatagtaa ttaccttcta 4440 cccattatta cagcaggaaa attcattaat aaaggtaatt caatatattt accgctatct 4500 ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt tatcatgcag gattgtttat gaactctatt 4560 caggaattgt cagataggcc taatgactgg cttttataat atgagataat gccgactgta 4620 ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg ttagttgaag aaggttttta 4680 tattacagct gtcgactcgt gatcttcgga caggctgttc agctttttct caatgcgatc 4740 cagctgcgct tttcggtttt tcgcatactt gaagcctgta acagccgcaa· agacgacagc 4800 ggcaaatata ataaatacaa acagctgaaa catcacatca cctatattca tgttcttcac 4860 ctcatgtttg cgggagagat tcattctctt ccgtttttta tttaaagcgg cttttccaga 4920 cgggaacggt gttttgtggt ctccattttc atttgccgat aggcgaacgc taaaaatggc 4980 aggccgagca gggtaatgcc gctcaggaca gaaaaaatat aaatcggccg gccagcgcca 5040 aacaggtcta tacatatccc cccgacccaa gggccgatga cgtttccgag ctgtggaaaa 5100 ccgattgccc cgaaataagt gccttttaat cctggttttg caatctggtc tacatacaaa 5160 tccatcatag agaataaaag cacttcgccg attgtaaatg tgatgacaat catcacaatt 5220 gatggaacac cgtgtgatac ggtgaaaatg gccatgctga tgctaaccat cacattaccg 5280 agcatcagag aacaaagcgg cgaaa-accgt tttgcaaaat ggacaatggg aaattgcgtc 5340 gccaacacaa cgattgcgtt taatgtcagc atcagcccat acagcttcgt tccattgccg 5400 atcaaggggt tctgcgccat atactgaggg aatgtggaac tgaattatga gtagccgaag 5460 gtgcatagcg taatgccgac caaagcaatg gtaaaaagat aatccttttg cgtgaccata 5520 aacgcttccc gcacgctcat atttcgggac tgggctggtg ctgataagga tggatgtttt 5580 ttaaattgga gggcaagcac aattccgtat agtccgtaaa tgactgcagg caccaaaaag 5640 ggcgtagtcg attgcgatga gccgaaatat aggccaagca caggtccgaa gacaacgccg 5700 atattaatag ccgcatagcg taaattaaaa actagcagtc tcgttttttc ttctgtcata 5760 tcagacaaca aggcctttga agcgggctca aacagtgatt tgcaaagacc gtttaatgcg 5820 tttactacaa aaaacaccca gagattagat gctgccgcaa agcctgcaaa taccagcatc 5880 catccgaaaa tcgatacaag catcatgttt tttctgccga atttatctga gatatatccg 5940 ccgtaaaagc ttgcgaggat gccgactgat gagctcgcgg cgatgaccag ccctgcatag 6000 gaagctgatg cgccttggac ggctgtcaaa taaatcgcta aaaaaggaat gctcatcgat 6060 gttgccattc tgccgaaaat ggttccgatt ataattgtac gcgttggatg catagcttga 6120 gtattctata gtgtcaccta aatagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 6180 gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 6240 cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 6300 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 6360 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6420 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 6480 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6540 aaaaggccgc gttgctggcg tttttcgata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 66G0 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6660 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6720 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 6780 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6840 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6900 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 6960 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 7020 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 7080 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 7140 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 7200 actcacgtta aggga11ttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 7 2 60 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 7320 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctctctattr cgttcatcca 7380 • · ·

» • · • · • · *

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7440 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 7500 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7560 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7620 acgttgttgg cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt .atggcttcat 7680 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7740 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7800 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7860 ctgtgacťgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata ccgcgcccgg cgaccgagtt 7920 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata gtgtatgaca tagcagaact ttaaaagtgc 7980 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 8040 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 8100 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga atáágggcga 8160 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 8220 gttattgtct. catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8280 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 8340 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg 8400 cgttaaatat ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 8460 cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 8520 gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 8580 atggcccact acgtgaacca tcacccaaat caag.tttttt gcggtcgagg tgccgtaaag 8640 ctctaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 8700 acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 8760 tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taa 8803

Claims (55)

1. Způsobu pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se t í m/ že zahrnuje:

kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu za podmínek, při kterých je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.'

2. Způsob podle nároku lvyznačující se t í m, že uvedený mikroorganismus má deregulované alespoň dva panthotenátové biosyntetické enzymy.

í i

3. Způsob podle nároku lvyznačující 'se tím, že uvedený mikroorganismus má deregulované alespoň tři panthotenátové biosyntetické enzymy.

4. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus má deregulované alespoň čtyři panthotenátové biosyntetické enzymy.

5. Způsob podle nároku· 4vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus má deregulovanou ketopanthoát-hydroxymethyltransferasu, deregulovanou ketopanthoát-reduktasu, deregulovanou panthotenát-synthetasu a deregulovanou aspartát-a-dekarboxylasu.

6. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus má dále deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu.

7. Způsob podle nároku 6vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus má deregulované alespoň dva enzymy pro biosyntézu isoleucinu-valinu (ilv).

8. Způsob podle nároku 6vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus má deregulované alespoň tři enzymy pro biosyntézu isoleucinu-valinu (ilv).

9. Způsob podle nároku 8vyznačující se t í m, že uvedený mikroorganismus má deregulovanou kyselou synthetasu acetohydroxykyselin, deregulovanou izomeroreduktasu acetohydroxykyselin a deregulovanou dehydratasu dihydroxykyselin.

10. Způsob pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má aktivitu PanB regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.

11. Způsob pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má aktivitu PanEl regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.

12. Způsob pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že • * • · «

100 zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má aktivitu PanE2 regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.

13. Způsob pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má aktivitu IlvC regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.

14. Způsob pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má aktivitu PanB a PanEl regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.

15. Způsob pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má aktivitu PanB a PanE2 regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.

16. · Způsob pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že

101 • · • · • 4 4 4 4 4 · zahrnuje kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu a deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) biosyntetickou dráhu, kde uvedený mikroorganismus má aktivitu PanB a IlvC regulovanou tak, že je produkován prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA.

17. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 10, 14, 15 a 16 vyznačující setím, že aktivita PanB je zvýšena nadměrnou expresí PanB.

18. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 10, 14, 15. a 16 vyznačující se tím, že aktivita PanB je zvýšena exprimováním mnoha kopií panB genu.

19. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 10, 14, 15 a 16 vyznačující se tím, že aktivita PanB je zvýšena snížením zpětnovazebně inhibice PanB.

20. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 10, 14, 15 a 16 vyznačující se tím, že aktivita PanB je zvýšena regulováním aktivity panthotenát-kinasy.

21. Způsob podle nároku 20vyznačující se tím, že aktivita panthotenát-kinasy je snížena.

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím; že CoaA je deletován a CoaX je snížené exprimován.

23. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že CoaX je deletován a CoaA je snížené exprimován.

24. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že CoaX a CoaA jsou snížené exprimovány.

Ί no .·♦♦·······

ΙνΖ» · · · · · · # · · ·

9 9 9 9 9 9 4 »4 · 4 4 · 4

444 44« 444

Λ 4 4444 44 9 9 99 9 9 4

25. Způsob podle nároku 10, 14 nebo 15, vyznačující se tím, že aktivita PanE je snížena deletováním panE2 genu.

26. Způsob podle nároku 10, 14 nebo 15 vyznačující se tím, že aktivita PanE je snížena regulováním exprese panE genu.

27. Způsob podle nároku 13 nebo 15 vyznačuj ící se t i m, že aktivita IlvC je snížena regulováním exprese ilvC genu.

28. Způsob podle jakéhokoliv z výše uvedených nároků vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus je kultivován za podmínek redukované rovnovážné koncentrace glukosy.

29. Způsob podle jakéhokoliv z výše uvedených nároků vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus je kultivován za podmínek zvýšené rovnovážné koncentrace rozpuštěného kyslíku.

30. Způsob podle jakéhokoliv z výše uvedených nároků vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus je kultivován za nadbytku šeřinu.

31. Způsob podle jakéhokoliv z výše uvedených nároků vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus má panthotenátovou biosyntetickou dráhu deregulovanou tak, že produkce panthotenátu je nezávislá na dodávání β-alaninu.

• 4

44 ·

103 • · · 4 · 4 4 4 4 4 « · 4 · 4 4 · 44 44444 • 44 444 · 4 ·

44 4444 44 4444 44 4

32. Způsob podle jakéhokoliv z výše uvedených nároků vyznačující se tím, že uvedený mikroorganismus nadměrně exprimuje panD gen tak, že produkce panthotenátu je nezávislá na dodávání β-alaninu.

33. Způsob podle jakéhokoliv z výše uvedených nároků vyznačující se tím, že mikroorganismus náleží do rodu Bacillus.

34. Způsob podle jakéhokoliv z výše uvedených nároků vyznačující se tím, že mikroorganismus je Bacillus subtilis.

35. Produkt synthetizovaný způsobem podle jakéhokoliv z předešlých nároků.

36. prostředek obsahující panthotenát bez HMBPA vyznačující se tím, že je syntetizovaný způsobem podle jakéhokoliv z předchozích nároků.

37. Prostředek syntetizovaný mikroorganismem majícím deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu vyznačující se tím, že uvedený prostředek obsahuje panthotenát a v podstatě neobsahuje HMBPA.

38. Rekombinantní mikroorganismus pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se t i m, že uvedený mikroorganismus má deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu, deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) dráhu, a má selektivně regulované PanB nebo PanEl.

39. Rekombinantní mikroorganismus pro produkci prostředku

104 ♦ 4 4 4 · 4 • · · · . · · 4 « 4 4 4

4 4 · · · ·

4 4 4 4 4 • 4 44 44 «4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 44444

4 «44

4444 44 9 obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se t í m, že uvedený mikroorganismus má deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu, deregulovanou isoleucin-valinovou (ílv) dráhu, a selektivně regulované

PanB a PanEI.

40. Rekombinantní mikroorganismus pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se t i m, že uvedený mikroorganismus má deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu, deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) dráhu, a selektivně regulovaný PanB nebo PanE2.

41. Rekombinantní mikroorganismus pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačující se t í m, že uvedený mikroorganismus má deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu, deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) dráhu, a selektivně regulované PanB a PanE2.

42. Rekombinantní mikroorganismus pro produkci prostředku obsahujícího panthotenát bez HMBPA vyznačuj ící se t í m, že uvedený mikroorganismus má deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu, deregulovanou isoleucin-valinovou (ilv) dráhu, a deletovaný PanEI, deletovaný PanE2 a nadměrně exprimovaný IlvC.

43. Mikroorganismus podle jakéhokoliv z nároků 38-42 vyznačující se tím, že náleží do rodu Bacillus.

44. Mikroorganismus podle jakéhokoliv z nároků 38-42 vyznačující se tím, že jím je Bacillus • ·

- · · φ

105 * · φ · · · φφφφ • « « I* Φ · φ ΦΦ ΦΦΦΦΦ φφφ φφφ «φφ ·· φφφφ ·· «φφφ φφ φ subtilis.

45. Způsob pro produkci prostředku obsahujícího selektivně smísený panthotenát:HMBPA vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje:

kultivování mikroorganismu majícího deregulovanou panthotenátovou biosyntetickou dráhu za podmínek, při kterých je produkován prostředek obsahující selektivní směs panthotenátu:HMBPA.

46. Způsob podle nároku 45vyznačující se tím, že mikroorganismus je kultivován za podmínek, které upřednostňují produkci panthotenátu.

47. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že mikroorganismus je kultivován za podmínek, které upřednostňují produkci HMBPA.

48. Způsob podle nároku 45 nebo 46vyznačuj í cí se t í m, že mikroorganismus je kultivován za podmínek řízené rovnovážné koncentrace glukosy, která upřednostňuje produkci panthotenátu.

49. Způsob podle nároku 45 nebo 47 vyznačuj ící se t í m, že mikroorganismus je kultivován za podmínek řízené rovnovážné koncentrace glukosy, která upřednostňuje produkci HMBPA.

50. Způsob podle nároku 45 nebo 46 vyznačuj ící se t í m, že mikroorganismus je kultivován za podmínek řízeného rovnovážného stavu rozpuštěného kyslíku, které upřednostňují produkci panthotenátu.

• ·

106 • · · • φ · · · ··· 1 1 9 9 9 1 »1 9·1· ·· ···· ·· *

51. Způsob podle nároku 45 nebo 47 v y z na č u j ící se t i m, že mikroorganismus je kultivován za podmínek řízeného rovnovážného stavu rozpuštěného kyslíku, které upřednostňují produkci HMBPA.

52. Způsob podle nároku 45 nebo 46vyznačuj ící se t i m, že mikroorganismus je kultivován za podmínek řízeného rovnovážného stavu šeřinu, které upřednostňují produkci panthotenátu.

53. Způsob podle nároku 45 nebo 46vyznačuj i cí se t i m, že mikroorganismus má modifikace, které upřednostňují produkci panthotenátu.

54. Způsob podle nároku 45 nebo 47vyznačuj i cí se t í m, že mikroorganismus mé modifikace, které upřednostňují produkci HMBPA.

55. Produkt vyznačující se tím, že je produkován způsobem podle jakéhokoliv z nároků 45-54.