FR3137108A1 - Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci - Google Patents
Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci Download PDFInfo
- Publication number
- FR3137108A1 FR3137108A1 FR2206411A FR2206411A FR3137108A1 FR 3137108 A1 FR3137108 A1 FR 3137108A1 FR 2206411 A FR2206411 A FR 2206411A FR 2206411 A FR2206411 A FR 2206411A FR 3137108 A1 FR3137108 A1 FR 3137108A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- seq
- arar
- xylr
- gene
- xylose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 title claims abstract description 72
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 title claims abstract description 23
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims abstract description 172
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 163
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 163
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 146
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims abstract description 77
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 57
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 48
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims abstract description 13
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 147
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 101150055570 araR gene Proteins 0.000 claims description 42
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 claims description 40
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 39
- 101150038987 xylR gene Proteins 0.000 claims description 38
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 claims description 7
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 21
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 18
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 7
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 7
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 7
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 32
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 32
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 25
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 21
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 11
- 241000423302 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Species 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 9
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 9
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 101150044726 pyrE gene Proteins 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 7
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 description 6
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 6
- 101150006699 xfp gene Proteins 0.000 description 6
- 101150110790 xylB gene Proteins 0.000 description 6
- 108091029499 Group II intron Proteins 0.000 description 5
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 5
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108010004621 phosphoketolase Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 4
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 description 4
- 102100029089 Xylulose kinase Human genes 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N thiamphenicol Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=C([C@@H](O)[C@@H](CO)NC(=O)C(Cl)Cl)C=C1 OTVAEFIXJLOWRX-NXEZZACHSA-N 0.000 description 4
- 229960003053 thiamphenicol Drugs 0.000 description 4
- 108091022915 xylulokinase Proteins 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 3
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 3
- 230000000789 acetogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000008209 arabinosides Chemical class 0.000 description 3
- 235000013524 arak Nutrition 0.000 description 3
- 235000020053 arrack Nutrition 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 2
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001070941 Castanea Species 0.000 description 2
- 235000014036 Castanea Nutrition 0.000 description 2
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 2
- 241000193452 Clostridium tyrobutyricum Species 0.000 description 2
- 241000002309 Collariella virescens Species 0.000 description 2
- 240000004585 Dactylis glomerata Species 0.000 description 2
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 description 2
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108010018080 L-arabinose isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108090000416 L-ribulose-5-phosphate 4-epimerases Proteins 0.000 description 2
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 2
- 240000003433 Miscanthus floridulus Species 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 2
- 235000015696 Portulacaria afra Nutrition 0.000 description 2
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 2
- 244000177175 Typha elephantina Species 0.000 description 2
- 235000018747 Typha elephantina Nutrition 0.000 description 2
- 101710120215 Xylose repressor Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 108020002667 ribulokinase Proteins 0.000 description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710129685 Arabinose-proton symporter Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241001656810 Clostridium aceticum Species 0.000 description 1
- 101100463887 Clostridium acetobutylicum (strain ATCC 824 / DSM 792 / JCM 1419 / LMG 5710 / VKM B-1787) CA_C1343 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100270108 Clostridium acetobutylicum (strain ATCC 824 / DSM 792 / JCM 1419 / LMG 5710 / VKM B-1787) araA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100270110 Clostridium acetobutylicum (strain ATCC 824 / DSM 792 / JCM 1419 / LMG 5710 / VKM B-1787) araA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186522 Clostridium aurantibutyricum Species 0.000 description 1
- 241001656809 Clostridium autoethanogenum Species 0.000 description 1
- 241001110912 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 Species 0.000 description 1
- 241001611022 Clostridium carboxidivorans Species 0.000 description 1
- 241000186566 Clostridium ljungdahlii Species 0.000 description 1
- 101100005275 Clostridium perfringens catP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000429427 Clostridium saccharobutylicum Species 0.000 description 1
- 241001508458 Clostridium saccharoperbutylacetonicum Species 0.000 description 1
- 241000186587 Clostridium scatologenes Species 0.000 description 1
- 241000193470 Clostridium sporogenes Species 0.000 description 1
- 101100119095 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) ermB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100157003 Escherichia coli (strain K12) xylF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000427324 Glinus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000952182 Homo sapiens Max-like protein X Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000933069 Lachnoclostridium phytofermentans Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102100037423 Max-like protein X Human genes 0.000 description 1
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101100157012 Thermoanaerobacterium saccharolyticum (strain DSM 8691 / JW/SL-YS485) xynB gene Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002053 acidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 101150038940 araA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108772 araA2 gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 aromatic alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000010455 autoregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003034 coal gas Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003116 impacting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 101150031929 ltrA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150015970 tetM gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000018412 transposition, RNA-mediated Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 101150033567 xylT gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/16—Butanols
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
- C12P7/28—Acetone-containing products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
BACTERIES CLOSTRIDIUM MODIFIEES POUR ASSIMILER PLUSIEURS SUCRES SIMULTANEMENT, PREPARATION ET UTILISATIONS DE CELLES-CI La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l’élimination ou la modification de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose ou les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose.
Description
La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genreClostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genreClostridium. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l’élimination ou la modification de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose ou les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose.
Le genreClostridiumcontient des bactéries à Gram positif, anaérobies strictes et sporulantes, appartenant au phylum des Bacillota. LesClostridiasont un groupe d’importance pour la communauté scientifique pour plusieurs raisons. La première est qu’un certain nombre de maladies graves (e.g. tétanos, botulisme) sont dues à des infections de membres pathogènes de cette famille (John & Wood, 1986). La deuxième est la possibilité d’utiliser des souches dites acidogènes ou solvantogènes en biotechnologie. CesClostridia, non pathogènes, ont naturellement la capacité de transformer une variété importante de sucres pour produire des espèces chimiques d’intérêt, et plus particulièrement de l’acétone, du butanol, et de l’éthanol (John & Wood, 1986) au cours d’une fermentation dite ABE. La bactérieClostridium acetobutylicumest aujourd’hui considérée comme un représentant modèle desClostridiumsolvantogènes.
LesClostridiumsolvantogènes sont capables d’assimiler une large variété de sources carbonées, ce qui est un atout pour les procédés de fermentation ABE (Keis, Shaheen et Jones 2001). Cette versatilité leur permet en théorie de proliférer efficacement sur de larges gammes de substrats, notamment sur des co-produits issus de l’agro-industrie (Qureshiet al.2008; Ezeji, Qureshi et Blaschek 2007; Ezeji et Blaschek 2008; Qureshiet al.2006). Grâce à l’essor des procédés industriels de fermentation, et plus récemment de la chimie verte, l’incorporation de la biomasse végétale dans les procédés industriels tend à se répandre. Or, une catégorisation des substrats végétaux s’est vite généralisée à l’ensemble de l’industrie, mettant en opposition deux « générations » de substrats industriels, sur la base de considérations environnementales et humaines.
Les substrats dits de première génération (« 1G »), regroupent toutes les sources carbonées issues des organes de réserve des végétaux. Les substrats 1G peuvent en particulier être issus de maïs, de blé, mais aussi de canne à sucre ou de betterave. Majoritairement constitués de saccharose et d’amidon, leur fermentation à l’échelle industrielle est aujourd’hui très efficace. En revanche, l’utilisation de ces substrats est sujette à controverse, puisqu’ils nécessitent l’utilisation de terres arables et de denrées exploitées par l’industrie agroalimentaire.
En opposition à ce paradigme, les substrats de seconde génération (« 2G ») rassemblent tous les substrats issus d’organes de structure de plantes, ou de co-produits de l’agro-industrie. Ce faisant, cette approche contribue à réduire les tensions entre les secteurs de l’énergie et de l’alimentation. Leur utilisation est cependant beaucoup moins aisée que les substrats 1G. En cause, la source de carbone majoritaire de ces substrats : la lignocellulose, matrice polymérique complexe et récalcitrante. Sa dégradation en sucres fermentescibles nécessite des prétraitements plus ou moins coûteux, et pouvant générer des inhibiteurs de croissance microbienne.
Du fait de la nature complexe des différentes fractions dont ils sont issus, les hydrolysats d’hémicellulose contiennent diverses sources carbonées. Parmi celles-ci on trouve majoritairement le xylose et le glucose, accompagnés d’un mélange de sucres minoritaires comme le galactose, le mannose et l’arabinose. Tous ces sucres sont fermentescibles par les espèces solvantogènes deClostridium. En pratique cependant, un processus biologique connu sous le terme de Répression Catabolique (RC), empêche l’utilisation optimale et simultanée de toutes ces sources de carbone. En particulier, la répression catabolique empêche la métabolisation efficace du xylose contenu dans les hydrolysats de lignocellulose. La bactérieC. acetobutylicumen particulier est sensible à ce phénomène de répression (Qureshiet al.2006; Grimmleret al.2010).
Les inventeurs décrivent, dans le contexte de la présente invention, des bactéries du genreClostridium, typiquement les bactéries solvantogènes, aptes à consommer, de manière simultanée, des sources de carbone différentes, en particulier des sucres différents. Ils décrivent en particulier, pour la première fois, une bactérieC. acetobutylicumapte à consommer, de manière simultanée, du glucose et un pentose, préférentiellement du glucose et de l’arabinose.
Les inventeurs décrivent en particulier une bactérie génétiquement modifiée, appartenant au genreClostridium, en particulier une bactérie solvantogène, n’exprimant pas les répresseurs transcriptionnels XylR et/ou AraR ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènesxylRet/ouaraR, en particulier les produits des gènes CA_C2613, CA_C3673 et/ou CA_C1340, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.
Une bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime pas le répresseur transcriptionnel XylR ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènesxylR, en particulier les produits des gènes CA_C2613 et/ou CA_C3673, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.
Une autre bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime pas le répresseur transcriptionnel AraR ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas le produit du gènearaR, en particulier le produit du gène CA_C1340, ou exprimant une version non fonctionnelle dudit produit.
Une autre bactérie génétiquement modifiée préférée selon l’invention est une bactérie n’exprimant pas les répresseurs transcriptionnels XylR et AraR ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci. Cette bactérie génétiquement modifiée est une bactérie n’exprimant pas les produits des gènesxylRetaraR, en particulier les produits des gènes CA_C2613, CA_C3673 et CA_C1340, ou exprimant des versions non fonctionnelles desdits produits.
Des bactéries génétiquement modifiées particulièrement préférées selon l’invention correspondent à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 968 telle qu’enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que ∆CA_C1340 ∆CA_C2613 ∆CA_C3673 ou ∆araR∆xylR1 ∆xylR2), et à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 967 telle qu’enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que ∆CA_C1340 ou ∆araR), utilisable pour préparer une souche équivalente à la souche IFP 968. L’invention vise également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celles-ci.
Les inventeurs décrivent en outre un procédé de production d’une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte, en particulier un procédé comprenant la délétion ou l’inactivation des gènesxylRet/ouaraRde manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et/ou AraR fonctionnelles, ainsi que les bactéries modifiées génétiquement susceptibles d’être obtenues par ce procédé, dont les bactéries IFP 967 et IFP 968 sont des exemples.
Ils décrivent aussi l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gènexylRouaraR, ou exprime une version non fonctionnelle du gènexylRouaraR, telle que la souche IFP 967, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention n’exprimant pas les produits des gènesxylRetaraR,ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
Les inventeurs décrivent par ailleurs l’utilisation d’un bactérie selon l’invention pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée par exemple à partir i) d’une biomasse lignocellulosique, ii) du produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, une culture de plantes pérennes fourragères, une culture d’herbacées ou une culture arbustive, ou iii) de substrat(s) 1G issu(s) d’une ou plusieurs plantes sucrières, céréalières, ou oléagineuses, ou iv) d’un mélange de telles sources carbonées.
Ils décrivent aussi l’utilisation des bactéries selon l’invention pour fermenter simultanément (ou en d’autres termes, pour « cofermenter ») au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose. De telles bactéries peuvent être avantageusement utilisées pour produire un solvant ou un mélange de solvants, en particulier à l’échelle industrielle.
L’invention concerne aussi un procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie génétiquement modifiée telle que décrite dans le présent texte.
Les inventeurs décrivent enfin des kits, en particulier un kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genreClostridium, et un kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à l’aide d’une bactérie appartenant au genreClostridium, ledit kit comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridiumselon l’invention et ii) un milieu, en particulier un milieu de culture riche, préférentiellement un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM, contenant au moins du glucose et un pentose, préférentiellement du glucose et de l’arabinose et/ou du xylose.
Bien qu’utilisées en industrie depuis plus d’un siècle, les connaissances sur les bactéries appartenant au genreClostridium, en particulier sur les bactéries solvantogènes, restent très limitées. Une contrainte majeure rencontrée par les industriels concerne leur incapacité à utiliser simultanément plusieurs sources distinctes de carbone et donc à métaboliser efficacement différents types de substrats, en particulier différents types de sucres.
Malgré les difficultés, bien connues de l’homme du métier, rencontrées pour modifier génétiquement les bactéries appartenant au genreClostridium, les inventeurs sont parvenus, pour la première fois dans le contexte de la présente invention, à obtenir une bactérieC. acetobutylicumcapable d’utiliser simultanément, i.e., de coassimiler, cométaboliser ou cofermenter (ces termes étant utilisés de manière indistincte dans le présent texte) plusieurs sources distinctes de carbone, en particulier issues de biomasse, notamment de biomasse végétale, par exemple de biomasse lignocellulosique.
Une « biomasse brute », dite aussi « biomasse native », préférée dans le cadre de l’invention est une biomasse végétale, en particulier une biomasse lignocellulosique. Cette dernière comprend essentiellement trois constituants naturels (polymères) présents en quantités variables selon son origine: la cellulose (environ 35 à 50% en masse sèche de la biomasse), qui est un polysaccharide essentiellement constitué d'hexoses, l'hémicellulose (environ 20 à 30% en masse sèche de la biomasse) qui est un polysaccharide essentiellement constitué de pentoses, et la lignine (environ 15 à 25% en masse sèche de la biomasse) qui est un polymère de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé d'alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ces différentes molécules sont responsables des propriétés intrinsèques de la paroi végétale et s'organisent en un enchevêtrement complexe. Parmi ces trois polymères de base qui intègrent la biomasse lignocellulosique, la cellulose et l'hémicellulose sont ceux qui permettent la production de jus sucrés 2G et d’alcool 2G.
Des exemples non limitatifs de biomasses lignocellulosiques comprennent par exemple les résidus d’exploitation agricole (notamment les déchets de paille, les rafles de maïs, la bagasse de canne à sucre, etc.), mais aussi les résidus d’exploitation forestière, les résidus de scieries (typiquement les copeaux de bois) ou tout autre type de résidus ligneux d’origine sylvicole, industrielle, urbaine ou ménagère. La biomasse cellulosique peut également être le produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, dédiée par exemple à la culture de plantes annuelles (utilisation « plante entière » par exemple du blé ou du maïs). Elle peut autrement être par exemple une culture de plantes pérennes fourragères (par exemple de fétuque, dactyle ou ray-grass), une culture d’herbacées (par exemple le miscanthus ou « herbe à éléphant » ou encore le switchgrass ou « panic érigé »), ou une culture arbustive (taillis à courtes ou très courtes rotation par exemple de saule, de peuplier, de châtaignier ou d’eucalyptus).
Une autre biomasse susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention peut être un substrat 1G ou un mélange de plusieurs substrats 1G issus de plantes sucrières (telles que par exemple la canne à sucre ou la betterave à sucre), céréalières (telles que par exemple le maïs ou le blé) et/ou oléagineuses (telles que par exemple le soja, le colza, la palme). Dans le contexte de l’invention, la biomasse peut être utilisée seule ou un mélange, par exemple de plusieurs types de biomasse différents. La quantité d’eau contenue dans la biomasse brute est comprise entre 1% et 70 % de la masse totale de biomasse brute.
Les inventeurs sont ainsi avantageusement parvenus à modifier génétiquement, en ce sens, une bactérie solvantogène, la souche de référenceC. acetobutylicum. Ils l’ont en particulier rendue apte à fermenter deux éléments carbonés de natures différentes, par exemple au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés distincts choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose, encore plus préférentiellement du glucose et de l’arabinose.
ChezC. acetobutylicum, les gènes liés au catabolisme du xylose sont organisés sous la forme d’un régulon (Guet al.2010). Le principal opéron impliqué dans l’assimilation du xylose est le locus CA_C2610-CA_C2612, qui contient les gènes codant la xylose isomérase XylA (CA_C2610) et la xylulokinase XylB (CA_C2612) (Guet al.2010). Les gènes codant les perméases prédites comme impliquées dans l’import de xylose, AraE1 (CA_C1339) et XylT (CA_C1345), sont localisés sur un second locus (CA_C1339-CA_C1349) contenant également des gènes liés à l’assimilation de l’arabinose. Un troisième opéron (CA_C3451-CA_C3452) contient les gènes codant les protéines XynT et XynB, correspondant respectivement à une perméase hypothétique et à une 1,4-β-D-xylosidase.
À l’exception dexylT, tous ces gènes possèdent dans leur promoteur ou leur séquence codante des séquences opératrices XylR-binding-site (XBS) (Guet al.2010). La présence du XBS a pour effet de placer ces gènes sous le contrôle d’un répresseur xylose, nommé XylR, capable d’empêcher la transcription en l’absence de xylose dans le milieu.
Le gène CA_C2613 est situé en amont du gènexylBau sein de l’opéron principal d’assimilation du xylose. Cette organisation est très similaire à ce qui est observé chez les espèces possédant un répresseur du xylose (Guet al.2010).
Le gène CA_C3673 possède un XBS au niveau de son promoteur, suggérant une autorégulation de sa transcription. Le produit de ce gène est également le répresseur présentant le plus d’identité avec des homologues de XylR appartenant à desClostridiumsolvantogènes proches, tels queC. beijerinckiiNCIMB 8052.
Les gènes impliqués dans l’assimilation de l’arabinose sont pour la plupart situés au sein du locus CA_C1339-CA_C1349. Ce locus comprend les gènes codants les transporteurs présumés de l’arabinose AraE1 et XylT, les L-arabinose isomérases AraA1 (CA_C1342) et AraA2 (CA_C1346), la ribulokinase AraK (CA_C1344) et la L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase AraD (CA_C1341).
Un second opéron contient les gènes CA_C1529 et CA_C1530 qui codent l’arabinofuranosidase Arb43 et le transporteur d’arabinoside AraT.
Tous ces gènes, ainsi que le gène codant la phosphocétolase Xfp sont placés sous contrôle du répresseur transcriptionnel AraR (CA_C1340), actif en l’absence d’arabinose (Zhanget al.2012).
Une particularité récemment mise en évidence chezC. acetobutylicumest la différence phénotypique qui existe entre la croissance sur xylose et celle sur arabinose, bien que les voies métaboliques permettant l’assimilation de ces sucres possèdent de nombreux intermédiaires communs (Servinskyet al.2010). En effet, alors que le temps de génération sur arabinose est de 78 min, celui-ci atteint 287 min sur xylose (Servinskyet al.2012). Si les activités xylose-perméase et xylulokinase ont été mises en cause, cette différence s’explique également par l’action de facteurs de régulation transcriptionnels.
L’analyse transcriptomique de cultures deC. acetobutylicumATCC 824 en présence de glucose, de xylose ou d’arabinose révèle que la voie des pentoses phosphate est induite de façon analogue par le xylose et l’arabinose (Servinskyet al.2010). En revanche, l’expression de la phosphocétolase Xfp présente un profil d’expression différent. En effet,xfpest faiblement induit par le xylose (d’un facteur 3 comparé au glucose) mais fortement induit par l’arabinose (d’un facteur 185 comparé au glucose) (Servinskyet al.2012). Le contraste marquant d’induction de l’expression du gènexfpen absence d’arabinose peut être expliqué par la présence d’un AraR-binding-site en amont de ce gène. Ainsi, l’une des conséquences les plus remarquables lors de l’analyse transcriptomique d’un mutant dont le gènearaRa été inactivé est l’amélioration de la transcription du gènexfpd’un facteur supérieur à 1000 (Zhanget al.2012). Cette régulation transcriptionnelle de la phosphocétolase contribue à entraver partiellement l’assimilation du xylose en absence d’arabinose.
Des travaux récents montrent en outre qu’en plus de subir une répression partielle en l’absence d’arabinose, l’assimilation du xylose est réduite en présence d’arabinose. En effet, des cultures réalisées en présence de xylose et d’arabinose montrent une consommation minime de xylose, alors que le taux d’assimilation de l’arabinose ne diffère pas du taux observable sur arabinose seul (Aristildeet al.2014). Une analyse des flux métaboliques confirme l’assimilation préférentielle de l’arabinose par rapport au xylose de culture sur ces deux sucres (Aristildeet al.2014). Servinskyet al.ont également montré que la préférence de l’arabinose sur le xylose ne peut pas s’expliquer entièrement par les taux de croissance inhérents à ces deux hydrates de carbone. Ils ont ainsi mis en évidence le fait que l’arabinose serait capable d’inhiber spécifiquement l’expression de gènes d’assimilation d’autres sucres, dont ceux du xylose.
Les inventeurs montrent pour la première fois que l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet d’obtenir une souche présentant des capacités de coassimilation étonnantes, puisque capable d’assimiler et/ou de métaboliser de manière simultanée deux sources carbonées distinctes telles que l’arabinose et le glucose, sans lever la répression catabolique sur l’assimilation du xylose.
Un objet décrit par les inventeurs vise ainsi une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, en particulier une espèce deClostridiumd’intérêt industriel, en particulierC. acetobutylicum, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènesxylRet/ouaraR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « gènexylR» vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou la séquence SEQ ID NO : 2 (CA_C3673). Le terme « gènexylR» vise aussi les variants desdites séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en particulier les variants présentant une homologie de séquence avec l’une desdites séquences SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2.
Dans le contexte de la présente invention, le terme « gènearaR» vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou un variant de ladite séquence, en particulier un variant présentant une homologie de séquence avec ladite séquence SEQ ID NO : 3.
Un exemple typique de variant selon l’invention présente une homologie de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1, avec la SEQ ID NO : 2 ou avec la séquence SEQ ID NO : 3 comprise entre 95% et 100%, et de préférence entre 96% et 100%. La séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 et son variant sont par exemple homologues à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, ou à au moins 99%. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 et son variant présentent des séquences homologues à au moins 96%, au moins 97%, ou au moins 98%.
Le terme « gènexylR» vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine XylR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en l’absence de xylose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose, par exemple apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi le gène codant la xylose isomérase « XylA » (codée par le gène CA_C2610, SEQ ID NO : 4), le gène codant la xylulokinase « XylB » (codée par le gène CA_C2612, SEQ ID NO : 5), un gène codant une perméase impliquée dans l’import de xylose telle que par exemple la protéine « AraE1 » (codée par le gène CA_C1339, SEQ ID NO : 6), la protéine « XylT » (codée par le gène CA_C1345, SEQ ID NO : 7), ou la protéine « XynT » (codée par le gène CA_C3451, SEQ ID NO : 8), et le gène codant la 1,4-β-D-xylosidase « XynB » (codée par le gène CA_C3452, SEQ ID NO : 9).
Le terme « gènexylR» vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur (SEQ ID NO : 10) du gène «xylA» (CA_C2610, SEQ ID NO : 4), le promoteur (SEQ ID NO : 11) du gène «xylB» (CA_C2612, SEQ ID NO : 5) ou une séquence opératrice « XBS » (XylR-binding site) choisie par exemple parmi SEQ ID NO : 12 et SEQ ID NO : 13. La protéine codée par la séquence nucléotidique variante est de préférence capable de reconnaitre une séquence XBS (XylR-Binding site) telle que par exemple la SEQ ID NO : 12 ou la SEQ ID NO : 13, et/ou de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression desdits gènes.
Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gènexylR» vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine XylR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en présence de xylose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose telle que décrite ci-dessus.
Le terme « gènearaR» vise aussi une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine AraR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en l’absence d’arabinose, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose ou de la voie d’assimilation de l’arabinose, en particulier capable d’empêcher partiellement l’assimilation du xylose ou de l’arabinose.
Le terme « gènearaR» vise aussi une séquence apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher, par exemple en l’absence d’arabinose, la transcription d’au moins un gène choisi parmi un gène codant un transporteur, ou transporteur présumé, de l’arabinose « XylA », tel que « AraE1 » (codée par le gène CA_C1339, SEQ ID NO : 6) ou « XylT » (codée par le gène CA_C1345, SEQ ID NO : 7) ; un gène codant une L-arabinose isomérase telle que « AraA1 » (codée par le gène CA_C1342, SEQ ID NO : 14) ou « AraA2 » (codée par le gène CA_C1346, SEQ ID NO : 15) ; le gène codant la ribulokinase « AraK » (codée par le gène CA_C1344, SEQ ID NO : 16) ; le gène codant la L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase « AraD » (codée par le gène CA_C1341, SEQ ID NO : 17) ; le gène codant l’arabinofuranosidase « Arb43 » (codée par le gène CA_C1529, SEQ ID NO : 18) ; le gène codant le transporteur d’arabinoside « AraT » (codée par le gène CA_C1530, SEQ ID NO : 19) ; et le gènexfp(CA_C1343, SEQ ID NO : 20) codant une phosphocétolase.
Le terme « gènearaR» vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur d’un gène «ara» tel que «araE1», «araA1», «araA2», «araK» ou «araD», par exemple une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, et SEQ ID NO : 24, ou une séquence opératrice « ABS » (AraR-binding site) choisie par exemple parmi SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 26, et SEQ ID NO : 27. La protéine codée par la séquence nucléotidique variante est de préférence capable de reconnaitre une séquence ABS (AraR-binding site) telle que par exemple la SEQ ID NO : 25 ou la SEQ ID NO : 26, et/ou de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’un ou plusieurs desdits gènes codant une enzyme impliquée dans la voie d’assimilation de l’arabinose.
Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gènearaR» vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine AraR, en particulier une protéine apte à/ capable de réprimer, diminuer ou empêcher (ou impliquée dans la répression de), par exemple en présence d’arabinose,. l’expression d’une enzyme telle que décrite ci-dessus de la voie d’assimilation du xylose ou de la voie d’assimilation de l’arabinose.
Lorsque le présent texte fait référence à une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènesxylRet/ouaraR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, l’expression « version non fonctionnelle du produit du gène »xylR, ouaraR, désigne une protéine, typiquement une protéine identifiée dans le présent texte en tant que « XylR » ou « AraR », non fonctionnelle, i.e., incapable d’exercer la fonction de la protéine codée par la version sauvage du gène visé. Dans le cas du produit du gènexylR, la version non fonctionnelle dudit produit désigne une protéine incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose et/ou de l’arabinose, par exemple incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi le gène codant la xylose isomérase « XylA », le gène codant la xylulokinase « XylB », un gène codant une perméase impliquée dans l’import de xylose telle que par exemple la protéine « AraE1 », la protéine « XylT », ou la protéine « XynT », et le gène codant la 1,4-β-D-xylosidase « XynB ».
Dans le cas du produit du gènearaR, la version non fonctionnelle dudit produit désigne une protéine incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, l’expression d’une enzyme de la voie d’assimilation du xylose et/ou de la voie d’assimilation de l’arabinose, en particulier capable d’empêcher partiellement l’assimilation du xylose. Cette protéine est par exemple incapable de réprimer, diminuer ou empêcher, la transcription d’au moins un gène choisi parmi un gène codant un transporteur, ou transporteur présumé, de l’arabinose « XylA », tel que « AraE1 » ou « XylT » ; un gène codant une L-arabinose isomérase telle que « AraA1 » ou « AraA2 » ; le gène codant la ribulokinase « AraK » ; le gène codant la L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase « AraD » ; le gène codant l’arabinofuranosidase « Arb43 » ; le gène codant le transporteur d’arabinoside « AraT » ; et le gènexfpcodant une phosphocétolase.
Par « bactérie du genreClostridium», on entend en particulier les espèces deClostridiumdites d’intérêt industriel, typiquement les bactéries solvantogènes ou acétogènes du genreClostridium. L’expression « bactérie du genreClostridium» englobe les bactéries sauvages ainsi que les souches dérivées de celles-ci, modifiées génétiquement dans le but d’améliorer leur performance.
Par « espèce deClostridiumd’intérêt industriel » ou bactérie «Clostridiumd’intérêt industriel » on entend les espèces capables de produire, par fermentation, des solvants tels que l’éthanol, le butanol, l’acétone ou l’isopropanol et/ou des acides tels que l’acide butyrique ou l’acide acétique, à partir de sucres ou d’oses, typiquement à partir de sucres comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose, l’arabinose ou le fructose, de sucres comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose ou le mannose, de polysaccharides ou polyosides tels que la cellulose ou une hémicellulose, et/ou de toute autre source de carbone assimilable et utilisable par les bactéries du genreClostridium(CO, CO2, et méthanol par exemple). Des exemples de bactéries solvantogènes d’intérêt sont les bactéries du genreClostridiumproductrices d’acétone, de butanol, d’éthanol et/ou d’isopropanol, telles que les souches identifiées dans la littérature en tant que « souche ABE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, de butanol et d’éthanol], « souche IBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’isopropanol (par réduction de l’acétone), de butanol et d’éthanol] et « souche AIBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, d'isopropanol, de butanol et d’éthanol]. Des bactéries solvantogènes du genreClostridiumpeuvent être sélectionnées par exemple parmi, sans être limitées à,C. acetobutylicum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum et C. tyrobutyricum, de manière préférée parmiC. acetobutylicum,C. beijerinckii, C. butyricum,C. tyrobutyricumetC. cellulolyticum, et de manière encore plus préférée parmiC. acetobutylicumetC. beijerinckii.
Les bactéries acétogènes d’intérêt sont des bactéries productrices d’acides et/ou de solvants à partir de CO2et H2. Des bactéries acétogènes du genreClostridiumpeuvent être sélectionnées par exemple parmiC. aceticum,C. thermoaceticum,C. ljungdahlii,C. autoethanogenum,C. difficile,C. scatologenesetC. carboxidivorans.
Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie du genreClostridiumconcernée est une « souche ABE », de préférence la bactérieC. acetobutylicum, par exemple la souche DSM 792 (également désignée souche ATCC 824 ou encore LMG 5710) deC.acetobutylicum.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie du genreClostridiumconcernée est une « souche ABE », de préférence la bactérieC. beijerinckii, par exemple la souche la souche NCIMB 8052 deC. beijerinckii.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la bactérie du genreClostridiumconcernée est une « souche IBE », de préférence un sous-clade de C.beijerinckiisélectionné parmi DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 et NCCB 27006.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la bactérie selon l’invention appartenant au genreClostridiumest une bactérieClostridiumd’intérêt industriel, en particulier une bactérie solvantogène, capable, à l’état sauvage, de produire des solvants et/ou des acides par fermentation à partir d’une source de carbone, ladite source de carbone étant choisie par exemple parmi un sucre, du CO, du CO2, un alcool, et un acide organique. Dans un mode de réalisation particulier préféré, la source de carbone est un sucre, en particulier un sucre comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose ou l’arabinose, un sucre comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose, le fructose ou le mannose, ou un polysaccharide ou polyoside tels que la cellulose ou l’hémicellulose.
Une bactérie particulièrement préférée selon l’invention est une bactérieClostridiumapte à fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose. Une bactérie particulièrement préférée selon l’invention est une bactérieClostridiumapte à fermenter simultanément les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose.
L’homme du métier peut ainsi aisément vérifier si ladite bactérieClostridiumest ou non une bactérie selon l’invention, en mettant en culture ladite bactérie sur un substrat comprenant plusieurs sources de carbone (par exemple selon la méthode enseignée par Grimmleret al., 2010) : si la bactérie fermente/ assimile aux moins deux sources de carbone différentes de manière simultanée (versus consécutive, i.e., les unes à la suite des autres), il s’agit d’une bactérie selon l’invention. Ainsi, une bactérieClostridiumsauvage mise en présence d’un substrat comprenant du glucose, de l’arabinose et du xylose, fermente d’abord le glucose, puis l’arabinose puis le xylose. Au contraire, une bactérie selon l’invention est capable de fermenter/ d’assimiler simultanément (i.e. en même temps) au moins deux des trois sucres présents au sein du substrat, à savoir dans l’exemple fourni le glucose et l’arabinose (le xylose étant assimilé dans un second temps).
Une autre manière simple de vérifier facilement si la bactérieClostridiumest ou non une bactérie selon l’invention, consiste à mesurer la vitesse de croissance de la bactérie. L’observation chez cette bactérie d’une croissance plus rapide qu’une croissance observable chez une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone, sera considérée comme un indice d’obtention de la bactérie à l’aide d’un procédé selon l’invention (comprenant la délétion ou l’inactivation des gènesxylRetaraRde manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles). Concrètement, l’homme du métier considère qu’une bactérieClostridiumsauvage présente un taux de croissance maximal compris entre environ 0,10 et environ 0,25 ; préférentiellement d’environ 0,15 ; sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone (Servinsky et al., 2010). Les inventeurs ont observé qu’une bactérie modifiée selon l’invention présente un taux de croissance maximal compris entre environ 0,45 et environ 0,60 ; préférentiellement supérieur à environ 0,50, sur un tel milieu. Une autre méthode permettant de vérifier si la bactérieClostridiumest ou non une bactérie selon l’invention, consiste à séquencer les loci CA_C1340, CA_C2613 et CA_C3673 et à vérifier s’ils ont, ou n’ont pas, été modifiés par rapport à leur version sauvage, en vue d’empêcher ou de diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.
Une bactérie particulièrement préférée appartient à l’espèceC. acetobutylicumet, comme expliqué ci-dessus, n’exprime pas les produits des gènes de séquences SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, de SEQ ID NO : 2 (CA_C3673) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, et de SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou une séquence homologue à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, au moins 97% ou à au moins 98% de celle-ci, ou exprime des versions non fonctionnelles desdits produits d’expression.
Cette bactérie particulièrement préférée présente les aptitudes techniques décrites ci-dessus, i.e., elle est capable de fermenter/ assimiler aux moins deux sources de carbone différentes de manière simultanée, et elle croît plus vite qu’une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone.
Une telle souche est caractérisée pour la première fois dans le cadre de la présente demande.
Cette souche a été enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG. Dans cette souche, les gènesxylRetaraRont été (conjointement) inactivés. La description concerne également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, typiquement dépourvues des gènesxylRetaraR, ou dans lesquels lesdits gènes ont également été inactivés.
Un autre objet de l’invention vise l’utilisation d’une bactérie selon l’invention pour fermenter simultanément deux sources distinctes de carbone, par exemple au moins un hexose et un pentose, ou encore les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose. Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie selon l’invention est par exemple capable de fermenter simultanément du glucose et de l’arabinose, du glucose et du xylose, du glucose et du mannose, du glucose et du galactose, de l’arabinose et du xylose, de l’arabinose et du mannose, de l’arabinose et du galactose, du xylose et du mannose, du xylose et du galactose ou du mannose et du galactose.
Dans un mode de réalisation particulier préféré, la bactérie selon l’invention est apte à fermenter un substrat comprenant au moins deux sucres choisis parmi glucose, arabinose et xylose, par exemple du glucose et de l’arabinose, du glucose et du xylose, ou de l’arabinose et du xylose.
La bactérie modifiée génétiquement selon l’invention peut être avantageusement utilisée pour produire un solvant, par exemple un biocarburant, ou un mélange de solvants, par exemple un mélange de biocarburants, en particulier à l’échelle industrielle.
L’invention vise aussi un procédé de fermentation, typiquement un procédé industriel, impliquant l’utilisation d’une bactérie selon l’invention.
Grâce à la présente invention, l’utilisation de substrats de seconde génération (« 2G »), notamment de lignocellulose, est désormais grandement facilitée. La présente invention offre une solution bienvenue qui permettra de réduire les tensions entre les secteurs de l’énergie et de l’alimentation.
Une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention peut aussi être avantageusement utilisée pour produire un sucre ou une molécule biosourcée à partir d’une biomasse, en particulier une biomasse lignocellulosique, ou à partir d’une culture énergétique dédiée.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par « molécule biosourcée » une molécule dont la spécificité est que la matière première utilisée pour sa production est obligatoirement issue de biomasse végétale, préférentiellement de biomasse lignocellulosique, et non pas issue de ressources d’origines fossiles telles que le pétrole, le charbon ou le gaz naturel.
Des exemples non limitatifs de biomasses lignocellulosiques comprennent par exemple les résidus d’exploitation agricole (notamment les déchets de paille, les rafles de maïs, la bagasse de canne à sucre, etc.), mais aussi les résidus d’exploitation forestière, les résidus de scieries (typiquement les copeaux de bois) ou tout autre type de résidus ligneux.
La biomasse cellulosique peut également être le produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, dédiée par exemple à la culture de plantes annuelles (utilisation « plante entière » par exemple du blé ou du maïs). Elle peut autrement être par exemple une culture de plantes pérennes fourragères (par exemple de fétuque, dactyle, ray-grass), une culture d’herbacées (par exemple miscanthus ou « herbe à éléphant », switchgrass ou « panic érigé »), ou une culture arbustive (taillis à courtes ou très courtes rotation par exemple de saule, de peuplier, de châtaignier ou d’eucalyptus).
Une autre biomasse susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention peut être un substrat 1G issus de plantes sucrières (telles que par exemple la canne à sucre ou la betterave à sucre), céréalières (telles que par exemple le maïs ou le blé) et/ou oléagineuses (telles que par exemple le soja, le colza, ou la palme).
L’invention vise par ailleurs un procédé de production d’une bactérie recombinante selon l’invention, comprenant la délétion ou l’inactivation des gènesxylRetaraRde manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.
Les procédés de modification connus les plus performants pour obtenir des souches modifiées génétiquement sont basés sur des événements de recombinaison homologue, ceux-ci permettant de modifier le génome de manière précise et stable.
Un procédé de production particulier selon l’invention comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un acide nucléique d’intérêt.
Par « acide nucléique », on entend au sens de l’invention, toute molécule d’ADN ou d’ARN naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante, éventuellement modifiée chimiquement (i.e. comprenant des bases non naturelles, des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, des bases modifiées et/ou des sucres modifiés), ou optimisée de manière à ce que les codons des transcrits synthétisés à partir des séquences codantes soient les codons les plus fréquemment trouvés chez une bactérie du genreClostridiumen vue de son utilisation chez celle-ci. Dans le cas du genreClostridium, les codons optimisés sont typiquement des codons riches en bases adénines (« A ») et thymines (« T »).
Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés sont représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C : cystéine; D : acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H : histidine; I : isoleucine; K : lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P : proline ; Q : glutamine ; R : arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V : valine ; W : tryptophane et Y : tyrosine.
Dans un mode de réalisation particulier décrit, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins deux régions complémentaires chacune d’une séquence cible, identiques à 100% ou identiques à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à ladite région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien. Ces régions sont capables de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence telle que décrite ci-dessus comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 100 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides. Les régions complémentaires de la séquence cible présentes au sein de l’acide nucléique d’intérêt peuvent reconnaître, de préférence cibler, les régions flanquantes en 5’ et en 3’ de la séquence ciblée dans un outil de modification génétique connu de l’homme du métier, typiquement tout outil basé sur la recombinaison homologue.
Dans un mode de réalisation particulier préféré, une partie de l’acide nucléique d’intérêt reconnait en outre (lie au moins en partie), et de préférence cible, i.e. reconnait et permet la coupure, dans le génome d’une bactérieClostridiumd’intérêt, d’au moins un brin i) d’une séquence cible, ii) d’une séquence contrôlant la transcription d’une séquence cible, ou iii) d’une séquence flanquant une séquence cible. La séquence reconnue est également identifiée dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ».
Dans ce même mode de réalisation particulier préféré, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins une région complémentaire de la séquence cible identique à 100% ou identique à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à la région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien et est capable de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence comprenant au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 15 et 30 nucléotides, de préférence à une séquence comprenant 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucléotides.
Le ou les acides nucléiques d’intérêt tels que décrits dans le cadre de la présente l’invention sont capables de supprimer la ou lesdites séquences cibles du génome de la bactérie ou de modifier leur expression, par exemple de les moduler/ réguler, en particulier de les inhiber, de préférence de les modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une ou plusieurs protéines, en particulier une ou plusieurs protéines fonctionnelles, à partir de ladite ou desdites séquences.
Les « acides nucléiques d’intérêt », typiquement les cassettes ou vecteurs d’expression, peuvent être construits par des techniques classiques bien connues de l’homme du métier et peuvent comporter un ou plusieurs promoteurs, origines de réplication bactérienne (séquences ORI), séquences de terminaison, gènes de sélection, par exemple gènes de résistance à un antibiotique, et séquences (« régions flanquées ») permettant l’insertion ciblée de la cassette ou du vecteur. Des séquences ORI d’intérêt peuvent par exemple être choisies parmi pIP404, pAMβ1, repH (origine de réplication chezC. acetobutylicum), ColE1 ou rep (origine de réplication chezE. coli), ou toute autre origine de réplication permettant le maintien du vecteur, typiquement du plasmide, au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genreClostridium. Des séquences de terminaison d’intérêt peuvent être choisies par exemple parmi celles des gènesadc, thl, de l’opéronbcs, ou de tout autre terminateur, bien connu de l’homme de l’art, permettant l’arrêt de la transcription au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genreClostridium. Des gènes de sélection (gènes de résistance) d’intérêt peuvent être choisis parmiermB,catP,bla,tetA,tetM, et/ou tout autre gène de résistance à l’ampicilline, à l’érythromycine, au chloramphenicol, au thiamphénicol, à la spectinomycine, à la tétracycline, ou à tout autre antibiotique, bien connu de l’homme de l’art, pouvant être utilisé pour sélectionner des bactéries du genreClostridium.
L’acide nucléique d’intérêt peut être un ARN naturel, synthétique ou produit par une technique de recombinaison. Cet acide nucléique d’intérêt peut être préparé par toute méthode connue de l’homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcriptionin vivoou des techniques d’amplification. Lorsque le ou les acides nucléiques d’intérêt sont introduits dans la cellule directement sous la forme de molécules d’ARN (matures ou précurseurs), par exemple d’ARN guide (ARNg), ces molécules peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d’augmenter leur résistance aux nucléases et d’augmenter ainsi leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation.
Les acides nucléiques d’intérêt utilisés selon l’invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme le sont par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme le sont par exemple les alpha-oligonucléotides, les 2'-O-alkyl riboses ou les PNA (Peptide Nucleic Acids) (Egholmet al., 1992).
Dans le contexte de la présente description, un exemple particulier d’acide nucléique d’intérêt, utilisé pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie d’intérêt, est un fragment d’ADN i) reconnaissant une séquence codant, ii) contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) flanquant une séquence codant, le répresseur XylR ou le répresseur AraR.
Dans un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique d’intérêt est sélectionné parmi le plasmide pGRNA-∆CA_C1340 de séquence SEQ ID NO : 28, le plasmide pGRNA-∆CA_C2613 de séquence SEQ ID NO : 29 ou le plasmide pGRNA-∆CA_C3673 de séquence SEQ ID NO : 30.
Un acide nucléique d’intérêt particulier décrit par les inventeurs est par exemple un vecteur, de préférence un plasmide, par exemple le plasmide pGRNA-∆CA_C1340 de séquence SEQ ID NO : 28, le plasmide pGRNA-∆CA_C2613 de séquence SEQ ID NO : 29 ou le plasmide pGRNA-∆CA_C3673 de séquence SEQ ID NO : 30, décrits dans la partie expérimentale de la présente description.
La ou l’une des séquences reconnues (séquence(s) cible(s)) est de préférence l’une des séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 correspondant aux gènesxylRetaraRcodant respectivement une protéine XylR et la protéine AraR, ou une séquence d’acides aminés identique à au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% à ladite protéine, ou une séquence comprenant tout ou au moins 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3. Autrement formulé, la séquence reconnue peut être une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1 et 40 nucléotides, de préférence une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3.
Selon un autre exemple particulier, la séquence cible peut aussi être une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment, typiquement une séquence promotrice, par exemple la séquence promotrice (SEQ ID NO : 10) du gène «XylA» (CA_C2610, SEQ ID NO : 4), ou celle (SEQ ID NO : 11) du gène «XylB» (CA_C2612, SEQ ID NO : 5). L’acide nucléique d’intérêt reconnaît alors, et est donc typiquement capable de se lier à une séquence contrôlant la transcription d’une séquence codante telle que décrite précédemment.
Selon un autre exemple particulier, la séquence cible peut être une séquence flanquant une séquence codante telle que décrite précédemment, par exemple une séquence flanquant la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, ou une séquence identique à au moins 70% à celle-ci. Une telle séquence flanquante comprend typiquement 1, 10 ou 20 et 1000 nucléotides, par exemple entre 1, 10 ou 20 et 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 100 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 50 nucléotides, ou entre 1, 10 ou 20 et 40 nucléotides, par exemple entre 10 et 40 nucléotides, entre 10 et 30 nucléotides, entre 10 et 20 nucléotides, entre 20 et 30 nucléotides, entre 15 et 40 nucléotides, entre 15 et 30 nucléotides ou entre 15 et 20 nucléotides.
Selon un aspect particulier, la séquence cible correspond à la paire de séquences flanquant une telle séquence codante, chaque séquence flanquante comprenant typiquement au moins 20 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides, de préférence entre 200 et 800 nucléotides.
De préférence, le procédé selon l’invention de production d’une bactérie recombinante comprend la transformation de la cellule bactérienne à l’aide d’au moins un acide nucléique d’intérêt, par exemple deux ou trois acides nucléiques d’intérêt tels que décrits précédemment, le ou lesdits acides nucléiques d’intérêt étant capables i) de reconnaître (et capable de lier au moins en partie) une séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur XylR, et ii) de reconnaître (et capable de lier au moins en partie) une séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur AraR.
Comme expliqué plus haut, la séquence codant, contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou flanquant une séquence codant, le répresseur XylR ou le répresseur AraR est également identifié dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ».
L’acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le cadre de la présente invention est de préférence capable de supprimer ladite séquence cible du génome de la bactérie ou de modifier son expression, par exemple de la moduler/ réguler, en particulier de l’inhiber, de préférence de la modifier de manière à rendre ladite bactérie incapable d’exprimer une protéine (typiquement une protéine AraR ou XylR), en particulier une protéine fonctionnelle, à partir de ladite séquence. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’acide nucléique d’intérêt est capable de modifier la bactérie de manière à la rendre incapable d’exprimer l’une et/ou l’autre des protéines AraR et XylR.
L’introduction dans la bactérie de tout acide nucléique d’intérêt peut être réalisée par toute méthode, directe ou indirecte, connue de l’homme du métier, par exemple par transformation, conjugaison, microinjection, transfection, électroporation, etc., de préférence par électroporation (Mermelsteinet al, 1993).
Par ailleurs, ces acides nucléiques d’intérêt (par exemple les fragments d’ADN, fragments d’ARN, cassettes d’expression ou vecteurs d’expression) peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques elles-aussi bien connues de l’homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie telle que décrite dans le présent texte, comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un acide nucléique d’intérêt selon l’invention tel que décrit plus haut et fait intervenir un outil de modification génétique par exemple un outil de modification génétique sélectionné parmi un outil CRISPR, un outil de mutagénèse insertionnelle, par exemple basé sur l’utilisation d’introns de type II (par exemple l’outil Targetron® ou l’outil ClosTron®) et un outil d’échange allélique (par exemple l’outil ACE®).
Le procédé pour transformer, et de préférence en outre modifier génétiquement, une bactérieClostridiumpeut comprendre en outre une étape d’obtention, de récupération, de sélection ou d’isolement de la bactérie transformée, i.e. de la bactérie présentant la ou les recombinaisons/modifications/optimisations recherchées.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation de (met en œuvre) la technologie / l’outil génétique CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), en particulier l’outil génétique CRISPR/Cas (CRISPR-associated protein). La présente invention peut être mise en œuvre à l’aide d’un outil génétique CRISPR/Cas classique utilisant un unique plasmide comprenant une nucléase, un ARNg et une matrice de réparation tel que décrit par Wanget al.(2015). L’homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique ou l’élément génétique mobile à cibler en utilisant des techniques bien connues (voir par exemple l’article de DiCarloet al., 2013). Les inventeurs ont autrement mis au point et décrit un outil génétique de modification de bactéries, adapté aux bactéries du genreClostridium,utilisable dans le contexte de la présente invention, basé sur l’utilisation de deux plasmides (cf. WO2017/064439, Waselset al., 2017).
Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’outil de mutagénèse insertionnelle, par exemple l’utilisation d’introns de type II, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®.
La technologie Targetron® repose sur l’utilisation d’un intron de groupe II (basé sur l’intron Ll.ltrB deLactococcus lactis) reprogrammable, capable d’intégrer le génome bactérien rapidement à un locus désiré (Chenet al., 2005, Wanget al., 2013), typiquement dans le but d’inactiver un gène ciblé. Les mécanismes de reconnaissance de la zone éditée ainsi que d’insertion dans le génome par rétro-épissage sont basés sur une homologie entre l’intron et ladite zone d’une part, et sur l’activité d’une protéine (ltrA) d’autre part.
La technologie ClosTron® repose sur une approche similaire, complétée par l’ajout d’un marqueur de sélection dans la séquence de l’intron (Heapet al., 2007). Ce marqueur permet de sélectionner l’intégration de l’intron dans le génome, et facilite donc l’obtention des mutants désirés. Ce système génétique exploite également les introns de type I. En effet, le marqueur de sélection (appelé RAM pourretrotransposition-activated marker) est interrompu par un tel élément génétique, qui empêche son expression depuis le plasmide (une description plus précise du système : Zhonget al.). L’épissage de cet élément génétique se produit avant intégration dans le génome, ce qui permet l’obtention d’un chromosome présentant une forme active du gène de résistance. Une version optimisée du système comprend des sites FLP/FRT en amont et en aval de ce gène, ce qui permet d’utiliser la recombinase FRT pour éliminer le gène de résistance (Heapet al., 2010).
Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention est basé sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et met par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®.
La technologie ACE® repose sur l’utilisation d’un mutant auxotrophe (pour l’uracile chezC. acetobutylicumATCC 824 par délétion du gènepyrE, qui provoque également une résistance à l’acide 5- fluoroorotique (A-5-FO) ; Heapet al., 2012). Le système utilise le mécanisme d’échange allélique, bien connu de l’homme de métier. Suite à une transformation avec un vecteur pseudo-suicide (à très faibles copies), l’intégration de ce dernier dans le chromosome bactérien par un premier évènement d’échange allélique peut être vérifiée grâce au gène de résistance présent initialement sur le plasmide. L’étape d’intégration peut être réalisée de deux manières différentes, soit au sein du locuspyrEsoit au sein d’un autre locus. Dans le cas de l’intégration au locuspyrE, le gènepyrEest également placé sur le plasmide, sans toutefois être exprimé (pas de promoteur fonctionnel). La deuxième recombinaison restaure un gènepyrEfonctionnel et peut alors être sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum, ne contenant pas d’uracile). Le gènepyrEnon-fonctionnel présentant également un caractère sélectionnable (sensibilité au A-5-FO), d’autres intégrations sont ensuite envisageables sur le même modèle, en alternant successivement l’état depyrEentre fonctionnel et non-fonctionnel. Dans le cas de l’intégration à un autre locus, une zone génomique permettant une expression du marqueur de contre-sélection après recombinaison est ciblée (typiquement, en opéron après un autre gène, de préférence un gène fortement exprimé). Cette deuxième recombinaison est alors sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum ne contenant pas d’uracile).
Dans les modes de réalisation décrits basés sur l’utilisation d’introns de type II, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ClosTron® ou l’outil génétique Targetron®, ou basés sur l’utilisation d’un outil d’échange allélique, et mettant par exemple en œuvre la technologie / l’outil génétique ACE®, la séquence ciblée est typiquement l’une des séquences décrites dans le présent texte.
L’invention concerne par ailleurs un kit (trousse) pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genreClostridiumcomprenant au moins un acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le présent texte (par exemple deux acides nucléiques d’intérêt, typiquement fragment d’ADN, reconnaissant chacun une séquence cible) pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie du genreClostridium, et éventuellement une ou plusieurs molécules de sélection. Un kit particulier comprend les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil CRISPR (typiquement au moins un acide nucléique utilisable en tant qu’ARNg, un acide nucléique utilisable en tant que matrice de réparation, au moins une paire d’amorces, et un inducteur permettant l’expression d’une nucléase de type Cas9 ou MAD7), les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil basé sur l’utilisation d’introns de type II (typiquement au moins un intron de type II, au moins une paire d’amorces et un inducteur permettant l’expression d’un rétrotranscriptase, par exemple type LtrA RT ou Tel4c RT), ou les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil d’échange allélique (typiquement au moins deux acides nucléiques utilisables en tant que matrice de recombinaison homologue, et au moins un couple d’amorces).
Les kits selon l’invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels qu’un milieu de culture, au moins une bactérie compétente du genreClostridium(i.e. conditionnée en vue de la transformation), ou encore une notice explicative.
L’invention concerne typiquement un kit pour la mise en œuvre d’un procédé de transformation et/ou de modification génétique décrit dans le présent texte à l’aide d’une bactérie du genreClostridium.
L’invention vise en particulier la bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridiumayant pour caractéristique essentielle de ne pas exprimer les produits des gènesxylRetaraR, ou d’exprimer des versions non fonctionnelles de ceux-ci, ainsi que toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, et leurs utilisations.
La demande décrit aussi la souche IFP 967, enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG, dans laquelle, le gènearaRa été inactivé, ainsi que toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci, typiquement dépourvues des gènesxylRetaraR, ou dans lesquels lesdits gènes ont également été inactivés.
Elle vise en particulier l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gènexylRouaraR, ou exprime une version non fonctionnelle du gènexylRouaraR, par exemple la souche IFP 967, enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’invention n’exprimant pas les produits des gènesxylRetaraR,ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
L’invention concerne par ailleurs un kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à l’aide d’une bactérie appartenant au genreClostridium, comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridiumselon l’invention, par exemple IPF968, et ii) un milieu, typiquement un milieu de conservation ou un milieu de culture de ladite bactérie. Le kit peut en outre comprendre une notice explicative.
Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement (appartenant au genreClostridium) selon l’invention présent au sein du kit est de préférence supplémenté en une source de carbone composée de glucose et d’au moins un pentose, de préférence i) de glucose et ii) d’arabinose et/ou de xylose. Ce milieu comprend de préférence entre 0,1 et 250 g/L, plus préférentiellement entre 1 et 100 g/L, de ladite source de carbone (composée de glucose et d’au moins un pentose).
Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement est de préférence un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM.
L’invention concerne aussi un kit particulier pour produire un solvant ou un biocarburant, ou un mélange de solvants ou de biocarburants, à l’aide d’une bactérie appartenant au genreClostridium, ledit kit comprenant i) une bactérie (appartenant au genreClostridium) modifiée génétiquement selon l’invention, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènesxylRetaraR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, et ii) un milieu de culture riche, préférentiellement un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM, contenant au moins du glucose et un pentose, préférentiellement de l’arabinose et/ou du xylose.
L’invention concerne par ailleurs les utilisations possibles du procédé ou du kit selon l’invention pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genreClostridium, typiquement une bactérie solvantogène du genreClostridium, par exemple pour générer des variants améliorés de ladite bactérie.
Elle concerne enfin les utilisations possibles du procédé, du kit ou d’une bactérie du genreClostridiumtransformée et de préférence modifiée génétiquement selon l’invention, en particulier pour permettre la production de solvants ou biocarburants, ou de mélanges de ceux-ci, typiquement à l’échelle industrielle.
Les exemples et figures ci-après ont pour but d’illustrer plus pleinement l’invention sans pour autant en limiter la portée. En particulier, ces exemples présentent l’obtention et la caractérisation de bactéries selon l’invention, dans lesquels l’inactivation de gènesaraRet/ouxylRest réalisée selon un mode de réalisation particulier préféré à l’aide d’un outil CRISPR-Cas9. Lesdits gènes peuvent être inactivés selon d’autres modes de réalisation particuliers, bien connus de l’homme de métier, basés par exemple sur l’inactivation de gène par recombinaison homologue ou par mutagénèse insertionnelle, comme expliqué ci-dessus.
EXEMPLE n°1 : Souche
C. acetobutylicum
ΔCA_C2613 ΔCA_C3673
C. acetobutylicumDSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L-1, extrait de levure 10 g L-1, glucose 5 g L-1, NaCl 4 g L-1) et CGM (KH2PO4, 0,75 g; K2HPO4, 0,75 g; MgSO4·7H2O, 0,40 g; MnSO4·H2O, 0,01 g; FeSO4·7 H2O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH4)2SO4, 2,0 g ; source de carbone comme précisé).Escherichia coliNEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L-1, extrait de levure 5 g L-1, NaCl 10 g L-1). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L-1d’agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L-1en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L-1respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L-1en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.
La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci-dessous :
CA_C2613_LHA_Fwd : AAAAAAGAATTCATTTGTCCACTTATACCAATTCCT (SEQ ID NO : 31)
CA_C2613_LHA_Rev : TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO : 32)
CA_C2613_RHA_Fwd : CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO : 33)
CA_C2613_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO : 34)
gRNA_CA_C2613_Fwd : TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT (SEQ ID NO : 35)
gRNA_CA_C2613_Rev : AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO : 36)
CA_C3673_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO : 37)
CA_C3673_LHA_Rev : TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO : 38)
CA_C3673_RHA_Fwd : GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO : 39)
CA_C3673_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT (SEQ ID NO : 40)
gRNA_CA_C3673_Fwd : TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG (SEQ ID NO : 41)
gRNA_CA_C3673_Rev : AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC (SEQ ID NO : 42)
CA_C2613_verif_Fwd : TCGGCAGCAAAAACTCCAGT (SEQ ID NO : 43)
CA_C2613_verif_Rev : GCAATTGCTGGCGGAATGAA (SEQ ID NO : 44)
CA_C3673_verif Fwd : TACTTCATACATATCTAACGCACTCT (SEQ ID NO : 45)
CA_C3673_verif Rev : AAATAACTTCTACTATGAGACAAGCA (SEQ ID NO : 46)
Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :
- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 47)
Il contient l’origine de réplication p15A, ainsi que les gènesampRetkanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase deBacillus subtilis,nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dansC. acetobutylicum.
- Plasmide N°2 : pGRNA_ΔCA_C2613 (SEQ ID NO : 29)
Il contient tous les éléments du pGRNAindavec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C2613 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO : 35) et gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO : 36) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par BsaI. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C2613. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C2613_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 31)/ CA_C2613_LHA_Rev (SEQ ID NO : 32) et CA_C2613_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 33) / CA_C2613_RHA_Rev (SEQ ID NO : 34) à partir de l’ADNg deC. acetobutylicumDSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et SalI.
- Plasmide N°3 : pGRNA_ΔCA_C3673 (SEQ ID NO : 30)
Il contient tous les éléments du pGRNAindavec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C3673 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO : 41) et gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO : 42) et intégré au plasmide par la technique du golden gate assembly, après digestion par BsaI. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C3673. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C3673_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 37) / CA_C3673_LHA_Rev (SEQ ID NO : 38) et CA_C3673_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 39) / CA_C3673_RHA_Rev (SEQ ID NO : 40) à partir de l’ADNg deC. acetobutylicumDSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et SalI.
Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la soucheC. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Waselset al.2020.
Edition génétique des gènes CA_C2613 (SEQ ID NO : 1) et CA_C3673 (SEQ ID NO : 2)
Les inactivations des gènes CA_C2613 et CA_C3673 dans les souches ΔCA_C2613-ΔCA_C3673, ont été réalisées par édition génétique selon le protocole décrit par Waselset al.2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO : 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO : 44) ; CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO : 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO : 46) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes CA_C2613 et CA_C3673, ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux-ci.
Cinétique de croissance et détermination du temps de génération
Des suivis de croissance des souches deC. acetobutylicumDSM 792 sauvage et ΔCA_C2613 ΔCA_C3673 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose ( ).
Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation conjointe des gènes CA_C2613 et CA_C3673 permet une amélioration de 33 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.
Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souchesC. acetobutylicumDSM 792 sauvage et ΔCA_C2613 ΔCA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).
Les résultats indiquent que l’inactivation conjointe de CA_C2613 et CA_C3673 ne présente pas de modification phénotypique significative par rapport à la souche sauvage.
Exemple n°2 : souche IFP 967 (LMG P-32702),
C. acetobutylicum
ΔCA_C1340
C. acetobutylicumDSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L-1, extrait de levure 10 g L-1, glucose 5 g L-1, NaCl 4 g L-1) et CGM (KH2PO4, 0,75 g; K2HPO4, 0,75 g; MgSO4·7H2O, 0,40 g; MnSO4·H2O, 0,01 g; FeSO4·7 H2O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH4)2SO4, 2,0 g ; source de carbone comme précisé).Escherichia coliNEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L-1, extrait de levure 5 g L-1, NaCl 10 g L-1). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L-1d’agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L-1en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L-1respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L-1en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.
La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci-dessous :
CA_C1340_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO : 48)
CA_C1340_LHA_Rev : AGAAGTAGAAGAATTAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO : 49)
CA_C1340_RHA_Fwd : TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO : 50)
CA_C1340_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO : 51)
gRNA_CA_C1340_Fwd : TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA (SEQ ID NO : 52)
gRNA_CA_C1340_Rev : AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO : 53)
CA_C1340_verif_Fwd : CCTACCAATAGCATCGCCCAAGA (SEQ ID NO : 54)
CA_C1340_verif_Rev : TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO : 55)
Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :
- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 47)
Il contient l’origine de réplication p15A, ainsi que les gènesampRetkanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase deBacillus subtilis,nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dansC. acetobutylicum.
- Plasmide N°4 : pGRNA_ΔCA_C1340 (SEQ ID NO : 28)
Il contient tous les éléments du pGRNAind(Wasels et al. 2020) avec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C1340 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des amorces gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO : 52) et gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO : 53) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par BsaI. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C1340. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO : 49) et CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 50)/ CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO : 51) à partir de l’ADNg deC. acetobutylicumDSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et SalI.
Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la soucheC. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Waselset al.2020.
Edition génétique du gène CA_C1340 (SEQ ID NO : 3) :
L’inactivation du gène CA_C1340 dans les souches ΔCA_C1340 a été réalisée par édition génétique selon le protocole décrit par Waselset al.2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C1340_verif_Fwd (SEQ ID NO : 54) / CA_C1340_verif_Rev (SEQ ID NO : 55) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus le produit du gène CA_C1340 ou exprimant une version non fonctionnelle de celui-ci.
Cinétique de croissance et détermination du temps de génération
Des suivis de croissance des souches deC. acetobutylicumDSM 792 sauvage et ΔCA_C1340 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose ( ).
Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation du gène codant le répresseur AraR permet une amélioration de + 152 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.
Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souchesC. acetobutylicumDSM 792 sauvage et ΔCA_C1340 sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).
Les résultats indiquent que l’inactivation de CA_C1340 permet d’obtenir une cinétique de consommation de l’arabinose en présence de glucose plus rapide que celle observée chez la souche sauvage.
Exemple 3 : souche IFP 968 (LMG P-32703),
C. acetobutylicum
ΔCA_C1340-ΔCA_C2613-ΔCA_C3673
C. acetobutylicumDSM 792 a été cultivée en milieu 2YTG (Tryptone 16 g L-1, extrait de levure 10 g L-1, glucose 5 g L-1, NaCl 4 g L-1) et CGM (KH2PO4, 0,75 g; K2HPO4, 0,75 g; MgSO4·7H2O, 0,40 g; MnSO4·H2O, 0,01 g; FeSO4·7 H2O, 0,01 g; NaCl, 1,0 g; asparagine, 2,0 g; extrait de levure, 5,0 g; (NH4)2SO4, 2,0 g ; source de carbone comme précisé).Escherichia coliNEB 10-beta a été cultivée en milieu LB (Tryptone 10 g L-1, extrait de levure 5 g L-1, NaCl 10 g L-1). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g L-1d’agarose aux milieux liquides. De l’érythromycine (à des concentrations de 40 mg.L-1en milieu 2YTG), du chloramphénicol (25 ou 12,5 mg L-1respectivement en milieu LB solide ou liquide), du thiamphénicol (15 mg L-1en milieu 2YTG) ont été utilisés si nécessaire.
La liste des amorces ayant servies à l’ensemble des constructions (nom/séquence d’ADN) est détaillée ci-dessous :
CA_C1340_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCACCAGAAAAACCAACGCCTAGTA (SEQ ID NO : 48)
CA_C1340_LHA_Rev : AGAAGTAGAAGAATTAAAATTGAAATAATTTATATTTAGTCCCTTGCC (SEQ ID NO : 49)
CA_C1340_RHA_Fwd : TTTCAATTTTAATTCTTCTACTTCTTCATATTTGTGCT (SEQ ID NO : 50)
CA_C1340_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACTAATTACTCATTACATACGTTATTTTTCAGT (SEQ ID NO : 51)
gRNA_CA_C1340_Fwd : TCATTTTAAGGTCGATGATTCACA (SEQ ID NO : 52)
gRNA_CA_C1340_Rev : AAACTGTGAATCATCGACCTTAAA (SEQ ID NO : 53)
CA_C1340_verif_Fwd : CCTACCAATAGCATCGCCCAAGA (SEQ ID NO : 54)
CA_C1340_verif_Rev : TTCTAGCATAAAATACTCCTCCCTA (SEQ ID NO : 55)
CA_C2613_LHA_Fwd : AAAAAAGAATTCATTTGTCCACTTATACCAATTCCT (SEQ ID NO : 31)
CA_C2613_LHA_Rev : TCCTACTAGATACGGCGGAGTAAAATTAGT (SEQ ID NO : 32)
CA_C2613_RHA_Fwd : CTCCGCCGTATCTAGTAGGAATCTCCCACT (SEQ ID NO : 33)
CA_C2613_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACAAAGAGAAAATAAGAGGAATACAAAAG (SEQ ID NO : 34)
gRNA_CA_C2613_Fwd : TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT (SEQ ID NO : 35)
gRNA_CA_C2613_Rev : AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC (SEQ ID NO : 36)
CA_C2613_verif_Fwd : TCGGCAGCAAAAACTCCAGT (SEQ ID NO : 42)
CA_C2613_verif_Rev : GCAATTGCTGGCGGAATGAA (SEQ ID NO : 43)
CA_C3673_LHA_Fwd : AAAAAAGGATCCAGAAAGACTTGTTACATCTCTAAGT (SEQ ID NO : 37)
CA_C3673_LHA_Rev : TGATATAGACTTAATTGAACAAGATGTAATTTGAAATTAGT (SEQ ID NO : 38)
CA_C3673_RHA_Fwd : GTTCAATTAAGTCTATATCAAACATATCGCACCAACC (SEQ ID NO : 39)
CA_C3673_RHA_Rev : AAAAAAGTCGACATGATAATGGGAAATATATAGGAACTTT (SEQ ID NO : 40)
gRNA_CA_C3673_Fwd : TCATGGAGTAGCAAGCTCTACAGG (SEQ ID NO : 41)
gRNA_CA_C3673_Rev : AAACCCTGTAGAGCTTGCTACTCC (SEQ ID NO : 42)
CA_C3673_verif Fwd : TACTTCATACATATCTAACGCACTCT (SEQ ID NO : 44)
CA_C3673_verif Rev : AAATAACTTCTACTATGAGACAAGCA (SEQ ID NO : 45)
Les vecteurs plasmidiques suivants ont été construits :
- Plasmide N°1 : pBANak (SEQ ID NO : 52)
Il contient l’origine de réplication p15A, ainsi que les gènesampRetkanR, permettant respectivement de conférer les résistances à l’ampicilline et la kanamycine. Il contient également une cassette d’expression de la phi 3T I methyltransferase deBacillus subtilis,nécessaire à la méthylation des vecteurs d’édition génétique avant transformation dansC. acetobutylicum.
- Plasmide N°4 : pGRNA_ΔCA_C1340 (SEQ ID NO : 28)
Il contient tous les éléments du pGRNAind(Wasels et al.2020) avec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C1340 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des amorces gRNA_CA_C1340_Fwd (SEQ ID NO : 52) et gRNA_CA_C1340_Rev (SEQ ID NO : 53) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par BsaI. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C1340. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C1340_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 48) / CA_C1340_LHA_Rev (SEQ ID NO : 49) et CA_C1340_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 50)/ CA_C1340_RHA_Rev (SEQ ID NO : 51) à partir de l’ADNg deC. acetobutylicumDSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et SalI.
- Plasmide N°2 : pGRNA_ΔCA_C2613 (SEQ ID NO : 29)
Il contient tous les éléments du pGRNAindavec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C2613 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C2613_Fwd (SEQ ID NO : 35) et gRNA_CA_C2613_Rev (SEQ ID NO : 36) et intégré au plasmide par la technique du « golden gate assembly », après digestion par BsaI. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C2613. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C2613_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 31)/ CA_C2613_LHA_Rev (SEQ ID NO : 32) et CA_C2613_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 33) / CA_C2613_RHA_Rev (SEQ ID NO : 34) à partir de l’ADNg deC. acetobutylicumDSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et SalI.
- Plasmide N°3 : pGRNA_ΔCA_C3673 (SEQ ID NO : 30)
Il contient tous les éléments du pGRNAindavec une substitution de l’ARN guide permettant de cibler CA_C3673 (Oligo-20-mer obtenu par hybridation des primers gRNA_CA_C3673_Fwd (SEQ ID NO : 41) et gRNA_CA_C3673_Rev (SEQ ID NO : 42) et intégré au plasmide par la technique du golden gate assembly, après digestion par BsaI. Il contient également une matrice d’édition permettant l’inactivation de CA_C3673. Cette matrice d’édition a été construite par clonage des fragments LHA et RHA obtenus respectivement par amplification avec les couples de primers CA_C3673_LHA_Fwd (SEQ ID NO : 37) / CA_C3673_LHA_Rev (SEQ ID NO : 38) et CA_C3673_RHA_Fwd (SEQ ID NO : 39) / CA_C3673_RHA_Rev (SEQ ID NO : 40) à partir de l’ADNg deC. acetobutylicumDSM 792. La matrice d’édition a été clonée entre les sites de restriction BamHI et SalI.
Les plasmides préparés dans la souche NEB 10-beta ont été méthylés par transformation dans une souche NEB 10-beta contenant également le plasmide pBANak. Les plasmides méthylés ainsi extraits seront ensuite utilisés pour transformer la soucheC. acetobutylicum. La transformation est réalisée selon le protocole décrit par Waselset al.2020.
Edition génétique des gènes CA_C2613 (SEQ ID NO : 1), CA_C3673 (SEQ ID NO : 2) et/ou CA_C1340 (SEQ ID NO : 3) :
Les inactivations des gènes CA_C1340, CA_C2613 et CA_C3673 dans la souche ΔCA_C1340-ΔCA_C2613-ΔCA_C3673, a été réalisée par édition génétique selon le protocole décrit par Waselset al.2020, utilisant respectivement les couples d’amorces CA_C1340_verif_Fwd (SEQ ID NO : 54) / CA_C1340_verif_Rev (SEQ ID NO : 55) ; CA_C2613_verif_Fwd (SEQ ID NO : 43) / CA_C2613_verif_Rev (SEQ ID NO : 44) ; CA_C3673_verif_Fwd (SEQ ID NO : 45) / CA_C3673_verif_Rev (SEQ ID NO : 46) lors de la validation de l’édition. L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes CA_C1340, CA_C2613 et/ou CA_C3673, ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux-ci.
Cinétique de croissance et détermination du temps de génération
Des suivis de croissance des souches deC. acetobutylicumDSM 792 sauvage, et ΔCA_C1340 ΔCA_C2613 ΔCA_C3673 ont été réalisés en quintuplicat sur du milieu CGM contenant 30 mM de xylose ( ).
Les résultats révèlent une amélioration du temps de génération lors de croissance sur xylose comme source de carbone. En outre, l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet une amélioration de + 171 % du temps de génération par rapport à la souche sauvage.
Des suivis de consommation d’un mélange de sucre ont été réalisés en triplicats techniques avec les souchesC. acetobutylicumDSM 792 sauvage et ΔCA_C1340 ΔCA_C2613 ΔCA_C3673, sur un milieu CGM contenant 25 mM de glucose, 25 mM d’arabinose et 70 mM de xylose (Figure 6).
Les résultats indiquent que la coassimilation simultanée de l’arabinose et du glucose, est rendue possible lors de l’inactivation conjointe de CA_C1340 et des gènes CA_C2613 et CA_C3673.
La répression catabolique empêchant la coassimilation du xylose en présence des deux autres sucres est cependant maintenue. Ce résultat inattendu indique que la synergie entre l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR permet la levée de la répression catabolique pesant sur l’arabinose, tout en la maintenant pour le xylose.
Au cours de ce travail, les inventeurs sont parvenus à démontrer l’intérêt de l’inactivation conjointe des gènes codant les répresseurs AraR et XylR chez la soucheC. acetobutylicumDSM 792, décrivant ainsi que la combinaison de ces modifications génétiques permet l’obtention d’une souche deC. acetobutylicumréalisant la coassimilation glucose/arabinose et présentant une croissance accélérée sur xylose seul. L’inactivation du gènearaRseule ne permet pas une co-assimilation de l’arabinose et du glucose, qui n’est obtenue que lorsque les copies des gènes codant le répresseur XylR sont également inactivées. De plus, l’inactivation des deux copies du gène codant XylR n’est pas suffisante pour diminuer de façon significative le temps de génération du micro-organisme lorsqu’il croit sur un milieu contenant du xylose comme seule source de carbone. L’inactivation du gène codant AraR est nécessaire.
Ce résultat est important puisque cette souche souffre naturellement d’une incapacité à assimiler simultanément des pentoses et des hexoses tels que le glucose, l’arabinose et le xylose, impactant drastiquement les performances lors de fermentation sur des substrats composés d’un mélange de ces sucres, tels les substrats industriels de procédés de production de sucres à partir de biomasse.
Claims (15)
- Bactérie modifiée génétiquement appartenant à l’espèceClostridium acetobutylicum, caractérisée en ce que la bactérie n’exprime pas les produits des gènes de séquences SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci et de SEQ ID NO : 2 (CA_C3673) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci (« gènexylR»), et de SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci (« gènearaR»), ou ii) exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
- Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle est apte à fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose.
- Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle est apte à fermenter simultanément les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose, de préférence choisis parmi glucose, arabinose et xylose.
- Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle croît plus vite qu’une bactérie exprimant une protéine AraR fonctionnelle, ou un mélange des protéines XylR et AraR fonctionnelles, sur un milieu comprenant du xylose en tant qu’unique source de carbone.
- Bactérie selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la bactérie est la souche IFP 968 enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32703 auprès de la collection BCCM-LMG.
- Utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènesxylRetaraR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, pour fermenter simultanément au moins un hexose et un pentose ou les éléments carbonés d’un substrat comprenant au moins deux éléments carbonés choisis parmi glucose, arabinose, xylose, mannose et galactose.
- Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le substrat comprend au moins deux sucres choisis parmi glucose, arabinose et xylose.
- Utilisation selon la revendication 6 ou 7, pour produire un solvant, par exemple un biocarburant, ou un mélange de solvants, par exemple un mélange de biocarburants.
- Utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènesxylRetaraR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, pour produire un sucre ou une molécule biosourcée à partir i) d’une biomasse lignocellulosique, ii) du produit d’une culture dédiée particulière telle qu’une culture énergétique, une culture de plante pérenne fourragère, une culture d’herbacées, une culture arbustive, ou iii) de substrat(s) 1G issu(s) d’une ou plusieurs plantes sucrières, céréalières, ou oléagineuses, ou iv) d’un mélange de telles sources carbonées.
- Procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènesxylRetaraR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
- Procédé de production d’une bactérie recombinante appartenant à l’espèceClostridium acetobutylicum, caractérisé en ce que le procédé comprend la délétion ou l’inactivation des gènes de séquences SEQ ID NO : 1 (CA_C2613) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci et de SEQ ID NO : 2 (CA_C3673) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci (« gènexylR»), et de SEQ ID NO : 3 (CA_C1340) ou une séquence homologue à au moins 95% de celle-ci (« gènearaR»), de manière à empêcher ou diminuer l’expression de protéines XylR et AraR fonctionnelles.
- Bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridiumsusceptible d’être obtenue par le procédé selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite bactérie est une bactérie telle que décrite dans l’une des revendications 1 à 5.
- Utilisation d’une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridium, caractérisée en ce qu’elle n’exprime pas le produit du gènexylRouaraR, ou exprime une version non fonctionnelle du produit du gènexylRouaraR, pour préparer une bactérie modifiée génétiquement selon l’une des revendications 1 à 5 n’exprimant pas les produits des gènesxylRetaraR,ou exprimant des versions non fonctionnelles de ceux-ci.
- Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que la bactérie modifiée génétiquement n’exprimant pas le produit du gènexylRouaraR, ou exprimant une version non fonctionnelle du produit du gènexylRouaraR, est la souche IFP 967 enregistrée le 13 juin 2022 sous le numéro de dépôt LMG P-32702 auprès de la collection BCCM-LMG.
- Kit pour produire un solvant, un sucre ou une molécule biosourcée à l’aide d’une bactérie appartenant au genreClostridium, comprenant une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genreClostridiumcaractérisée en ce qu’elle n’exprime pas les produits des gènesxylRetaraR, ou exprime des versions non fonctionnelles de ceux-ci, et un milieu de conservation de ladite bactérie.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR2206411A FR3137108A1 (fr) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci |
PCT/FR2023/050965 WO2024003493A1 (fr) | 2022-06-27 | 2023-06-26 | Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR2206411A FR3137108A1 (fr) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci |
FR2206411 | 2022-06-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR3137108A1 true FR3137108A1 (fr) | 2023-12-29 |
Family
ID=84820011
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR2206411A Pending FR3137108A1 (fr) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR3137108A1 (fr) |
WO (1) | WO2024003493A1 (fr) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013159710A1 (fr) * | 2012-04-25 | 2013-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | Procédé pour améliorer le taux de consommation de xylose de clostridium beijerinckii |
WO2017064439A1 (fr) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | IFP Energies Nouvelles | Outil genetique de transformation de bacteries clostridium |
-
2022
- 2022-06-27 FR FR2206411A patent/FR3137108A1/fr active Pending
-
2023
- 2023-06-26 WO PCT/FR2023/050965 patent/WO2024003493A1/fr unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013159710A1 (fr) * | 2012-04-25 | 2013-10-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | Procédé pour améliorer le taux de consommation de xylose de clostridium beijerinckii |
WO2017064439A1 (fr) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | IFP Energies Nouvelles | Outil genetique de transformation de bacteries clostridium |
Non-Patent Citations (18)
Title |
---|
BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 22, no. 3, pages 673 - 680 |
DELAROUZÉE ALEXANDRE ET AL: "Alleviation of Carbon Catabolite Repression through araR and xylR Inactivation in Clostridium acetobutylicum DSM 792", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 13 February 2023 (2023-02-13), US, XP093033991, ISSN: 0099-2240, Retrieved from the Internet <URL:https://journals.asm.org/doi/pdf/10.1128/aem.02135-22> DOI: 10.1128/aem.02135-22 * |
EZEJI, THADDEUSBLASCHEK, HANS P: "Fermentation of dried distillers' grains and solubles (DDGS) hydrolysates to solvents and value-added products by sol-ventogenic clostridia", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 99, no. 12, 2008, pages 5232 - 5242 |
EZEJI, THADDEUSQURESHI, NASIBBLASCHEK, HANS P.: "Butanol production from agricultural residues. Impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation.", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 97, no. 6, 2007, pages 1460 - 1469, XP071166444, DOI: 10.1002/bit.21373 |
GRIMMLER, CHRISTINAHELD, CLAUDIALIEBL, WOLFGANGEHRENREICH, ARMIN: "Transcriptional analysis of catabolite repression in Clostridium acetobutylicum growing on mixtures of D-glucose and D-xylose", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 150, no. 3, 2010, pages 315 - 323, XP027483999, DOI: 10.1016/j.jbiotec.2010.09.938 |
GU, YANGDING, YIREN, CONGSUN, ZHERODIONOV, DMITRY A.ZHANG, WEIWEN ET AL.: "Reconstruction of xylose utilization pathway and régulons in Firmicutes.", BMC GENOMICS, vol. 11, 2010, pages 255 |
HU SHIYUAN ET AL: "Comparative genomic and transcriptomic analysis revealed genetic characteristics related to solvent formation and xylose utilization in Clostridium acetobutylicum EA 2018", BMC GENOMICS, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 12, no. 1, 2 February 2011 (2011-02-02), pages 93, XP021086510, ISSN: 1471-2164, DOI: 10.1186/1471-2164-12-93 * |
HU, SHIYUANZHENG, HUAJUNGU, YANGZHAO, JINGBOZHANG, WEIWENYANG, YUNLIU ET AL.: "Comparative genomic and transcriptomic analysis revealed genetic characteristics related to solvent formation and xylose utilization in Clostridium acetobutylicum EA 2018", BMC GENOMICS, vol. 12, 2011, pages 1 |
KEIS, S.SHAHEEN, R.JONES, D. T.: "Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii, and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp. nov. and Clostridium saccharobutylicum sp. nov.", INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY, vol. 51, no. 6, 2001, pages 2095 - 2103, XP002543381 |
QURESHI, NASIBEZEJI, THADDEUS C.EBENER, JENNIFERDIEN, BRUCE S.COTTA, MICHAEL A.BLASCHEK, HANS P.: "Butanol production by Clostridium beijerinckii. Part I. Use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 99, no. 13, 2008, pages 5915 - 5922, XP022647443, DOI: 10.1016/j.biortech.2007.09.087 |
SERVINSKY MATTHEW D. ET AL: "Arabinose-inducible catabolite repression as a mechanism for pentose hierarchy in Pentose Sugar Metabolism in Clostridium acetobutylicum ATCC 824", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 3, no. 2, 1 October 2018 (2018-10-01), US, pages 1452 - 1462, XP093034830, ISSN: 0099-2240, Retrieved from the Internet <URL:https://journals.asm.org/doi/pdf/10.1128/AEM.03199-14> DOI: 10.1128/AEM.03199-14 * |
SERVINSKY, M. D.GERMANE, K. L.LIU, S.KIEL, J. T.CLARK, A. M.SHANKAR, J.SUND, C. J.: "Arabinose is metabolized via a phosphoketolase pathway in Clostridium acetobutylicum ATCC 824", JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY, vol. 39, no. 12, 2012, pages 1859 - 1867 |
SERVINSKY, MATTHEW D.KIEL, JAMES T.DUPUY, NICOLE F.SUND, CHRISTIAN J.: "Transcriptional analysis of differential carbohydrate utilization by Clostridium acetobutylicum.", MICROBIOLOGY (READING, ENGLAND, vol. 156, 2010, pages 3478 - 3491 |
WASELS, FRANÇOISCHARTIER, GWLADYSHOCQ, RÉMILOPES FERREIRA, NICOLASJULIA PETTINARI, M.: "A CRISPR/Anti-CRISPR Genome Editing Approach Underlines the Synergy of Butanol Dehydrogenases in Clostridium acetobutylicum DSM 792", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 86, no. 13, 2020, pages 4823 - 1462 |
WEN ZHIQIANG ET AL: "Metabolic Engineering of Clostridium cellulovorans to Improve Butanol Production by Consolidated Bioprocessing", ACS SYNTHETIC BIOLOGY, vol. 9, no. 2, 15 January 2020 (2020-01-15), Washington DC ,USA, pages 304 - 315, XP093033997, ISSN: 2161-5063, Retrieved from the Internet <URL:https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acssynbio.9b00331> DOI: 10.1021/acssynbio.9b00331 * |
XIAO, HANLI, ZHILINJIANG, YUYANG, YUNLIUJIANG, WEIHONGGU, YANGYANG, SHENG: "Metabolic engineering of D-xylose pathway in Clostridium beijerinckii to optimize solvent production from xylose mother liquid", METABOLIC ENGINEERING, vol. 14, no. 5, 2012, pages 569 - 578 |
YANG GU ET AL: "Reconstruction of xylose utilization pathway and regulons in Firmicutes", BMC GENOMICS, vol. 11, no. 1, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 255, XP055177801, ISSN: 1471-2164, DOI: 10.1186/1471-2164-11-255 * |
ZHANG, LEILEYN, SEMEN A.GU, YANGJIANG, WEIHONGRODIONOV, DMITRY A.YANG, CHEN: "Ribulokinase and transcriptional régulation of arabinose metabolism in Clostridium acetobutylicum", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 194, no. 5, 2012, pages 1055 - 1064 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2024003493A1 (fr) | 2024-01-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3362559B1 (fr) | Outil genetique de transformation de bacteries clostridium | |
JP5185940B2 (ja) | キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生 | |
JP5346808B2 (ja) | エタノール産生のためのキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)のキシリトール合成変異体 | |
US7629156B2 (en) | Ethanol production in fermentation of mixed sugars containing xylose | |
EP0737742A2 (fr) | Fermentation de pentose par des Zymomonas recombinantes | |
EP2646544B1 (fr) | Procédé de preparation d'une levure industrielle, levure industrielle et application à la production d'ethanol a partir d'au moins un pentose | |
JP2013505739A (ja) | 乳酸菌におけるアセト乳酸誘導生成物への改善されたフラックス | |
US20130273601A1 (en) | Pentose and glucose fermenting yeast cell | |
JPH09505469A (ja) | グルコースおよびキシロースの効果的発酵用の組み換え酵母 | |
WO2006096130A1 (fr) | Souches de saccharomyces cerevisiae capables de faire fermenter l'arabinose et le xylose | |
CA2794843C (fr) | Levure industrielle, apte a produire de l'ethanol a partir d'au moins un pentose | |
FR3081881A1 (fr) | Outil genetique optimise pour modifier les bacteries du genre clostridium | |
US10767155B2 (en) | Method of preparing a strain of Saccharomyces cerevisiae and a method of fermentation to produce ethanol | |
US5821093A (en) | Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes | |
US20070172937A1 (en) | Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes | |
US11535872B2 (en) | Microbial strains and uses thereof | |
CN103695329A (zh) | 具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法 | |
FR3137108A1 (fr) | Bacteries clostridium modifiees pour assimiler plusieurs sucres simultanement, preparation et utilisations de celles-ci | |
KR101548480B1 (ko) | 혼합당 동시발효능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 생산 방법 | |
EP2516621A1 (fr) | Thermoanaerobacter italicus subsp. marato thermophile a productivite d'alcool elevee | |
CA2880181C (fr) | Micro-organisme recombine ayant une capacite accrue pour produire du butanol, et procede de production de butanol utilisant ledit micro-organisme | |
KR101432072B1 (ko) | FrsA를 발현하는 균주 및 이를 이용한 에탄올 생산방법 | |
AU698662B2 (en) | Pentose fermentation by recombinant zymomonas | |
WO2020240122A1 (fr) | Outil genetique optimisé pour modifier les bacteries |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20231229 |