CN113637621A - 一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组菌技术领域，特别是涉及一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用。所述减毒炭疽芽孢杆菌包括降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性得到的菌。本发明通过Cre‑loxP系统结合自杀质粒介导的同源重组将炭疽芽孢杆菌A16R中编码Npr599蛋白和编码MntA蛋白的基因进行敲除，从而构建的减毒炭疽芽孢杆菌A16R‑NM菌株，所述的A16R‑NM菌株胞外蛋白酶活性与毒力较现有炭疽芽孢杆菌疫苗株A16R都有明显降低，能稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，可用于制备稳定免疫的炭疽芽孢杆菌减毒活疫苗。

Description

一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及重组菌技术领域，特别是涉及一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用。

背景技术

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是烈性传染病炭疽的病原菌，可感染人和动物。目前批准使用的炭疽疫苗主要分两大类，一类是中国和俄罗斯使用的减毒活芽孢疫苗，另一类是以美国的AVA疫苗和英国的AVP疫苗为代表的炭疽杆菌培养上清过滤后加铝盐佐剂吸附制备而成的蛋白疫苗。正常情况下，蛋白组分疫苗使用注射接种不便于群体免疫，且保存期不够理想，而活芽孢疫苗具有不必纯化抗原、易于大量生产、使用方便、保存期长等优点，在一定程度上符合炭疽疫苗开发研制的发展方向。

构建新型的减毒炭疽芽孢杆菌作为炭疽疫苗是研究新型炭疽杆菌疫苗的一种重要策略，如以色列的IIBR(Israel Institute forBiological Research)的研究人员通过缺失炭疽芽孢杆菌sterne株的htrA基因，构建了新的疫苗候选株，动物安全性实验显示，该菌株针对豚鼠的LD₅₀较sterne株提高了4个数量级以上，针对小鼠和兔子的LD₅₀也有不同程度的提高，表明其安全性较出发菌株有了极大的提高。动物免疫有效性实验显示，以1*10⁹剂量经皮下注射免疫豚鼠和兔子，仅通过一次免疫对100LD₅₀强毒株攻毒就能达到100％的保护，而且保护效果能够持续至少50周，可见减毒炭疽芽孢杆菌活芽孢疫苗具有良好的研究前景。

发明内容

为了实现上述目标，，本发明提供了一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用。本发明提供的减毒炭疽芽孢杆菌胞外蛋白酶活性与毒力较现有疫苗株A16R都有明显降低，能稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，可用于制备稳定免疫的炭疽芽孢杆菌减毒活疫苗。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌，所述减毒炭疽芽孢杆菌包括降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性得到的菌。

优选的，所述降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性包括沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达。

优选的，所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达包括采用Cre-loxP重组酶系统结合自杀质粒介导的同源重组的方式进行。

优选的，所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因采用的同源重组的Npr599蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的第1～867位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因采用的同源重组的Npr599蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的第2569～3395位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中MntA蛋白编码基因采用的同源重组的MntA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的第1～958位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中MntA蛋白编码基因采用的同源重组的MntA蛋白编码基因的下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的第1895～2875位。

优选的，所述Npr599蛋白编码基因上游同源臂的扩增引物包括Npr599uF和Npr599uR；所述Npr599uF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Npr599uR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述Npr599蛋白编码基因下游同源臂的扩增引物包括Npr599dF和Npr599dR；所述Npr599dF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述Npr599dR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述MntA蛋白编码基因上游同源臂的扩增引物包括MntAuF和MntAuR；所述MntAuF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述MntAuR的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述MntA蛋白编码基因下游同源臂的扩增引物包括MntAdF和MntAdR；所述MntA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述MntAdR的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

优选的，所述减毒炭疽芽孢杆菌的保藏号为CGMCC NO.22619。

本发明还提供了上述的减毒炭疽芽孢杆菌在制备预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品中的应用。

本发明还提供了上述的减毒炭疽芽孢杆菌在制备炭疽杆菌减毒活疫苗中的应用。

本发明还提供了一种预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品，其活性成分包括上述的减毒炭疽芽孢杆菌。

本发明还提供了一种炭疽杆菌疫苗，其活性成分包括上述的减毒炭疽芽孢杆菌。

有益效果：

本发明提供了一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌，所述减毒炭疽芽孢杆菌包括降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性得到的菌。本发明通过Cre-loxP系统结合自杀质粒介导的同源重组将炭疽芽孢杆菌A16R中编码Npr599蛋白和编码MntA蛋白的基因进行敲除，从而构建的减毒炭疽芽孢杆菌A16R-NM菌株，所述的A16R-NM菌株胞外蛋白酶活性与毒力较现有疫苗株A16R都有明显降低，能稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，可用于制备稳定免疫的炭疽芽孢杆菌减毒活疫苗。

生物保藏说明：

炭疽芽孢杆菌A16R-NM菌株，拉丁名为Bacillus anthracis，于2021年5月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.22619。

附图说明

图1为重组质粒构建示意图；

图2为基因敲除过程示意图；

图3为npr599基因敲除PCR鉴定结果，其中泳道M为分子量Marker，泳道1为重组炭疽芽孢杆菌A16R结果，泳道2为重组炭疽芽孢杆菌A16R-N扩增结果；

图4为mntA基因敲除PCR鉴定结果，其中泳道M为分子量Marker，泳道1为重组炭疽芽孢杆菌A16R扩增结果，泳道2为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM扩增结果；

图5为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM的胞外蛋白酶活性分析结果；

图6为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM生长曲线的结果；

图7为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM的芽孢形成能力分析结果；

图8为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM免疫印迹分析PA表达结果，其中第一泳道为A16R对照，第二泳道为A16R-NM；

图9为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM小鼠毒力评价结果；

图10为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM小鼠免疫评价实验结果；

图11为重组炭疽芽孢杆菌A16R-NM小鼠免疫保护实验结果。

具体实施方式

本发明提供了一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌，所述减毒炭疽芽孢杆菌包括降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性得到的菌。

在本发明中，所述降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性优选包括沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达；所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达优选包括采用Cre-loxP重组酶系统结合自杀质粒介导的同源重组的方式进行。本发明对所述Cre-loxP重组酶系统结合自杀质粒介导的同源重组的方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

在本发明中，所述Npr599蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列优选为SEQ IDNO.1所示：ATTGCGGTAAGTTATACAGAAAAAGGTCAGTATGAAGAAGCTTTAAAAATGTATGAAAGTATATTGAGAGAGTCCGCATCTTTTGCTGATAAGGATGTACTTTTAGCTATTACTTTAAGTAATATGGGAAGCATCTATTATAAAAAAGGCAAATATCAGCAAGCAAAAAAATATTATTTAGATAGTCTACAACTTCAAAAACAAATAGATTTAAATTATTTAGATACAATATATGAAATGGCAGTAGTATGCATTAAATTAGAAGAGTTAGAGGAGGCAAAGGCATTAATTGATAAGGGAATTGATGCAGCAAAACAAGAAGAGAGGTTTAATGCAAAATTATACTTGCTTTTAATGCTTAGATATAAATATTTTGAAGAAGCGAAAGATTATAAAGCATTTTTGGAAAATGAGGCTATCCCGTTGTATAAATCTGCGGGAAATAAAATAGAATTAAAGAAAGTATACATTGAACTAGCAGAACATTTTTCCAGTTTATCGAGATTTGAAGAAAGCAATCGATATTATAGGTTAGTTATTGATTTAATGAATGATAAGGAGGAATAAAAATGAAAAAGATGGTATTTGGAGCATTAGCATTTATAGTGACTCTTACAGTTGCTGGAGGAATACATCAGTATAGCAGTAAACCTGATATTGTTGGTCAAGAAGCTAAAACAGTGCAACAAATTAATTCATAATTGAAAACCCCTTTCCAACCGGAAAGGGGTTTTTCAATATTTGTTCCCCAAAATTCTACAAAACTTGAGAAATAAATTAATTGAATTTTTAGTATATTAATAGTGAAAACATAATGCTAATATGAAACTACTCTTTTTCAAAAAAAAATTATTAGGGGGAAGGTTCATGAAAAAGAAAAGTTTAGCGTTAGTGTTAGCGACAGGAATGGCAGTTACAACGTTTGGAGGGACAGGCTCTGCTTTTGCAGATTCTAAAAATGTGCTCTCTACGAAGAAGTACAATGAGACAGTACAGTCACCGGAGTTTATTTCTGGGGATTTAACTGAAGCAACTGGTAAGAAAGCAGAATCTGTTGTGTTTGATTACTTAAATGCAGCAAAAGGTGATTATAAGTTAGGGGAAAAGAGTGCGCAAGATTCTTTCAAAGTGAAACAAGCGAAGAAAGATGCTGTAACTGATTCAACAGTATTACGTTTGCAACAAGTTTACGAAGGAGTACCTGTATGGGGTTCTACGCAAGTAGCTCACGTAAGTAAAGATGGTTCATTAAAAGTATTGTCTGGAACAGTTGCACCTGATTTAGACAAAAAAGAAAAGTTGAAAAATAAAAATAAGATCGAAGGCGCAAAAGCAATTGAAATTGCGCAAAAAGATTTAGGTGTTACACCTAAATATGAGGTAGAACCAAAAGCGGACTTATATGTATATCAAAATGGTGAAGAAACAACATATGCATACGTTGTAAATTTAAACTTCTTAGAGCCAAGCCCAGGAAACTACTACTATTTCATTGAAGCGGACAGCGGTAAAGTATTAAATAAATATAATAAATTGGATCATGTAGCAAATGAAGATAAGTCACCAGTTAAGCAAGAGGCACCTAAACAAGAAGCGAAACCGGCTGTAAAGCCTGTAACAGGCACAAATGCAGTGGGTACTGGTAAAGGTGTATTAGGAGATACGAAGTCACTTAATACAACGTTATCTGCATCATCTTACTATTTACAAGATAATACGCGCGGAGCAACGATTTTCACATATGATGCGAAAAACCGCTCAACATTACCAGGAACGTTATGGGTAGATGCGGATAATGTTTTCAATGCAGCGTATGATGCAGCGGCAGTAGATGCTCACTACTATGCTGGTAGAACATATGATTACTATAAAGCGACATTTAATAGAAACTCTATTAATGATGCAGGAGCACCATTAAAATCAACAGTTCATTATGGAAGTAGATATAATAATGCGTTCTGGAATGGCTCTCAAATGGTATACGGAGATGGTGATGGTGTAACATTCACTTCATTGTCTGGTGGAATTGATGTAATTGGCCATGAATTAACGCATGCTGTTACAGAGTATAGCTCAGATTTAATTTATCAAAATGAATCAGGAGCATTAAATGAAGCTATTTCAGATGTATTTGGTACATTAGTAGAGTATTATGATAACCGTAACCCTGATTGGGAAATTGGTGAAGATATTTACACGCCTGGTAAAGCTGGAGATGCACTTCGCTCTATGAGTGATCCAACGAAATATGGTGATCCAGATCATTATTCTAAGCGTTACACAGGTACTGGTGATAACGGTGGCGTTCATACAAATAGCGGTATTATTAACAAAGCGGCTTACTTACTAGCGAATGGTGGTACGCATTACGGTGTTACTGTAAACGGTATTGGTAAAGATAAAGTAGGAGCGATTTATTACCGTGCAAATACGCAATATTTCACACAATCTACTACGTTTAGTCAAGCTCGTGCTGGATTAGTACAAGCTGCAGCTGACTTATATGGTGCTAGCTCTGCAGAAGTAGCAGCAGTTAAGCAATCATATAGTGCTGTTGGCGTAAACTAAGGCTTTAAGGGATAGTTATAATAAAATACCTCAAAAATAAAGAAGGAGCATAGGCTCCTTCTTTATTTTTTTCTCCATTTTTTCCACAAATAAAACAACCCAATAGCGCCCGCGATTGTTACAATCCACTTCGCTTCATTTGTTCCATTGATAACATGATATGCCGAATATACTTCAATCAATAAAGCCGGTATTTTACCTATTGTACTGGCAATACTGAAGGATAGTAATGACATTTTACCTAGAGCTGCAAATAAAGTAACGATACTGGATGGGATAAAAGGTATCAATCGGAATGATAGGACGAGTAGAAAGGCCTCTTTACCTTTTACATAAAGGAGGCGTTCTACCTTTGGATACTTATTTACTTTGCTGTGAGTGAATTTCTGAAGGCCTATACGATAAATATAAAACGAGATAATAGCCCCTAATGCCTCACCTGCGATCGAAATAATGGTTCCGTTTGTTACACCGAAGAGCTGTATGTTAATAGCGGTCAAAAAAATACTAGGGATAAAACCTAAAAGACTGATGATGATGTTAATTAAGATACTAAGTGGAATTGCGATTGAATAATAGTCTGTTAAGAAGTTTTGAATTGTTTCAGCCATTGTTTAAAATCCTTTATCTTTTTTTGCATTACACCATATTTCCATTGTGTAGGCAAGTACAAATTTACATAATGTAGAAAACGTTGATAAAAAAACCATCCGTATACCTTATATAGGTATTGGGTATATGAAATCAGGGATATATTTTAATAACTTAAAAAACACCAAACGAACCCTTTATTTAAAAGATTTATTTGGTGTTTTTATAGGCATTTA的第1～867位；所述Npr599蛋白编码基因上游同源臂的扩增引物优选包括Npr599uF和Npr599uR；所述Npr599uF的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示：TTTGGTCTCCTGACATTGCGGTAAGTTATACAG，所述Npr599uR的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示：TTTGGTCTCAGATCGAACCTTCCCCCTAAT；Npr599蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列优选为SEQ ID NO.1所示的第2569～3395位；所述Npr599蛋白编码基因下游同源臂的扩增引物优选包括Npr599dF和Npr599dR；所述Npr599dF的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示：TTTGGTCTCGAATTGGCTTTAAGGGATAGTT，所述Npr599dR的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示：TTTGGTCTCCCCAATAAATGCCTATAAAAACACC；

在本发明中，所述MntA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列优选为SEQ IDNO.2所示：GAACCAACTGTTATGTCAAAAGCATATGTGAATCAAGGAATATTGTTTAATAATGCGGCGGAGGTACATTCATCATGAAGATTGTAGAATTTATAGATGCATTAACGCAGTACAGTTTTCTGCAGAAGGCGTTGTTAACTTCCGTTATGGTAGGAATTATCTGTGGTGTCATTGGGTGTTTTATTATTTTACGAGGTATGGCATTAATGGGTGATGCCATTTCACATGCCGTTCTTCCTGGAGTAGCGCTTTCTTATATGATTGGAATGAACTATTTCATAGGAGCTGTTTTAACAGGTGTTATTACTGCAGTTGGAATTGGTTTTGTAAGTCAAAATAGTCGTATTAAACATGATATGGCGATAGGGATTATGTTCACATCTGTATTTGCTGTAGGGATTATTTTAATTACCTTTATGAAGAGTAGTTCAGATTTATATCATATTTTATTCGGGAACGTCCTATCAGTCCGTTCTTCCGATATGTGGATGACACTTATTATTGGAGTAGTTATTATTGGCCTTGTCATGCTGTTTTACAAAGAATTACTCGTATCCACTTTTGATCCAACAATGGCGCAAAGTTATGGATTGCCGAACAAATGGATTCATTATGGCTTAATGATTCTTCTTACAATGGTGACAGTCGCATCCCTTCAAACTGTTGGAATTATTCTAGTTGTTGCCATGCTTATCACACCGGCGGCTACAGCGTATTTATTAACAAATCGTTTATGGGTCATGATTTATTTAGCGGCAGGCATCGGTGCACTTTCATCTGTAGTAGGGTTATATTTTAGTTTCTCTTATAATCTTGCTTCAGGTGCGACAATTGTTCTTGTTGCAACATTCTTGTTCGCATTAGCATTCTTTTTCTCACCGTCACAAGGTTTGTTTTGGAGAGCTATCAAAATTAGAAAAAATAGAGCAGAGTTGTCATAATTGATTGGAGGATAAAAATGAAATTTAAAAATGTTGTATTATCGATACTTTGTATTTTCGTATTTGCATTAACAGCGTGTTCTAGTAACACAAATGGAAAAGAAGAGGGCAGTGGAAAATTAAAAGTTGTAACTACATACTCCATTATATATGATATGGTGAAGCAAATTGGCGGAGAGAAAGTTGAGATTCATAGTCTTGTTCCAATTGGAGCTAACCCGCATGAATATGATCCACTACCAAAAGATGTTATGAAAATGACAGATGCAGATATGGTTCTTTACAATGGATTGAACCTAGAAGAAGGTGGAGCGTGGTTTAAAAAGCTATTAAAAACGGCAAATAAATCAGAGAAAGATGCACCGGTTTATAAAGTAAGTGAAGGCGTAGAAGCTATTTATTTAGAGACAAAAGGATTAGAAAAAGAACCAGACCCGCATGCATGGATGAACATTAAAAATGGTATTTTATATGCTGAAAATGTGAAAAAGGCATTAATTAAAGAAGACCCTAAAAATAAAGAGTTCTATACTAAAAATGCTGACAACTATGTAGCAGAACTTCAAAAGTTACATGATGAGACAGTAAACAGAATTCATCAAATCCCTGAGGAGAAACGGTTCTTAATCTCTAGTGAAGGTGCTTTTAAATACTTTGGAAAAGCATATGATATTAAAACGGGATACATTTGGGAAATTAACTCAGAAAATCAAGGTACACCAGATCAAATTCGAGATGTTGTAAGTGTAATTCAAACAAATAAAGTTCCGGCTCTATTTGTAGAAACTAGTGTAGATCGACGCAGCATGGAAACTGTTTCAAAAGAAACAAACGTGCCAATTGCAGGTACAATTTTTACAGATTCACTAGGTAAATCAGGTGAGGATGGAGATACGTATTTAAAAATGATGAAATGGAATATAGATACCATTATTAATGGGTTACAAAAGTAAAATCTAGCTTGTGTAACTGTTGAAGTTTTATAAGGTAAGGAAGAGCCAACTCATGTGAATTGGCTCTTTTTTTGTATCATGTTTATTAATAATTTGGCTGAATATACCTTAGTTACATTCGCTTCGTAACAGATTCTAAAGAAGATGAGACAATATTACCAAAAGCATCACCTTCCCAAATCCCATTACCTTTAAAATGAGGAAAGTTTAATATAATGGACATAAACGATGCTTATACATGTAAAGTAAGAGGTCATGAAAAGGAGTAAAGACTGCTAATTTTCATACGCTTTGATTATGTAAAAATAGAGGGGATGGCATGAAAGACAATATTCCTTAGAAAGTTTTATTTATTTTGGTAATTAAGGGGTTCACGTGAGGAATGTAATTATAGTATGTCATTCATGATAAACGAATCATACAATTCTTAAACCATATTCATTTCATGGGCTTGAAAATGTAGTCTAACCATATTAGCATCGATAAACATGAAGTTAAATGTTTGGTGCTTTTAACTAGAGTGAACTCTCGCATTTTATAAAAATCATTTACGAAAAAGGGATTTGGGTAATTTTCTTGAATTTATTTATTCAGAAAAAACAATTTTGAATTGGAACTAATTTACATCCAATAATTAGAGGAGATTAAAAATGAATCACTTTTTTGTAGAATTTGGTGAATACCAAGCAAGTGTTTGTGAATGGGGGGATAAAAGTAACCCTCAAATCATTTGTTTTCATGGTTTAGGAAGTACAAAGTTAAGTTTTATAGAAATGGCGGAATTTCTAAAAGATAAATATCATGTTGTATCGTTTGATCTACCTGGACATGGGAAAACACCAAATTTTGAGACGGATGAAGATTACGGTGCATCCCATTTAATAAATTGGGTAGTAGCATTACTTGAGCACATAGGAAAAGAAACATTTCACCTATTAGCACATTCATGGGGAGCAAGCGTTGCGCTTCACTATGCAGCAG的第1～958位；所述MntA蛋白编码基因上游同源臂的扩增引物优选包括MntAuF和MntAuR；所述MntAuF的核苷酸序列优选如12所示：TTTGGTCTCCTGACGAACCAACTGTTATGTC，所述MntAuR的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.13所示：TTTGGTCTCAGATCTTTTATCCTCCAATCA；

MntA蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列优选为SEQ ID NO.2所示的第1895～2875位；所述MntA蛋白编码基因下游同源臂的扩增引物包括MntAdF和MntAdR；所述MntAdF的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示：TTTGGTCTCGAATTAATCTAGCTTGTGTAACTG，所述MntAdR的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示：TTTGGTCTCCCCAACGGAATTCCTGCTGCATAGTGAAG。

本发明还提供了上述的减毒炭疽芽孢杆菌在制备炭疽杆菌减毒活疫苗中的应用。本发明提供的减毒炭疽芽孢杆菌胞外蛋白酶活性与毒力较现有疫苗株A16R都有明显降低，能稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，可用于制备稳定免疫的减毒炭疽芽孢杆菌活疫苗。

本发明还提供了上述的减毒炭疽芽孢杆菌在制备预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品中的应用。本发明提供的减毒炭疽芽孢杆菌胞外蛋白酶活性与毒力较现有疫苗株A16R都有明显降低，能稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，可用于制备预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品。

本发明还提供了一种炭疽杆菌减毒活疫苗，其活性成分包括上述的减毒炭疽芽孢杆菌。

本发明还提供了一种预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品，其活性成分优选包括上述的减毒炭疽芽孢杆菌。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌A16R-NM的构建。

一、npr599基因的敲除

1.npr599基因敲除质粒的构建

以炭疽杆菌A16R株(炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析董梅，庄汉澜，王希良军事医学科学院院刊2009年2月第33卷第1期；中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生物工程研究所已保存)基因组DNA为模板，分别扩增npr599基因上下游同源臂。上游同源臂的扩增引物为Npr599uF和Npr599uR；下游同源臂的扩增引物为Npr599dF和Npr599dR，得到867bp的npr599基因上游同源臂(SEQ ID NO.1所示的第1～867位核苷酸)和827bp的npr599基因下游同源臂(SEQ ID NO.1所示的第2569～3395位核苷酸)，以质粒pUC-spcR(携带有两端带loxP识别位点壮观霉素抗性基因(SEQ ID NO.3所示)，由安徽通用生物合成并克隆到pUC57载体)中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生物工程研究所已保存)为模板，利用spcF和spcR引物扩增两端带loxP识别位点壮观霉素抗性基因片段，上述三个片段分别克隆到商业化的T载体pEZclone-NRS-Amp-Blunt-HC(购自北京中美泰和生物技术有限公司，货号C5851-25)，经测序鉴定正确后获得三个重组质粒，分别命名为pT-Up-Npr599、pT-Down-Npr599和pT-spcR。

Npr599uF:TTTGGTCTCCTGACATTGCGGTAAGTTATACAG(BsaI)(SEQ ID NO.4所示)

Npr599uR:TTTGGTCTCAGATCGAACCTTCCCCCTAAT(BsaI)(SEQ ID NO.5所示)

Npr599dF:TTTGGTCTCGAATTGGCTTTAAGGGATAGTT(BsaI)(SEQ ID NO.6所示)

Npr599dR:TTTGGTCTCCCCAATAAATGCCTATAAAAACACC(BsaI)(SEQ ID NO.7所示)

spcF:TTTGGTCTCAGATCTTAGGGATAACAGGG(BsaI)(SEQ ID NO.8所示)

spcR:TTTGGTCTCGAATTCCCATGGCGACGCG(BsaI)(SEQ ID NO.9所示)

上述3个重组质粒利用Golden-Gate的方法与重组质粒pKMBKI(Wang TT,etal.Construction of a high-efficiency cloning system using the Golden Gatemethod and I-SceI endonuclease for targeted gene replacement in Bacillusanthracis.Journal of Biotechnology,2018,271:8–16.中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存)连接(Golden-Gate试剂盒购自NEB公司，货号E1600S)，将目标片段按设计的顺序克隆到目标质粒pKMBKI正确位置，如图1所示。连接后完成后Golden-Gate反应产物再转化DH5ɑ取连接正确的质粒进行测序，得到鉴定正确的重组质粒再电转化E.coliSCS110。从电转化得到的电转E.coli SCS110中提取质粒得到去甲基化的打靶用质粒，命名为pKMBKI-Npr599。

重组质粒pKMBKI-Npr599为将SEQ ID NO.1所示的第1～867位所示的Npr599基因上游同源臂片段、两端带loxP识别位点壮观霉素抗性基因片段(SEQ ID NO.3所示：AGATCTTAGGGATAACAGGGTAATGGAATTCAGGTCGACGGCCCCCGGGCGGGATCCGTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGACGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACGTAACGTGACTGGCAAGAGATATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAaAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTTTAGAAAACAACTGCAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGCATGCTGACGCGTCGCCATGGGAATTC)和SEQ ID NO.1所示的第2569～3395位位所示的npr599基因下游同源臂片段插入质粒pKMBKI的两个BsaI位点之间。

2、npr599基因的无痕敲除

npr599基因敲除的大致过程如图2所示。

从-70℃保存的B.anthracis A16R菌种中划线分离单菌落，接种于5mL BHIG(HBI培养基加0.5％甘油)培养基中，37℃过夜培养。将过夜培养物按1％的比例接种到100mL新的BHIG培养基(Bacto^TM Brain Heart Infusion,BHI，BD公司，货号237500，使用时添加0.5％甘油)中，37℃剧烈振荡培养。当OD₆₀₀值达到0.5～0.6时(2小时)，从摇床中取出，离心收集菌体，用含1mM的HEPES的10％甘油洗三次，最后用1/10体积10％甘油(含1mM的HEPES)重悬菌体，分装得到电转化感受态。

每40μL感受态细胞加5μL(约1.5μg)质粒pSS4332(Plaut RD and StibitzS.Improvements to a Markerless Allelic Exchange System for Bacillus.PLoS ONE10(12):e0142758.中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存)，混合后于0.1cm电击杯中冰浴5分钟，然后用Bio-Rad电转仪进行电转化，条件为：1.8kV、200Ω和25μF。电击完毕后立即加入1mL冰冷的LB培养基，30度孵育2.5小时。分别取200和800μL涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。得到转化子A16R/pSS4332。

取转化子A16R/pSS4332接种于5mL BHIG含卡那霉素(50μg/mL)培养基，37℃过夜培养。然后按上述方法制备感受态。

质粒pKMBKI-Npr599按上述方法电转化入AP429/pSS4332中，最后取200μL涂布于含壮观霉素(300μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，30℃过夜培养，得到转化子。挑取转化子一个菌落，接种到5mL含卡那霉素(50μg/mL)LB培养基中，42℃培养，然后每12小时按1:100的比例转接一次，连续传代4～5次后，取5μL培养物梯度稀释，取10^-2和10^-3稀释液各100μL涂布于含壮观霉素(300μg/mL)的LB平板上，42℃过夜培养。

选50个菌落，每个菌落均一一对应点种到含壮观霉素(300μg/mL)和氯霉素(5μg/mL)的LB平板上，42℃过夜培养。选只在壮观霉素平板上生长的菌落为BacillusanthracisA16RΔNpr599::spc(壮观霉素抗性基因替代了Npr599基因)。

用PCR的方法鉴定Bacillus anthracisA16RΔnpr599::spc，上下游引物分别为Npr599:iF和Npr599:iR，然后对PCR产物进行测序鉴定。

Npr599iF:GGATTTCGTAGTGAATATAAGTTTAG(SEQ ID NO.10所示)；

Npr599iR:TACCCCTATGTTTTTATAATTATTTC(SEQ ID NO.11所示)。

上步鉴定发生重组的菌Bacillus anthracis A16RΔnpr599::spc在无抗生素存在的条件下传10代，分析证明不再有红霉素抗性和卡那霉素抗性后，按照前述方法制备感受态，转入质粒pHY-Cre(王艳春.炭疽杆菌芽孢疫苗载体的探索性研究.[博士学位论文].北京：军事医学科学院，2009，表达Cre重组酶，通过Cre重组酶识别spc元件两端的LoxP位点，去除抗性标记)，方法同样采用电转化，条件同前述。电击完毕后立即加入1mL冰冷的BHIG培养基，30度孵育2.5小时，取50μL涂布于含红霉素(5μg/mL)的LB平板上，30℃过夜培养。

得到的重组菌在含红霉素(5μg/mL)的LB液体培养基中30℃传两代后，再在无抗生素存在的条件下37℃传5代，得到不含质粒的npr599基因敲除的菌株，该菌株无npr599基因，仅在该基因原位点残留了一个无活性的loxp72位点，命名为Bacillus anthracisA16R-N。

Bacillus anthracisA16R-N进行PCR鉴定(引物为Npr599iF和Npr599iR)，结果如图3所示，泳道M为分子量Marker，泳道1为Bacillus anthracis A16R结果，泳道2为Bacillus anthracisA16R-N扩增结果，PCR结果表明npr599基因敲除成功。

重组菌Bacillus anthracis A16R-N为将Bacillus anthracis A16R基因组中的npr599基因敲除得到的菌。

二、mntA基因的敲除

与npr599基因敲除方法相同。

1、mntA基因敲除质粒的构建

根据GenBank登录的Bacillus anthracisA16R株mntA基因的序列，序列号为A16R_RS16300，设计两对特异性引物MntAuF&MntAuR和MntAdF&MntAdR。

MntAuF:TTTGGTCTCCTGACGAACCAACTGTTATGTC(BsaI)(SEQ ID NO.12所示)；

MntAuR:TTTGGTCTCAGATCTTTTATCCTCCAATCA(BsaI)(SEQ ID NO.13所示)；

MntAdF:TTTGGTCTCGAATTAATCTAGCTTGTGTAACTG(BsaI)(SEQ ID NO.14所示)；

MntAdR:TTTGGTCTCCCCAACGGAATTCCTGCTGCATAGTGAAG(BsaI)(SEQ ID NO.15所示)；

以Bacillus anthracisA16R株(董梅，庄汉澜，王希良，炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析，军事医学科学院院刊2009年2月第33卷第1期，6-9页。中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存)基因组DNA为模板，MntAuF/MntAuR和MntAdF/MntAdR分别扩增，得到约950bp的mntA基因上游同源臂(SEQ ID NO.2所示的第1～958位核苷酸)和约980bp的mntA基因下游同源臂(SEQ ID NO.2所示的第1895～2875位核苷酸)。上述二个片段分别克隆到商业化的T载体pEZclone-NRS-Amp-Blunt-HC(购自北京中美泰和生物技术有限公司，货号C5851-25)，经测序鉴定正确后获得二个重组质粒，分别命名为pT-Up-MntA和pT-Down-MntA，然后利用Golden-Gate的方法将这两个质粒以及与前期敲除Npr599基因时构建的pT-spcR质粒与重组质粒pKMBKI连接(Golden-Gate试剂盒购自NEB公司，货号E1600S)，将目标片段按设计的顺序克隆到目标质粒pKMBKI正确位置，如图1所示。连接后完成后Golden-Gate反应产物再转化DH5ɑ，取连接正确的质粒进行测序，得到鉴定正确的重组质粒再电转化E.coli SCS110。从SCS110中提取质粒得到去甲基化的打靶用质粒，命名为pKMBKI-MntA。

重组质粒pKMBKI-MntA为将SEQ ID NO.2所示第1～958位所示的mntA基因上游同源臂片段、两端带loxP识别位点壮观霉素抗性基因片段(SEQ ID NO.3所示)和SEQ ID NO.2所示第1895～2875位位所示的mntA基因下游同源臂片段插入质粒pKMBKI的两个BsaI位点之间。

2、mntA基因的无痕敲除

mntA基因敲除的过程与上述基因npr599敲除的过程基本相同，不同的是出发菌株是Bacillus anthracisA16R-N，具体如下：

将质粒pSS4332转入出发菌株Bacillus anthracis A16R-N中，得到转化子A16R-N/pSS4332。

将质粒pKMBKI-MntA转入A16R-N/pSS4332中，选只在壮观霉素平板上生长的菌落为A16R-NΔmntA::spc。

重组菌株A16R-NΔmntA::spc在无抗生素存在的条件下传5代，按照前述方法制备感受态，转入质粒pHY-Cre。电击完毕后立即加入1mL冰冷的BHIG培养基，30℃孵育2.5小时，取50μL涂布于含红霉素(5μg/mL)的LB平板上，30℃过夜培养。得到的重组菌在含红霉素(5μg/mL)的LB液体培养基中30℃传两代后，再在无抗生素存在的条件下37℃传三代，再用PCR的方法鉴定抗性基因去除情况，结果。最终通过一系列实验，得到不含质粒的mntA基因敲除的菌株，该菌株在基因组中残留了2个无活性的loxp72位点，不影响基因组稳定性，命名为Bacillus anthracisA16R-NM。

Bacillus anthracisA16R-NM进行PCR鉴定(引物MntAiF和MntAiR)，结果如图4所示，泳道M为分子量Marker，泳道1为Bacillus anthracis A16R扩增结果，泳道2为BacillusanthracisA16R-NM扩增结果；从PCR结果看，重组菌株MntA基因敲除成功。

MntAiF：GTTGTTGTACATCATGATTTAAG(SEQ ID NO.16所示)；

MntAiR：AAGCCCGTTTTTCTGATTGGATG(SEQ ID NO.17所示)；

重组菌Bacillus anthracisA16R-NM为将Bacillus anthracis A16R基因组中的npr599基因和基mntA因敲除得到的菌，该菌株npr599和mntA两个基因都发生了缺失的突变株。

将炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)A16R-NM于2021年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO.22619，分类命名为炭疽芽孢杆菌。

实施例2

重组菌炭疽芽孢杆菌A16R-NM的生物特性分析

1、炭疽芽孢杆菌A16R-NM菌株胞外蛋白酶活性分析。

取A16R-NM菌株和A16R菌株的过夜培养物5μl，滴加到奶粉平板(制备方法：LB固体培养基中添加1％的脱脂奶粉，二者分别高压，使用前混合后倾倒平板)，待液滴风干后，37℃倒置培养24h，观察平板上水解圈形成情况，判断菌株胞外蛋白酶活性。结果如图5所示，A16R-NM菌株几乎没有形成的水解圈，而A16R株在菌斑的周围形成了明显的水解圈，表明A16R-NM株与A16R株相比胞外蛋白酶活性明显减小。

2、炭疽芽孢杆菌A16R-NM菌株生长曲线分析

取炭疽芽孢杆菌A16R-NM和炭疽芽孢杆菌A16R过夜培养物1mL接种到40ml的LB液体培养基中，实时监测细菌生长状况，平行进行3次重复实验，绘制A16R-NM和A16R的生长曲线。结果如图6显示，A16R-NM菌株和A16R菌株的生长特性没有显著差异。

3、菌株炭疽芽孢杆菌A16R-NM芽孢形成能力分析

菌株炭疽芽孢杆菌A16R-NM接种于LB培养基中，37度培养5天后取样涂片进行芽孢染色，观察芽孢形成情况。结果如图7所示，炭疽芽孢杆菌A16R-NM仍具有很好的芽孢形成能力。

4、菌株炭疽芽孢杆菌A16R-NM菌株PA蛋白表达的免疫印迹分析

挑取实施例1获得的A16R-NM和A16R新鲜菌落，分别接种到5mL的LB液体培养基中，37℃摇菌。培养12h后，以1‰比例转接到200mL的LB液体培养基中，摇床225rpm，过夜培养。将新鲜菌液离心收集培养上清。取10ml培养上清，用超滤管(购自Sartorius公司，货号VS15T02，截留分子量10000MWCO)超滤浓缩10倍后均取100μl按照实验手册制样，用12％凝胶进行SDS-PAGE电泳，等量上样20μl，然后转移到NC膜上。NC膜用5％脱脂奶粉室温封闭1小时；然后与鼠抗PA单抗(购自Abcam公司，货号ab69485,1:1000稀释)37℃共孵育1小时，然后膜用PBST洗涤3次，每次5分钟，再与相应的HRP标记的抗小鼠IgG二抗(1:5000稀释)共孵育1小时，最后将膜用PBST洗干净，利用凝胶成像系统ECL发光显影。结果如图8所示。图中第一泳道为A16R对照，第二泳道为A16R-NM，图中结果表明，在电泳上样量一致的情况下，A16R-NM菌株PA蛋白的表达水平明显高于A16R。

5、菌株炭疽芽孢杆菌A16R-NM菌株毒力评价

不同剂量的炭疽芽孢杆菌A16R-NM芽孢悬于0.05％泊洛沙姆水溶液中，利用手持式肺递送装置(北京慧荣和科技有限公司)接种DBA/2小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)，每天观察并记录死亡情况，剂量依次为5×10³CFU/只、5×10⁴CFU/只和5×10⁵CFU/只。以现有疫苗株炭疽芽孢杆菌A16R作为对照。实验结束后用Graphpad 8.0软件统计分析相应数据。

结果如图9所示，炭疽芽孢杆菌A16R-NM仅在5×10⁵CFU/只的高剂量组有40％的死亡，而炭疽芽孢杆菌A16R组在5×10³CFU/只的低剂量组就有40％的死亡，这一结果表明，A16R-NM安全性明显优于现有疫苗株A16R。

实施例3

减毒炭疽芽孢杆菌A16R-NM的免疫学评价

将30只BALB/c小鼠随机分成3组，每组10只。分别设置为阴性对照组(生理盐水)、炭疽芽孢杆菌A16R-NM高剂量免疫组和低剂量免疫组。高剂量免疫组接种剂量为5×10⁷CFU/只；低剂量免疫组接种剂量为5×10⁶CFU/只。具体免疫方式如下：不同剂量的芽孢悬于0.05％泊洛沙姆水溶液中，利用手持式肺递送装置进行免疫接种，第0周、第3周和第6周共免疫三次，且第二免疫和第三次免疫后10天均进行尾静采脉血，分离血清检测血清中炭疽抗保护性抗原PA的抗体效价。第9周利用5×10⁶CFU/只剂量的炭疽II号疫苗株用手持式肺递送装置(北京慧荣和科技有限公司)进行攻毒，攻毒后，每天记录小鼠死亡情况，试验观察期为攻毒后的14天。

血清中炭疽抗保护性抗原PA的抗体效价检测结果如图10所示，与对照组相比，两个剂量的芽孢免疫组都能够产生针对保护性抗原PA特异性IgG，说明利用芽孢进行免疫后能够激发小鼠产生针对保护性抗原PA的免疫应答。攻毒结果如图11所示，其中，5×10⁷CFU免疫剂量组小鼠的保护率为60％，5×10⁶CFU免疫剂量组小鼠的保护率为50％，而阴性对照组的小鼠在2天后就全部死亡。从结果可以看出，炭疽芽孢杆菌A16R-NM免疫小鼠后能够产生一定的免疫保护效果。

综上所述，本发明提供的减毒炭疽芽孢杆菌A16R-NM胞外蛋白酶活性与毒力较现有疫苗株A16R都有明显降低，无抗生素抗性基因标记，稳定表达保护性抗原，且能够形成芽孢，以芽孢形式免疫小鼠后可以产生一定的保护性免疫效果，可用于制备稳定免疫的减毒炭疽芽孢杆菌疫苗。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgcggtaa gttatacaga aaaaggtcag tatgaagaag ctttaaaaat gtatgaaagt 60

atattgagag agtccgcatc ttttgctgat aaggatgtac ttttagctat tactttaagt 120

aatatgggaa gcatctatta taaaaaaggc aaatatcagc aagcaaaaaa atattattta 180

gatagtctac aacttcaaaa acaaatagat ttaaattatt tagatacaat atatgaaatg 240

gcagtagtat gcattaaatt agaagagtta gaggaggcaa aggcattaat tgataaggga 300

attgatgcag caaaacaaga agagaggttt aatgcaaaat tatacttgct tttaatgctt 360

agatataaat attttgaaga agcgaaagat tataaagcat ttttggaaaa tgaggctatc 420

ccgttgtata aatctgcggg aaataaaata gaattaaaga aagtatacat tgaactagca 480

gaacattttt ccagtttatc gagatttgaa gaaagcaatc gatattatag gttagttatt 540

gatttaatga atgataagga ggaataaaaa tgaaaaagat ggtatttgga gcattagcat 600

ttatagtgac tcttacagtt gctggaggaa tacatcagta tagcagtaaa cctgatattg 660

ttggtcaaga agctaaaaca gtgcaacaaa ttaattcata attgaaaacc cctttccaac 720

cggaaagggg tttttcaata tttgttcccc aaaattctac aaaacttgag aaataaatta 780

attgaatttt tagtatatta atagtgaaaa cataatgcta atatgaaact actctttttc 840

aaaaaaaaat tattaggggg aaggttcatg aaaaagaaaa gtttagcgtt agtgttagcg 900

acaggaatgg cagttacaac gtttggaggg acaggctctg cttttgcaga ttctaaaaat 960

gtgctctcta cgaagaagta caatgagaca gtacagtcac cggagtttat ttctggggat 1020

ttaactgaag caactggtaa gaaagcagaa tctgttgtgt ttgattactt aaatgcagca 1080

aaaggtgatt ataagttagg ggaaaagagt gcgcaagatt ctttcaaagt gaaacaagcg 1140

aagaaagatg ctgtaactga ttcaacagta ttacgtttgc aacaagttta cgaaggagta 1200

cctgtatggg gttctacgca agtagctcac gtaagtaaag atggttcatt aaaagtattg 1260

tctggaacag ttgcacctga tttagacaaa aaagaaaagt tgaaaaataa aaataagatc 1320

gaaggcgcaa aagcaattga aattgcgcaa aaagatttag gtgttacacc taaatatgag 1380

gtagaaccaa aagcggactt atatgtatat caaaatggtg aagaaacaac atatgcatac 1440

gttgtaaatt taaacttctt agagccaagc ccaggaaact actactattt cattgaagcg 1500

gacagcggta aagtattaaa taaatataat aaattggatc atgtagcaaa tgaagataag 1560

tcaccagtta agcaagaggc acctaaacaa gaagcgaaac cggctgtaaa gcctgtaaca 1620

ggcacaaatg cagtgggtac tggtaaaggt gtattaggag atacgaagtc acttaataca 1680

acgttatctg catcatctta ctatttacaa gataatacgc gcggagcaac gattttcaca 1740

tatgatgcga aaaaccgctc aacattacca ggaacgttat gggtagatgc ggataatgtt 1800

ttcaatgcag cgtatgatgc agcggcagta gatgctcact actatgctgg tagaacatat 1860

gattactata aagcgacatt taatagaaac tctattaatg atgcaggagc accattaaaa 1920

tcaacagttc attatggaag tagatataat aatgcgttct ggaatggctc tcaaatggta 1980

tacggagatg gtgatggtgt aacattcact tcattgtctg gtggaattga tgtaattggc 2040

catgaattaa cgcatgctgt tacagagtat agctcagatt taatttatca aaatgaatca 2100

ggagcattaa atgaagctat ttcagatgta tttggtacat tagtagagta ttatgataac 2160

cgtaaccctg attgggaaat tggtgaagat atttacacgc ctggtaaagc tggagatgca 2220

cttcgctcta tgagtgatcc aacgaaatat ggtgatccag atcattattc taagcgttac 2280

acaggtactg gtgataacgg tggcgttcat acaaatagcg gtattattaa caaagcggct 2340

tacttactag cgaatggtgg tacgcattac ggtgttactg taaacggtat tggtaaagat 2400

aaagtaggag cgatttatta ccgtgcaaat acgcaatatt tcacacaatc tactacgttt 2460

agtcaagctc gtgctggatt agtacaagct gcagctgact tatatggtgc tagctctgca 2520

gaagtagcag cagttaagca atcatatagt gctgttggcg taaactaagg ctttaaggga 2580

tagttataat aaaatacctc aaaaataaag aaggagcata ggctccttct ttattttttt 2640

ctccattttt tccacaaata aaacaaccca atagcgcccg cgattgttac aatccacttc 2700

gcttcatttg ttccattgat aacatgatat gccgaatata cttcaatcaa taaagccggt 2760

attttaccta ttgtactggc aatactgaag gatagtaatg acattttacc tagagctgca 2820

aataaagtaa cgatactgga tgggataaaa ggtatcaatc ggaatgatag gacgagtaga 2880

aaggcctctt taccttttac ataaaggagg cgttctacct ttggatactt atttactttg 2940

ctgtgagtga atttctgaag gcctatacga taaatataaa acgagataat agcccctaat 3000

gcctcacctg cgatcgaaat aatggttccg tttgttacac cgaagagctg tatgttaata 3060

gcggtcaaaa aaatactagg gataaaacct aaaagactga tgatgatgtt aattaagata 3120

ctaagtggaa ttgcgattga ataatagtct gttaagaagt tttgaattgt ttcagccatt 3180

gtttaaaatc ctttatcttt ttttgcatta caccatattt ccattgtgta ggcaagtaca 3240

aatttacata atgtagaaaa cgttgataaa aaaaccatcc gtatacctta tataggtatt 3300

gggtatatga aatcagggat atattttaat aacttaaaaa acaccaaacg aaccctttat 3360

ttaaaagatt tatttggtgt ttttataggc attta 3395

<210> 2

<211> 2875

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaccaactg ttatgtcaaa agcatatgtg aatcaaggaa tattgtttaa taatgcggcg 60

gaggtacatt catcatgaag attgtagaat ttatagatgc attaacgcag tacagttttc 120

tgcagaaggc gttgttaact tccgttatgg taggaattat ctgtggtgtc attgggtgtt 180

ttattatttt acgaggtatg gcattaatgg gtgatgccat ttcacatgcc gttcttcctg 240

gagtagcgct ttcttatatg attggaatga actatttcat aggagctgtt ttaacaggtg 300

ttattactgc agttggaatt ggttttgtaa gtcaaaatag tcgtattaaa catgatatgg 360

cgatagggat tatgttcaca tctgtatttg ctgtagggat tattttaatt acctttatga 420

agagtagttc agatttatat catattttat tcgggaacgt cctatcagtc cgttcttccg 480

atatgtggat gacacttatt attggagtag ttattattgg ccttgtcatg ctgttttaca 540

aagaattact cgtatccact tttgatccaa caatggcgca aagttatgga ttgccgaaca 600

aatggattca ttatggctta atgattcttc ttacaatggt gacagtcgca tcccttcaaa 660

ctgttggaat tattctagtt gttgccatgc ttatcacacc ggcggctaca gcgtatttat 720

taacaaatcg tttatgggtc atgatttatt tagcggcagg catcggtgca ctttcatctg 780

tagtagggtt atattttagt ttctcttata atcttgcttc aggtgcgaca attgttcttg 840

ttgcaacatt cttgttcgca ttagcattct ttttctcacc gtcacaaggt ttgttttgga 900

gagctatcaa aattagaaaa aatagagcag agttgtcata attgattgga ggataaaaat 960

gaaatttaaa aatgttgtat tatcgatact ttgtattttc gtatttgcat taacagcgtg 1020

ttctagtaac acaaatggaa aagaagaggg cagtggaaaa ttaaaagttg taactacata 1080

ctccattata tatgatatgg tgaagcaaat tggcggagag aaagttgaga ttcatagtct 1140

tgttccaatt ggagctaacc cgcatgaata tgatccacta ccaaaagatg ttatgaaaat 1200

gacagatgca gatatggttc tttacaatgg attgaaccta gaagaaggtg gagcgtggtt 1260

taaaaagcta ttaaaaacgg caaataaatc agagaaagat gcaccggttt ataaagtaag 1320

tgaaggcgta gaagctattt atttagagac aaaaggatta gaaaaagaac cagacccgca 1380

tgcatggatg aacattaaaa atggtatttt atatgctgaa aatgtgaaaa aggcattaat 1440

taaagaagac cctaaaaata aagagttcta tactaaaaat gctgacaact atgtagcaga 1500

acttcaaaag ttacatgatg agacagtaaa cagaattcat caaatccctg aggagaaacg 1560

gttcttaatc tctagtgaag gtgcttttaa atactttgga aaagcatatg atattaaaac 1620

gggatacatt tgggaaatta actcagaaaa tcaaggtaca ccagatcaaa ttcgagatgt 1680

tgtaagtgta attcaaacaa ataaagttcc ggctctattt gtagaaacta gtgtagatcg 1740

acgcagcatg gaaactgttt caaaagaaac aaacgtgcca attgcaggta caatttttac 1800

agattcacta ggtaaatcag gtgaggatgg agatacgtat ttaaaaatga tgaaatggaa 1860

tatagatacc attattaatg ggttacaaaa gtaaaatcta gcttgtgtaa ctgttgaagt 1920

tttataaggt aaggaagagc caactcatgt gaattggctc tttttttgta tcatgtttat 1980

taataatttg gctgaatata ccttagttac attcgcttcg taacagattc taaagaagat 2040

gagacaatat taccaaaagc atcaccttcc caaatcccat tacctttaaa atgaggaaag 2100

tttaatataa tggacataaa cgatgcttat acatgtaaag taagaggtca tgaaaaggag 2160

taaagactgc taattttcat acgctttgat tatgtaaaaa tagaggggat ggcatgaaag 2220

acaatattcc ttagaaagtt ttatttattt tggtaattaa ggggttcacg tgaggaatgt 2280

aattatagta tgtcattcat gataaacgaa tcatacaatt cttaaaccat attcatttca 2340

tgggcttgaa aatgtagtct aaccatatta gcatcgataa acatgaagtt aaatgtttgg 2400

tgcttttaac tagagtgaac tctcgcattt tataaaaatc atttacgaaa aagggatttg 2460

ggtaattttc ttgaatttat ttattcagaa aaaacaattt tgaattggaa ctaatttaca 2520

tccaataatt agaggagatt aaaaatgaat cacttttttg tagaatttgg tgaataccaa 2580

gcaagtgttt gtgaatgggg ggataaaagt aaccctcaaa tcatttgttt tcatggttta 2640

ggaagtacaa agttaagttt tatagaaatg gcggaatttc taaaagataa atatcatgtt 2700

gtatcgtttg atctacctgg acatgggaaa acaccaaatt ttgagacgga tgaagattac 2760

ggtgcatccc atttaataaa ttgggtagta gcattacttg agcacatagg aaaagaaaca 2820

tttcacctat tagcacattc atggggagca agcgttgcgc ttcactatgc agcag 2875

<210> 3

<211> 1299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatcttagg gataacaggg taatggaatt caggtcgacg gcccccgggc gggatccgta 60

ccgttcgtat agcatacatt atacgaagtt atctcgacgt tcgtgaatac atgttataat 120

aactataact aataacgtaa cgtgactggc aagagatatt tttaaaacaa tgaataggtt 180

tacacttact ttagttttat ggaaatgaaa gatcatatca tatataatct agaataaaat 240

taactaaaat aattattatc tagataaaaa atttagaagc caatgaaatc tataaataaa 300

ctaaattaag tttatttaat taacaactat ggatataaaa taggtactaa tcaaaatagt 360

gaggaggata tatttgaata catacgaaca aattaataaa gtgaaaaaaa atacttcgga 420

aacatttaaa aaataacctt attggtactt acatgtttgg atcaggagtt gagagtggac 480

taaaaccaaa tagtgatctt gactttttag tcgtcgtatc tgaaccattg acagatcaaa 540

gtaaagaaat acttatacaa aaaattagac ctatttcaaa aaaaatagga gataaaagca 600

acttacgata tattgaatta acaattatta ttcagcaaga aatggtaccg tggaatcatc 660

ctcccaaaca agaatttatt tatggagaat ggttacaaga gctttatgaa caaggataca 720

ttcctcagaa ggaattaaat tcagatttaa ccataatgct ttaccaagca aaacgaaaaa 780

ataaaagaat atacggaaat tatgacttag aggaattact acctgatatt ccattttctg 840

atgtgagaag agccattatg gattcgtcag aggaattaat agataattat caggatgatg 900

aaaccaactc tatattaact ttatgccgta tgattttaac tatggacacg ggtaaaatca 960

taccaaaaga tattgcggga aatgcagtgg ctgaatcttc tccattagaa catagggaga 1020

gaattttgtt agcagttcgt agttatcttg gagagaatat tgaatggact aatgaaaatg 1080

taaatttaac tataaactat ttaaataaca gattaaaaaa attataaaaa aattgaaaaa 1140

atggtggaaa cacttttttc aatttttttg ttttattatt taatatttgg gaaatattca 1200

ttctaattgg taatcagatt ttagaaaaca actgcagata acttcgtata gcatacatta 1260

tacgaacggt agcatgctga cgcgtcgcca tgggaattc 1299

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttggtctcc tgacattgcg gtaagttata cag 33

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttggtctca gatcgaacct tccccctaat 30

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttggtctcg aattggcttt aagggatagt t 31

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttggtctcc ccaataaatg cctataaaaa cacc 34

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttggtctca gatcttaggg ataacaggg 29

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttggtctcg aattcccatg gcgacgcg 28

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatttcgta gtgaatataa gtttag 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tacccctatg tttttataat tatttc 26

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttggtctcc tgacgaacca actgttatgt c 31

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttggtctca gatcttttat cctccaatca 30

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttggtctcg aattaatcta gcttgtgtaa ctg 33

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttggtctcc ccaacggaat tcctgctgca tagtgaag 38

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gttgttgtac atcatgattt aag 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aagcccgttt ttctgattgg atg 23

Claims (10)

1.一种重组低胞外蛋白酶活性的减毒炭疽芽孢杆菌，其特征在于，所述减毒炭疽芽孢杆菌包括降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性得到的菌。

2.根据权利要求1所述的减毒炭疽芽孢杆菌，其特征在于，所述降低和/或抑制炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白和MntA蛋白活性包括沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达。

3.根据权利要求2所述的减毒炭疽芽孢杆菌，其特征在于：所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因和MntA蛋白编码基因的表达包括采用Cre-loxP重组酶系统结合自杀质粒介导的同源重组的方式进行。

4.根据权利要求3所述的减毒炭疽芽孢杆菌，其特征在于：

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因采用的同源重组的Npr599蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的第1～867位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中Npr599蛋白编码基因采用的同源重组的Npr599蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的第2569～3395位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中MntA蛋白编码基因采用的同源重组的MntA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的第1～958位；

所述沉默炭疽芽孢杆菌A16R中MntA蛋白编码基因采用的同源重组的MntA蛋白编码基因的下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的第1895～2875位。

5.根据权利要求4所述的减毒炭疽芽孢杆菌，其特征在于：所述Npr599蛋白编码基因上游同源臂的扩增引物包括Npr599uF和Npr599uR；所述Npr599uF的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述Npr599uR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述Npr599蛋白编码基因下游同源臂的扩增引物包括Npr599dF和Npr599dR；所述Npr599dF的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述Npr599dR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述MntA蛋白编码基因上游同源臂的扩增引物包括MntAuF和MntAuR；所述MntAuF的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述MntAuR的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述MntA蛋白编码基因下游同源臂的扩增引物包括MntAdF和MntAdR；所述MntA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述MntAdR的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

6.根据权利要求1～5任一项所述的减毒炭疽芽孢杆菌，其特征在于，所述减毒炭疽芽孢杆菌的保藏号为CGMCC NO.22619。

7.权利要求1～6任一项所述的减毒炭疽芽孢杆菌在制备预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品中的应用。

8.权利要求1～6任一项所述的减毒炭疽芽孢杆菌在制备炭疽杆菌减毒活疫苗中的应用。

9.一种预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品，其活性成分包括权利要求1～6任一项所述的减毒炭疽芽孢杆菌。

10.一种炭疽杆菌疫苗，其活性成分包括权利要求1～6任一项所述的减毒炭疽芽孢杆菌。

Images