KR100456594B1 - 스트렙토코커스독소a의변이체및그의사용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편, 백신 및 백신 조성물, 및 백신 및 백신 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 SPE-A 독소는 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며 또한 야생형 SPE-A 독소에 비하여 실질적으로 치사성이 없다. 변이체 SPE-A 독소는 야생형 SPE-A 독소의 생물학적 활성에 대하여 동물을 보호하는데 유용한 백신 조성물을 형성할 수 있다.
Description
제 1 도는 스트렙토코커스 발열성 엑소톡신 A의 3차원구조 모델의 리본형 도면이다. 도메인 A 및 B가 도시되어 있다.
제 2 도는 제 1 도에 도시된 표준면을 참조하여 후면에서 본 SPE-A의 도면이다. 번호를 붙인 잔기는 감소된 전신치사성을 평가하는 TSST-1의 잔기에 상응하는 것이다.
제 3 도는 T12로부터 클론된 SPE-A 독소의 DNA 서열(SEQ ID NO:12) 및 추정되는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:13)을 나타낸다.
제 4 도는 T-세포 증식 분석을 나타낸다. 토끼 비장세포는 SPE-A, K16N-SPE-A 및 N20D-SPE-A를 이용하여 4회 반복으로 96웰 마이클로타이터 플레이트에서 72시간 배양하였다. 세포는 [3H]티미딘으로 18 내지 24시간 펄스(pulse)하고, 여과기로 수거하고, [3H] 티미딘 함입(incorporation)을 섬광계수기로 측정하였다. 결과는 분당 카운트 (CPM) 대 독소의 농도 (㎍/㎖)로 표시되어 있다. 표시된 데이터는 3개의 독립적인 실험의 가장 대표적인 데이터로부터 얻었다.
제 5 도는 T 세포 증식 분석을 나타낸다. 토끼 비장세포는 SPE-A, C87S-SPE-A, C98S-SPE-A 및 C90S-SPE-A를 이용하여 4회 반복으로 96웰 마이클로카이터 플레이트에서 72시간 배양하였다. 세포는 [3H]티미딘으로 18 내지 24시간 펄스하고, 여과기로 수거하고, [3H] 티미딘 함입을 섬광계수기로 측정하였다. 결과는 분당 카운트 (CPM) 대 독소의 농도 (㎍/㎖)로 표시되어 있다. 표시된 데이터는 3개의 독립적인 실험의 가장 대표적인 데이터로부터 얻었다.
제 6 도는 T 세포 증식 분석을 나타낸다. 토끼 비장세포는 SPE-A, K157E-SPE-A 및 S195A-SPE-A를 이용하여 4회 반복으로 96웰 마이클로타이터 플레이트에세 72시간 배양하였다. 세포는 [3H]티미딘으로 18 내지 24시간 펄스하고, 여과기로 수거하고, [3H] 티미딘 함입을 섬광계수기로 측정하였다. 결과는 분당 카운트 (CPM) 대 독소의 농도 (㎍/㎖)로 표시되어 있다. 표시된 데이터는 3개의 독립적인 실험의 가장 대표적인 데이터로부터 얻었다.
제 7 도는 단일 변이체에 대한 야생형 SPEA의 초항원성을 나타낸다. 토끼 비장세포는 지정된 투여용량에서 SPEA 또는 변이체로 4일간 배양하였다. 4개의 복제 웰은 SPEA 및 변이체의 각 용량에서 사용하였다. 3일에 1 μCi 3H 티미딘을 각 웰에 첨가하였다. 초항원 지수는 SPEA의 존재하에 비장세포당 3H 티미딘 함입을 SPEA 또는 변이체의 부재하에 3H 티미딘 함입으로 나눈 것이다.
제 8 도는 이중 변이체와 비교한 야생형 SPEA의 초항원성을 나타낸다. 사용된 방법은 제 7 도에 기술된 방법과 동일하다.
제 9 도는 면역화된 토끼 혈청에 의한 SPE-A 억제를 나타낸다. 단일 및 이중 변이체로 면역화된 토끼로부터 얻은 토끼 혈청은 SPEA의 존재하에 비장세포 유사분열성을 중화시키는 혈청의 능력을 입증하는데 사용된다.
본 발명은 변이체 SPE-A 독소 및 그의 절편, 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 포함하는 백신 및 약학적 조성물, 변이체 SPE-A 독소 및 그의 절편을 제조하는 방법 및 변이체 SPE-A 독소 및 그의 절편을 사용하는 방법에 관한 것이다.
변이체 SPE-A 독소는 실질적으로 야생형 SPE-A 독소에 상응하는 단백질에 비하여 생물학적 작용에서 적어도 하나의 변화를 가지며 또한 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖는 단백질이다. 바람직하게는, 변이체 SPE-A 독소는 동일 투여용량에서 야생형 SPE-A 독소에 비하여 실질적으로 치사성이 없다. 변이체 SPE-A 독소는 부위 지향성 변이유발, 불규칙 변이유발, 통상적인 변이유발, 시험관내 변이유발, 우연 변이유발 및 화학적 합성을 포함한 다양한 방법을 이용하여 생산할 수 있다. 변이체 SPE-A 독소는 바람직하게는 1) 아미노산에서 적어도 하나의 변화를 확보하고 또한 2) 분자의 적어도 하나의 생물학적 변화, 바람직하게는 전신치사성의 감소 또는 제거를 갖도록 선택된다. 변이체 독소는 STSS의 예방 또는 경감, STSS의 증상이 있는 동물의 치료 방법, T 세포 증식을 자극하는 방법 및 암의 치료와 같은 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대한 방어용 백신 조성물에 유용하다. 단일 및 이중 SPE-A 변이체를 시험하였고, 변이체에 대한 항체는 SPEA에 대한 세포반응을 억제하였다.
A. 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편, 백신 및 약학적 조성물
본 발명은 야생형 SPE-A와 동일한 생물학적 활성을 가지거나 실질적으로 이에 상응하는 단백질에 비하여 생물학적 활성의 적어도 하나의 변화를 가지며 또한 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소를 포함한다.
야생형 SPE-A 독소는 박테리오파지 T12에서 발견된 유전자 speA로 코딩된다. 야생형 SPE-A 독소는 성숙(mature) 단백질의 추정되는 아미노산 서열로부터 계산하는 경우 25,787 달톤의 분자량을 갖는다. 야생형 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열 및 야생형 SPE-A 독소에 대한 예상되는 아미노산 서열은 제 3 도에 도시되어 있다. 야생형 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열은 대장균 및 S. 아우레우스에서 클론되었다. 본 출원에서 아미노산 번호의 지정은 제 3 도의 서열을 참조하여 31번 위치의 글루타민을 첫 번째 아미노산으로 지정하여 이루어졌다. 처음 30개의 아미노산은 변이단백질에 존재하지 않는 선두서열(leader sequence)을 나타낸다. 상기 선두서열이 제외된 야생형 SPE-A 독소의 아미노산 서열을 서열번호 14에 나타내었다.
야생형 SPE-A 독소의 구조 모델은 제 1 도에 도시되어 있다. 상기 구조 모델은 캘리포니아 산디에고의 바이오심 회사(BioSym Corp.)에서 시판중인 인사이트/호모로지 프로그램을 사용하는 호모로지 모델에 의해 구축되었다. 상기 모델은 야생형 SPE-A 독소가 여러 가지 특이한 구조적 특징을 가지고 있음을 보여준다. 이들 구조적 특징은 다음을 포함한다: 헬릭스(helix) 2 (아미노산 11-15); N-말단 알파 헬릭스 3 (아미노산 18-26); 헬릭스 4 (아미노산 64-72); 중앙-α 헬릭스 5 (아미노산 142-158); 헬릭스 6 (아미노산 193-202); 사슬(strand) 1 (아미노산 30-36), 사슬 2 (아미노산 44-52), 사슬 3 (아미노산 55-62), 사슬 4 (아미노산 75-83), 사슬 5 (아미노산 95-106)을 포함하는 도메인 B 베타 사슬; 사슬 6 (아미노산 117-126), 사슬 7 (아미노산 129-135), 사슬 8 (아미노산 169-175), 사슬 9 (아미노산 180-186), 및 사슬 10 (아미노산 213-220)을 포함하는 도메인 A 베타 사슬. 아울러, 87, 90 및 98의 시스테인 잔기는 추정되는 디설파이드(disulfide) 결합의 형성 또는 국소적인 3-D 구조(conformation)를 유지시키는데 중요할 수 있다.
야생형 SPE-A 독소는 여러 가지 생물학적 활성을 갖는다. 이들 생물학적 활성은 1) 열; 2) SPSS; 3) STSS의 발전 또는 엔도톡신 쇼크의 증가로 인한 전신 치사율; 4) 엔도톡신의 증가; 5) 모세혈관 누출 및 저혈압의 유도; 6) IFN γ, IL-1, TNF-α 및 TNF-β와 같은 사이토카인의 분비 유발; 7) 돼지 대동맥 내피세포에 결합; 8) MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합; 9) T-세포 수용체에 결합; 및 10) T-세포 유사분열 (초항원성)을 포함한다. 이들 활성은 당업자들에게 알려져 있는 방법으로 분석 및 특정화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 야생형 SPE-A 독소의 정의는 야생형 SPE-A 독소와 동일한 생리적 활성을 갖는 야생형 SPE-A 독소의 변이체를 포함한다. 이들 SPE-A 독소는 상이한 아미노산을 가질 수 있으며 그의 유전자는 제 3 도에 도시된 것과 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖지만 상이한 생물학적 활성을 갖는 것은 아니다. 아미노산 서열의 변화는 표현형적으로는(pheonotypically) 변화없다(silent). 바람직하게는, 이들 독소분자는 전신 치사성을 가지며 또한 제 3 도에 도시된 야생형 SPE-A 독소와 동일한 정도로 엔도톡신 쇼크를 증가시킨다. 바람직하게는, 이들 독소는 Altschul, S. F., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)에 기술된 바와 같은 SS2 배열 알고리즘(Alignment Algorithm)을 사용하여 측정하는 경우 제 3 도에 도시된 바와 같이 야생형 SPE-A 독소 아미노산 서열과 적어도 60-99%의 상동성(homology)를 갖는다. 이들 특성을 갖는 단백질은 실질적으로 야생형 SPE-A에 상응한다.
변이체 SPE-A 독소는 실질적으로 야생형 SPE-A 독소에 상응하는 단백질에 비해서 아미노산중에 적어도 하나의 변화를 갖는 독소이다. 이러한 변화는 아미노산의 치환(substitution), 제거(deletion) 또는 부가(addition)일 수 있다. 아미노산 서열에는 적어도 하나의 변화, 바람직하게는 1 내지 6개의 변화가 있을 수 있다. 변이체 SPE-A 독소가 전신치사성 및 독성을 갖는 야생형 SPE-A 독소로 전환되는 것을 최소화시키기 위해서는 아미노산 서열에 하나 이상의 변화가 있는 것이 바람직하다. 백신에 유용한 변이체 SPE-A 독소의 경우, 독소의 아미노산 서열에서의 변화가 야생형 SPE-A 독소를 중화할 수 있는 항체반응을 자극할 수 있는 독소의 능력의 변화를 생기게 하지는 않는다. 백신에 유용한 변이체 SPE-A 독소의 경우, 변이체 독소는 폴리클로날(polyclonal) 중화 항체에 의하여 Boca Raton, Fla.에 있는 Toxin Technologies 또는 Dr. Schlievert (미네소타주, 미니아폴리스, 미네소타 대학)로부터 입수된 것과 같은 SPE-A 독소로 인식되는 것과 단백질분해성 프로필(proteolytic profile)이 야생형 spe-A에 비하여 변경되지 않는 것이 특히 바람직하다.
아미노산 서열의 변화는 야생형 SPE-A 독소의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 부위 특이적(site-specific) 변화가 될 수 있다. 부위 특이적 변화는 전술한 바와 같은 분자의 특정한 도메인에 존재하는 잔기를 동정하거나 또는 시스테인 잔기가 위치하는 곳을 확인함으로써 선택된다. 특정 위치에서의 부위 특이적 변화는 선택적으로는 한 위치 또는 한 도메인에 존재하는 아미노산이 1차(primary) 서열 상동성 또는 3-D 구조의 비교에 의하여 다른 상동성 분자에 존재하는 잔기와 동일하거나 또는 유사한 특성이 있는지 여부를 결정함으로써 추가로 선택될 수 있다. 상동성 분자는 당업자들에게 알려져 있다. 상동성 분자는 Altschul 등의 SS2 배열 알고리즘, 즉 캘리포니아 산디에고 바이오심의 인사이트/호몰로지와 같은 상동모델 프로그램을 이용하여 1차 서열 상동관계를 비교하여 확인할 수 있는 것이다. 상동성 분자는 동일하거나 또는 보존적으로 변화된 아미노산의 상당한 수, 대표적으로는 30-99%를 나타내거나 또는 야생형 SPE-A 독소에 비하여 유사한 3차원 구조, 대표적으로는 보존 부위에서의 〈 2 옹스트롬의 RMS 오차를 갖는 것이다.
특정한 부위에서의 아미노산 서열 변화는 불규칙하게 이루어지거나 또는 특정한 변화가 선택될 수 있다. 일단 특정한 부위가 선택되면 제 3 도에 도시된 바와 같은 야생형 SPE-A의 부위에서 발견된 아미노산에 의해 또는 아미노산 번호 표시에 의해 인용된다. 본 출원에서의 아미노산 번호 표시는 제 3 도의 서열을 참고한 것이고 31번째 위치에 있는 글루타민은 첫번째 아미노산으로 카운트된다. 야생형 SPE-A에 실질적으로 상응하는 단백질의 특정한 부위에서 확인된 아미노산에 해당하는 동등한 아미노산은 참고서열이거나 또는 절편일 경우 상이한 아미노산 번호를 가질 수 있다. 또한, 동등한 잔기는 1차 아미노산 구조 비교 또는 제 1 도에 도시된 바와 같은 모델구조 비교 또는 상동성 분자의 공지된 결정구조 비교에 의해 야생형 SPE-A 독소에 실질적으로 상응하는 단백질의 아미노산과 동등한 것으로 확인될 수 있는 상동성 분자에서 발견된 것이다. 본 발명은 그의 아미노산 번호 표시에 상관없이 동일 또는 유사한 위치에서 동등한 아미노산의 변화를 포함하는 것이다.
특정한 치환이 특정 부위의 아미노산에 선택되는 경우 그 위치에서 치환될 아미노산은 야생형 SPE-A의 그 위치 아미노산에 비하여 생물학적 활성을 부여할 수 있는 구조적 변화를 포함하도록 선택된다. 이러한 치환은 보존적(conservative) 또는 비보존적일 수 있다. 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있는 구조적 변화를 야기시키는 치환은 1) 한 타입의 전하(charge)에서 다른 것으로의 변화; 2) 전하에서 비전하로의 변화; 3) 시스테인 잔기의 변화 및 디설파이드 결합의 형성; 4) 소수성잔기에서 친수성 잔기로의 변화 또는 친수성 잔기에서 소수성 잔기로의 변화; 5) 아미노산 크기의 변화; 6) 구조적으로 제한되는(conforamtionally restrictive) 아미노산 또는 유사체로의 변화; 및 7) 비 자연발생 아미노산 또는 유사체를 포함한다. 선택된 특이적 치환은 또한 선택된 부위의 위치에 따라 달라진다. 예를 들면 N-말단 알파 헬릭스에 있는 아미노산은 노출된 아미노산과 상호작용하기 위한 하이드록시기를 가지며 또한 α-헬릭스의 N-말단에 존재하는 부분 양전하와 상호작용하기 위해 음전하가 될 수 있다.
변이 독소는 또한 특정의 부위 또는 부위들에 지향된 불규칙 돌연변이를 포함할 수 있다. 일단 한 부위가 선택되면 변이체는 Aiyar 등, Biotechniques 14:366 (1993) 또는 Ho 등, Gene 77:51 54 (1984)에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 그 부위에 다른 19가지 아미노산이 각각 치환된 변이체가 생성될 수 있다. 시험관내 돌연변이 유발은 Anthony-Cahill 등, Trends Biochem. Sci. 14:400 (1989)에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 특정한 위치에서 다른 19가지 아미노산 또는 비자연적 발생 아미노산 또는 유사체의 어느 하나를 치환시키는데 이용될 수 있다.
또한, 변이체 독소는 구체적으로 선택되지 않은 분자중 하나 이상의 부위에서 변하를 가지며 또한 구체적으로 선택되지는 않았지만 다른 19가지 아미노산 또는 비자연적 발생 아미노산중의 어느 하나가 될 수 있는 아미노산의 변화를 갖는 독소를 포함한다.
특정 부위에서의 치환은 비자연적 발생 아미노산 예를 들어 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 호모시스테인, 2-아미노아디프산, 2-아미노피밀릭산, 오르니틴, 호모아르기닌, N-메틸라이신, 디메틸 라이신, 트리메틸 라이신, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 하이드록시라이신, 치환된 페닐아라닌, 노르로이신, 노발린, γ-발린 및 할로겐화 티로신과의 치환을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 특정 부위에서의 치환은 비펩타이드(non-peptide) 화학을 이용하여 에스테르, 에테르 및 포스포릴 및 보론 결합을 포함하나 이로 한정되지 않는 유사체(analog)의 사용을 포함한다.
변이체 독소는 다양한 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 방법은 부위 특이적 돌연변이를 포함하며, 부위 특이적 돌연변이 방법은 EMS 또는 소듐 비설파이트와 같은 화학물질을 사용하거나, UV 조사, 자연 돌연변이, 시험관내 돌연변이 및 화학적 합성에 의해 이뤄진다. 변이유발의 방법은 Sambrook 등, A Guide to Molecular Cloning, Cold Spring Harbard, 뉴욕 (1989)에서 발견될 수 있다. 부위 특이적 변이 유발의 특히 바람직한 방법은 Perrin 및 Gilliland, 1990, Nucleic Acid Res. 18:7433에 기술된 바와 같이 3개의 프라이머로 비대칭형 PCR을 이용하는 것이다.
일단 야생형 SPE-A 독소에 실질적으로 상응하는 단백질에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소가 생성되면, 변이체 SPE-A 독소는 비치사성을 위해 스크리닝된다. 이러한 스크리닝으로부터 선택된 변이체 SPE-A 독소는 야생형 SPE-A 독소와 동일한 투여용량에서 또는 그 이상의 투여용량에서 소형삼투 펌프(miniosmotic pump, 실시예 2에 기술됨)를 사용하여 투여하였을 때 토끼에서 실질적으로 비치사성을 갖는 것이 바람직하다. 만일 야생형 독소와 동일한 투여용량에서 토끼에게 투여되는 경우 토끼의 약 10-20% 미만이 죽는다면, 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편은 실질적으로 비치사성이다. 비치사성을 갖는 변이체 독소는 백신 및 약학적 조성물에 유용하다. 본 발명을 한정하는 의미는 아니지만, 전신 치사성에 영향을 미치는 일부 아미노산 잔기 또는 도메인은 다른 생물학적 활성 특히 T-세포 유사분열성과는 별개인 것으로 간주된다.
백신 조성물에 유용한 변이체 독소의 경우 변이체 SPE-A 독소는 야생형 SPE-A 독소 활성을 중화하는 항체반응을 자극할 수 있는 것으로 스크리닝하는 것이 더욱 바람직하다. 야생형 SPE-A 독소 활성을 중화하는 항체반응을 자극할 수 있는 변이체 독소를 스크리닝하는 방법은 변이체 독소가 Boca Raton, Fla.의 Toxin Technilogies 또는 Schlievert 박사로부터 입수 가능한 야생형 SPE-A에 대한 폴리클로날 중화성 항체와 면역반응하는지 여부를 측정하는 것이다. 변이체 SPE-A 독소가 야생형 SPE-A 독소에 대한 항체와 면역반응하는지 여부를 측정하는 방법은 ELISA, 웨스턴 블롯(Western Blot), 이중 면역확산 분석(Double Immunodiffusion Assay) 등을 포함한다.
경우에 따라, 변이체 독소는 또한 변이체 독소의 단백질분해 프로파일이 야생형 SPE-A 독소와 동일한지 여부를 판단하기 위해 스크리닝될 수 있다. 어떤 경우에는, 생성된 변이체는 야생형 SPE-A 독소에 비하여 변이체 독소의 전체 3차원 구조를 거의 변화시키지 않는 것이 바람직하다. 전체 구조에 변화가 있었는지 여부를 검사하는 한가지 방법은 야생형 SPE-A 독소에 대한 항체의 면역반응성을 관찰하거나 및/또는 변이체 SPE-A 독소의 단백질분해 프로파일을 검사하는 것이다. 단백질 분해 프로파일은 당업자에게 공지된 방법으로 트립신, 키모트립신, 파파인, 펩신, 섭틸리신 및 VS 프로테아제와 같은 효소를 사용하여 측정할 수 있다. 제 3 도에 도시된 서열을 가진 야생형 SPE-A의 단백질분해 프로파일은 공지되어 있다. 야생형 SPE-A와 유사한 프로파일을 갖는 변이체가 선택된다.
경우에 따라, 변이체 독소는 또한 생물학적 활성의 다른 변화를 갖도록 스크리닝하여 선택될 수 있다. 전술한 바와 같이, 야생형 SPE-A 독소와 관련된 여러가지 생물학적 활성이 있다. 이들 생물학적 활성으로는 1) 열; 2) STSS; 3) STSS의 발전 또는 엔도톡신 쇼크의 증가로 인한 전신 치사성; 4) 엔도톡신의 증가; 5) 모세혈관 누출 및 저혈압; 6) IFN γ, IL-1, TNF-α 및 TNF-β와 같은 사이토카인의 분비 유발; 7) 대동맥 내피세포에 결합; 8) MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합; 9) T-세포 수용체에 결합; 및 10) T-세포 유사분열성(초항원성)이 있다. 이들 생물학적 활성은 당업자들에게 알려져 있는 방법으로 측정될 수 있다.
백신 조성물에 유용한 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편의 경우, 이들은 야생형 SPE-A에 대한 중화 항체에 대해 실질적으로 비독성이고 또한 면역반응성인 것이 바람직하다. 중화 항체는 동물에 처리되었을 때 야생형 독소의 치사성을 억제하는 것들을 포함한다. 경우에 따라, 변이체 SPE-A 독소는 전술한 바와 같이 야생형 SPE-A 독소의 하나 이상의 생물학적 활성의 변화를 가질 수 있다.
경우에 따라, 백신 조성물의 바람직한 변이체 독소는 엔도톡신 쇼크의 상승작용 부족 때문에 더 스크리닝하여 선택된다. 엔도톡신 쇼크의 증가 부족을 검사하는 바람직한 평가는 실시예 4에 기술되어 있다. 토끼는 바람직하게는 시험전에 입증가능한 박테리아성 또는 바이러스성 감염을 갖지 않는다. 엔도톡신 쇼크의 상승작용 부족 또는 거의 증가없음은 동일 투여용량에서 야생형 SPE-A 활성에 비하여 변이체 SPE 독소가 엔도톡신과 함께 투여되었을 때 동물의 약 25% 미만이 쇼크를 일으키는 것으로 나타났다.
경우에 따라, 백신 조성물의 바람직한 변이체는 T 세포 유사분열의 변화에 대하여 추가로 스크리닝 및 선택된다. T-세포 유사분열의 변화는 실시예 4에 기술된 바와 같이 토끼 임파구를 사용하는 표준 3H 티미딘 분석에서 T-세포증식을 측정하거나; IFN -γ 또는 TNF-β 등의 사이토카인의 생산정도를 측정하거나; T-세포 반응의 Vβ 타입을 측정하거나; 또는 MHC 클래스 Ⅱ 수용체와 분자의 상호작용을 측정함에 의해 검출될 수 있다. T-세포 유사분열의 감소를 검출하는 바람직한 방법은 변이체 독소의 존재하에 또는 부재하에 토끼임파구의 T-세포 증식을 측정하는 것이다. 야생형 SPE-A 독소에 대한 T-세포의 반응은 항원에 대한 정상적인 시험관내 반응 이상으로 크게 증가한다. T 세포 유사분열의 실질적인 감소는 변이체 SPE-A 독소가 항원 또는 음성 대조군의 자극 이상으로 T 세포증식반응을 자극하지 않을 때 나타난다. 바람직하게는, 감소는 변이체 SPE-A 독소에 대한 T 세포 증식반응이 야생형 SPE-A 독소와 동일한 용량에서 토끼 임파구를 사용하여 측정하였을 때 2배 이상의 정도로 나타난다.
경우에 따라, 백신 조성물에 유용한 변이체 SPE-A 독소는 내피세포의 모세 혈관 누출시의 감소를 더욱 스크리닝하여 선택된다. 바람직한 방법은 Lee 등, J. Infect. Dis. 164:711 (1991)에 기술된 바와 같이 돼지 대동맥 내피세포를 사용하는 것이다. 변이체 SPE-A 독소의 존재하에 모세혈관 누출의 감소는 방사성 표지(label)된 화합물의 분비 감소를 측정함에 의해 또는 방사성 표지된 화합물의 이동 변화에 의해 측정할 수 있다. 모세혈관 누출의 감소는 방사활성으로 라벨된 화합물의 분리 또는 이동이 야생형 독소의 활성에 비하여 약 2배 미만으로 감소될 때 나타난다.
백신 조성물에 유용한 특히 바람직한 변이체 SPE-A 독소는 야생형 SPE-A 독소 활성을 갖는 단백질에 비하여 생물학적으로 활성적이지 않다. 생물학적으로 비활성인 것으로 인하여, 변이체 독소는 전신치사성이 약하거나 없고, 엔도톡신 쇼크가 약하거나 없고, 또는 T 세포 유사분열성이 약하거나 없다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 백신 조성물용으로 선택된 변이체 SPE-A 독소는 이들 생물학적 활성이 실질적으로 결여되어 있다. 즉, 이들은 음성 대조군처럼 반응하거나 또는 배경(background)보다 두배가 넘지 않는 정도로 반응을 촉진한다.
다른 생물학적 활성의 변화는 다음과 같이 검출될 수 있다. MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 결합은 Jardetzky, Nature 368:711 (1994)에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 열의 변화는 변이체 SPE-A 독소의 투여후 시간 경과에 따른 온도를 추적함으로써 알아낼 수 있다. 변이체 SPE-A 독소의 존재하에 사이토카인 생성정도의 변화는 상업적으로 입수가능하고 또한 면역학의 최근 프로토콜에 기재되어 있는 방법을 사용하여 측정할 수 있다(참조: Coligan, Kruisbeck, Margulies, Shevach, and Stroker. National Institute of Health, John Wiley and Sons, Inc.).
적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며 또한 실질적으로 비독성인 변이체 SPE-A 독소의 구체적인 예를 설명하면 다음과 같다.
백신 조성물의 특히 바람직한 변이체는 야생형 SPE-A 독소에 대한 폴리클로날 중화항체와 면역반응하며, 비독성이며, 또한 경우에 따라 엔도톡신 쇼크의 상승 작용의 감소 및 T-세포 유사분열의 감소를 갖는 변이체 SPE-A 독소이다. 특히 바람직한 변이체는 성숙한(mature) 독소의 20번째 잔기에 있는 아스파라긴 대신에 치환된 아스파르트산을 가지는 돌연변이 N20D와 같은 20번째 아미노산의 아스파라긴에 변화를 가지는 것이다. N20D 변이체는 비독성이고, 엔도톡신 쇼크의 증가가 없고 또한 T-세포 유사분열성의 5배 감소를 갖는 것으로 나타났다. 그 외에, 98번째 아미노산 위치에서 시스테인 그룹이 없어지는 98번째 아미노산의 변화는 엔도톡신 쇼크의 증가가 감소하고 또한 유사분열성이 4배 감소하는 변이체 독소를 생기게 한다. 이 위치에서 특히 바람직한 변이체는 시스테인 대신에 치환된 세린을 갖는다(C98S).
T-세포 증식의 자극 및 암의 치료에 바람직한 변이체는 실질적으로 비치사성을 갖는 변이체 독소이다. 이들 변이체 독소는 적어도 야생형 SPE-A 독소의 수준에서 T-세포 유사분열성을 유지하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 변이체는 예를 들면 157번째 잔기에 라이신 대신 글루탐산으로 치환된(K157E) 것과 같이 야생형 SPE-A의 157번째 잔기에 아미노산 변화를 가진다. K157E 변이체는 치사성은 없으나, 야생형 SPE-A 독소에 필적할 만한 유사분열성을 유지하는 것으로 나타났다.
한 분자의 특정한 도메인에서 아미노산을 다음과 같이 변화시킴으로써 기능성 변화에 영향을 미치는 변이체를 생산할 수 있다. 야생형 SPE-A 독소의 분자모델은 제 1 도에 도시되어 있다. 특히 바람직한 도메인은 N-말단 α 헬릭스 3 (아미노산 18-26), 중앙 α 헬릭스 5 (아미노산 142-158), 도메인 B 베타 사슬 (아미노산 30-36; 44-52; 55-62; 75-83; 및 95-106), 및 도메인 A 베타 사슬 (아미노산 117-126; 129-135; 169-175; 180-186; 및 213-220)을 포함한다. 87, 90 및 98번 위치의 시스테인 잔기도 또한 중요할 수 있다.
본 발명을 제한하는 의미는 아니지만, 이들 도메인은 야생형 SPE-A 활성의 생물학적 기능에 중요한 특정한 3-D 구조를 형성하는 것으로 생각된다. 제 2 도에 도시된 바와 같이 N-말단 α 헬릭스 및 중앙 α 헬릭스는 매우 가까이 위치하고 있어서 이곳에 위치하는 잔기들은 야생형 SPE-A 분자의 독성에 특히 중요할 수 있다. 그 외에, 중앙 알파 헬릭스에 가까운 주변(bordering) B 사슬에 위치하는 아미노산도 또한 독성에 있어서 중요할 수 있다. 제 1 도 및 2 도에 도시된 바와 같은 분자 모델은 구조 도메인의 표면 잔기와 내부(buried) 잔기를 확인하는 것을 돕는다.
백신 조성물의 경우, 바람직하게는 N-말단 알파 헬릭스 3의 잔기 (18-26 잔기)에 일어난 변화는 전신 치사성을 저하시키거나 엔도톡신 또는 T-세포 유사분열성을 증가시키거나 또는 이들 세가지 모두를 포함하도록 스크리닝 및 선택된다.
N-말단 알파 헬릭스 3의 변화에 대한 구체예는 20번째 잔기의 아미노산 변화이다. 아스파라긴에서 아스파르트산으로 상기 잔기가 변화하는 것은 엔도 쇼크 증가의 감소, 전신 치사성의 저하 및 5배의 유사분열성 감소를 생기게 한다. 20번째 잔기에서의 다른 변화는 표면 잔기의 전하 분포를 변화시키거나 또는 중앙 α 헬릭스와 N-말단 α 헬릭스의 상호작용을 변화시키는 것이 바람직하다. 글루탐산, 라이신, 아르기닌과 같은 전하 아미노산으로 20번째 아미노산이 치환되는 것은 동일한 효과를 나타낼 가능성이 있다. 이 지역에서 이루어진 변화는 STSS로 인한 전신 치사성을 감소시키는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 중앙 α 헬릭스 5의 142-158번째 잔기에서 변화가 이루어진다. 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖는 상기 지역에서의 변이체는 STSS 때문에 기인하는 전신 치사성을 감소시키기 위해 바람직하게 선택된다. 다른 독소 분자에서 확인된 유사한 중앙 α 헬릭스는 독성과 연관된 것으로 나타났다. 구체적인 예는 157번째 잔기의 변화이다. 상기 잔기의 라이신이 글루탐산으로 변화되는 것은 STSS로 인한 엔도톡신 쇼크 및 전신치사성의 증가를 감소시키게 한다.
그러나, T-세포 유사분열성은 상기 잔기에서의 변화에 의해 영향받지 않는다. 이들 결과는 독성 및 엔도톡신 쇼크 증가가 T-세포 유사분열성과는 별개의 활성을 갖는 것임을 보여준다. 백신 조성물의 경우, 상기 도메인에서 변화를 갖는 다른 변이체 독소는 T-세포 유사분열성을 감소시키기 위해 선택적으로 스크리닝 및 선택된다. 157번째 아미노산에 존재하는 전하 타입의 변화는 라이신을 아스파르트산으로 치환하는 것이 유사한 효과를 가질 수 있음을 나타낸다.
바람직하게는, 30-36번째 잔기 (베타 사슬 1), 44-52번째 잔기 (베타 사슬 2), 55-62번째 잔기 (베타 사슬3), 75-83번째 잔기 (베타 사슬4) 및 95-106번째 잔기 (베타 사슬5) (도메인 5)를 포함하는 도메인 B 베타 사슬에서의 변화는 비치사성을 위해 또한 임의로 엔도톡신 쇼크 증가 및/또는 세포 유사분열성의 저하를 위해 스크리닝 및 선택된다. SEB, SEA, TSST-1과 같은 여러가지 독소에서 베타 쉬트의 N-말단 장벽을 형성하는 복수개 잔기는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는데 중요한 것으로 나타났다. 변이체 독소에 의해 MHC 클래스 Ⅱ 결합의 저하는 Jardetzky 등, cited supra에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 선택할 수 있다. 베타 쉬트 구조를 파괴하거나 또는 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 접촉하는 잔기, 특히 베타 장벽(barrel)의 오목(concave) 표면상의 잔기를 변화시키는 잔기의 변화가 선택된다. 제 1 도 참조. 백신 조성물의 경우, 국소적인 구조를 변화시킬 수 있는 변화는 야생형 SPE-A 독소에 대한 폴리클로날 중화 항체와 변이체 독소와의 면역 반응성을 변화시키지 않는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 117-126번째 잔기 (도메인 베타 사슬 6), 129-135번째 잔기(도메인 7), 169-175번째 잔기 (도메인 8), 180-186번째 잔기 (도메인 9) 및 213-220번째 잔기 (도메인 10)를 포함하는 도메인 A 베타 사슬에 대한 변화는 비치사성을 나타내고, 엔도톡신 쇼크 감소를 가지고, 및/또는 T 세포 유사분열성의 감소를 갖는 것이 선택된다. 야생형 SPE-A 독소에 대한 폴리클로날 중화 항체와 변이체 SPE-A 독소와의 면역 반응성을 변화시키지 않으면서 베타 쉬트 구조를 변화시키는 변이체가 바람직하게 선택된다.
시스테인 잔기에 대한 변화 또는 디설파이드 결합이 도입된 변이체 SPE-A 독소는 치사성 저하, 또는 선택적으로는 엔도톡신 쇼크 증가의 감소, 및/또는 T-세포 유사분열성의 감소를 갖는 것이 선택될 수 있다. 구체적인 예는 98번째 시스테인 잔기의 변화이다. 상기 잔기에서 시스테인이 세린으로 변화되는 것는 유사분열성의 약 4배 감소 및 엔도톡신 쇼크 증가의 감소 및 STSS로 인한 치사성의 감소를 생기게 한다. 98번째 잔기에서 시스테인 그룹을 제거하는 변화는 세린으로의 치환과 유사한 방법으로 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다. 98번째 잔기에서 일어날 수 있는 다른 변화는 알라닌, 글리신 또는 트레오닌과 같은 다른 작은 지방족 잔기의 치환을 포함한다. 90 및 97번째 아미노산 잔기에서의 다른 시스테인 잔기의 변화는 유사분열성의 감소를 생기게 한다.
유리하게는, 치료방법에 유용한 변이체 SPE-A 독소는 아미노산 서열에서 하나 이상의 변화를 갖는 것으로 제조될 수 있다. 독성 또는 치사성을 갖는 분자로의 전환율을 최소화하기 위해서는 하나 이상의 위치에서 변화를 갖는 것이 바람직하다. 백신 조성물의 경우, 다수개의 변화를 갖는 변이체 독소가 야생형 SPE-A에 대한 보호 면역반응을 여전히 생기게 하거나 및/또는 야생형 SPE-A에 대한 중화 폴리클로날 항체와 면역반응하는 것이 바람직하다. 약학적 조성물의 경우, 다수개의 변화를 갖는 변이체는 T-세포의 유사분열성을 유지시키면서 실질적으로 비치명성을 갖는 것이 바람직하다. 약 2 내지 6의 변화를 갖는 것이 특히 바람직하다. 이러한 변이체는 예를 들면 N20D/K157E, N20D/C98S와 같은 이중 변이체, 삼중 변이체 등을 포함하는 ND20 변이를 갖는 것을 포함한다.
SPEA의 이중 변이체는 단일 변이체보다 이점을 제공할 수 있다. 이것은 실시예 6에 상세히 설명된 3개의 실험으로 평가되었다. 결과는 도면 제 7-9 도에 나타나 있다. 데이터는 N20D/C98S 변이체가 단일 N20D 변이체보다 적은 독성을 가지며 또한 이중 변이체 N20D/K157E는 다른 두 가지 단백질 사이의 중간체(intermediate) 임을 나타낸다. 세개의 변이체는 모두 야생형 SPEA 보다 현저하게 적은 독성을 갖는다. 단일 및 이중 변이체로 면역화된 토끼의 혈청은 변이되지 않은 SPEA 독소에 대한 반응시 임파세포 증식을 억제하였다. 임파세포 증식은 독소의 모든 독성과 연관되어 있으며 또한 필요하다.
동물들은 실시예 7에 기술된 바와 같이 N20D, N20D/C98S 또는 N20D/K157E에 대해 면역화되었다. 결과는 표 9에 나타나 있다. 이중 변이체로 면역화된 동물은 열 및 엔도톡신 쇼크에 대한 증가된 민감성으로부터 완전히 보호된다.
삼중 변이체는 본 출원 및 한 실시예에서 검토되며, SPE-A 변이체 N20D/C98S/D45N은 실시예 1-7의 방법 및 분석 및 본 명세서에서 기술된 프라이머를 사용하여 검사된다.
20번째 아미노산 잔기인 아스파라긴의 제거 및/또는 157번째 아미노산인 라이신 또는 98번째 시스테인의 제거 등 특정의 부위에서 잔기를 제거하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 백신 조성물의 경우, 제거를 갖는 변이체는 야생형 SPE-A 독소에 대한 폴리클로날 중화 항체와 면역반응하거나 및/또는 야생형 SPE-A 활성에 대한 보호 면역 반응을 자극할 수 있는 것을 선택할 수 있다.
SPE-A의 변이체 독소는 백신 조성물을 형성하는데 유용하다. 백신 조성물의 바람직한 변이체는 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 전신적으로 비독성이며 또한 야생형 SPE-A에 대한 폴리클로날 중화항체와 면역반응한다. 특히 바람직한 변이체는 N20D, N20D/K157E, N20D/C98S와 같은 20번째 아미노산에서 변화를 갖는 변이체 SPE-A 및 20번째 잔기인 아스파라긴이 제거되는 변이체를 포함한다.
변이체 독소는 생리학적으로 허용되는 담체와 결합된다. 생리학적으로 허용되는 희석제는 생리학적 식염용액 및 포스페이트 완충 식염같은 중성 pH에서 완충된 식염용액을 포함한다. 생리학적 담체의 다른 유형은 리포좀(liposome) 또는 폴리머 등을 포함한다. 경우에 따라, 변이체 독소는 프로이트 불완전 보조제, 프로이트 완전 보조제, 알룸(alum), 모노포스포릴 리피드 A, 알람 포스페이트 또는 하이드록사이드, QS-21 등과 같은 보조제와 결합할 수 있다. 경우에 따라, 변이체 독소 또는 그의 절편은 인터루킨, 인터페론 등과 같은 면역조절제와 결합할 수 있다. 많은 백신 제형은 당업자들에게 공지되어 있다.
변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편은 야생형 SPE-A 독소와 적어도 하나의 생물학적 활성에 대한 동물의 보호 면역 반응을 자극하는데 효과적인 양으로 백신 제형에 첨가된다. 보호 면역반응의 생성은 항체, 바람직하게는 야생형 SPE-A 독소를 중화하는 항체의 발전에 따라 측정할 수 있다. 야생형 SPE-A 독소의 중화는 동물의 야생형 SPE-A으로 인한 치사성 억제를 유발시켜 측정할 수 있다. 그 외에, 보호 면역 반응은 엔도톡신 증가 또는 STSS의 증상의 경감 또는 제거와 같은 야생형 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성의 감소를 측정함으로써 알아낼 수 있다. 보호 면역 반응을 형성할 수 있는 변이체 독소의 양은 체중의 kg당 약 0.1㎍ 내지 100 mg, 더욱 바람직하게 체중 kg당 약 1㎍ 내지 약 100㎍이다. 약 25㎍/kg 체중의 야생형 SPE-A 독소가 토끼의 보호 면역성을 유발하는데 효과적이다.
백신 조성물은 동물, 예를 들어 토끼, 설치류(rodent), 말 및 인간에 투여된다. 바람직한 동물은 인간이다.
변이체 SPE-A 독소는 또한 약학적 조성물을 형성하는데 유용하다. 약학적 조성물은 T-세포 증식의 자극이 바람직할 수 있는 치료학적 상황, 예를 들어 암의 치료시에 유용하다. 바람직한 변이체 SPE-A 독소는 야생형 SPE-A 독소에 필적할 만한 T-세포 유사분열성을 유지시키면서 비치사성을 갖는 것이다. 바람직한 변이체는 K157E와 같은 야생형 SPE-A 독소의 157번째 잔기 라이신에서 변화를 갖는 것이다.
약학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체 예를 들어 생리학적 식염수, 포스페이트 완충 식염수와 같이 중성 pH에서 완충된 식염수 용액과 변이체 SPE-A 독소를 결합시켜 형성된다. 변이체 SPE-A 독소는 동일용량에서 야생형 SPE-A 독소에 필적할 만한 T-세포 증식을 자극하는데 유효한 양으로 결합된다. T-세포 반응성의 증가는 토끼 임파구 세포로 표준 3H 티미딘 분석을 사용하여 측정할 수 있을 뿐만 아니라 형광 활성화 T-세포 분류기(sorter) 또는 ELISPOT같은 분석을 통한 생체내 T-세포 집단 측정에 의해 결정될 수 있다. 또한, 유효한 양은 암세포의 성장을 경감시키거나 감소시키는데 효과적인 양이다. 이것은 생체내 암세포의 성장에 대한 변이체 SPE-A 독소의 영향을 측정함으로써 또는 암-특이적 T-세포의 자극을 측정함으로써 결정할 수 있다. 유효량의 범위는 체중 kg당 100 ng 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 체중 kg당 1㎍ 내지 1 mg이다. 야생형 SPE-A 독소의 약 10-6 ㎍은 증가된 T-세포 반응성을 자극할 수 있다. 예를 들면, 이들 변이체 SPE-A 독소는 단독으로 사용되거나 또는 인터루킨 또는 인터페론 치료와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 SPE-A 독소의 절편 또는 변이체 SPE-A 독소의 절편을 포함한다. 백신 조성물의 경우, 절편은 바람직하게는 보호면역반응을 자극하는데 충분하다. B 세포 에피토프의 최소 크기는 약 4-7 아미노산이며, 또한 T-세포 에피토프의 경우에는 약 8-12 아미노산이다. 야생형 SPE-A의 전체 크기는 리더(leader) 서열을 포함하여 약 251 아미노산이다. 절편은 약 4 내지 250 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 10-50 아미노산인 펩타이드이다.
절편은 단일 펩타이드일 수 있거나 또는 다른 부위가 함께 결합된 펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 절편은 제 1 도에서 확인되고 전술한 바와 같은 하나 이상의 도메인을 포함한다. 또한, 변이체 SPE-A 독소로부터 절편은 야생형 SPE-A 독소에 실질적으로 상응하는 단백질에 비하여 아미노산 서열에서 적어도 하나의 변화 및 바람직하게는 아미노산 서열에서 1-6개의 변화를 갖는다.
바람직하게는, 절편은 전신적으로 거의 비치사성을 갖는다. 절편은 전술한 바와 같은 야생형 SPE-A 독소를 갖는 단백질과 동일한 용량 또는 그 이상의 용량에서 소형 삼투압 펌프를 사용하여 토끼의 독성이 약하거나 없는 것을 스크리닝하여 선택된다. 절편은 또한 야생형 SPE-A 독소에 필적할 만한 용량이 주어질 때 인간에게 비독성인 것이 바람직하다.
백신 조성물의 경우, 절편은 중앙 α 헬릭스 및/또는 N-말단 α 헬릭스 유래의 잔기들을 포함한다. 절편은 N20D와 같은 야생형 SPE-A 독소의 20번째 잔기와 동등한 아미노산 잔기에서의 변화 또는 야생형 SPE-A 독소에서 98번째 잔기인 시스테인과 동등한 아미노산 잔기에서의 변화를 포함하는 것이 바람직하다.
백신 조성물의 경우, 절편은 야생형 SPE-A 독소 활성을 갖는 단백질에 대한 중화항체반응을 자극하는 것이 바람직하다. 절편은 야생형 SPE-A 독소에 대한 폴리클로날 중화 항체와의 면역반응성을 위해 스크리닝 및 선택될 수 있다. 또한, 절편은 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있으며, 형성된 항체는 야생형 SPE-A 독소의 중에 대해 시험하였다.
백신 조성물의 경우, 특히 바람직한 절편은 생물학적으로 비활성이 되게 더욱 스크리닝 및 선별된다. 생물학적으로 비활성이라 함은 절편이 전신적으로 비치사성을 가지며, 엔도톡신의 증가가 약하거나 없고 또한 T-세포 자극이 약하거나 없다는 것을 의미한다. 경우에 따라, 절편은 돼지 내피세포에 모세혈관 누출 영향을 감소시키는 것을 스크리닝 및 선택된다.
백신 조성물용으로 스크리닝하여 선택된 절편은 백신 제형으로 결합시켜 전술한 바와 같이 이용할 수 있다. 경우에 따라, 절편은 담체 분자 예를 들어 소혈청 알부민, 사람혈청 알부민, 키이호울 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 파상풍 중독 독소 등에 부착될 수 있다.
약학적 조성물의 경우, 절편은 N-말단 도메인 B β 사슬에 단독적으로 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 중앙 α 헬릭스와 결합되게 아미노산 잔기를 포함한다. 절편은 K157E와 같이 야생형 SPE-A 독소의 157번째 아미노산인 라이신과 동등한 아미노산 잔기에서의 변화를 포함하는 것이 바람직하다.
약학적 조성물의 경우, 절편은 전신적으로 비치사성을 갖고 또한 임의로 전술한 바와 같이 엔도톡신 쇼크의 증가가 약하거나 없게 스크리닝 및 선택되는 것이 바람직하다. 절편은 야생형 SPE-A 독소와 유사한 T 세포 유사분열성을 유지하는 것이 바람직하다. 변이체 독소 SPE-A의 절편은 전술한 바와 같이 약학적 조성물을 형성할 수 있다.
변이체 SPE-A 독소의 절편은 PCR, 제한효소 소화 및/또는 접합(ligation), 시험관내 변이 및 화학적 합성을 이용하여 제조될 수 있다. 더욱 작은 절편의 경우, 화학적 합성이 바람직할 수 있다.
변이체 SPE-A 독소의 절편은 변이체SPE-A 독소에 대해 기술된 것과 동일한 조성 및 방법으로 이용될 수 있다.
B. 변이체 SPE-A 독소, 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 사용하는 방법
변이체 SPE-A 독소 및/또는 그의 절편은 야생형 SPE-A 독소의 효과에 대한 동물을 보호하는 방법, 강화된 T-세포 증식 및 반응성을 포함하여 STSS로 동물을 경감 또는 치료하는 방법 및 암의 증상을 치료 또는 경감하는 방법에 유용하다.
야생형 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대해 동물을 보호하는 방법은 동물에 백신 조성물을 투여하여 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대한 보호면역반응을 수행하는 단계를 포함한다. 보호면역반응은 중화하고 치사성 또는 STSS의 증상에 대하여 보호하는 것이 바람직하다. 백신 조성물은 바람직하게는 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 야생형 SPE-A에 대한 폴리클로날 항체와 면역반응하며 또한 비치사성을 갖는 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 포함한다. 특히 바람직한 변이체는 변이체 N20D 또는 N20D/K157E 또는 N20D/C98S와 같이 20번째 아미노산 잔기인 아스파라긴에서 변화를 갖는다.
백신 조성물은 다양한 투여방법, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내, 내피내(intradermal), 경구, 비강내, 눈 및 복강내 등으로 동물에 투여될 수 있다. 바람직한 투여방법은 근육내이다.
백신 조성물은 토끼, 설치류, 말 및 인간을 포함한 다양한 동물에 투여될 수 있다. 바람직한 동물은 인간이다.
백신 조성물은 야생형 SPE-A의 생물학적 특성 중의 적어도 하나에 대한 보호 면역성이 이루어질 때까지 일회 또는 다수회 용량으로 투여할 수 있다. 보호면역성은 표준방법을 사용하여 야생형 SPE-A에 대한 중화항체의 존재를 측정하여 알아낼 수 있다. 실질적인 독성을 일으키지 않으면서 보호 면역성을 제공하는데 유효한 양을 투여한다.
변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편은 변이체 SPE-A 독소 및 야생형 SPE-A 독소와 면역반응하는 중화항체를 생성시키는데 유용하다. 이들 항체는 STSS의 증상을 가진 환자들에게서 증상을 치료 또는 경감하기 위하여 음성 면역혈청으로 사용할 수 있다. 상술한 바와 같은 백신 조성물은 야생형 SPE-A에 대한 중화항체가 생성될 때까지 말 또는 인간 등의 동물에 투여할 수 있다. 이어서 이들 중화항체를 수거하고 정제한 다음 STSS의 증상을 나타내는 환자를 치료하기 위해 사용한다. 또한, 야생형 SPE-A 독소에 대한 중화항체는 야생형 SPE-A를 사용하여 형성될 수 있다. 그러나, 야생형 SPE-A는 토끼의 야생형 SPE-A의 LD50의 1/50 내지 1/100과 같이 독성을 유발하는 것보다 더 낮은 용량으로 투여되어야 한다.
중화항체는 STSS 증상 예를 들어 열, 저혈압, 그룹 A 스트렙토코커스 감염, 근염, 근막염 및 간장애를 나타내는 환자들에게 SPE-A 독소의 효과를 중화하는데 유효한 양으로 투여된다. 중화항체는 정맥내, 근육내, 내피내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여방법은 정맥내이거나 또는 국부적인 감염의 경우 표면절개(debridement)된 조직 손상부위에서 국소적으로 투여된다. 중화항체는 항생제 치료와 함께 투여되는 것도 또한 바람직하다. 중화항체는 쇼크 또는 조직손상의 감소가 일회 또는 다수회 투여용량으로 이루어질 때까지 투여될 수 있다. 대표적으로 투여되는 중화항체의 바람직한 양은 체중의 약 1mg 내지 1000mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 200mg/kg이다.
변이체 SPE-A 독소 및/또는 그의 절편은 T-세포 증식의 자극을 위한 약학적 조성물에서, 특히 암의 치료에도 또한 유용하다. 이들 약학적 조성물은 인터루킨, 인터페론 또는 종양괴사인자를 사용하는 최신 암치료요법 대신에 또는 이와 함께 사용하는 것이 특히 바람직하다. 변이체 SPE-A 독소는 T-세포 임파종 및 난소 및 자궁암을 치료하는데도 또한 유용하다. 본 발명을 한정하는 의미는 아니지만, 변이체 SPE-A 독소는 T-임파세포에 선택적으로 독성을 나타낼 수 있다.
약학적 조성물은 T-세포 유사분열성을 유지하면서 치사성을 나타내지 않는 변이체 SPE-A 독소 및/또는 그의 절편을 포함한다. 바람직한 변이체 SPE-A 독소는 K157E와 같은 157번째 아미노산 잔기인 라이신에서 변화를 갖는 것이다.
약학적 조성물은 암 환자에게 정맥내, 근육내, 피내, 경구, 복강내 및 피하로 투여된다. 바람직한 방법은 정맥내이다. 약학적 조성물은 단일용량 또는 다수용량으로 투여할 수 있다. 약학적 조성물은 강화된 T-세포 증식 반응을 자극하거나 및/또는 실질적인 독성없이 암의 성장을 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다. 바람직한 양은 100ng 내지 100mg/kg, 더욱 바람직하게는 1ng 내지 1mg/kg 범위이다. 변이체 SPE-A 약학적 조성물은 인터페론, 인터루킨 또는 종양괴사인자를 사용하는 치료요법과 함께 또는 상기 요법 대신에 투여된다.
C. 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 발현 카셋트 및 이러한 DNA 발현 카셋트의 제조 방법
본 발명은 또한 변이체 SPE-A 독소 및/또는 그의 절편의 발현에 유용한 DNA 서열 및 발현 카셋트를 포함한다. 발현 카셋트는 숙주세포에서 작용을 하는 프로모터에 기능적으로 결합된 야생형 SPE-A 독소에 실질적으로 상응하는 단백질에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변화 및 적어도 하나의 생물학적 기능 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소 및/또는 그의 절편을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 발현 카셋트는 형질전환 벡터에 도입되며 또한 변이체 SPE-A 독소는 형질전환 세포에서 생산된다. 이어서 변이 독소는 숙주세포 또는 숙주세포 상등액으로 정제될 수 있다. 또한, 변형된 숙주세포는 백신 조성물로서도 유용하다.
또한, 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편은 부위 특이적 또는 임의 돌연변이(random mutagenesis)에 대해 기술된 것과 유사한 방법으로 자연 돌연변이체(spontaneous mutant)를 스크리닝 및 선택함으로써 형성될 수 있다. 끝으로, 변이체 SPE-A 독소는 화학적 합성법을 사용하여 생성될 수 있다.
변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열
아미노산 서열에서 적어도 하나의 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 변이체 DNA 서열은 선택된 변화의 유형에 따라 다양한 방법으로 형성될 수 있다. 야생형 SPE-A 독소에 실질적으로 상응하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열을 생성시키는데 사용되는 주형 DNA로서 작용한다. 야생형 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열은 제 3 도에 도시되어 있으며, ATCC 수탁번호 69830으로 기탁된 미생물에 기탁되어 있다.
특정의 위치 또는 위치들에서 특정의 변화 또는 변화들을 생기게 하기 위해서는 PCR은 Perrin 등, cited supra의 방법에 따라 이용하는 것이 바람직하다. 특정한 위치에서의 변화를 목적으로 하기 위하여, 아미노산의 변화를 코딩하는 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 내부(internal) 프라이머가 5' 및 3' 인접(flanking) 프라이머를 포함하는 혼합물에 포함된다. 5' 인접 프라이머는 야생형 SPE-A 코딩서열의 번역시작 부위 상류의 DNA 지역에 상동적이거나 또는 교잡된다. 바람직하게는, 5' 인접 지역은 speA 프로모터 및 조절 부위의 상류이다. 예를 들면, 5' 인접 프라이머는 제 2 도에 도시된 바와 같이 번역시작 부위의 760 염기 상류에 상동적이거나 교잡될 수 있다. 상류 조절 부위에서 SPE-A 프로모터를 포함하는 5' 인접 프라이머의 예는 다음과 같은 서열을 갖는다.
하류 인접 프라이머는 야생형 SPE-A에 대한 코딩 서열의 정지코돈 하류 DNA 부위에 상동적이거나 또는 교잡한다. 하류 인접 프라이머는 전사 및 번역 정지 신호를 제공하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 3' 인접 프라이머는 SPE-A의 코딩서열에 대한 정지코돈의 200 염기쌍 하류 부위에 상동적이거나 교잡한다. 3' 인접 프라이머의 예는 다음과 같은 서열을 갖는다.
상류 및 하류 인접 프라이머는 수득된 PCR 생성물이 speA 프로모터 및 상류 조절 부위 및 전사 및 번역 정지신호를 포함하도록 모든 PCR 반응에 존재한다. 다른 상류 및 하류 프라이머는 당업자들에 의해 용이하게 구성될 수 있다. 바람직하긴 하지만, 본래의(naive) speA 프로모터 및 상류 조절 부위가 PCR 생성물에 포함되어야 함는 것이 절대적으로 필요한 것이 아니다.
특정한 부위에서의 각각의 변이는 특정한 잔기에서 변화를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 내부 프라이머를 사용하여 생성된다. 예를 들면, 특정한 부위에서의 아미노산 치환은 다음과 같은 내부 프라이머를 사용하여 생성될 수 있다:
제 3 도에 도시된 바와 같이 밑줄친 뉴클레오타이드는 야생형 speA 유전자로부터의 뉴클레오타이드 서열 변화를 나타낸다.
내부 프라이머는 제 3 도에 도시된 바와 같은 야생형 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열을 이용하여 특정한 위치에서 변화가 생기게 하도록 고안될 수 있다. 프라이머는 상술한 바와 같은 특정의 위치에서 특정의 아미노산 치환을 코딩하도록 고안될 수 있다. 프라이머는 Rennell 등, J. Mol. Biol. 22:67 (1991)에 기술된 바와 같이 특정의 부위에서 불규칙 치환이 생기게 하도록 고안될 수 있다. 프라이머는 특정의 부위에서 아미노산이 제거되도록 고안될 수 있다. 또한, 프라이머는 특정의 위치에서 추가의 아미노산 코딩서열을 부가하도록 고안될 수 있다.
프라이머는 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오타이드 길이이며, 더욱 바람직하게는 15 내지 30 뉴클레오타이드 길이이다. 프라이머는 바람직하게는 자동화 합성법에 의해 제조된다. 5' 및 3' 인접 프라이머는 야생형 SPE-A 독소의 코딩서열을 코딩하는 인접 DNA 서열에 교잡하는 것이 바람직하다. 이들 프라이머는 인접 DNA 서열에 100% 상동적이거나 상보적인 약 10 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하다. 내부 프라이머는 특정의 위치에서 이들의 변화를 코딩하기 때문에 특정의 위치에서 아미노산을 코딩하는 DNA 서열에 100% 상보적이지 않다. 내부 프라이머는 약 15 내지 30 뉴클레오타이드 길이를 갖는 프라이머에서 야생형 SPE-A 서열과 약 1 내지 4 부정합(mismatch)을 갖는다. 또한, 인접 프라이머 및 내부 프라이머는 바람직하게는 프라이머 말단 근처에서 제한효소 부위 및 클램프(clamp) 부위를 코딩하는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 교잡조건은 문헌[Sambrook 등, 분자클로닝-A 실험 매뉴얼, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]에 기술된 바와 같은 공지방법에 따라 프라이머내에 존재하는 부정합의 수를 고려하여 변경될 수 있다.
하나 이상의 내부 프라이머는 하나 이상의 부위에서 변화가 요구되는 경우 사용될 수 있다. 예를 들면, 20번째 아미노산인 아스파라긴에서의 변화 및 157번째 아미노산인 라이신에서의 변화를 갖는 변이체를 생산하기 위하여, 상술한 바와 같은 내부 프라이머가 실시예 5에 기술된 바와 같은 2개의 별도의 반응에서 이용될 수 있다. 하나 이상의 위치에서 부위-특이적 변화를 일으키는 PCR 방법은 Aiyar 등, cited supra에 기술되어 있다. 다른 방법은 실시예 5에 기술되어 있다.
한 방법에서, 특정의 부위에서 하나의 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열이 생산된 다음, 이것은 두번째 부위에서 변화를 갖는 변이체 DNA 서열을 생산하도록 주형으로 사용된다. PCR의 첫 번째 라운드에서, 첫 번째 내부 프라이머는 첫 번째 변화를 갖는 변이체 DNA 서열을 생산하기 위해 사용된다. 첫 번째 변화를 갖는 변이체 DNA 서열은 주형 DNA로서 사용되며 또한 상이한 부위에서의 변화를 코딩하는 두 번째 내부 프라이머는 두 개의 위치에서 아미노산 서열의 변화를 갖는 변이체 독소를 코딩하는 DNA 서열을 제조하기 위해 사용된다. PCR 방법은 약 2 내지 6개의 변화를 갖는 아미노산 서열을 코딩하면서 DNA 서열을 생산하는데 이용될 수 있다.
바람직한 PCR 방법은 Perrin 등, cited supra에 기술된 바와 같다. 요컨대, PCR 반응조건은 다음과 같다: PCR은 100mM 트리스-HCl (pH=8.3), 50mM KCl2, 1.5mM MgCl2, 200μM 각각의 dNTP, 2ng 주형 플라스미드 DNA, 100 pmole 인접 프라이머, 5 pmole 내부 프라이머 및 2.5 유니트의 Ampli Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus)를 함유하는 100㎕ 반응 혼합물 중에서 수행된다. 두 번째 증폭단계에서 반응혼합물의 조성은 동일한 몰량(각각 5 pmole)의 인접 플라이머 및 메가프라이머(megaprimer) 및 1㎍의 주형을 제외하고는 상기와 같다. PCR은 94℃ × 1분동안 변성(denaturation), 37℃ 또는 44℃ × 2분동안 어닐링(annealing) 및 72℃에서 3분동안 연장(extension)을 30 사이클 수행한다.
PCR 생성물은 분리된 다음 [Murray 등의 방법, J. Immunology 152:87 (1994)에 의해 생산되고 미네소타주 미니아폴리스, 미네소타 대학에서 입수 가능한 pMIN과 같은] 셔틀 벡터로 클로닝된다. 상기 벡터는 암피실린 내성을 가진 대장균 플라스미드 pBR328 및 에리트로마이신 내성을 부여하는 스타필로코커스 플라스미드 pE194의 키메라(chimera)이다. 접합된 플라스미드 혼합물은 Toxin Technologies, Boca Raton, Fla로부터 또는 Schlievert로부터 입수된 야생형 SPE-A에 대한 폴리클로날 중화항체를 사용하여 대장균에서 독소 생산에 대해 스크리닝된다. 변이체 SPE-A 독소는 원하는 변이의 존재 및 다른 변이의 부재를 확인하기 위하여 Hsiao 등의 방법, Necleic Acid Res. 19:2787 (1991)에 의해 시퀀싱(sequencing)된다.
이러한 방법으로 생산된 특정의 DNA 서열은 939번째 위치의 아데닌이 구아닌 잔기로 바뀐 것을 제외하고는 제 3 도에 도시된 바와 같은 코딩서열을 가지며 또한 변이체 N20D를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
변이체 C87S를 코딩하는 DNA 서열은 1,152번째 위치의 티민이 아데닌으로 바뀌고 또한 1,154번째 위치의 티민이 시토신으로 바뀌는 것을 제외하고는 제 3 도와 동일한 코딩 서열을 갖는다. 변이체 SPE-A 독소 C98S를 코딩하는 DNA 서열은 1,185번째 위치의 구아닌이 시토신으로 바뀌고, 또한 1,186번째 위치의 티민이 구아닌으로 바뀌는 것을 제외하고는 제 3 도와 동일한 코딩 서열을 갖는다. 변이체 SPE-A 독소 C90S를 코딩하는 DNA 서열은 1,161번째 위치의 구아닌이 시토신으로 바뀌는 것을 제외하고는 제 3 도와 동일한 코딩서열을 갖는다. 변이체 SPE-A 독소 K157E를 코딩하는 DNA 서열은 제 3 도에 도시된 코딩 서열과 동일하지만 1,351번째 위치의 아데닌에서 구아닌으로 바뀐다. 변이체 SPE-A 독소 S195A를 코딩하는 DNA 서열은 1,464번째 위치의 티민이 구아닌인 것을 제외하고는 제 3 도에 도시된 바와 같은 코딩 서열을 갖는 DNA 서열이다. 변이체 K16N SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열은 941번째 위치의 아데닌이 시토신으로 바뀌는 것을 제외하고는 제 3도에 도시된 것과 같은 서열을 포함한다.
당업자들은 유전코드의 유연성(degeneracy) 때문에 다수의 DNA 서열이 아미노산중에 동일한 변화를 코딩할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖지만 아미노산 서열에서 동일한 변화를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
특정한 부위에서의 임의 돌연변이(random mutagenesis)의 경우, 일련의 프라이머는 특정의 위치에서 다른 19개 아미노산 각각 또는 비자연 발생 아미노산이 치환되도록 고안된다. PCR은 상술한 것과 유사한 방법으로 또는 Rennell 등, cited supra에 기술된 방법으로 수행된다. PCR 생성물을 서브클로닝한 다음 독소의 생성은 야생형 SPE-A에 대한 폴리클로날 항체와의 면역반응성으로 검사한다. 아미노산 서열중에 변화가 일어났는지는 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열의 시퀀싱에 의해 검증될 수 있다. 바람직하게는, 변이체 독소는 비치사성에 대하여 스크리닝 및 선택된다.
변이유발의 다른 방법도 또한 야생형 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열 중에 임의 변이를 생기게 하는데 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 임의 변이 또는 임의 변이발생은 선택된 부위에서 있지 않거나 및/또는 선택된 변화에서 없다. 야생형 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열, 바람직하게는 pMIN 164를 포함하는 박테리아 숙주 세포는 다른 표준 방법 예를 들어 화학적 돌연변이 발생 및 UV 조사를 이용하여 변이를 일으킬 수 있다. 이러한 방법으로 생산된 변이체는 야생형 SPE-A에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 독소생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 그러나 생물학적 활성에서 적어도 하나의 변화를 갖는 변이체 독소, 바람직하게는 비치사성의 변이체 독소를 확인하기 위해 추가의 스크리닝이 필요하다. 자연적으로 발생하는 변이체는 또한 야생형 SPE-A로부터 생물학적 활성의 적어도 하나의 변화에 대해 스크리닝될 수 있다.
불규칙 변이발생은 또한 Anthony-Cahill 등, Trends Biochem. Sci. 14:400(1989)에 기술된 바와 같이 시험관내 변이 발생을 이용하여 수행될 수 있다.
그 외에, 변이체 SPE-A 독소는 화학적 합성을 이용하여 형성할 수 있다. 단백질을 화학적으로 합성하는 방법은 Wallace, FASEB J. 7:505 (1993)에 기술되어 있다. 단백질의 일부는 합성된 다음 효소 또는 직접적인 화학적 중합(condensation)을 통하여 함께 결합될 수 있다. 화학적 합성을 이용하면 원하는 위치에서 비자연적 발생 아미노산을 당업자들이 삽입시키는데 유용할 것이다. 그 외에 화학적 합성은 변이체 SPE-A 독소의 절편을 만드는데 특히 유용할 것이다. 여기에 기술된 방법은 어느 것이나 변이체 SPE-A 독소의 절편을 형성하는데 유용할 것이다. 그 외에, 절편은 제한효소 소화 및/또는 접합을 사용하여 쉽게 생산할 수 있다. 절편을 생산하는 바람직한 방법은 20개 아미노산 또는 그 이하의 절편의 직접적인 화학적 합성을 통하여 또는 더 큰 절편의 유전적 클로닝을 통하여 이루어진다.
변이체 독소를 코딩하는 DNA 서열은 부위-특이적이든 임의적이든 야생형 SPE-A 독소로부터 생물학적 활성의 다른 변화를 위해 더 스크리닝된다. 적어도 하나의 생물학적 활성에서의 변화를 스크리닝하는 방법은 앞에서 설명되어 있다. 변이체 SPS-A 독소를 코딩하는 선택된 DNA 서열이 생물학적 활성에서 적어도 하나의 변화를 위해 일단 선택되면, 이들 서열은 발현 카셋트를 형성하는데 사용된다.
발현 카셋트의 형성은 숙주세포에서 변이체 SPE-A 독소의 발현을 부여하는 프로모터와 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열을 결합시키는 것을 포함한다. 여기에 기술된 PCR을 사용하여 생산된 변이체 SPE-A 독소의 경우, 자연적(native) speA 프로모터가 존재하여 숙주세포에서의 발현을 제공한다.
경우에 따라, DNA 서열은 상이한 프로모터와 결합하여 특이한 형태의 숙주 세포 중에서 발현을 제공하거나 숙주세포 중에서 발현 정도를 증가시킨다. 바람직하게는, 프로모터는 변이체 SPE-A 독소의 발현을 어느 정도 부여하여 변이체 SPE-A에 대한 항체에 의해 검출될 수 있도록 한다. 원핵 세포에서 사용될 수 있는 다른 프로모터는 Plac, Ptac, T7 등을 포함한다.
변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열이 일단 적절한 프로모터와 결합하여 발현 카셋트를 형성하게 되면, 발현 카셋트는 적절한 형질전환 벡터로 서브 클로닝된다. 적절한 형질전환 벡터는 적어도 하나의 선택 가능한 표시유전자를 포함하며, 바람직하게는 대장균 및 그람 양성 미생물에서 증폭될 수 있는 셔틀 벡터이다. 적절한 셔틀 벡터의 예는 pMIN 164 및 pCE 104를 포함한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터 예를 들어 바쿠로바이러스, SV40, 폭스바이러스, 예를 들어 백시니아, 아데노바이러스 및 시토메가바이러스를 포함한다. 바람직한 벡터는 대장균 및 S. 아우레우스에서 증폭될 수 있는 셔틀 벡터인 pMIN 164 벡터이다.
형질전환 벡터가 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 발현 카셋트를 운반되어 형성되면 변이체 SPE-A 독소의 발현을 제공하는 적절한 숙주세포내로 도입된다. 적절한 숙주세포는 다른 바람직하지 않은 분자 예를 들어 엔도톡신 및 M-단백질과의 오염 가능성을 최소화하면서 변이체 독소의 발현을 높은 수준으로 제공하는 세포이다. 적절한 숙주세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포 예를 들어 S. 아우레우스, 대장균. 및 살모넬라 종, 효모세포 및 곤충세포를 포함한다. 형질전환 방법은 당업자들에게 공지되어 있으며, 또한 프로토플라스트 형질전환, 리포솜 매개 형질전환, 칼슘포스페이트 침전 및 일렉트로포레이션법을 포함한다. 바람직한 방법은 프로토플라스트 형질전환이다.
바람직한 형질전환 세포는 20번째 아미노산인 아스파라긴에서 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 발현 카셋트를 운반한다. 이러한 형질전환 세포는 마릴랜드 록크빌라의 ATCC에 기탁되어 있다. 기탁된 미생물의 특징은 자연적 speA 프로모터 및 다른 조절 부위에 기능적으로 결합된 돌연변이 N20D를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 pMIN 164를 운반하는 S. 아우레우스인 것이다. 상기 미생물은 부다페스트 조약에 따라 수탁번호 69831로 기탁되어 있다.
또 다른 미생물은 ATCC에 기탁되어 있다. 상기 미생물은 자연적 speA 프로모터 및 조절 부위에 기능적으로 결합된 야생형 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열을 운반하는 S. 아우레우스이다. 상기 미생물은 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 수탁번호 69830으로 기탁되어 있다.
형질전환 세포는 백신 조성물에 이용될 수 있는 다량의 변이체 SPE-A 독소를 생산하는데 이용될 수 있다. 형질전환된 미생물은 살아있는, 약독화된 또는 숙주 사멸된 백신에 이용될 수 있다. 형질전환된 미생물은 야생형 SPE-A에 대한 보호면역반응을 자극하는데 충분한 정도의 양으로 변이체 SPE-A 독소를 포함한다. 바람직하게는, 변이체 SPE-A 독소가 분비된다. 미생물은 바람직하게는 사람에게 비 병원성이며 또한 독성인 형태로의 전환을 최소화하기 위해 다수개의 아미노산 변화를 갖는 변이체 독소를 포함한다. 미생물은 공지된 원리에 따라 살아있는 또는 가열 사멸된 백신으로서 투여될 수 있다. 살아있는 백신의 바람직한 미생물은 형질전환된 세포 예를 들어 살모넬라 종이다.
숙주세포에서 작용을 하는 프로모터에 기능적으로 결합된 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 코딩하는 DNA 서열과 발현 카셋트를 포함하는 바이러스 벡터는 또한 여기에 기술된 백신 조성물에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 포유동물 세포에서 작용을 한다. 적절한 바이러스 벡터의 예는 폭스 바이러스 예를 들어 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 시토메가로바이러스 등을 포함한다. 백시니아 바이러스 벡터는 야생형 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대하여 인간을 면역화시키는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 숙주세포에서 작용을 하는 프로모터에 기능적으로 결합된 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 프로모터는 바람직하게는 포유동물 숙주세포에서 작용을 한다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 백신 조성물은 개개 자신의 세포내에서 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편의 발현을 위해 숙주세포 또는 개인에게 공급된다. 개인에게 있어서 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편의 핵산 서열이 발현되는 것은 야생형 SPE-A 독소에 대하여 보호면역을 제공한다. 경우에 따라, 발현 카셋트는 벡터내에 도입될 수 있다. 핵산 분자는 직접적으로 또는 바이러스 벡터중에 투여될 수 있다. 백신 조성물은 또한 임의로 백신을 세포내로 공급하는 공급제 예를 들어 리포좀 등을 포함한다. 백신 조성물은 또한 임의로는 보조제 또는 다른 면역조절화합물 및 세포내로 핵산의 흡입을 증가시키는 추가 화합물을 포함한다. 백신 조성물은 정맥내, 복강내 등의 비경구법을 포함한 다양한 투여방법에 의해 또는 점막표면과의 접촉에 의해 투여될 수 있다.
변이체 SPE-A 독소의 대규모 성장 및 생산 조건은 당업자들에게 공지되어 있다. 미생물 공급원으로부터 변이체 SPE-A 독소의 정제방법은 다음과 같다. pMIN164에 있는 야생형 speA 또는 변이체를 운반하는 S. 아우레우스는 5㎍/ml의 에리트로마이신을 함유하는 투석 가능한 소 심장 배지에서 정지상(stationary phase)이 되도록 호기적으로 37℃에서 성장한다. 배양배지는 발열물질이 제거된 물속에 재용해된 4배 부피의 에탄올 및 단백질로 침전된다. 조준비물(crude preparation)은 3.5 내지 10 및 4 내지 6의 pH 구배로 연속적인 플랫 베드 등전 집중 분리(isoelectric focusing separation) 처리된다. 항체 반응성에 의해 독성에 양성을 보이는 분획은 발열물질이 제거된 물에 대하여 광범위하게 투석되며, 또한 각각의 앨리쿼트는 15% (중량/용적) 겔에서의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 순도를 실험한다. SPE-A에 대한 폴리클로날 중화항체는 Toxin Technologies, Boca Raton, Fla 또는 Dr. Schlievert로부터 입수할 수 있다. 칼럼 클로마토그래피 또는 HPLC를 포함한 다른 정제방법이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명은 바람직한 실시예를 대표하는 하기 실시예에 의해 보다 잘 이해될 수 있다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것처럼 해석되어서는 안된다.
실시예 1
SPE-A 야생형의 클로닝 및 발현
야생형 SPE-A 독소 (speA)를 코딩하는 유전자는 Johnson 등, Mol. Gen. Genet. 194:52-56 (1984)에 기술된 바와 같이 대장균으로부터 클로닝되었다. 요컨대, speA 유전자는 대장균 RR1의 pBR322에 있는 Phage T12 DNA의 HindⅢ 소화절편을 클로닝함으로써 동정되었다. 형질전환체는 A 독소에 대한 폴리클로날 중화 항혈청을 사용하여 독소 생산에 양성인 것을 확인함으로써 선택되었다. A 독소의 뉴클레오타이드는 Weeks 등, Inf. Imm. 52:144 (1986)에 보고되어 있다.
speA 유전자를 포함하는 DNA 서열를 서브클로닝한 다음 S. 아우레우스에서 발현시켰다. 대장균 플라스미드에 운반된 speA는 제한효소 HindⅢ 및 SalI과 함께 소화되었다. 절편을 정제한 다음 pMIN 164 (전술한 바와 같이 입수가능)의 HindIII-SalI 형태로 접합시켰다. 벡터 pMIN 164는 스타필로코커스 플라스미드 pE194 (에리트로마이신 내성을 가짐) 및 대장균 벡터 pBR328 (Amp 및 Tet 내성을 가짐)의 키메라이다. 상기 벡터의 HindⅢ-SalI 부위에 speA이 클로닝되는 것은 Tet 내성을 파괴한다. 클로닝된 유전자의 바로 상류에 위치하는 본 플라스미드의 프로모터는 자연적 speA 프로모터이다.
speA 유전자의 발현은 발명자들 실험실에서 준비한 톡신으로부터 SPE-A에 대한 폴리클로날 중화항체로 이중 면역분산 평가에 의해 독소를 검출함으로써 증명하였다.
실시예 2
재조합 생산된 SPE-A(wt)로 토끼의 투여 및 면역화
동물에게 재조합 생산된 SPE-A를 투여하는 것은 STSS를 유도한다. 재조합 생산된 SPE-A에 의한 동물의 면역화는 동물이 M3 및 M1 스트렙토코커스로 자극되어 STSS에 대하여 동물을 보호할 때 사망률을 저하시킨다.
SPE-A의 투여는 토끼에서 STSS를 유발시킨다. STSS의 토끼모델은 피하로 주입된 소형삼투압 펌프로 SPE-A의 투여에 의해 입증되었다. Lee 등, Infect Immun. 59-879 (1991) 참조. 이들 펌프는 7일기간에 걸쳐 일정량의 독소를 방출하여 독소에 연속적인 노출을 제공하도록 고안되어 있다. 재조합 생산된 SPE-A는 7일 동안에 총 용량 200㎍/in 0.2ml로 토끼에 투여되었다. 결과는 SPE-A로 처리된 동물이 7일 이내에 죽는 거의 모든 동물에 STSS의 증상을 일으켰음을 나타낸다(도시되지 않음). 토끼에서의 STSS의 증상은 체중감소, 설사, 안면반상, 열, 붉은 결막 및 점막 및 투명한 갈색뇨를 포함한다. 예상한 바와 같이, 비독소 처리된 대조군 동물은 건강하게 남아있었다. 두 개의 다른 주요한 관찰은 1) 유체 대체(fluid replacement)는 기대한 바와 같이 동물에 완전한 보호를 제공하였으며, 또한 2) 독소 처리된 동물이 SPE-A 이외에 또는 이에 추가의 인자를 나타내는 괴사성 근막염 또는 근염을 일으켰으며, 이들은 연한 조직손상이 요구된다는 것이다.
STSS의 임상적 특징의 발전은 SPE-A의 투여와 상호관련되어 있다. SPE-A 양성 스트렙토코커스로 주입된 토끼는 STSS을 일으킨 반면, SPE-A 음성 스트렙토코커스로 주입된 토끼는 STSS의 증상을 보여주지 않았다.
SPE-A는 약간의 그룹 A 스트렙토코커스에 의해 이루어진 가변특성인 것은 잘 알려져 있다. SPE-A에 대한 유전자는 박테리오파지 T12에 의해 코딩되며, 잘 특성화된 스트렙토코커스 균주는 T12로 일컬어지는 SPE-A 파지가 존재하는지 여부에만 차이가 있는 것으로 입증되었다. T12 큐어된(cured) 스트렙토코커스 균주 T253는 SPE-A의 생산에 양성인 반면, 큐어된 T253은 SPE-A 음성이다.
토끼는 Scott 등, Infect Immunity 39:383 (1983)에 기술된 바와 같이, T12 큐어된 SPE-A 양성 스트렙토코커스 T253 또는 이식된 위플레 골프 볼에 큐어된 SPE-A 음성 T253으로 피하주사되었다. 결과는 표 1에 나타나 있다. 그 결과는 SPE-A 양성 스타필로코커스로 주사한 동물이 STSS의 임상적 특징을 일으키고 또한 6/8이 치사함을 보여준다. 두 마리의 생존동물은 SPE-A에 대한 항체를 발생시켰다. 반면, 독소 음성 균주인 큐어드 T25는 훨씬 높은 박테리아 세포 농도에서 조차도 열만 유발하였으며 치사는 관찰되지 않았다. 전술한 동물모델 실험에서와 같이 연한 조직의 괴사 증거는 관찰되지 않았다. 더구나, 스트렙토코커스는 골프 볼에 국부적으로 잔류하였으며, 이는 이들 스트렙토코커스 균주가 고도로 침습적이지 않음을 암시한다.
* 약 1x108 세포
+ 약 1x1011 세포
++ 2마리의 생존체는 SPE-A에 대한 항체를 발생시켰음
재조합 생산된 SPE-A로 면역화하는 것은 토끼가 M1 또는 M3 스타필로코커스로 항원투여되었을 때 치사율을 감소시켰다. 토끼는 스타필로코커스 생성물, 예를 들어 M 단백질에 오염되어 동물이 면역화되는 가능성을 방지하기 위하여 S. 아우레우스로부터 유도된 클론화 SPE-A로 면역화되었다. 대조동물은 SPE-A에 대하여 면역화되지 않는다. 프로인트 불완전 보조제중에 50㎍의 재조합 생산된 SPE-A를 피하로 주입하였다. 9일후 토끼는 투석된 소 심장 배지에서 성장한 M3(1.4x109 총CFU) 또는 M1(4.2x109 총CFU) 스트렙토코커스 25ml로 피하투여되었다. M1 및 M3 스트렙토코코스 분리체(isolate)는 임상적 분리체이다. M1 분리체는 MNST로 지정되며 또한 M3 분리물은 NNBY로 지정되어 있다. 이들 분리체는 미네소타 미니아폴리스의 미네소타대학, Dr. Schlievert로부터 입수가능하다.
표 2에 나타낸 데이터는 이들 실험의 결과를 보여준다.
* 동물은 S. 아우레우스로부터 준비된 클론화 SPE-A에 대해 면역화되며 또한 SPE-A에 대한 ELISA 타이터는 10,000이상임.
+ 동물은 투석가능한 소 심장 배지에서 1.4x109 CFU M3 또는 4.2x109 CFU M1 스타필로코커스로 피하로 항원투여됨.
++ 미네소타대학 동물보호위원회의 가이드라인에 따르며, M3 스타필로코커스를 사용한 실험은 24시간후 정지되었으며 또한 M1 스타필로코커스를 사용한 실험은 48시간후 정지되었음.
s 피셔의 정확한 확률시험에 의해 측정된 P 값.
상기와 같이 SPE-A 면역화된 토끼 19마리 중 16마리는 M3 스타필로코커스로 항원투여시 생존하였으나, 면역화되지 않은 토기는 20마리 중 4마리만 생존하였다. 살아있는 면역동물은 함유된 연한 농양 형성의 분명한 증거를 보여주었으며, 액체 검사시 PMN으로 채워져 있었다. 유사한 결과는 M1 스타필로코커스의 연구에서도 얻어졌으며, 다만 M1 미생물은 M3 미생물처럼 유독하지 않았다 (표 2). 비 면역 대조동물에서 조차도, 더 높은 수의 M1 스타필로코커스가 사용되었고 토끼에서의 감소된 치사율이 나타났다. 이것은 M3 균주에 비하여 M1 균주에 의한 약 50배 더 낮은 SPE-A 생산을 반영할 수 있다.
반면, 비면역 동물은 농양 형성을 보여주지 않았으며, 2/2 동물로부터 액체의 검사는 PMN 침입을 나타내지 않았다. 이들 결과는 SPE-A 면역동물과 비면역 동물간의 한가지 주요한 차이점이 염증반응을 높일 수 있는지 여부에 있는 것으로 보이고 있음을 보여준다. SPE-A는 물론 다른 발열 독소 초항원은 대식세포를 유발하여 높은 농도의 TNF-α를 생산한다. TNF-α는 외관상으로는 화학주화성(chemotatic) 수용체의 조절을 통하여 PMN 화학주성을 크게 감소시킨다. 따라서, 상기 결과는 SPE-A 면역동물의 항체(타이터〉10,000 by ELISA)가 중화 SPE-A에 의해 대식세포로부터 TNF-α의 분비를 봉쇄하며, 이에 따라 보호염증반응을 유발시키는 것으로 생각된다. 비면역 동물에서 SPE-A는 보호 화학주화성 반응의 유발을 방지하는 TNF-α의 현저한 분비의 원인이 될 수 있다.
치사된 동물 모두는 한 마리를 제외하고는 그들의 전체측면이 진홍색-흑색으로 변하고 많은 경우에 허물을 벗는 것으로부터 입증되는 바와 같이 광범위한 연질 조직 손상을 보여주었음을 주목하는 것이 중요하다. 면역 그룹에서 하나의 동물은 면역후 치사하였다. 이들 동물의 조직에서 탐지가능한 염증이 없음은 숙주면역성분이 아닌 스트렙토코커스 인자가 괴사성 근막염 및 근염의 원인이 되고 있음을 암시한다. 다른 세포외 인자도 또한 연질조직손상, 예를 들어 SPE-B 및 스트렙토라이신 O 및 S에 기여할 수 있다.
상기 데이터 모두는, STSS의 유발시, 존재하는 경우, 발열 독소 초항체 및 특히 SPE-A의 원인이 되는 강한 케이스이다.
실시예 3
SPE-A를 코딩하는 DNA 서열의 부위 지향성 변이유발
생물학적 활성에 중요한 SPE-A의 위치는 부위 지정(site directed) 변이유발을 사용하여 확인하였다. 단일 아미노산 변화는 하기 기술된 바와 같은 다양한 분자 지역으로 도입된다.
SPE-A의 3차원 구조 모델은 제 1 도에 도시되어 있다. 상기 모델 구조는 캘리포니아 산디에고, BioSym Corp.의 Insight/Homology 프로그램을 사용하는 Homology에 의해 만들었다. 상기 분자는 하기와 같이 동정되는 여러 가지 도메인을 갖는다:
아미노산 번호 지정은 제 3 도에 도시된 서열을 참조한 것이다.
아미노산은 분자중의 시스테인 잔기를 변화시키도록 도메인 각각에서 선택되었다. 특히 바람직한 도메인은 N-말단 α-헬릭스 (18-26); 중앙 α-헬릭스 (142 내지 158); 도메인 A β 사슬 및 도메인 B β 사슬이다.
변이유발용 표적 잔기는 전술한 바와 같은 프로그램을 사용하여 1차 아미노산 서열 및/또는 3-D 구조의 유사성 또는 상동성을 비교함으로써 발열 독소군을 통한 보존된 아미노산 중에서 선택하였다. 아미노산 각각에 대해 이루어진 변화는 특정 부위 잔기의 아미노산 체인의 특성을 변화시켜 선택하였다. 예를 들면, 세 개의 잔기(87, 90 및 98)에서 세린은 분자중의 설피드릴(sulphydryl) 그룹이 변하도록 시스테인 대신 치환되었다. 세 개의 다른 아미노산 잔기에서는 특정부위에 존재하는 전하에서 변화가 이루어졌다. 예를 들면, 라이신은 글루탐 (157)산으로 변환되고 라이신은 아스파라긴 (16)으로 변환되고 또한 아스파라긴은 아스파틱산(20)으로 변환되었다.
다른 아미노산은 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 독소의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 또 다른 분자에서, TSST-1N 말단 β 배럴 사슬은 MHC 클래스 Ⅱ 분자의 α 및 β 체인과의 접촉에 중요하였다. 따라서, 도메인 A 및 도메인 B β 사슬에서의 변화는 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 이들 분자의 상호작용을 조절하는데 중요할 수 있다. 아울러, 잔기의 변화는 특정한 위치에서 임의 돌연변이 및 각각의 다른 19가지 아미노산의 치환 방법을 사용하여 준비될 수 있으며, 이후 치사성과 같은 생물학적 활성에 있어서 변화를 보이는 상기 돌연변이체를 선별할 수 있다.
변이체 SPE-A 분자는 파지 T12 유래의 클론된 SPE-A 유전자를 주형 DNA로 하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용한 부위 지정 돌연변이 방법을 사용하여 준비되었다. 상기 프라이머들은 생성되는 각각의 돌연변이를 위해 사용되었다. 각각의 변이체의 생산은 하기와 같은 세가지 프라이머를 사용하는 것을 포함하였다: 상류 5' 인접 프라이머, 아미노산에서 변화를 코딩하는 DNA 서열의 변화를 포함하는 내부 프라이머 및 하류 인접 프라이머. 상류 인접 프라이머는 모든 PCR 반응에 포함되며, 또한 번역 시작 부위의 DNA 지역 약 760 염기 상류에 상동성이 있으며, 하기 서열을 갖는다.
수득된 PCR 생성물은 speA 프로모터 및 가능한 상류 조절 부위을 포함한다. 하류 인접 프라이머는 정지코돈의 270 베이스 하류 DNA 부위에 상보적이며 또한 다음 서열을 갖는다:
하류 인접 프라이머는 모든 PCR 반응에서 존재하며 또한 프라이머의 위치때문에 PCR 생성물은 잠재적인(putative) 전사 정지 서열을 포함한다.
각각의 변이는 특정의 아미노산 잔기에서의 변화를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 내부 프라이머를 사용하여 발생된다. 각각의 변이체를 생성시키기 위해 사용되는 내부 프라이머는 다음과 같다:
밑줄친 잔기는 야생형 SEQ-A를 코딩하는 DNA 서열로부터 만든 코딩서열의 변화를 나타낸다.
PCR은 다음과 같이 수행하였다: 간략히 설명하면, 아미노산 변화를 생성시키는데 필요한 뉴클레오타이드 치환을 함유하고 돌연변이 부위를 포괄(spanning)하는 전방 프라이머 및 하류 인접 프라이머는 표준 PCR 반응 상태에서 동일하지 않은 몰량으로 혼합되었다. 수득된 DNA 생성물은 변이를 포함하는 사슬이 우세하였다. 수백 염기 길이일 수 있는 생성물 또는 메가프라이머는 1% 아가로스 겔중의 전기영동에 의해 분리되며 또한 제조회사(Bio 101, La Jolla, 캐리포니아)에서 추천하는 바와 같이 Geneclean kit를 사용하여 용출하였다.
간략히 설명하면, PCR 반응조건은 다음과 같다: PCR은 10 mM 트리스-HCl (pH=8.3), 50 mM MgCl2, 200 μM 각각 dNTP, 2 ng 주형 플라스미드 DNA, 100 pmole 인접 프라이머, 5pmole 내부 프라이머 및 2.5 유니트의 Ampli Taq DNA 중합효소 (Perkin Elmer Cetus)를 함유하는 100 ㎕ 반응혼합물 중에서 수행된다. 제 2 증폭 단계에서 반응혼합물의 조성은 동일한 몰 (각각 5pmole)의 인접 프라이머 및 메가프라이머 및 1 ㎍ 주형을 제외하고는 상기와 같다. PCR은 94℃×1분에서 변성, 37℃ 또는 44℃×2분에서 어닐링 및 72℃에서 3분간 연장을 30사이클 수행한다. 교잡조건은 프라이머 크기, 부정합 및 GC 함량에 따라 공지된 원리에 의해 변할 수 있다.
speA 클로닝 유전자 및 인접 서열을 함유하는 플라스미드는 주형으로 사용되었다. 제 2 단계에서 완전한 길이의 변이체 speA를 생산하기 위하여 메가 프라이머 및 상류 인접 프라이머는 반응 혼합물중에 동일한 몰량으로 혼합되었다.
변이체 speA 유전자는 적절한 제한효소로 소화되어 셔틀벡터 pMIN 164 형태로 클로닝되었다. 상기 벡터는 암피실린 억제 유전자를 운반하는 대장균 플라스미드 pBR328 및 에리트로마이신 억제를 부여하는 스타필로코커스 플라스미드 pE194의 키메라이다. 접합된 플라스미드 혼합물은 형질전환되고, 선택되고, 대장균에서 스크리닝된다. 이중 면역확산 분석(double immunodiffusion assay)에 따른 판단으로 독소 생산에 양성인 클론들은 원하는 돌연변이의 존재 및 다른 돌연변이의 부재를 확인하기 위하여 Hsiao cited supra의 방법에 의해 시퀀싱되었다. 이어서 플라스미드는 변이체 독소의 발현 및 생산을 위해 S. 아우레우스 균주 RN 4220 (뉴욕, Richard Novic, Skirball Institute에서 입수가능)으로 형질전환되었다.
pMIN164 중의 야생형 speA 또는 변이체를 운반하는 S. 아우레우스는 5㎍/ml의 에리트로마이신을 함유하는 투석 가능한 소 심장 배지에서 정지상으로 37℃에서 호기적 성장시켰다. 배양 배지는 발열물이 제거된 물속에 재용해된 4배 부피의 에탄올 및 단백질로 침전시켰다. 조준비물(crude preparation)은 3.5 내지 10 및 4 내지 6의 pH 구배로 연속적인 플랫 베드 등전 집중 분리 처리되었다. 항체 반응성에 의한 독성에 양성인 분획은 발열물이 제거된 물에 대하여 광범위하게 투석하였으며 또한 각각의 앨리쿼트는 15% (중량/용적) 겔 중의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 순도를 실험하였다 (도시되지 않음). 제조된 모든 변이체는 트립신 (2 ㎍/㎍ SPE-A)으로 60분간 처리에 대하여 자연독소와 같은 내성이 있으며, 또한 이것은 자연 SPE-A에 대하여 일어나는 폴리클로날 항체에 대한 보존 반응성과 함께 도입된 돌연변이가 독소의 거대한 구조변화의 원인이 되지 않는다는 것을 나타낸다. 이들 방법을 사용하여 SPE-A의 아미노산 서열중에 단일 아미노산 치환을 갖는 7개 변이체가 생성되었다.
실시예 4
변이체 SPE-A의 생물학적 활성
변이체 독소의 생물학적 활성은 야생형 SPE-A의 것과 비교 평가되었다. 변이체 독소는 T-임파구(초항원성)의 증식을 자극하고, 엔도톡신 쇼크에 대한 숙주 민감성을 높이고 또한 쇼크 증후군 및 치사율을 유발할 수 있는 능력에 대하여 실험 되었다.
T-임파구의 증식을 자극할 수 있는 능력은 토끼 비장세포의 DNA내로 [3H] 티미딘 함입으로 측정하였다. 표준 4일 유사분열성 평가는 96웰 마이클로타이터 플레이트중에서 수행하였다. 각 웰은 25 mM HEPES, 2.0 mM L-글루타민, 100℃페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2% 심장 비활성화 FCS로 보충된 200 ㎕ RPMI 1640 (Gibico, Grand Island, NY)에 재현탁된 2x105 토끼 비장세포를 함유하였다. 엔도톡신의 10㎍ 샘플을 최종량의 4배량 : 1 ㎍ 내지 105 ㎍/웰로 첨가하였다. 주변세포증식은 비장세포에 20㎕ RPMI를 첨가하여 4배웰로 측정하였다. 37℃ 및 7% CO2에서 습도조절 챔버중에 3일간 배양한 후, 1.0 μCi (20㎕ 용적의 5-[메틸-3H]-티미딘 (46 Ci/mole, Amersham, Arlington Heights, IL)을 각 웰에 첨가하고 18 시간 배양하였다. 세포 DNA는 글래스 파이버 필터로 수집하고 [메틸-3H]-티미딘 함입은 액체 신틸레이션 계수기로 정량하였다. 3개의 상이한 토끼 공여체를 사용하는 3개의 별도의 평가를 수행하였다. 엑소프로테인 농도는 3개의 평가 각각에 대하여 4회 반복하여 수행하였다. 결과는 CPM으로 나타나 있다.
엔도톡신 쇼크에 대한 숙주민감성을 높이는 능력은 American Dutch Belted 토끼에서 검사되었다. 체중 1 내지 2 kg의 동물을 5 ㎍/kg 체중의 SPE-A (1/50 LD50과 동등함)로 가장자리 귀 정맥에 주사하고 4시간 후 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 유래의 1 또는 10㎍/kg 체중의 엔도톡신 (약 1/100 LD50)을 IV 주사에 의해 투여하였다. 동물을 치사 48시간 후 모니터하였다.
또한, 치사성은 200㎍의 독소를 함유하며 American Dutch Belted 토끼에 피하로 주입된 미니삼투압 펌프를 사용하여 측정하였다. 개개의 단백질 (200㎍)은 미니삼투압 펌프 (Alzet, AlzaCo, Palo Alto, 캘리포니아)내에 0.2ml PBS로 주사하였다. 펌프는7일간에 걸쳐 일정량의 독소를 공급하도록 고안되어 있다. 토끼는 설사, 결막 및 귀의 홍반, 쇼크 및 8일이내 치사와 같은 독성 쇼크 증후군에 대하여 매일 3회 모니터하였다.
T-세포 유사분열성의 연구 결과는 제 4, 5 및 6 도에 도시되어 있다. 그 결과는 변이체 N20D가 초항원성 및 T-세포 유사분열 활성에서 5배 감소를 가졌음을 보여준다. 변이체 C87S 및 C98S도 또한 T-세포 유사분열성에서 4배 감소를 나타내었다. 따라서, 돌연변이 중 여럿은 초항원 또는 T 세포 유사분열성의 생물학적 활성에 영향을 미쳤다.
엔도톡신 쇼크 증가 및 치사율의 결과는 하기 표 3, 4 및 5에 나타나 있다.
상기 결과는 변이체 N20D로 처리한 동물이 STSS의 양쪽 모델을 사용하여 시험하였을 때 STSS를 유발하지 않았음을 보여준다. N20D에서의 변이는 독소의 후방에 깊은 홈을 접하는 조직화된 α-헬릭스에서 발견된다. 상기 잔기는 분자의 초항원성 및 치사기능에 중요하다.
설피딜 그룹을 제거하고 따라서 가능한 디설파이드 결합을 방해하는 변이는 시스테인 잔기가 변이가 되어 있느냐에 따라 SPE-A의 생물학적 활성에 대한 영향을 변화시킨다. C90S 변이체는 완전히 치사적인 것으로 남아 있으며 (표 4), 또한 T-세포 자극활성은 현저하게 감소되지 않았다 (제 5a 도). 반면, C87S 및 C98S 돌연변이는 독소의 유사분열성을 대략 4배 감소시켰다 (제 5b 도). 그러나, 엔도톡신을 유발할 수 있는 능력은 두 개의 변이에서 다르게 영향을 받는다. 즉 C98S는 단지 약한 독성이지만 C87S는 강한 독성이다 (표 4). 이들 결과에 대한 설명은 1차 서열 및 3-차원 구조에서 3개의 시스테인 잔기의 상대 위치를 기본으로 한다 (제 1 도). C98의 설피딜 그룹의 부족은 스타필로코커스 엔테로톡신에서 나타난 추상적인 디설파이드 결합의 형성을 방지할 수 있으며, 따라서 루프의 형태가 없어진다. 이것은 상기 루프에 존재하는 아미노산이 숙주세포 수용체와 접촉하는 역할을 하거나 또는 분자의 생물학적 활성에 있어서 어떤 다른 기능을 가진다면 활성에 대하여 해로운 영향이 된다. C87S 변이의 경우에 잠재적인 디설파이드 결합은 형태의 대부분을 유지하므로 그의 활성도 유지하면서 C90 및 C98 사이에서 생성될 수 있다.
긴 중앙 α-헬릭스내에 위치한 변이체 K157E는 완전한 초항원성을 유지하지만, 토끼에 미니삼투압 펌프로 투여하였을 때 치사성이 없었다 (표 6).
α-5 헬릭스의 일부인 잔기 S195A는 그의 변이가 시험된 활성에 영향을 미치지 않기 때문에 시험된 생물학적 활성에 중요하지 않을 수 있다. 상기 잔기는 환경에 노출할 수 없거나 또는 결합에 기여할 수 없다.
이들 결과는 치사성 및 초항원성이 여러 부위에서 변이에 의해 영향을 받을 수 있음을 보여준다. 치사성은 N-말단 α-헬릭스 (N20D) 및 중앙 α-헬릭스 (K157E)에서 잔기의 변이에 의해 영향을 받을 수 있다. 유사분열성은 N 말단 α-헬릭스에서의 변이 및 설피드릴 그룹에 대한 변화에 영향을 줄 수 있다.
이들 결과는 또한 초항원성에 영향을 미치지 않고 치사성에 영향을 미치는 변이체 (K157E) 및 치사성에 영향을 미치지 않고 유사분열성에 영향을 미치는 변이체 (C87S)를 생산하기 때문에 유사분열성 및 치사성이 별개의 활성이라는 것을 보여준다.
실시예 5
PCR을 사용하는 SPE-A의 이중 또는 삼중 변이체의 제조
이중 또는 삼중 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 생성시키는데 사용될 수 있는 여러 가지 방법이 있다.
아미노산 서열에 2개 이상의 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소는 전술한 바와 같은 PCR을 사용하여 제조할 수 있다. 첫 번째 PCR 반응에서 선택된 부위에서 첫 번째 변화를 코딩하는 제 1 내부 프라이머는 5' 및 3' 인접 프라이머와 결합하여 첫번째 PCR 생성물을 형성한다. 첫 번째 PCR 생성물은 아미노산 서열에서 하나의 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열이다. 이어서 상기 첫 번째 PCR 생성물은 주형 DNA로 작용함으로써 야생형 SPE-A 활성을 갖는 단백질에 비하여 아미노산 서열에서 두개의 변화를 갖는 두 번째 PCR 생성물을 생성시킨다. 첫 번째 PCR 생성물은 두 번째 부위에서 아미노산의 변화를 코딩하는 두 번째 내부 프라이머와 결합된 주형 DNA이다. 두 번째 내부 프라이머도 또한 5' 및 3' 인접 프라이머와 결합하여 두 번째 PCR 생성물을 형성한다. 두 번째 PCR 생성물은 아미노산 서열의 두 개의 부위에서 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA 서열이다. 이어서 상기 두 번째 PCR 생성물은 세 번째 반응에서 주형으로 작용하여 아미노산 서열의 3개 부위에서 변화를 갖는 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 생성물 DNA 서열을 형성한다. 상기 방법은 아미노산 서열에서 하나 이상의 변화를 갖는 변이체 독소를 코딩하는 DNA 서열을 생성시킨다.
하나 이상의 변화를 코딩하는 DNA 서열을 제조하기 위한 다른 방법은 자동합성법에 의해 아미노산 서열의 변화 또는 변화들을 코딩하는 DNA 서열의 절편을 제조하는 것이다. 이어서 상기 절편은 여러가지 독특한 제한효소 부위를 사용하는 야생형 SPE-A 코딩 서열로 서브클로닝 될 수 있다. 제한효소 부위는 당업자들에게 알려져 있으며 또한 야생형 SPE-A 독소의 DNA 서열로부터 쉽게 결정될 수 있다. 클로닝은 Revi 등, Nucleic Acid Res. 16:1030 (1980)에 기술된 바와 같은 세 개 절편의 접합법으로 단일단계로 수행될 수 있다.
실시예 6
단일 또는 이중 변이체에 관한 독성연구
야생형 SPEA, SPEA N20D, SPEA K157E, SPEA N20D/C98S 및 SPEA N20D/K157E는 토끼 비장세포 증식을 자극할 수 있는 용량에 기초하여 초항원성을 평가하였다 (제 7 및 8 도 참조).
이중 변이체 SPEA (N20D/C89S, N20D/K157E)는 상술한 기술을 사용하는 PCR 변이유발에 의해 제조되었다다. 변이체 SPEA 유전자인 speA N20D는 두 번째 변이의 도입을 위한 주형 DNA로 작용하였다. 단지 지정된 변화만이 존재한다는 것을 확인하기 위하여, 이중 변이체 유전자는 상기에 기재된 방법에 따라 시퀀싱 되었다. 토끼 비장세포는 1μCi/웰의 3H 티미딘 첨가후 시험관내에서 SPEA 및 SPEA 변이체의 존재하에 3일간 배양한 다음 며칠간 더 배양하였다. 임파구 DNA로의 3H 티미딘의 함입은 T-세포 증식에 대한 측정으로 사용하였다. 초항원지수는 자극세포에서 3H 티미딘 함입에서의 평균 카운트/분을 첨가된 SPEA 또는 변이체 없이 배양된 세포에서의 평균 카운트/분으로 나눈 것으로 계산하였다.
야생형 SPEA는 1 내지 0.001 ㎍/웰의 용량에서 현저하게 초항원성을 나타내었다 (제 7 도). SPEA K157E는 0.01 내지 0.001 ㎍/웰의 용량에서 현저하게 유사 분열성을 나타내었다 (제 7 도). 3개의 다른 변이체 (SPEA N20D, SPEA N20D/C98S, SPRA N20D/K157E)는 1 내지 0.001 ㎍ (p〈0.001)에서 야생형 SPEA 보다 현저하게 적은 초항원성을 나타내었다 (제 8 도). 흥미롭게는, SPEA N20D는 1 및 0.1 ㎍ 의 용량(각각, p〈0.0005, p〈0.001)에서 SPEA N20D/C98S보다 현저하게 높은 초항원성을 나타내었다 (제 8 도). 더욱이, SPEA N20D는 1 ㎍/웰의 용량(p〈0.01)에서 SPEA N20D/K157E보다 더 유사분열성을 나타내었다. 따라서, 데이터는 N20D/C98S 변이체가 단일 N20D 변이체보다 더 적은 독성을 가졌으며, 또한 이중 변이체 N20D/K157E가 다른 두 단백질간의 중간체 이었음을 나타낸다. 모든 세 개의 변이체는 야생형 SPEA보다 현저하게 적은 독성을 나타내었다.
두 번째 실험에서 토끼(3/그룹)는 10 ㎍/kg SPEA 또는 변이체로 iv 투여되었고, 4시간 후에 엔도톡신 5 ㎍/kg로 투여되었다. 동물은 SPE 및 엔도톡신의 투여로 인하여 증가된 치사성을 위해 48시간동안 모니터하였다. 상기 분석은 SPEA 치사 활성의 생체내 측정에서 가장 민감하다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 야생형 SPEA 및 엔도톡신으로 항원투여된 0/3 동물이 생존하였다. 반면, SPEA N20D로 항원투여된 하나의 동물만 살아있었고, SPEA N20D/C98S 또는 SPEA N20D/K157E로 항원투여한 모든 동물이 생존하였다.
표 6. 엔도톡신 (5㎍/kg)의 치사효과에 대한 토끼민감성을 높일 수 있는 SPEA (10㎍/kg) 또는 변이체 (10㎍/kg)의 능력
주: SPEA 또는 변이체는 0시간에 정맥내로 또한 4시간에 정맥내로 엔도톡신을 투여하였다. 동물은 치사성을 위해 48시간 모니터하였다.
세 번째 실험에서 SPEA N20D, SPEA N20D/C98S 또는 SPEA N20D/K157E로 면역화시킨 다음 전술한 실험에서와 같이 야생형 SPEA (10㎍/kg) 및 엔도톡신(5㎍/kg 또는 25㎍/kg)으로 항원투여하였다. 대조동물은 면역화되지 않았으나, 야생형 및 엔도톡신으로 항원투여하였다. 토끼는 불완전 보조제 (Freund's, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)중에 현탁된 변이 단백질(50㎍/주사)로 격주마다 2회씩 면역화되었으며, 야생형 독소로 항원투여하기 전에 일주일 휴식시켰다. 야생형 SPEA 및 엔도톡신을 결합하면 10 ㎍/kg SPEA 및 5 ㎍/kg 엔도톡신의 경우에는 20 LD50, 10 ㎍/kg SPEA 및 25 ㎍/kg 엔도톡신의 경우에는 100 LD50을 나타낸다.
표 7에 나타낸 바와 같이, SPEA 및 엔도톡신의 100 LD50으로 항원투여된 모든 동물은 죽었다. 마찬가지로, SPEA 및 엔도톡신의 20 LD50으로 항원투여되었을때 SPEA N20D 또는 N20D/K157E로 면역화된 모든 동물은 죽었다. 반면, 이중변이체 N20D/C98S로 면역시킨 동물은 살아있었다. 이중 변이체 N20D/K157E로 면역시킨 동물은 다른 동물보다 일찍 죽었다. 상기 데이터는 이중 변이체 특히 SPEA N20D/C98S가 시험동물에서 독성백신으로서 효과적임을 보여준다.
표 7. 치사성 엔도톡신 쇼크에 대한 민감성을 증가시킬 수 있는 야생형 SPEA의 능력에 대하여 토끼를 면역시킬 수 있는 SPEA 변이체의 능력
주: 약간의 동물은 이 실험중 이탈하였다. 이들 동물은 상기 데이터에 포함되지 않았다.
실시예 7
SPE-A 변이체에 대한 항체에 의한 SPE A 억제 및 SPE-A 변이체의 면역
ND20D, N20D/C98S 및 N20D/K157E SPEA로 면역화된 토기 및 비면역화된 대조군 토끼 각각의 가장자리 귀 정맥으로부터 1ml의 혈액을 취하였다. 동물은 최종면역화 7일 후 (동물이 표 6의 실험에 사용되기 하루전) 채혈하였다. 혈액이 응고된 후 원심분리 (13,000xg, 10min)에 의해 혈청을 분리시켰다. 각 그룹의 혈청을 모으고(pooled) 실온에서 1시간 동안 33 1/3% (최종농도)의 암모늄 설페이트로 처리하여 면역글로불린을 침전시켰다. 침전된 면역글로불린은 원심분리 (13,000xg, 10min)에 의해 수집하고 포스페이트 완충 식염수 (0.005M NaPO4pH7.0, 0.15M NaCl)중에 최초용액으로 재용해시키고, 4℃에서 1리터의 0.15M NaCl에 대하여 24시간 투석하였다. 투석물은 여과 멸균(0.45 ㎛ 구공크기)시키고 0.01㎍ SPEA의 토끼 비장세포 유사분열성(초항원성)을 중화시키는 조사에 사용되었다 (제 9 도).
야생형 SPEA로 아치사량(sublethal dose)으로 면역화된 한 마리 토끼로부터 분리된 혈청은 비교할 수 있을 정도로 분획되었고 양성 대조군으로 사용되었다. 각 군의 혈청으로부터 20 ㎕의 면역글로불린 분획물 (Igs)을 완전한 RPMI 1460 포유동물 세포 배양배지(최초 혈청용적에 대하여 희석)로 1/5 및 1/50 희석시킨 다음, 표준 유사분열성 평가에서 야생형 SPEA 및 2x105 토기 비장세포를 함유하는 40웰의 각각에 첨가하였다. Igs 및 야생형 독소는 시간 0에서 임파구에 첨가되었다. 그 결과는 제 9 도에 도시되어 있다. 1/5 희석된 Igs는 면역화된 동물유래이건 비장세포 증식에 억제성을 나타내었는데, 아마도 아마 Igs내의 암모늄 설페이트 때문으로 보인다. 그러나, SPEA 면역동물 유래의 Igs 및 ND20, ND20D/C98S 및 ND20D/K157E 면역동물 유래의 Igs는, 유사분열성의 특이 억제를 나타내면서, 비면역 대조동물 유래의 Igs보다 더 억제성을 나타내었다 (정상분포된 데이터의 Student's t 분석을 이용하면 SPEA 대 비면역의 경우 p=0.006, N20D 대 비면역이 경우 p=0.035, N20D/C98S 대 비면역이 경우 p=0.0002 및 N20D/K157E 대비면역의 경우 p=0.035).
Igs가 1/50 희석액에 첨가되는 경우, 이중 변이체 N20D/C98S는 비면역 대조군에 비해 비장세포증식의 현저한 증가를 유발하였다 (p=0.046). 이러한 Igs 농도에서, 어떤 분획물도 임파세포 유사분열성의 비특이적 억제성이 없었다.
이들 데이터는 이중 변이체 N20D/C98S가 단일변이체 N20D 또는 다른 이중변이체 N20D/K157E보다 야생형 SPEA의 유사분열성에 대하여 동물을 면역시키는데 더 좋을 수 있음을 제시한다. 그러나, 이중변이체 N20D/K157E는 단일변이체 N20D보다 더 좋은 면역성이 있었다. 다음으로 한정되지는 않지만, N20D/C98 변이체는 치사성, T-세포수용체 상호작용 및 아마도 간접적으로는 항원 표시 세포에 대한 클래스 Ⅱ MHC 상호작용에 필요한 숙주세포 수용체 부위와 상호작용할 수 있다. 클래스 Ⅱ MHC 상호작용은 독소의 표준면(standard view)에서 β 배럴 도메인 (도메인 B)내의 잔기에 좌우되기 때문에, 본 발명자는 또한 상기 도메인 (예: D45N)에서의 변화가 N20D/C98S의 항원성을 더욱 증가시킬 수 있음을 제안한다. 상기 가설에 대한 기초는 야생형 독소 (및 클래스 Ⅱ MHC 상호작용 도메인에서의 변화가 없는 변이체)가 항원 표시 세포에 의해 정상 진행요건 없이 클래스 Ⅱ MHC 분자에 직접 결합한다는 것이다. 상기와 같은 직접적인 클래스 Ⅱ MHC 상호작용을 방해하는 아미노산 변화를 포함하는 변이체는 상기 변이체가 더욱 쉽게 내부화되고 진행될 수 있기 때문에 더 항원성이 있을 수 있다. 따라서, 삼중 변이체 N20D/C98S/D45N은 다른 변이체를 평가하는데 사용되는 방법을 사용하여 평가될 것이다. 비면역 대조 토끼 및 N20D/, N20D/C98S 또는 N20D/K157E 면역된 토끼로부터 얻은 혈청은 야생형 SPEA에 대하여 ELISA 타이터로 직접 시험하였다 (L. Hudson and F.C. Hay, Practical Immunology 2nd Ed. 1980, Blackwell Scientific Publications, Boston p237-239). 각각의 동물 유래의 혈청은 별도로 평가되었다. 수득된 항체 타이터를 평균하여 표 8에 나타내었다. 비면역 대조동물은 SPEA에 대하여 매우 낮은 타이터의 항체를 갖는 것으로 기대된다. 반면, 변이체에 대하여 면역된 모든 동물은 현저한 항체 타이터를 갖는다. 이중 변이체 N20D/K157E로 면역된 동물은 다른 두 개의 변이체와 비교할 때 최고 평균 타이터를 갖는다. 그러나, N20D 면역된 동물의 타이터 범위는 이중 변이체보다 훨씬 더 높다 (6마리 동물에 대하여 각각 20, 40, 160, 640). 상기 데이터는 이중 변이체가 더욱 일정한 면역성을 제공함을 제시한다.
표 8. N20D, N20D/C98S, N20D/K157E SPEA에 대해 면역된 동물 및 비면역 대조동물의 ELISA 항체 타이터
a 6마리 동물/그룹
b 탐지 가능한 최저 타이터는 10이었다. 타이터는 양성결과를 주는 최종 희석도의 역수이다.
최종 실험에서 동물 (3/그룹)은 5회 주사를 위해 변이체 단백질을 투여하고 동물을 하루간 휴식시킴으로써 N20D, N20D/C98S 또는 N20D/K157E (50㎍/정맥내 주사)에 대해 면역시켰다. 동물은 열을 유발하는 야생형 SPEA의 능력에 대해 면역성을 평가하였다 [체중 kg당 주사 4시간후 최소발열용량(MPD)의 20배 (20 MPD-4)]. SPEA는 0.15㎍/kg의 토끼에서 하나의 MPD-4로 알려진 가장 강력한 발열물중의 하나이다. 그 결과는 표 9에 도시되어 있다.
N20D SPEA로 면역된 동물 및 비면역동물은 현저한 열반응 (두 그룹의 경우 0.8℃) 및 엔도톡신에 증가된 민감성 (2/3은 두 그룹에서 48시간 살아있음)을 보여주었다. 반면 이중 변이체로 면역화된 동물은 열 및 증가현상으로부터 완전히 보호되었다.
종합적으로, 상기 데이터의 전부는 두 개의 이중 변이체가 단일 변이체보다 SPEA의 독성효과에 대해 동물을 더 잘 면역화시킬 수 있음을 제시한다. 변이체 자신은 어느 것도 동물에 독성을 나타내지 않았다. 이중 변이체 N20D/C98S는 N20D/K157E보다 더 좋은 면역원이었으나, 둘다 효과적이었다.
표 9: SPEA 및 엔도톡신에 의한 SPEA 발열성 및 치사 항원투여에 대하여 토끼를 면역화시키는 SPEA 변이체 N20D, N20D/C98S 및 N20D/K157E의 능력
본 발명은 특정한 실시예의 내용으로 설명되었음에도 불구하고, 특허의 보호 범위는 이들 특정한 실시예로 제한되는 것은 아니지만, 다음의 특허청구범위를 참조하여 판단된다.
기탁 미생물에 대한 표시(PCR 규칙 13bis)
A. 기탁 미생물에 관한 표시는 명세서 제35면 제 8행-11행에 기재되어 있음.
B. 기탁물에 대한 증명 추가 기탁물은 별지로 증명함■
1. 기탁 기관 명칭
미국 모식균 배양 수집소(ATCC)
2. 기탁 기관의 주소(국가명 및 우편번호 포함)
미국, 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301
3. 기탁 일자
1995 년 6 월 1일
4. 수탁 번호
ATCC 69830
C. 추가 표시(부적합한 경우 공란으로 둘 것) 이 정보는 별지에 계속됨 □
D. 표시가 적용되는 지정국(모든 지정국에 대해 표시가 필요하지 않은 경우)
E. 표시에 대한 별도의 언급(부적합한 경우 공란으로 둘 것)
본 표시는 차후에 국제사무국에 제출될 것임(본 표시의 일반적인 성질, 예를 들어, "기탁물의 수탁번호"를 기재할 것)
접수처용: □ 본 서류는 국제 출원과 동시에 접수됨. 서명 :
국제사무국용: □ 본 서류는 년 월 일에 국제 사무국에 접수됨. 서명 :
기탁 미생물에 대한 표시(PCR 규칙 13bis)
A. 기탁 미생물에 관한 표시는 명세서 제44면 제 9행-10행에 기재되어 있음.
B. 기탁물에 대한 증명 추가 기탁물은 별지로 증명함 ■
1. 기탁 기관 명칭
미국 모식균 배양 수집소(ATCC)
2. 기탁 기관의 주소(국가명 및 우편번호 포함)
미국, 메릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이브 12301
3. 기탁 일자
1995 년 6 월 1일
4. 수탁 번호
ATCC 69831
C. 추가 표시(부적합한 경우 공란으로 둘 것) 이 정보는 별지에 계속됨 □
D. 표시가 적용되는 지정국(모든 지정국에 대해 표시가 필요하지 않은 경우)
E. 표시에 대한 별도의 언급(부적합한 경우 공란으로 둘 것)
본 표시는 차후에 국제사무국에 제출될 것임(본 표시의 일반적인 성질, 예를 들어, "기탁물의 수탁번호"를 기재할 것)
접수처용: □ 본 서류는 국제 출원과 동시에 접수됨. 서명 :
국제사무국용: □ 본 서류는 년 월 일에 국제 사무국에 접수됨. 서명:
〈발명의 배경〉
β-헤모리틱 그룹 A 스트렙토코커스 (GAS)로 알려진 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)는 인두염 및 농가진 등의 약한 감염의 원인이 될 수 있는 인간 병원체이다. 감염후의 자가면역 합병증은 소위 류마티스열 및 급성사구체신염을 일으킬 수 있다. GAS는 또한 성홍열 및 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군(STSS) 등의 심한 급성질환의 원인이 될 수 있다. 심한 GAS 감염은 금세기 초에 미국 및 전세계에서 큰 문제가 되고 있다. 40대 중반에는 질환발생건수 및 그의 심각성이 아직 완전히 이해되지 않은 이유로 서서히 감소하였다. 그러나, 더욱 최근에 GAS의 원인으로 심한 질환의 재발이 나타났으며 미국에서는 매년 10-20,000건의 STSS가 발생되었다. 이들 환자중의 50 내지 60%는 괴사성 근막염 및 근염을 가지게 되며, 30 내지 60%는 사망하고 생존자중의 절반은 팔다리가 절단된다.
1986년 및 1987년에는 록키산 지역에서 심한 CAS 감염이 돌발하였다는 두개의 보고가 나왔다. 이들 보고서는 과거 몇 년간 관심의 대상이 되었으며 다른 사람들은 유사한 임상 증상으로 질병을 설명하였다. 이 질병에 대해 기술된 증상은 독성 쇼크 증후군(TSS)에 대해 기술된 증상과 매우 유사하였으며 또한 1992년에 과학자들의 모임은 이러한 임상 증상을 STSS란 공식명칭을 부여하여 진단 기준을 마련하였다. STSS는 하기와 같이 정의된다.
1. 저혈압 및 쇼크;
2. 그룹 A 스트렙토코커스의 분리;
3. 다음 증상들중의 2가지 이상: 38.5℃ 이상의 열병, 성홍열, 구토 및 설사, 간 및 신장 기능장애, 성인 호흡 곤란 증후군, 비만성 맥관내 응집, 괴사성 근막염 및/또는 근염, 균혈증.
STSS 환자로부터 분리된 스트렙토코커스는 주로 M타입 1 및 3이며, M18 및 타입이 없는 유기체는 대부분의 기억을 형성한다. STSS와 연관된 M1, 3, 18, 타입이 없는 균들은 대부분 발열 엔도톡신 A (SPE-A, 성홍열 독소A)를 만든다. 반면, 일반적인 스트렙토코커스 균은 단지 15%만이 이 독소를 생산한다. 더구나, 두건의 우연한 인간 접종 및 토끼 동물모델에 SPE-A를 투여하여 STSS의 증상을 일으킬 수 있다.
SPE-A는 25,787 달톤에 해당하는 분자량의 단일 펩타이드이며, 그의 코딩 서열은 용원(temperate) 박테리오파지 T12에서 운반된다. SPE-A에 대한 유전자인 speA는 대장균(Escherichia coli)에서 성공적으로 클로닝하여 발현된다. SPE-A는 엔도톡신에 대한 숙주민감성을 100,000배까지 증가시키고 열을 유발할 수 있는 능력에 기초하여 발열독소로 일컬어지는, 스트렙토코커스 및 스타필로코커스에 의해 생산되는 엑소톡신의 대부류 일원(member)이다.
최근에 이러한 독소는 T세포 수용체의 β체인의 가변부분의 조성에 의존하는 방식으로 또한 그의 항원특이성에 상관없이 T임파구의 거대한 증식을 유발할 수 있는 능력 때문에 초항원(superantigen)으로 불리우고 있다. 이들 독소는 또한 IFN-γ, IL-1, TNF-α 및 TNF-β의 분비를 크게 자극한다. 이러한 부류의 다른 인자에는 스트렙토코커스 발열 에소톡신 타입 B 및 C, 스타필로코커스 독성 쇼크 증후군 독소 1, 스타필로코커스 엔테록스톡신 A, B, Cn, D, ,E, G 및 H, 및 비-그룹 A 스트렙토코커스 발열 엑소톡신이 있다. 이들 독소는 유사한 생화학적 특성, 생물학적 활성 및 다양한 정도의 서열유사성을 갖는다.
STSS의 가장 심한 증상은 저혈압 및 쇼크이며, 이는 사망의 원인이 된다. 일반적으로 맥관내에서 세포간(interstitial) 공간으로 액체의 누출은 저혈압의 최종원인이 되며, 이는 상기 STSS의 토끼모델에서 유체 대체 요법이 쇼크를 예방하는데 성공적이라는 관찰에 의해 뒷받침된다. SPE-A는 이러한 병변을 유발하는 숙주에서 여러 가지 방법으로 작용할 수 있는 것으로 추정된다. SPE-A 분자의 중앙부에서의 어떤 단일 아미노산 치환은 SPE-A에 의한 HLA 클래스 Ⅱ 분자들에의 결합 및 유사분열활동에 영향을 미치는 것으로 나타났다(하트위그(Hartwig) 등, 국제 면역학 5:5, 869-875(1993)).
SPE-A는 간 쿠퍼(Kupper) 세포의 활성을 손상시킴으로써 내인성 균 유래 엔도톡신의 간 정화(liver clearance)를 봉쇄하는 것으로 나타났다. 이것은 리포폴리사카라이드 결합 단백질(LPB)에 결합 및 CD14 신호전달을 통하여 대식세포를 활성화시킨 다음 TNF-β 및 다른 사이토카인을 분비시키는 순환 엔도톡신의 현저하게 증가시키는 것으로 보인다. 질병에서 엔도톡신의 역할은 SPE-A의 치명적인 효과가 폴리마이신 B 의 동물 투여 또는 병원균(pathogen) 없는 토끼의 사용에 의해 적어도 부분적으로는 중화될수 있다는 발견에 의해 뒷받침된다.
쇼크 유발의 다른 양상은 모세관 내피세포에 대한 독소의 직접작용이 될 수 있다. 이러한 가설은 스타필로코커스 발열독소 TSST-1이 인간 제대 정맥세포에 직접 결합하고 분리된 돼지 대동맥 내피세포에 독성을 보인다는 발견으로부터 유래한다.
또 다른 독소 작용 양상은 그의 초항원성을 포함하며, 여기서 독소는 상호작용하여 숙주 T 임파구의 50%까지 활성화시킨다. 이 거대한 T 세포 자극은 TNF-α 및 IL-1의 분비를 유발하는 대식세포에 직접 영향을 주는 비정상적으로 높은 정도의 순환 사이토카인 TNF-β 및 IFN-γ를 생기게 한다. 이들 사이토카인은 또한 T세포의 부재하에 MHC 클래스Ⅱ 결합 및 신호전달을 통한 SPE-A에 의해 대식세포로부터 직접 유도될 수 있다. 높은 수준의 TNF-α 및 -β는 그람 음성 균 유발 쇼크에서 대표적으로 발견되는 여러 가지 효과의 원인이 되며, 이중에서 내피세포 및 모세혈관 누출에 유해하다. 그러나, IL-2 및 T 세포 증식의 지나친 규제를 봉쇄하는 사이클로스포린 A를 SPE-A 처리된 토끼에 투여하면 쇼클로부터 동물을 보호하지 않으며, 이것은 추가의 메카니즘이 모세혈관 누출에 더욱 중요한 원인이 될 수 있음을 암시한다.
따라서, 상이한 생물학적 활성에 관여하는 SPE-A 분자의 작용 부위를 국한시킬 필요가 있다. 또한 독성 및 유사분열성(mitogenicity)과 같은 생물학적 활성을 변화시키는 SPE-A의 변이체를 개발할 필요도 있다. 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군을 예방 또는 경감시키기 위해 백신에 유용한 조성물을 개발할 필요가 있다. 그 외에 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군 및 기타 질환의 치료에 유용한 치료제를 개발할 필요가 있다.
〈발명의 요약〉
본 발명은 변이체 SPE-A 독소 및 그의 절편(fragment), 백신 및 약학적 조성물, 및 백신 및 약학적 조성물을 사용하는 방법을 포함한다.
변이체 SPE-A 독소는 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며 또한 실질적으로 야생형(wild type) SPE-A 독소에 해당하는 단백질에 비해서 실질적으로 치사성이 없다. 백신 조성물의 경우 변이체 독소는 또한 야생형 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대한 보호 면역반응을 촉진시킨다. 백신 조성물용 변이체 독소는 야생형 SPE-A에 비하여 T 세포 유사분열성의 감소 및 엔도톡신 쇼크의 감소를 갖도록 경우에 따라 추가로 선택된다. 특히 바람직한 백신 조성물용 변이체는 야생형 SPE-A 독소의 아미노산 20과 동등한 아미노산에서 변화를 갖는 것이다. 약학적 조성물의 경우 변이체 독소는 실질적으로는 치사성이 없으면서 야생형 SPE-A 독소에 필적할 만한 T 세포 유사분열성을 유지시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 야생형 speA 독소의 절편 및 speA 독소의 변이체를 포함한다. 야생형 SPE-A 유래의 절편 및 펩타이드는 변이체 SPE-A 독소이다. 절편은 함께 결합된 분자의 상이한 도메인(domain) 또는 지역을 포함할 수 있다. 절편은 야생형 SPE-A 독소에 비하여 실질적으로 치사성이 없다. 변이체 독소의 경우 절편은 야생형 SPE-A 아미노산 서열에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖는다. 절편은 또한 백신 및 약학적 조성물에 유용하다.
본 발명은 또한 발현 카셋트, 벡터 및 변형 세포를 포함한다. 발현 카셋트는 숙주 세포에 작용성이 있는 프로모터에 사용가능하게 결합된 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. DNA 카셋트는 바람직하게는 벡터에 삽입된다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 벡터는 주형(template) DNA를 제공하여 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 DNA를 생성시키는데 유용하다. DNA 카셋트 및 벡터는 또한 백신 조성물에 유용하다. 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 코딩하는 핵산은 포유동물 세포에서의 발현을 위하여 직접 운반될 수 있다. 프로모터는 포유동물에서 기능을 하는 프로모터가 바람직하다. 세포에 직접 운반된 핵산은 개인에 있어서 변이체 SPE-A 독소의 발현을 위하여 제공되어서 보호 면역 반응이 야생형 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성으로 나타날 수 있도록 할 수 있다.
그외에 백신 조성물은 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 코딩하는 발현 카셋트를 포함하는 안정하게 형질전환된(transformed) 세포 또는 바이러스성 벡터를 포함한다. 백시니아(vaccinia)와 같은 바이러스 벡터는 야생형 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성을 생성시켜 인간을 면역화시키는데 사용될 수 있다. 형질 전환된 세포는 S. 아우레우스(aureus), 대장균(E. coli) 또는 살모넬라 종 아종(Salmonella species spp.)과 같은 미생물인 것이 바람직하다. 형질전환된 미생물은 그의 표면상에 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편을 포함하거나 변이독소를 분비할 수 있다. 형질전환 미생물은 살아있는, 약독화된, 또는 가열 멸균된 백신으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 백신 및 약학적 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. 백신은 야생형 SPE-A 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대한 보호면역반응을 생성시키는데 유효한 양으로 동물에게 투여된다. 바람직하게는, 백신 조성물은 인간에게 투여되며 STSS의 발전을 저해한다. 약학적 조성물은 T 세포 증식을 촉진시키는 방법에 사용된다. 약학적 조성물은 인터루킨, 인터페론 또는 기타 면역조절제로 처리된 암, 즉 T 세포 임파종, 난소 및 자궁암을 치료하는데 특히 유용하다.
변이체 SPE-A 독소 및/또는 그의 절편 및 다른 백신 조성물은 수동적(passive) 면역 혈청을 생성시키는데 유용할 수 있다. 변이체 SPE-A 독소 또는 그의 절편, DNA 발현 카셋트 또는 벡터, 또는 형질전환 미생물은 야생형 SPE-A의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대한 중화항체(nutralizing antibody)를 생성시켜 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있다. 중화 항체는 변이체 SPE-A 독소 및/또는 그의 절편 및 야생형 SPE-A 독소와 면역반응한다. 수동적 면역 혈청은 스트렙토코커스 감염 및 STSS의 증후군을 가진 동물에게 투여할 수 있다.
Claims (11)
- 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열의 20번째 잔기인 아스파리긴이 아스파르트산으로 치환, 157번째 잔기인 라이신이 글루탐산으로 치환, 98번째 잔기인 시스테인이 세린으로 치환, 및 87번째 잔기인 시스테인이 세린으로 치환 중 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 변이체 SPE-A 독소.
- 제 1항에 있어서, 45번째 잔기인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체 SPE-A독소.
- 제 1항에 있어서, 상기 변이체 SPE-A 독소는 20번째 잔기인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환되고 157번째 잔기인 라이신이 글루탐산으로 치환된 이중 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체 SPE-A 독소.
- 제 1항에 있어서, 상기 변이체 SPE-A 독소는 20번째 잔기인 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환되고 98번째 잔기인 시스테인이 세린으로 치환된 이중 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체 SPE-A 독소.
- 제 2항에 있어서, 상기 변이체 SPE-A 독소는 20번째 잔기인 아스파리긴이 아스파르트산으로 치환, 98번째 잔기인 시스테인이 세린으로 치환 및 45번째 잔기인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 삼중 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체 SPE-A 독소.
- 제 1항에 있어서, 상기 변이체는 T-세포 유사분열성을 감소시킴, 야생형 SPE-A 독소보다 엔도톡신 쇼크를 증가시키지 않음 및 치사성이 없고 T-세포 유사분열성을 유지함으로 구성된 군으로부터 선택되는 특징들 중 적어도 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변이체 SPE-A 독소.
- 제 1항에 따른 변이체 SPE-A 독소를 포함하는 백신.
- 제 1항에 따른 변이체 SPE-A 독소를 포함하는 약학적 조성물.
- 제 1항에 따른 변이체 SPE-A 독소를 코딩하는 유전자.
- 제 9항에 따른 유전자를 포함하는 형질전환 숙주세포.
- 제 7항에 따른 백신을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 야생형 SPE-A의 적어도 하나의 활성에 대하여 인간을 제외한 동물을 보호하는 방법.
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