CN117969822A - Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用 - Google Patents

Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117969822A
CN117969822A CN202311850778.7A CN202311850778A CN117969822A CN 117969822 A CN117969822 A CN 117969822A CN 202311850778 A CN202311850778 A CN 202311850778A CN 117969822 A CN117969822 A CN 117969822A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
buffer
detection
labeled antibody
fluorescent microsphere
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311850778.7A
Other languages
English (en)
Inventor
林潮喜
陈棠明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Ruimeng Innovation Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Ruimeng Innovation Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Ruimeng Innovation Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Ruimeng Innovation Biotechnology Co ltd
Priority to CN202311850778.7A priority Critical patent/CN117969822A/zh
Publication of CN117969822A publication Critical patent/CN117969822A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本申请涉及医学检验领域Galectin‑3、NT‑ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用。试剂盒中检测试纸条包括底板以及免疫层析功能区；沿层析方向，免疫层析功能区包括缓冲区、标记区和检测区，或缓冲‑标记复合区和检测区，检测区设有检测线和质控线；标记区和缓冲‑标记复合区包被有标记抗体‑荧光微球复合物，检测线包被有包被抗体，质控线包被有质控蛋白；标记抗体‑荧光微球复合物中的标记抗体特异性结合待测样品中目标抗原形成目标抗原‑标记抗体‑荧光微球复合物，包被抗体特异性结合目标抗原‑标记抗体‑荧光微球复合物形成包被抗体‑目标抗原‑标记抗体‑荧光微球复合物，质控蛋白特异性结合标记抗体‑荧光微球复合物。

Description

Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用
技术领域
本申请涉及医学检验领域，特别涉及一种Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用。
背景技术
Galectin-3(Galectin-3，半乳糖凝集素一3)是脊椎动物中唯一的嵌合体型半乳糖凝集素，既有凝集区域又有非凝集素区域。在人类基因组中，Galectin-3由六个外显子和五个内含子组成，位于第14号染色体上，基因座为q21-q22，由单个基因LGALS3编码。其分子量为32～35kD，由251个氨基酸残基组成，由一个高度保守的碳水化合物可识别CRD(Carbohydrate Recognition Domain)和一个由短的氨基酸片段串联重复组成的不典型N端结构域组成。该CRD保留了凝集素活性，由130个氨基酸残基组成，可以通过胰蛋白酶进行蛋白水解。不典型N端结构域包含大约120个氨基酸，由9个氨基酸残基的串联重复序列组成，富含脯氨酸、酪氨酸和甘氨酸，这对于Galectin-3的生物学活性至关重要，不典型N末端结构域可被蛋白酶(例如胶原酶和基质金属蛋白酶)切割。
Galectin-3作为新型心肌细胞纤维化/重塑生物标志物，与sST2类似，Galectin-3在2017年ACCF/AHA心力衰竭治疗指南中定为IIb类被推荐临床应用；欧洲指南中则不推荐。其在皮肤、呼吸道、消化道、造血组织、生殖道和尿道等各系统中均有少量表达。作为一种多功能蛋白，Galectin-3主要存在于细胞质，也可以转移到细胞核和线粒体中，或分泌到细胞膜表面和细胞外基质中。其CRD与一系列细胞外基质蛋白、糖类、非糖基化分子及胞外受体(胶原Ⅳ)等结合而发挥其生物学效应，包括细胞生长分化、细胞凋亡、细胞粘附、血管生成、炎症反应、纤维化生成和肿瘤进展。
Galectin-3在不同细胞类型和组织中有不同的表达，在造血组织中，单核细胞表达Galectin-3，而在巨噬细胞中表达量更高。Galectin-3在不同组织中的表达是有差异的，且其表达是可诱导的。健康心脏组织中的Galectin-3表达量非常低，在心脏损伤期间其表达量会被迅速诱导升高。Galectin-3的上调在组织修复的初始阶段起着至关重要的作用。持续的Galectin-3过度高表达会导致心脏纤维化损伤，继而导致其他组织中Galectin-3的表达也增加，这与器官纤维化显著相关。最近研究发现，心力衰竭中的几个过程如纤维发生、组织修复、成纤维细胞增殖、炎症和心室重构等都与Galectin-3相关。
有研究指出，心衰患者的血清Galectin-3水平显著上升，并且Galectin-3水平的升高与心血管死亡、心衰再入院的风险增加正相关。Lok等人对240例NYHA功能Ⅲ级和Ⅳ级的心力衰竭患者进行了随访，随访时间为8年以上，并测量了患者的超声心动图、NT-proBNP和Galectin-3。结果表明，与稳定和升高的左室舒张末期容积患者相比，左室舒张末期容积随时间降低的患者的Galectin-3值显著降低。然而，在所有这些分组中，没有发现NT-proBNP水平的显著差异。此外，Galectin-3是在长期随访结果中预测死亡率的重要指标。因此，Galectin-3与通过连续超声心动图确定的左心室重塑有关，并可预测严重慢性心力衰竭患者的长期死亡率。其它来自3个研究团队的Galectin-3研究(评估心力衰竭的咨询和咨询结果的协调研究(COACH),调查急诊室呼吸困难的NT-proBNP的预后(PRIDE)和马里兰大学关于NT-proBNP对呼吸困难患者的诊断和预后(UMDH-23258))汇总分析也表明Galectin-3是心力衰竭预后的独立预测因子。Galectin-3浓度超过17.8ng/mL的患者在出院后的1-4个月有再次入院治疗的倾向。即使在调整患者特征、肾和心脏功能以及BNP水平后，Galectin-3仍可作为心力衰竭再次住院的独立预测因子。Galectin-3和sST2虽均可为心力衰竭患者提供有价值的信息，但Galectin-3在左心室重塑功能评价方面更为优越。
ST2(Growth stimulation expressed gene 2，生长刺激表达基因2)，别称1型白细胞介素-1受体(IL1RL-1)，于1989年首次被Tominaga等人在小鼠成纤维细胞中发现。到2002年，Weinberg等人报道发现ST2可以通过心肌细胞表现出对心肌的应激反应，这引起研究人员对探究ST2在心血管系统中的作用的强烈兴趣。人的ST2基因位于2号染色体，约40kbo ST2基因由基因启动子剪接后，编码出4种互为异构体的亚型，分别为sST2、ST2L、ST2V和ST2LV，其中ST2V和ST2LV是ST2L的两个剪接体。可溶性形式的sST2和膜结合受体形式的ST2L与心血管疾病相关。ST2L含有跨膜片段和一个Toll/IL-1受体胞内结构域，而sST2缺失跨膜片段及胞内结构域。sST2受到生物机械应力诱导生成，主要来源于心脏成纤维细胞以及心肌细胞，部分来源于主动脉及冠脉等大血管及心脏微血管中的内皮细胞。
sST2作为新型心肌细胞纤维化重塑生物标志物，主要参与了心血管疾病的病理和生理过程，能够反映心肌纤维化和心室重塑。sST2对急性冠状动脉综合征、急性心力衰竭和慢性心力衰竭患者具有诊断和预后价值，并己被纳入2017美国心脏协会和美国心脏病学会(ACC/AHA)心衰管理指南；对急性和慢性心衰患者进行危险分层，在欧洲心力衰竭指南的建议中仍然保留。到目前为止，sST2的水平似乎不受年龄、性别、体重指数、心力衰竭的病因、心房颤动和贫血的影响。特别的是，与目前其它的心脏生物标志物不同，sST2几乎不受肾脏功能的影响。因此，在肾功能不全患者中，sST2的预后风险评价能力更好。另外，与其他生物标志物相比，sST2的个体内变异程度最低，相对变化值最小，因此适合对心力衰竭患者进行长期监测。但是血清sST2水平升高也出现在其他疾病中，包括胃癌、乳腺癌、肾病和肝病患者中。因此，血清sST2水平可能受到心衰患者其他器官病变的影响，故而sST2作为HF诊断和风险评估标志物缺乏疾病特异性。也有研究者认为血清sST2水平升高能够反映患者心衰病情的严重程度、心肌牵张、炎症以及预后不良，所以在急性和慢性心衰中，sST2有潜在研究应用价值。
脑钠肽(braln natriuretic peptide，BNP)和N末端脑钠肤前体(N-terminalpro-brain natriuretic peptide NT-proBNP)属于心肌细胞牵张标志物，为ACC/AHA(美国心脏病学刽美国心脏协会)、ESC(欧洲心脏病学会)、HFSA(美国心力衰竭协会)指南所推荐，是研究最深入和最广泛的应用于心衰的生物标志物。BNP是能抑制近曲小管重吸收钠的肤类激素，由2135个氨基酸残基组成，通过抑制醛固酮和ADH的释放，从而发挥促进钠、水排出的功能。BNP最开始是由日本学者于1988年从猪脑分离出来而被发现。在血流动力学应激反应下，BNP的134个氨基酸的前体蛋白在心室心肌细胞内合成，随后裂解为108个氨基酸组成的proBNP最后被切割成一个32个氨基酸的具有生物活性的C末端BNP、一个76个氨基酸的无活性的BNP前体(pro BNP)和一个具有26个氨基酸的信号肤。ProBNP和BNP都是通过容积和压力超负荷响应舒张末期壁应力而直接从左心室心肌分泌的。BNP是一种血管活性激素，对肾素一血管紧张醛固酮系统和肾上腺素系统活性具有一定抑制作用，参与机体内环境稳态、血管舒张和心血管重塑。利钠肤与已经存在心室功能障碍的普通人群发生心力衰竭的风险密切相关。NT-proBNP在临床病情风险预测方面优于BNP，这可能与它在体内和体外的半衰期更长因素相关。NT-proBNP除了有助于急性和慢性心力衰竭的诊断外，无论在一般人群，还是在急性心肌梗死患者，或者是在稳定的冠心病患者中，其浓度与心血管疾病和死亡风险密切相关。虽然BNP和NT-proBNP是对心力衰竭有明确诊断和评估价值的生物标志物，但利钠肤在心力衰竭诊断中受年龄、瓣膜性心脏病、肾功能、体重指数等因素影响，所以临床上迫切需要更多生物标志物来对心力衰竭作出更准确的预后评估，为心衰患者日常治疗和疾病管理提供有效的指导。
血清sST2、Galectin-3水平可以反映心力衰竭的严重程度，作为新型生物标志物对CHF有良好的诊断及风险评估的应用价值，二者与传统标志物NT-proBNP联合能提高评估的准确性。
目前的联合检测试纸条有两种形式：一种是把单检试纸条组装到一个联检卡盒中，试纸条本质上还是单项检测的形式。另一种是把多项检测集成到一个试纸条上，即在NC膜上划多条检测线和一条质控线。与第二种相比第一种集成度更高，操作更简便，同时生产成本更低，是更经济快捷的一种联检方式。虽然该种联合检测方式有诸多经济便捷等的好处，但是也存在项目存在精密度、线性范围等关键性能指标不如单项检测的好的缺点。例如专利CN209803152U记载的一种心衰患者三联检测卡。
发明内容
基于此，本申请中的一个或者多个实施例提供了一种检测试纸条，其独特的设计有助于在ST2、Galectin-3和NT-proBNP联合检测中拓宽各项目的检测范围，提高检测精密度。
在本申请的第一方面，提供一种检测试纸条，所述检测试纸条包括底板以及设于所述底板上的免疫层析功能区；
沿层析方向，所述免疫层析功能区包括缓冲区、标记区和检测区，或者缓冲-标记复合区和检测区，所述检测区设有检测线和质控线；
所述的标记区和缓冲-标记复合区包被有标记抗体-荧光微球复合物，所述检测线包被有包被抗体，所述质控线包被有质控蛋白；
所述标记抗体-荧光微球复合物中的标记抗体特异性结合待测样品中的目标抗原形成目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物，所述包被抗体特异性结合所述目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物形成包被抗体-目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物，所述质控蛋白特异性结合所述标记抗体-荧光微球复合物。
在本申请的一些实施方式中，所述的标记区和缓冲-标记复合区包被Galectin-3标记抗体-荧光微球复合物、ST2标记抗体-荧光微球复合物和NT-ProBNP标记抗体-荧光微球复合物中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中，所述标记抗体-荧光微球复合物中荧光微球选自绿色量子点荧光微球、红色量子点荧光微球、时间分辨荧光微球、荧光素微球、AIE荧光微球和近红外Ⅱ区荧光微球中的一种。
在本申请的一些实施方式中，所述质控蛋白包括(1)至(4)中的一种：
(1)所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体特异性结合的抗原；
(2)所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体特异性结合的二抗；
(3)能与所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体的修饰基团特异性结合的蛋白；
(4)能偶联在所述标记抗体-荧光微球复合物的荧光微球上的蛋白。
在本申请的一些实施方式中，所述的标记区和缓冲-标记复合区包被多种标记抗体-荧光微球复合物以特异性结合待测样品中的多种目标抗原，所述检测区对应设有多条检测线和多条质控线。
在本申请的一些实施方式中，多种标记抗体-荧光微球复合物具有不同发射光波长的荧光微球。
在本申请的一些实施方式中，所述免疫层析功能区包括标记垫、层析垫和吸收垫，所述缓冲-标记复合区设于所述标记垫，所述检测区设于层析垫。
在本申请的一些实施方式中，所述免疫层析功能区满足如下条件中的一个或者多个：
(a)所述标记垫的材质包括玻璃纤维或/和聚酯；
(b)所述层析垫的材质包括硝酸纤维素；
(c)所述吸收垫的材质包括植物纤维或/棉绒；以及，
(d)所述底板的材质包括PVC。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲-标记复合区经工作液1处理，所述工作液1包括标记抗体-荧光微球复合物以及稀释液；所述稀释液1包括糖、封闭剂、稳定剂、表面活性剂、抗红细胞抗体、阻断剂以及缓冲液；
可选地，所述稀释液1满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述糖包括海藻糖；
2)所述封闭剂包括BSA；
3)所述稳定剂包括PVP；
4)所述表面活性剂包括Tween20；以及，
5)所述缓冲剂包括Tris缓冲液；
可选地，所述稀释液1包括3wt％-7wt％海藻糖、0.5％-1.5％(w/v)BSA、0.5％-1.5％(w/v)PVP、0.5％-1.5％(w/v)Tween20、0.3mg/mL-0.7mg/mL抗红细胞抗体、0.5mg/mL-1.5mg/mL阻断剂以及0.03M-0.08M的Tris缓冲液；
可选地，所述标记抗体-荧光微球复合物在所述工作液1中的浓度为1.5％-2.5％(w/v)。
在本申请的一些实施方式中，所述免疫层析功能区包括样品垫、层析垫和吸收垫；
所述缓冲区设于所述样品垫，所述标记区和所述检测区设于所述层析垫。
在本申请的一些实施方式中，所述免疫层析功能区满足如下条件中的一个或者多个：
a)所述样品垫的材质包括玻璃纤维、聚酯或/和聚丙烯；
b)所述层析垫的材质包括硝酸纤维素；
c)所述吸收垫的材质包括植物纤维或/棉绒；以及，
d)所述底板的材质包括PVC。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲区经工作液2处理，所述工作液2包括糖、封闭剂、稳定剂、表面活性剂、抗红细胞抗体、阻断剂以及缓冲液；
可选地，所述工作液2满足如下条件中的一个或者多个：
A)所述糖包括海藻糖；
B)所述封闭剂包括BSA；
C)所述稳定剂包括PVP；
D)所述表面活性剂包括Tween20；以及，
E)所述缓冲剂包括Tris缓冲液；可选地，所述Tris缓冲液包括0.03M-0.08M的Tris缓冲液；
可选地，所述工作液2包括3wt％-7wt％海藻糖、0.5％-1.5％(w/v)BSA、0.5％-1.5％(w/v)PVP、0.5％-1.5％(w/v)Tween20、0.3mg/mL-0.7mg/mL抗红细胞抗体、0.5mg/mL-1.5mg/mL阻断剂以及0.03M-0.08M的Tris缓冲液。
在本申请的一些实施方式中，所述标记区经工作液3处理，所述工作液3包括标记抗体-荧光微球复合物以及稀释液；所述稀释液包括糖以及缓冲液；
可选地，所述糖包括海藻糖；
可选地，所述缓冲液包括Tris缓冲液；可选地，所述Tris缓冲液包括0.008M-0.012M的Tris缓冲液；
可选地，所述稀释液包括3wt％-7wt％海藻糖以及0.008M-0.012M的Tris缓冲液；
可选地，所述标记抗体-荧光微球复合物在所述工作液3中的浓度为0.08％-0.12％(w/v)。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲区和所述标记区之间设有干扰物分离区，所述干扰物分离区包被嗜异性抗体特异性结合蛋白；
可选地，所述干扰物分离区的数量为多个；
可选地，所述干扰物分离区设于所述层析垫；
可选地，所述嗜异性抗体特异性结合蛋白包括抗IgG抗体或/和抗IgM抗体；
可选地，所述干扰物分离区经工作液4处理，所述工作液4包括嗜异性抗体特异性结合蛋白以及前述中定义的稀释液；
可选地，所述嗜异性抗体特异性结合蛋白在所述工作液4中的浓度为1.5mg/mL-2.5mg/mL。
在本申请的一些实施方式中，所述检测线经工作液5处理，所述工作液5包括所述包被抗体以及前述中定义的稀释液；可选地，所述工作液5中所述包被抗体的浓度为0.5mg/mL-1.5mg/mL。
在本申请的一些实施方式中，所述质控线经工作液6处理，所述工作液6包括所述质控蛋白以及权利要求13中定义的稀释液；可选地，所述质控蛋白在所述工作液6中的浓度为0.3mg/mL-1mg/mL。
本申请的第二方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括试纸卡，所述试纸卡包括壳体以及安装在所述壳体中的第一方面中所述的检测试纸条；
所述壳体上设有加样孔和检测窗口；
所述加样孔和所述检测试纸条的缓冲区和缓冲-标记复合区对应，用于滴加待测样品；
所述检测窗口和所述检测区对应，用于观察所述检测区的检测结果。
在本申请的第三方面，提供所述的检测试纸条的制备方法，所述制备方法包括将所述的免疫层析功能区和底板组装成检测试纸条的步骤。
在本申请的第四方面，提供一种样品中目标抗原的检测方法，所述检测方法包括采用第一方面中所述的检测试纸条或者第二方面中所述的检测试剂盒检测待测样品中的目标抗原的步骤。
在本申请的一些实施方式中，所述待测样品包括血样；可选地，所述血样包括全血。
本申请的一个或多个实施例细节在下面的描述中提出，本申请的其他特征、目的和优点将从说明书及其权利要求书变得明显。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为光路设计示意图；
图2为实施例1的检测结果；
图3为实施例1的检测结果；
图4为实施例1的检测试纸条结构示意图；
图5为实施例1、2、3中的试纸卡结构示意图、图片；
图6为实施例1的试纸卡的检测结果和检测试纸条的检测结果；
图7为实施例1检测试纸条的Galectin-3线性范围测试(独立C线和非独立C线)；
图8为实施例1检测试纸条的ST2线性范围测试(独立C线和非独立C线)；
图9为实施例1检测试纸条的NT-ProBNP线性范围测试(独立C线和非独立C线)；
图10为实施例2的检测试纸条结构示意图；
图11为实施例2的检测试纸条的Galectin-3线性范围测试(独立C线和非独立C线)；
图12为实施例2的检测试纸条的NT-ProBNP线性范围测试(独立C线和非独立C线)；
图13为实施例3的检测试纸条结构示意图；
图14为实施例3的检测试纸条的Galectin-3线性范围测试(独立C线和非独立C线)；
图15为实施例3的检测试纸条的临床测试。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请实施例的第一方面
本申请实施例提供一种检测试纸条，所述检测试纸条包括底板以及设于所述底板上的免疫层析功能区；
沿层析方向，所述免疫层析功能区包括缓冲区、标记区和检测区，或者缓冲-标记复合区和检测区，所述检测区设有检测线和质控线；
所述的标记区和缓冲-标记复合区包被有标记抗体-荧光微球复合物，所述检测线包被有包被抗体，所述质控线包被有质控蛋白；
所述标记抗体-荧光微球复合物中的标记抗体特异性结合待测样品中的目标抗原形成目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物，所述包被抗体特异性结合所述目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物形成包被抗体-目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物，所述质控蛋白特异性结合所述标记抗体-荧光微球复合物。
本申请实施例提供的检测试纸条具有如下有益效果：1、非独立C线加上检测线与质控线比值的计算方式，拓宽了检测线性，提高了检测精密度。2、不同的项目使用的不同激发光和不同接收光的荧光微球或者量子点微球，配合可发射和接收不同特定波长的仪器检测，解决了因联检带来的多条质控线和多条检测线之间的信号交叉问题。3、多个项目联合检测，一次加样测试，检测多个项目结果。4、能测试全血，实现无需样品前处理即可测试，真正做到方便快捷。
本申请实施例提供的检测试纸条，其设计有非独立C线：非独立质控线的核心是检测线和质控线是相互竞争的关系，原理是检测线和质控线能桥接和直接捕获标记物。在标记复合物含量相对固定的情况下，当检测线捕获的标记复合物越多，质控线捕获的标记复合物就越少；反之，当检测线捕获的标记复合物越少，质控线捕获的标记复合物就越多，从而使检测线和质控线形成了“T强C弱”、“T弱C强”的关系。通过T/C的算法，使检测范围内的浓度值对应的T/C映射区间，相较于传统的独立C线(即检测线和质控线不存在竞争关系，检测线捕获含目标抗原的复合物，质控线捕获质控蛋白)大大增加。即相同检测浓度值的范围，对应的T/C值的梯度范围相交于传统的独立C线大大提高。相较于独立C线的方式，T/C换算成浓度值时是呈现收敛的状态。因此能提高T/C换算成浓度值后的精密度。而C线随着检测浓度的升高而变低，则可以拓宽检测范围。如图3所示，T值越高，C值越低。
非独立C线的实现方式主要包含4大类。第一种为C线包被可被标记抗体特异性结合的抗原；第二种为C线包被可特异性捕获标记抗体的二抗，如羊抗鼠等；第三种为标记抗体生物素化，C线包被亲和素；第四种为独立C线配对的一方与标记抗体连接在同一个微球上，C线包被另一方。独立C线包括但不限于抗兔IgG/兔IgG、抗鸡IgY/鸡IgY、抗DNP/DNP-BSA、生物素-BSA/亲和素等。
在其中一个示例中，所述的标记区和缓冲-标记复合区包被Galectin-3标记抗体-荧光微球复合物、ST2标记抗体-荧光微球复合物和NT-ProBNP标记抗体-荧光微球复合物中的一种或者多种。
本申请对所述标记抗体-荧光微球复合物中荧光微球不做特别限定，包括但不限于：绿色量子点荧光微球、红色量子点荧光微球、时间分辨荧光微球、荧光素微球、AIE荧光微球和近红外Ⅱ区荧光微球。
基于本申请实施例检测试纸条的设计，当其为多种抗原的联检试纸条的情况下，特异性捕获多种抗原的多种标记抗体-荧光微球复合物彼此采用不同的发射光波长微球，能有效消除不同项目之间的交叉干扰。仪器在读取相应项目的荧光信号时，按照设置的波长进行激发和接收。不同项目接收波长不一样，以此实现不同项目之间不会形成交叉干扰。如图1和图2所示。
本申请实施例的荧光微球，可以选自但不限于表中罗列种类。
表1
类型 激发 发射 适用微球
荧光类型1 365nm 525nm 绿色量子点
荧光类型2 365nm 615nm 红色量子点、时间分辨微球
荧光类型3 470nm 525nm 常规荧光素微球
荧光类型4 365nm 415nm AIE荧光微球
红外类型5 855nm 988nm 近红外Ⅱ区微球
在其中一个示例中，所述质控蛋白包括(1)至(4)中的一种：
(1)所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体特异性结合的抗原；
(2)所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体特异性结合的二抗；
(3)能与所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体的修饰基团特异性结合的蛋白；
(4)能偶联在所述标记抗体-荧光微球复合物的荧光微球上的蛋白。
在其中一个示例中，所述的标记区和缓冲-标记复合区包被多种标记抗体-荧光微球复合物以特异性结合待测样品中的多种目标抗原，所述检测区对应设有多条检测线和多条质控线。
在其中一个示例中，多种标记抗体-荧光微球复合物具有不同发射光波长的荧光微球。
在其中一个示例中，所述免疫层析功能区包括标记垫、层析垫和吸收垫，所述缓冲-标记复合区设于所述标记垫，所述检测区设于层析垫。
在其中一个示例中，所述免疫层析功能区满足如下条件中的一个或者多个：
(a)所述标记垫的材质包括玻璃纤维或/和聚酯；
(b)所述层析垫的材质包括硝酸纤维素；
(c)所述吸收垫的材质包括植物纤维或/棉绒；以及，
(d)所述底板的材质包括PVC。
在其中一个示例中，所述缓冲-标记复合区经工作液1处理，所述工作液1包括标记抗体-荧光微球复合物以及稀释液；所述稀释液1包括糖、封闭剂、稳定剂、表面活性剂、抗红细胞抗体、阻断剂以及缓冲液；
可选地，所述稀释液1满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述糖包括海藻糖；
2)所述封闭剂包括BSA；
3)所述稳定剂包括PVP；
4)所述表面活性剂包括Tween20；以及，
5)所述缓冲剂包括Tris缓冲液；
可选地，所述稀释液1包括3wt％-7wt％海藻糖、0.5％-1.5％(w/v)BSA、0.5％-1.5％(w/v)PVP、0.5％-1.5％(w/v)Tween20、0.3mg/mL-0.7mg/mL抗红细胞抗体、0.5mg/mL-1.5mg/mL阻断剂以及0.03M-0.08M的Tris缓冲液；
可选地，所述标记抗体-荧光微球复合物在所述工作液1中的浓度为1.5％-2.5％(w/v)。
在其中一个示例中，所述免疫层析功能区包括样品垫、层析垫和吸收垫；
所述缓冲区设于所述样品垫，所述标记区和所述检测区设于所述层析垫。
在其中一个示例中，所述免疫层析功能区满足如下条件中的一个或者多个：
a)所述样品垫的材质包括玻璃纤维、聚酯或/和聚丙烯；
b)所述层析垫的材质包括硝酸纤维素；
c)所述吸收垫的材质包括植物纤维或/棉绒；以及，
d)所述底板的材质包括PVC。
在其中一个示例中，所述缓冲区经工作液2处理，所述工作液2包括糖、封闭剂、稳定剂、表面活性剂、抗红细胞抗体、阻断剂以及缓冲液；
可选地，所述工作液2满足如下条件中的一个或者多个：
A)所述糖包括海藻糖；
B)所述封闭剂包括BSA；
C)所述稳定剂包括PVP；
D)所述表面活性剂包括Tween20；以及，
E)所述缓冲剂包括Tris缓冲液；可选地，所述Tris缓冲液包括0.03M-0.08M的Tris缓冲液；
可选地，所述工作液2包括3wt％-7wt％海藻糖、0.5％-1.5％(w/v)BSA、0.5％-1.5％(w/v)PVP、0.5％-1.5％(w/v)Tween20、0.3mg/mL-0.7mg/mL抗红细胞抗体、0.5mg/mL-1.5mg/mL阻断剂以及0.03M-0.08M的Tris缓冲液。
在其中一个示例中，所述标记区经工作液3处理，所述工作液3包括标记抗体-荧光微球复合物以及稀释液；所述稀释液包括糖以及缓冲液；
可选地，所述糖包括海藻糖；
可选地，所述缓冲液包括Tris缓冲液；可选地，所述Tris缓冲液包括0.008M-0.012M的Tris缓冲液；
可选地，所述稀释液包括3wt％-7wt％海藻糖以及0.008M-0.012M的Tris缓冲液；
可选地，所述标记抗体-荧光微球复合物在所述工作液3中的浓度为0.08％-0.12％(w/v)。
在本申请的一些实施方式中，所述缓冲区和所述标记区之间设有干扰物分离区，所述干扰物分离区包被嗜异性抗体特异性结合蛋白；
可选地，所述干扰物分离区的数量为多个；
可选地，所述干扰物分离区设于所述层析垫；
可选地，所述嗜异性抗体特异性结合蛋白包括抗IgG抗体或/和抗IgM抗体；
可选地，所述干扰物分离区经工作液4处理，所述工作液4包括嗜异性抗体特异性结合蛋白以及前述中定义的稀释液；
可选地，所述嗜异性抗体特异性结合蛋白在所述工作液4中的浓度为1.5mg/mL-2.5mg/mL。
干扰物分离工艺：基于免疫层析试纸条干扰物质的分离，试纸条至少包含样品垫、NC膜、吸收垫、PVC板等组件。其中样品垫会处理上糖、蛋白、表面活性剂、缓冲体系、大分子等，以使样品垫塑型、亲水、保持一定的pH等。NC膜上包被有干扰物分离线、标记抗体线、检测抗体线、质控线，干扰物分离线用于分离样品中的干扰物质，使检测结果不受干扰物质的影响；标记抗体线用于标记样品中的待检测物，以使检测结果可被观测；检测线用于捕获待测物，以使待测物富集于检测线上，从而被检测。质控线用于对检测的质量控制，以确保检测结果有效。吸收垫用于给试纸条提供定向层析力，使层析在一定的时间内朝一个方向进行。PVC板起支撑作用，把各个组分黏在一起，形成一个完整的试纸条。其原理为，当样品加入到样品垫中，样品在毛细作用下向NC膜流动，样品首先跟干扰物分析线接触，干扰物与干扰物分离线结合，实现干扰物分离；不含干扰物的样品在NC膜上继续层析，与标记抗体线接触，待测物与标记抗体结合形成标记抗体-待测物复合物；含标记抗体-待测物复合物的样品继续层析至检测抗体线，标记抗体-待测物复合物与检测抗体线上的抗体结合富集于检测线上，未结合的标记抗体与质控线上的特异性配体结合富集于检测线上。
该方法在不增加检测操作步骤的情况下，实现了检测过程中分离干扰物质，使中的干扰物质无法参与检测反应的过程中，故而能从根本上隔离干扰物对整个测试的影响。该工艺同时取消了传统工艺的标记垫，把标记抗体喷于NC膜上，优化标记抗体稀释液配方，使标记抗体在NC膜上的释放更彻底，速度更快，从而反应达到平衡的时间更短，从而使常规试剂15min才能达到充分反应，缩短到3min以内便可打到充分反应，加样3分钟便可出稳定的结果。同时由于标记抗体位于NC膜上，相比于传统的标记物先在标记垫释放后，再到NC膜，标记垫的释放差异会影响标记抗体在NC膜上的均一性，从而影响精密度。所以标记抗体喷涂于在NC膜上的均一度更高，能提高试剂的精密度。
在其中一个示例中，所述检测线经工作液5处理，所述工作液5包括所述包被抗体以及如上定义的稀释液；可选地，所述工作液5中所述包被抗体的浓度为0.5mg/mL-1.5mg/mL。
在其中一个示例中，所述质控线经工作液6处理，所述工作液6包括所述质控蛋白以及前述中定义的稀释液；可选地，所述质控蛋白在所述工作液6中的浓度为0.3mg/mL-1mg/mL。
本申请的第二方面
本申请提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括试纸卡，所述试纸卡包括壳体以及安装在所述壳体中的第一方面中所述的检测试纸条；
所述壳体上设有加样孔和检测窗口；
所述加样孔和所述检测试纸条的缓冲区和缓冲-标记复合区对应，用于滴加待测样品；
所述检测窗口和所述检测区对应，用于观察所述检测区的检测结果。
本申请的第三方面
本申请提供所述的检测试纸条的制备方法，所述制备方法包括将所述的免疫层析功能区和底板组装成检测试纸条的步骤。
本申请的第四方面
本申请提供一种样品中目标抗原的检测方法，所述检测方法包括采用第一方面中所述的检测试纸条或者第二方面中所述的检测试剂盒检测待测样品中的目标抗原的步骤。
本申请对待测样品的种类不做特别限定，可以是血样，例如为全血。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
本实施例提供一种Galectin-3、ST2和NT-ProBNP联合检测试纸条及其制备方法和应用。
1.检测试纸条
本实施例的试纸条的组件包括标记垫、层析垫、吸收垫和底板。其中：
标记垫会处理上含有GALECTIN-3标记物、ST2标记物、NT-ProBNP标记物、阻断剂、糖、蛋白、表面活性剂、大分子、缓冲体系的标记垫处理液。以使标记垫塑型、亲水、保持一定的pH，为免疫反应提供一个抗原与标记物特异性结合的合适环境，同时确保标记物均匀释放提高精密度等。GALECTIN-3标记物为GALECTIN-3抗体与荧光微球通过物理或者化学键相连接形成的“抗体-荧光微球”复合物。ST2标记物为ST2抗体与荧光微球通过物理或者化学键相连接形成的“抗体-荧光微球”复合物。NT-ProBNP标记物为NT-ProBNP抗体与荧光微球通过物理或者化学键相连接形成的“抗体-荧光微球”复合物。其中三个项目分别用不同激发光或不同接收光的荧光微球标记，以实现不同项目间检测互不干扰。
层析垫上包被有GALECTIN-3检测线(T1)、ST2检测线(T2)、NT-ProBNP(T3)检测线、GALECTIN-3质控线(C1)、ST2质控线(C2)、NT-ProBNP(C3)质控线。GALECTIN-3检测线上包被有GALECTIN-3抗体，用于特异性捕获样品中的GALECTIN-3，以实现对样品中GALECTIN-3的分离富并集于T1线上；ST2检测线上包被有ST2抗体，用于特异性捕获样品中的ST2，以实现对样品中ST2的分离并富集T2线上；NT-ProBNP检测线上包被有NT-ProBNP抗体，用于特异性捕获样品中的NT-ProBNP，以实现对样品中NT-ProBNP的分离并富集于T3线上。GALECTIN-3质控线上包被有GALECTIN-3抗原，用于特异性吸附未结合抗原的GALECTIN-3标记物并富集于C1线上，用于计算样品中CAL-3的含量以及质量控制；ST2质控线上包被有ST2抗原，用于特异性吸附未结合抗原的ST2标记物并富集于C2线上，用于计算样品中ST2的含量以及质量控制；NT-ProBNP质控线包被有NT-ProBNP抗原，用于特异性吸附未结合抗原的NT-ProBNP标记物，用于计算样品中NT-ProBNP的含量以及质量控制。
吸收垫用于给试纸条提供定向层析力，使层析在一定的时间内朝一个方向进行。
底板起支撑作用，把各个组分黏在一起，形成一个完整的试纸条。
本实施例试纸条的检测原理为：当样品加入到标记垫中，样品在毛细作用下向层析垫流动，样品首先跟标记垫上的标记物接触，当样品中含相应的抗原时，形成抗原-标记物复合物；与标记物特异性反应后的样品在层析垫上继续层析，先与检测线接触，抗原-标记物复合物被检测线上的抗体特异性结合并富集于检测线上；未结合的标记物与质控线上的配体特异性结合富集于质控线上。在该模式下，相同项目的检测线与质控线上的标记物是总量恒定的关系。即当检测线信号高，相应的质控线信号就低；反之检测线信号低，相应的质控线信号就高。同时以检测线与质控线之间的比值来计算浓度，实现了拓宽试剂的检测范围，提高了试剂精密度。
2.试纸条的制备方法
2.1标记垫的制备
2.1.1生物素化ST2标记抗体制备
(a)试剂
1)NHSB：N-羟基琥珀酰亚胺生物素。
2)0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液，pH 8.0。
3)双蒸水(注意去除游离氨基)，用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液。
4)DMSO(二甲亚砜，有毒试剂)。
5)1mol/L NH4Cl。
6)Proclin300。
7)PBS。
8)ST2标记抗体。
(b)设备
1)分子筛柱(如G25)。
2)电磁搅拌器。
3)透析袋(MW CO 8000)。
4)铝铂
5)微量移液器。
(c)步骤
1)将待生物素化的蛋白质(即ST2标记抗体)用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)(或0.5mol/L硼酸缓冲液，pH 8.6)稀释到1mg/mL，一般实验室应用的生物素化体积为1～2.5mL。
2)交互用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)(或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH 8.6)，对蛋白质充分透析。
3)用1mL DMSO溶解NHSB 1mg。
4)向1mL蛋白质溶液(即含蛋白质1mg)加入120μL NHSB溶液(即含NHSB 120μg)。
5)在室温下持续搅拌，保温2～4小时。
6)加入9.6μL1mol/L NH4Cl(每25μg NHSB加1μL)，在室温下搅拌10min。
7)在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素。
8)将样品上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1～3mL之间洗下。
9)最后，样品加入0.05wt％proclin300。将结合产物置4℃，避光保存。
2.1.2标记物制备
(a)试剂准备
1)时间分辨荧光微球激发光365nm发射光615nm，用于标记GALECTIN-3抗体；AIE荧光微球激发光365nm发射光415nm，用于标记ST2抗体；量子点微球激发光365nm发射光525nm，用于标记NT-ProBNP抗体。
2)GALECTIN-3标记抗体，生物素化ST2标记抗体，NT-ProBNP标记抗体，抗DNP抗体，使用前30分钟，从冰箱拿出，回温到室温。
3)活化剂EDC、Sulfo-NHS(EDC干燥环境小管分装，开盖时间短，称量后封口膜封口，-20℃保存；Sulfo-NHS 4℃保存；使用前30min，从冰箱拿出，回温到室温)。
4)活化液Buffer A(0.05M的MES pH6.0)。
5)反应液Buffer B(0.05M的MES pH6.5)。
6)封闭液Buffer C(0.05M的TRIS-HCl+1％W/V BSA pH8.0)。
7)保存液Buffer D(0.05M的TRIS-HCl+1％W/V BSA+0.05％W/V Proclin300pH8.0)。
(b)标记过程
1wt％微球稀释10倍，即反应过程微球浓度为0.1wt％；
1)清洗微球
取3个1.5mL离心管，分别加入50μL不同型号的1％微球，再加入活化液Buffer A450μL，1000rpm震荡1min，然后14000rpm离心30min，取掉上清，加入400μL活化液Buffer A，复溶混匀(必要时可采用超声分散)，清洗1次。
2)活化微球
使用活化液Buffer A配制10mg/mL的EDC及Sulfo-NHS溶液，如称取1mg EDC，用100μL Buffer A溶解(现配现用)。在清洗后的微球中先后加入50μL Sulfo-NHS溶液和50μLEDC溶液，即EDC、NHS使用浓度为1mg/mL，置于漩涡振荡器上1000rpm震荡活化30min。
3)活化后清洗
活化后清洗、溶液更换为反应液Buffer B：
(1)活化后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL反应液Buffer B，复溶(必要时可采用超声分散)，清洗1次。
(2)清洗后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL反应液Buffer B，复溶(必要时可采用超声分散)。
4)偶联抗体
GALECTIN-3标记抗体、生物素化ST2标记抗体分别取50μg加入至对应的复溶后的微球中做好标记，旋转混合反应2h。
NT-ProBNP标记抗体取50μg，抗DNP抗体取5μg混匀后加入至对应复溶好的微球中做好标记，旋转混合反应2h。
抗体体积量＝标记抗体质量/抗体浓度。
5)封闭
偶联反应2.0h后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL封闭液Buffer C，复溶(必要时可采用超声分散)，置于旋转培养器上旋转混合封闭60min。
6)清洗保存
封闭后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入250μL保存液Buffer D(微球终浓度2mg/mL)，复溶(必要时可采用超声分散)。重悬后，于2-8℃保存备用。
2.1.3标记垫制备
1)配置标记垫稀释液，包括：0.05M Tris以及5％(w/v)海藻糖、1％(w/v)BSA、1％(w/v)PVP、1％(w/v)Tween20、0.5mg/mL RBC抗体和1mg/mL阻断剂。标记垫工作液含三个项目的标记物、缓冲液、抗红细胞抗体、阻断剂、表面活性剂、糖、聚合物等成分的溶液喷涂处理，起到缓冲，分离全血样品中的红细胞，阻断HAMA、RF等物质对测试的干扰。
2)配置标记垫工作液，步骤包括：用标记垫稀释液稀释上述步骤2.1.2所得到的三种标记物，使三种标记物在同一溶液中的含量均为2％(w/v)。
3)标记垫喷涂，按照《喷金划膜仪》的作业指导书操作设备喷垫，参数为4μL/cm，间隔6mm，喷三线居中。
4)标记垫喷涂结束后，转移至50℃烘箱，干燥24小时后，湿度小于30％室温保存备用。
2.2层析垫的制备
2.2.1试剂准备
1)GALECTIN-3、ST2、NT-ProBNP包被抗体；
2)GALECTIN-3抗原、链霉亲和素、DNP-BSA；
3)包被稀释液：0.01M/L PBS+5％ W/V海藻糖；
4)NC膜。
2.2.2包被过程
1)用包被稀释液把GALECTIN-3、ST2、NT-ProBNP包被抗体分别稀释至1mg/mL；
2)用包被稀释液把重组GALECTIN-3抗原、链霉亲和素、DNP-BSA分别稀释至0.5mg/mL；
3)把稀释好的GALECTIN-3、ST2、NT-ProBNP包被抗体以1uL/cm的用量，分别划于NC膜的T1、T2、T3线区域上；
4)把稀释好的重组GALECTIN-3抗原、链霉亲和素、DNP-BSA以1uL/cm的用量划于NC膜的C1、C2、C3线区域上；
5)划好的NC膜置于50℃干燥72小时，湿度小于30％室温保存备用。
2.3吸水垫干燥
吸水垫裁切成相应的尺寸，50℃干燥24小时，湿度小于30％室温保存备用。
2.4组装
领取含以上中间品的PVC板、标记垫、NC膜、吸收垫，组装切条装卡，见图4、图5。1、PVC板，2、标记垫，3、NC膜，4、GALECTIN-3检测线(T1线)，5、ST2检测线(T2线)，6、NT-ProBNP检测线(T3线)，7、GALECTIN-3质控线(C1线)，8、ST2质控线(C2线)，9、NT-ProBNP质控线(C3线)，10、吸收垫。
(1)PVC板：表面涂有不干胶，起支撑与固定作用。
(2)标记垫：成分为玻纤、聚酯等，经过标记垫工作液喷涂处理。
(3)NC膜：硝酸纤维素膜，层析反应的载体，上面依次包被有第一检测线(T1)、第二检测线(T2)、第三检测线(T3)、第一质控线(C1)、第二质控线(C2)、第三质控线(C3)。
(4)检测线(T1)：包被于NC膜上，含有GALECTIN-3包被抗体，用于检测GALECTIN-3含量。
(5)检测线(T2)：包被于NC膜上，含有ST2包被抗体，用于检测ST2含量。
(6)检测线(T3)：包被于NC膜上，含有NT-ProBNP包被抗体，用于检测NT-ProBNP含量。
(7)质控线(C1)：包被于NC膜上，含有GALECTIN-3抗原，用于指示产品的有效性及计算GALECTIN-3的含量。
(8)质控线(C2)：包被于NC膜上，含有链霉亲和素，用于指示产品的有效性及计算ST2的含量。
(9)质控线(C3)：包被于NC膜上，含有DNP-BSA，用于指示产品的有效性及计算NT-ProBNP的含量。
(10)吸收垫：成分为棉绒，用于吸收多余的液体，为层析反应提供动力。
3性能验证
1)全血样品测试
全血测试，红细胞分离完全，NC膜膜面无红细胞干扰测试情况。采用本实施例检测试纸条以及试纸卡检测的结果可参见图6。
2)精密度测试
表2
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺精密度测试表明，两种工艺在T/C的精密度差异不大的情况下，由于非独立C线工艺的T/C响应曲线的斜率更高，因此通过四参数拟合计算值的精密度更低，非独立C线工艺能提高检测试纸条的精密度和准确度。
表3
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺精密度测试表明，两种工艺在T/C的精密度差异不大的情况下，由于非独立C线工艺的T/C响应曲线的斜率更高，因此通过四参数拟合计算值的精密度更低，非独立C线工艺能提高检测试纸条的精密度和准确度。
表4
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺精密度测试表明，两种工艺在T/C的精密度差异不大的情况下，由于非独立C线工艺的T/C响应曲线的斜率更高，因此通过四参数拟合计算值的精密度更低，非独立C线工艺能提高检测试纸条的精密度和准确度。
3)线性范围测试
表5(图7)
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺线性范围测试表明，非独立C线工艺在相同的检测范围内的响应曲线比独立C线工艺具有更高的斜率，因此非独立C线能提高试剂的检测区间。
表6(图8)
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺线性范围测试表明，非独立C线工艺在相同的检测范围内的响应曲线比独立C线工艺具有更高的斜率，因此非独立C线能提高试剂的检测区间。
表7(图9)
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺线性范围测试表明，非独立C线工艺在相同的检测范围内的响应曲线比独立C线工艺具有更高的斜率，因此非独立C线能提高试剂的检测区间。
实施例2
本实施例提供一种Galectin-3、NT-ProBNP联合检试纸条及其制备方法和应用。
1.检测试纸条
本实施例的检测试纸条的组件包括标记垫、层析垫、吸收垫、底板。其中：
标记垫会处理上含有GALECTIN-3标记物、NT-ProBNP/抗DNP标记物、阻断剂、糖、蛋白、表面活性剂、大分子、缓冲体系的标记垫液。以使标记垫塑型、亲水、保持一定的pH，为免疫反应提供一个抗原与标记物特异性结合的合适环境，同时确保标记物均匀释放提高精密度等。GALECTIN-3标记物为GALECTIN-3抗体与荧光微球通过物理或者化学键相连接形成的“抗体-荧光微球”复合物。NT-ProBNP/抗DNP标记物为NT-ProBNP抗体和抗DNP抗体与量子点微球通过物理或者化学键相连接形成的“抗体-荧光微球”复合物。其中两个项目分别用不同激发光或不同接收光的荧光微球标记，以实现不同项目间检测互不干扰。
层析垫上包被有GALECTIN-3检测线(T1)、NT-ProBNP(T2)检测线、GALECTIN-3质控线(C1)、NT-ProBNP(C2)质控线。GALECTIN-3检测线上包被有GALECTIN-3抗体，用于特异性捕获样品中的GALECTIN-3，以实现对样品中GALECTIN-3的分离富并集于T1线上；NT-ProBNP检测线上包被有NT-ProBNP抗体，用于特异性捕获样品中的NT-ProBNP，以实现对样品中NT-ProBNP的分离并富集于T2线上。GALECTIN-3质控线上包被有GALECTIN-3抗原，用于特异性吸附未结合抗原的GALECTIN-3标记物并富集于C1线上，用于计算样品中CAL-3的含量以及质量控制；NT-ProBNP质控线包被有DNP-BSA，用于特异性吸附未结合抗原的NT-ProBNP/抗DNP标记物，用于计算样品中NT-ProBNP的含量以及质量控制。
吸收垫用于给试纸条提供定向层析力，使层析在一定的时间内朝一个方向进行。
底板起支撑作用，把各个组分黏在一起，形成一个完整的试纸条。
本实施例试纸条的检测原理为：当样品加入到标记垫中，样品在毛细作用下向NC膜流动，样品首先跟标记物接触，当样品中含相应的抗原时，形成抗原-标记物复合物；与标记物特异性反应后的样品在NC膜上继续层析，先与检测线接触，抗原-标记物复合物被检测线上的抗体特异性结合并富集于检测线上；未结合的标记抗体与质控线上的配体特异性结合富集于质控线上。在该模式下，相同项目的检测线与质控线上的标记物是总量恒定的关系。即当检测线信号高，相应的质控线信号就低；反之检测线信号低，相应的质控线信号就高。同时以检测线与质控线之间的比值来计算浓度，实现了拓宽试剂的检测范围，提高了试剂精密度。
2.检测试纸条的制备
2.1标记垫制备
2.1.1标记物制备
(a)试剂准备
1)时间分辨荧光微球激发光365nm发射光615nm，用于标记GALECTIN-3抗体；量子点微球激发光365nm发射光525nm，用于标记NT-ProBNP抗体。
2)GALECTIN-3标记抗体，NT-ProBNP标记抗体，抗DNP(脱氧核糖核蛋白)抗体，使用前30min，从冰箱拿出，回温到室温。
3)活化剂EDC、Sulfo-NHS(EDC干燥环境小管分装，开盖时间短，称量后封口膜封口，-20℃保存；Sulfo-NHS 4℃保存；使用前30min，从冰箱拿出，回温到室温)。
4)活化液Buffer A(0.05M的MES pH6.0)。
5)反应液Buffer B(0.05M的MES pH6.5)。
6)封闭液Buffer C(0.05M的TRIS-HCl+1％W/V BSA pH8.0)。
7)保存液Buffer D(0.05M的TRIS-HCl+1％W/V BSA+0.05％W/V Proclin300pH8.0)。
(b)标记过程
1wt％微球稀释10倍，即反应过程微球浓度为0.1wt％；
1)清洗微球
取2个1.5mL离心管，分别加入50μL不同型号的1％wt微球，再加入活化液Buffer A450μL，1000rpm震荡1min，然后14000rpm离心30min，取掉上清，加入400μL活化液Buffer A，复溶混匀(必要时可采用超声分散)，清洗1次。
2)活化微球
使用活化液Buffer A配制10mg/mL的EDC及Sulfo-NHS溶液，如称取1mg EDC，用100μL Buffer A溶解(现配现用)。在清洗后的微球中先后加入50μL Sulfo-NHS溶液和50μLEDC溶液，即EDC、NHS使用浓度为1mg/mL，置于漩涡振荡器上1000rpm震荡活化30min。
3)活化后清洗
活化后清洗、溶液更换为反应液Buffer B：
(1)活化后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL反应液Buffer B，复溶(必要时可采用超声分散)，清洗1次。
(2)清洗后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL反应液Buffer B，复溶(必要时可采用超声分散)。
4)偶联抗体
GALECTIN-3标记抗体取50μg加入至对应的复溶后的微球中做好标记，旋转混合反应2h。
NT-ProBNP标记抗体取50μg，抗DNP抗体取5μg加入到同一离心管混匀后，加入至对应复溶好的微球中做好标记，旋转混合反应2h。
抗体体积量＝标记抗体质量/抗体浓度。
5)封闭
偶联反应2.0h后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL封闭液Buffer C，复溶(必要时可采用超声分散)，置于旋转培养器上旋转混合封闭60min。
6)清洗保存
封闭后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入250μL保存液Buffer D(微球终浓度2mg/mL)，复溶(必要时可采用超声分散)。重悬后，于2-8℃保存备用。
(c)标记垫制备
1)配置标记垫处理液，配方为：0.05M Tris+5％W/V海藻糖+1％W/V BSA+1％W/VPVP+1％Tween20+0.5mg/mL抗RBC抗体+1mg/mL阻断剂。
2)配置标记垫工作液，用标记垫处理液稀释上述步骤所得到的两种标记物，使两种标记物在同一溶液中的含量均为2％W/V。
3)标记垫喷涂，按照《喷金划膜仪》的作业指导书操作设备喷垫，参数为4μL/cm，间隔6mm，喷三线居中。
4)标记垫喷涂结束后，转移至50℃烘箱，干燥24小时后，湿度小于30％室温保存备用。
2.2抗体包被NC膜
(a)试剂准备
1)GALECTIN-3包被抗体、NT-ProBNP包被抗体。
2)重组GALECTIN-3抗原、DNP-BSA。
3)包被稀释液：0.01M PBS+5％ W/V海藻糖。
4)NC膜。
(b)包被过程
1)用包被稀释液把GALECTIN-3包被抗体、NT-ProBNP包被抗体分别稀释至1mg/mL。
2)用包被稀释液把重组GALECTIN-3抗原、DNP-BSA分别稀释至0.5mg/mL。
3)把稀释好的GALECTIN-3包被抗体、NT-ProBNP包被抗体以1μL/cm的用量，分别划于NC膜的T1、T2线区域上。
4)把稀释好的重组GALECTIN-3抗原、DNP-BSA以1μL/cm的用量划于NC膜的C1、C2线区域上。
5)划好的NC膜置于50℃干燥72小时，湿度小于30％室温保存备用。
2.3吸收垫制备
吸水纸裁切成相应的尺寸，50℃干燥24小时，湿度小于30％室温保存备用。
2.4组装
领取含以上中间品的PVC板、标记垫、NC膜、吸收纸，如图10所示组装切条装卡。1、PVC板，2、标记垫，3、NC膜，4、GALECTIN-3检测线(T1线)，5、NT-ProBNP检测线(T2线)，6、GALECTIN-3质控线(C1线)，7、NT-ProBNP质控线(C2线)，8、吸收垫
(1)PVC板：表面涂有不干胶，起支撑与固定作用。
(2)标记垫：成分为玻纤、聚酯等，经过标记垫工作液喷涂处理。标记垫工作液含三个项目的标记物、缓冲液、抗红细胞抗体、阻断剂、表面活性剂、糖、聚合物等成分的溶液喷涂处理，起到缓冲，分离全血样品中的红细胞，阻断HA、RF等物质对测试的干扰。
(3)NC膜：硝酸纤维素膜，层析反应的载体，上面依次包被有第一检测线(T1)、第二检测线(T2)、第一质控线(C1)、第二质控线(C2)。
(4)检测线(T1)：包被于NC膜上，含有GALECTIN-3包被抗体，用于检测GALECTIN-3含量。
(5)检测线(T2)：包被于NC膜上，含有NT-ProBNP包被抗体，用于检测NT-ProBNP含量。
(6)质控线(C1)：包被于NC膜上，含有GALECTIN-3抗原，用于指示产品的有效性及计算GALECTIN-3的含量。
(7)质控线(C2)：包被于NC膜上，含有DNP-BSA，用于指示产品的有效性及计算NT-ProBNP的含量。
(8)吸收垫：成分为棉绒，用于吸收多余的液体，为层析反应提供动力。
3.性能验证
1)精密度
表8
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺精密度测试表明，两种工艺在T/C的精密度差异不大的情况下，由于非独立C线工艺的T/C响应曲线的斜率更高，因此通过四参数拟合计算值的精密度更低，非独立C线工艺能提高检测试纸条的精密度和准确度。
表9
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺精密度测试表明，两种工艺在T/C的精密度差异不大的情况下，由于非独立C线工艺的T/C响应曲线的斜率更高，因此通过四参数拟合计算值的精密度更低，非独立C线工艺能提高检测试纸条的精密度和准确度。
2)线性范围
表10(图11)
/>
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺线性范围测试表明，非独立C线工艺在相同的检测范围内的响应曲线比独立C线工艺具有更高的斜率，因此非独立C线能提高试剂的检测区间。
表11(图12)
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺线性范围测试表明，非独立C线工艺在相同的检测范围内的响应曲线比独立C线工艺具有更高的斜率，因此非独立C线能提高试剂的检测区间。
实施例3
本实施例提供一种Galectin-3检测试纸条及其制备方法和应用。
1.检测试纸条
本实施例检测试纸条的组件包括样品垫、NC膜、吸收垫、PVC板。其中：
样品垫会处理上含有抗RBC(红细胞)抗体、糖、蛋白、表面活性剂、大分子、缓冲体系的样品垫处理液(见本实施例2.3项下记载)，以使样品垫塑型、亲水、保持一定的pH，为免疫反应提供一个抗原与标记物特异性结合的合适环境，同时分离样品中的红细胞等干扰物，提高检测的准确性等。GALECTIN-3标记物为GALECTIN-3抗体与荧光微球通过物理或者化学键相连接形成的“抗体-荧光微球”复合物。
NC膜上包被有干扰物分离线(S1、S2、S3)、标记线(L)、GALECTIN-3检测线(T)、GALECTIN-3质控线(C)。干扰物分离线(S1、S2、S3)上包被有抗人IgG抗体、抗人IgM抗体，用于分离样品中的IgG和IgM，使检测不受嗜异性抗体、RF(类风湿因子)等的干扰。标记物线(L)含有GALECTIN-3标记物，由于GALECTIN-3标记物通过稀释液(2.1.2中的包被稀释液1)进行了钝化处理，无法吸附在L线上，不含干扰物的样品与L线接触后，GALECTIN-3标记抗体与抗原结合形成抗原-标记物复合物，并随样品一起向前层析直到被T、C线捕获，用于检测样品中GALECTIN-3的含量。GALECTIN-3检测线上包被有GALECTIN-3包被抗体，用于特异性捕获样品中的GALECTIN-3，以实现对样品中GALECTIN-3的分离富并集于T线上。GALECTIN-3质控线上包被有GALECTIN-3抗原，用于特异性吸附未结合抗原的GALECTIN-3标记物并富集于C线上，用于计算样品中的GALECTIN-3的含量以及质量控制。
吸收垫用于给试纸条提供定向层析力，使层析在一定的时间内朝一个方向进行。
PVC板起支撑作用，把各个组分黏在一起，形成一个完整的试纸条。
本实施例检测试纸条的原理为：当样品加入到样品垫中，样品在毛细作用下向NC膜流动，样品首先跟干扰物分离线接触，样品中的干扰物被吸附于干扰物分离线上，不含干扰物的样品中含相应的抗原当与L线接触时，形成抗原-标记物复合物；由于GALECTIN-3标记物通过稀释液(2.1.2中的包被稀释液1)进行了钝化处理，无法吸附在L线上，与标记物特异性反应后的样品在NC膜上继续层析，先与检测线接触，抗原-标记物复合物被检测线上的包被抗体特异性结合并富集于检测线上；未结合的标记物与质控线上的配体特异性结合富集于质控线上。在该模式下，检测线与质控线上的标记物是总量恒定的关系。即当检测线信号高，相应的质控线信号就低；反之检测线信号低，相应的质控线信号就高。同时以检测线与质控线之间的比值来计算浓度，实现了拓宽试剂的检测范围，提高了试剂精密度。同时还做到了干扰物分离，实现了只有酶免、化学发光等液相检测经过洗涤才有的去除检测样品中的干扰物。
2.检测试纸条的制备
2.1层析垫的制备
2.1.1GALECTIN-3标记物制备
(a)试剂准备
1)时间分辨荧光微球激发光365nm发射光615nm，用于GALECTIN-3标记抗体。
2)GALECTIN-3标记抗体(使用前30min，从冰箱拿出，回温到室温)。
3)活化剂EDC、Sulfo-NHS(EDC干燥环境小管分装，开盖时间短，称量后封口膜封口，-20℃保存；Sulfo-NHS 4℃保存；使用前30min，从冰箱拿出，回温到室温)。
4)活化液Buffer A(0.05M的MES pH6.0)。
5)反应液Buffer B(0.05M的MES pH6.5)。
6)封闭液Buffer C(0.05M的TRIS-HCl+1％w/v BSA pH8.0)。
7)保存液Buffer D(0.05M的TRIS-HCl+1％w/v BSA+0.05％w/v Proclin300pH8.0)。
(b)标记过程
1wt％微球稀释10倍，即反应过程微球浓度为0.1wt％；
1)清洗微球
取1.5mL离心管，加入50μL含量为1％微球，再加入活化液Buffer A 450μL，1000rpm震荡1min，然后14000rpm离心30min，取掉上清，加入400μL活化液Buffer A，复溶混匀(必要时可采用超声分散)，清洗1次。
2)活化微球
使用活化液Buffer A配制10mg/mL的EDC及Sulfo-NHS溶液，如称取1mg EDC，用100μL Buffer A溶解(现配现用)。在清洗后的微球中先后加入50μL Sulfo-NHS溶液和50μLEDC溶液，即EDC、NHS使用浓度为1mg/mL，置于漩涡振荡器上1000rpm震荡活化30min。
3)活化后清洗
活化后清洗、溶液更换为反应液Buffer B：
(1)活化后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL反应液Buffer B，复溶(必要时可采用超声分散)，清洗1次。
(2)清洗后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL反应液Buffer B，复溶(必要时可采用超声分散)。
4)偶联抗体
GALECTIN-3标记抗体取50μg标记抗体加入至对应的复溶后的微球中做好标记，旋转混合反应2h。
抗体体积量＝标记抗体质量/抗体浓度。
5)封闭
偶联反应2.0h后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入500μL封闭液Buffer C，复溶(必要时可采用超声分散)，置于旋转培养器上旋转混合封闭60min。
6)清洗保存
封闭后，14000rpm离心20min，取掉上清，加入250μL保存液Buffer D(微球终浓度2mg/mL)，复溶(必要时可采用超声分散)。重悬后，于2-8℃保存备用。
2.1.2包被NC膜
(a)试剂准备
1)GALECTIN-3包被抗体。
2)GALECTIN-3抗原。
3)抗人IgG抗体。
4)抗人IgM抗体。
5)GALECTIN-3标记物。
6)包被稀释液1：0.01M PBS+5％ W/V海藻糖。
7)包被稀释液2：0.05M Tris+5％ W/V海藻糖+1％ W/V BSA+1％ W/V PVP+1％Tween20。
8)NC膜。
(b)包被过程
1)用包被稀释液1把GALECTIN-3包被抗体稀释至1mg/mL。
2)用包被稀释液1把GALECTIN-3抗原稀释至0.5mg/mL。
3)用包被稀释液1把抗人IgG抗体和抗人IgM抗体在同一溶液中分别稀释至2mg/mL。
4)用包被稀释液1把GALECTIN-3标记物稀释10倍备用。
5)把稀释好的GALECTIN-3包被抗体以1μL/cm的用量，划于NC膜的T线区域上。
6)把稀释好的重组GALECTIN-3抗原以1μL/cm的用量划于NC膜的C线区域上。
7)把稀释好的GALECTIN-3标记物以2μL/cm的用量划于NC膜的L线区域上。
8)把稀释好的鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体，以1.5μL/cm的用量划于NC膜的S1、S2和S3线区域上。
9)划好的NC膜置于50℃干燥72小时，湿度小于30％室温保存备用。
2.2吸收垫制备
吸收垫裁切成相应的尺寸，50℃干燥24小时，湿度小于30％室温保存备用。
2.3样品垫制备
1)配置样品垫处理液，配方为：0.05M Tris+5％W/V海藻糖+1％W/V BSA+1％W/VPVP+1％Tween20+0.5mg/mL抗RBC抗体+1mg/mL阻断剂。
2)样品垫喷涂，按照《喷金划膜仪》的作业指导书操作设备喷垫，参数为4uL/cm，间隔6mm，喷三线居中。
3)样品垫结束后，转移至50℃烘箱，干燥24小时后，湿度小于30％室温保存备用。
2.4组装
领取含以上中间品的PVC板、样品垫NC膜、吸收垫，如图13所示组装检测试纸条、切条装卡。
1、PVC板，2、样品垫，3、NC膜，4干扰物分离线1(S1线)，5干扰物分离线2(S2线)，6干扰物分离线3(S3)，7标记线(L线)，8检测线(T线)，9质控线(C线)，10吸收垫。
(1)PVC板：表面涂有不干胶，起支撑与固定作用。
(2)样品垫：成分为玻纤，经过样品垫处理液喷涂处理。参照2.3项下记载，样品垫处理液含缓冲液、抗红细胞抗体、表面活性剂、糖、聚合物等成分，起到缓冲、分离全血样品中的红细胞等的作用。
(3)NC膜：硝酸纤维素膜，层析反应的载体，上面依次包被有干扰物分离线S1/S2/S3，标记线L线，测线T线，质控线C线。
(4)干扰物分离线S1线：包被于NC膜上，含有抗人IgG抗体、抗人IgM抗体，用于分离样品中的IgG/IgM等干扰物质。
(5)干扰物分离线S2线：与干扰物分离线S1作用一样，以实现双重拦截干扰物的效果。
(6)干扰物分离线S3线：与干扰物分离线S1作用一样，以实现三重拦截干扰物的效果。
(7)标记线L线：含有GALECTIN-3标记物，用于检测样品中的GALECTIN-3含量。
(8)检测线T线：含有GALECTIN-3捕获抗体，用于检测样品中的GALECTIN-3含量。
(9)质控线：包被于NC膜上，含有GALECTIN-3抗原，用于指示产品的有效性，及计算GALECTIN-3的含量。
(10)吸收垫：成分为棉绒，用于吸收多余的液体，为层析反应提供动力。
3.性能验证
1)精密度
表12
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺精密度测试表明，两种工艺在T/C的精密度差异不大的情况下，由于非独立C线工艺的T/C响应曲线的斜率更高，因此通过四参数拟合计算值的精密度更低，非独立C线工艺能提高检测试纸条的精密度和准确度。
2)线性
表13(图14)
结果分析：非独立C线工艺与独立C线工艺线性范围测试表明，非独立C线工艺在相同的检测范围内的响应曲线比独立C线工艺具有更高的斜率，因此非独立C线能提高试剂的检测区间。
3)与酶免试剂临床相关性
表14(图15)
序号 ELISA测值(ng/mL) 本试剂盒测值(ng/mL)
1 51.3 52.4
2 81.1 79.6
3 1.5 1.6
4 94.8 93.9
5 14.2 12.7
9 16.9 16.5
10 17.8 18.6
12 18.9 18.8
13 19.0 21.0
16 28.8 29.1
17 30.9 30.2
18 33.9 34.4
19 35.6 35.9
20 38.2 38.1
21 5.6 5.2
22 20.2 21.8
23 40.9 42.5
24 2.5 2.8
25 76.7 78.9
26 38.9 41.3
27 18.9 19.2
28 17.6 16.3
29 76.4 75.1
30 41.5 40.9
31 30.8 31.4
32 62.7 64.0
33 37.4 38.7
34 46.7 42.0
35 67.7 63.5
36 72.2 74.0
37 24.8 23.1
38 19.9 17.8
39 17.2 16.5
40 35.4 34.8
结果分析：与商业化的ELISA试剂盒对比测试临床样本表明，本试剂盒与商用ELISA试剂盒相关性好R2＝0.9955，具备商用价值。
4)不同反应时间
表15
结果分析：标记垫工艺与标记膜工艺对比测试表明，标记膜工艺测试低、中、高不同浓度的参考品，在3分钟到20分钟的反应时间内，其偏倚均在±5以内，说明3分钟已经充分反应，该工艺可实现3分钟出相对稳定的结果。而标记垫工艺测试低、中、高不同浓度的参考品，在3分钟到15分钟的反应时间内，其偏倚均超过10％，说明标记垫工艺至少需要15分钟才能充分反应，因此标记垫工艺至少需要15分钟才能出相对稳定的结果。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (20)

1.一种检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条包括底板以及设于所述底板上的免疫层析功能区；
沿层析方向，所述免疫层析功能区包括缓冲区、标记区和检测区，或者缓冲-标记复合区和检测区，所述检测区设有检测线和质控线；
所述的标记区和缓冲-标记复合区包被有标记抗体-荧光微球复合物，所述检测线包被有包被抗体，所述质控线包被有质控蛋白；
所述标记抗体-荧光微球复合物中的标记抗体特异性结合待测样品中的目标抗原形成目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物，所述包被抗体特异性结合所述目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物形成包被抗体-目标抗原-标记抗体-荧光微球复合物，所述质控蛋白特异性结合所述标记抗体-荧光微球复合物。
2.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述的标记区和缓冲-标记复合区包被Galectin-3标记抗体-荧光微球复合物、ST2标记抗体-荧光微球复合物和NT-ProBNP标记抗体-荧光微球复合物中的一种或者多种。
3.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述标记抗体-荧光微球复合物中荧光微球选自绿色量子点荧光微球、红色量子点荧光微球、时间分辨荧光微球、荧光素微球、AIE荧光微球和近红外Ⅱ区荧光微球中的一种。
4.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述质控蛋白包括(1)至(4)中的一种：
(1)所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体特异性结合的抗原；
(2)所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体特异性结合的二抗；
(3)能与所述标记抗体-荧光微球复合物的标记抗体的修饰基团特异性结合的蛋白；
(4)能偶联在所述标记抗体-荧光微球复合物的荧光微球上的蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测试纸条，其特征在于，所述的标记区和缓冲-标记复合区包被多种标记抗体-荧光微球复合物以特异性结合待测样品中的多种目标抗原，所述检测区对应设有多条检测线和多条质控线。
6.根据权利要求5所述的检测试纸条，其特征在于，多种标记抗体-荧光微球复合物具有不同发射光波长的荧光微球。
7.根据权利要求1至4以及6中任一项所述的检测试纸条，其特征在于，所述免疫层析功能区包括标记垫、层析垫和吸收垫，所述缓冲-标记复合区设于所述标记垫，所述检测区设于层析垫。
8.根据权利要求7所述的检测试纸条，其特征在于，所述免疫层析功能区满足如下条件中的一个或者多个：
(a)所述标记垫的材质包括玻璃纤维或/和聚酯；
(b)所述层析垫的材质包括硝酸纤维素；
(c)所述吸收垫的材质包括植物纤维或/棉绒；以及，
(d)所述底板的材质包括PVC。
9.根据权利要求7所述的检测试纸条，其特征在于，所述缓冲-标记复合区经工作液1处理，所述工作液1包括标记抗体-荧光微球复合物以及稀释液；所述稀释液1包括糖、封闭剂、稳定剂、表面活性剂、抗红细胞抗体、阻断剂以及缓冲液；
可选地，所述稀释液1满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述糖包括海藻糖；
2)所述封闭剂包括BSA；
3)所述稳定剂包括PVP；
4)所述表面活性剂包括Tween20；以及，
5)所述缓冲剂包括Tris缓冲液；
可选地，所述稀释液1包括3wt％-7wt％海藻糖、0.5％-1.5％(w/v)BSA、0.5％-1.5％(w/v)PVP、0.5％-1.5％(w/v)Tween20、0.3mg/mL-0.7mg/mL抗红细胞抗体、0.5mg/mL-1.5mg/mL阻断剂以及0.03M-0.08M的Tris缓冲液；
可选地，所述标记抗体-荧光微球复合物在所述工作液1中的浓度为1.5％-2.5％(w/v)。
10.根据权利要求1至4以及6中任一项所述的检测试纸条，其特征在于，所述免疫层析功能区包括样品垫、层析垫和吸收垫；
所述缓冲区设于所述样品垫，所述标记区和所述检测区设于所述层析垫。
11.根据权利要求10所述的检测试纸条，其特征在于，所述免疫层析功能区满足如下条件中的一个或者多个：
a)所述样品垫的材质包括玻璃纤维、聚酯或/和聚丙烯；
b)所述层析垫的材质包括硝酸纤维素；
c)所述吸收垫的材质包括植物纤维或/棉绒；以及，
d)所述底板的材质包括PVC。
12.根据权利要求11所述的检测试纸条，其特征在于，所述缓冲区经工作液2处理，所述工作液2包括糖、封闭剂、稳定剂、表面活性剂、抗红细胞抗体、阻断剂以及缓冲液；
可选地，所述工作液2满足如下条件中的一个或者多个：
A)所述糖包括海藻糖；
B)所述封闭剂包括BSA；
C)所述稳定剂包括PVP；
D)所述表面活性剂包括Tween20；以及，
E)所述缓冲剂包括Tris缓冲液；可选地，所述Tris缓冲液包括0.03M-0.08M的Tris缓冲液；
可选地，所述工作液2包括3wt％-7wt％海藻糖、0.5％-1.5％(w/v)BSA、0.5％-1.5％(w/v)PVP、0.5％-1.5％(w/v)Tween20、0.3mg/mL-0.7mg/mL抗红细胞抗体、0.5mg/mL-1.5mg/mL阻断剂以及0.03M-0.08M的Tris缓冲液。
13.根据权利要求11所述的检测试纸条，其特征在于，所述标记区经工作液3处理，所述工作液3包括标记抗体-荧光微球复合物以及稀释液；所述稀释液包括糖以及缓冲液；
可选地，所述糖包括海藻糖；
可选地，所述缓冲液包括Tris缓冲液；可选地，所述Tris缓冲液包括0.008M-0.012M的Tris缓冲液；
可选地，所述稀释液包括3wt％-7wt％海藻糖以及0.008M-0.012M的Tris缓冲液；
可选地，所述标记抗体-荧光微球复合物在所述工作液3中的浓度为0.08％-0.12％(w/v)。
14.根据权利要求11所述的检测试纸条，其特征在于，所述缓冲区和所述标记区之间设有干扰物分离区，所述干扰物分离区包被嗜异性抗体特异性结合蛋白；
可选地，所述干扰物分离区的数量为多个；
可选地，所述干扰物分离区设于所述层析垫；
可选地，所述嗜异性抗体特异性结合蛋白包括抗IgG抗体或/和抗IgM抗体；
可选地，所述干扰物分离区经工作液4处理，所述工作液4包括嗜异性抗体特异性结合蛋白以及权利要求13中定义的稀释液；
可选地，所述嗜异性抗体特异性结合蛋白在所述工作液4中的浓度为1.5mg/mL-2.5mg/mL。
15.根据权利要求1至4、6、8、9、11至14中任一项所述的检测试纸条，其特征在于，所述检测线经工作液5处理，所述工作液5包括所述包被抗体以及权利要求13中定义的稀释液；可选地，所述工作液5中所述包被抗体的浓度为0.5mg/mL-1.5mg/mL。
16.根据权利要求1至4、6、8、9、11至14中任一项所述的检测试纸条，其特征在于，所述质控线经工作液6处理，所述工作液6包括所述质控蛋白以及权利要求13中定义的稀释液；可选地，所述质控蛋白在所述工作液6中的浓度为0.3mg/mL-1mg/mL。
17.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括试纸卡，所述试纸卡包括壳体以及安装在所述壳体中的权利要求1至16中任一项所述的检测试纸条；
所述壳体上设有加样孔和检测窗口；
所述加样孔和所述检测试纸条的缓冲区和缓冲-标记复合区对应，用于滴加待测样品；
所述检测窗口和所述检测区对应，用于观察所述检测区的检测结果。
18.权利要求1至16中任一项所述的检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将所述的免疫层析功能区和底板组装成检测试纸条的步骤。
19.一种样品中目标抗原的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用权利要求1至16任一项所述的检测试纸条或者权利要求17所述的检测试剂盒检测待测样品中的目标抗原的步骤。
20.根据权利要求19所述的样品中目标抗原的检测方法，其特征在于，所述待测样品包括血样；可选地，所述血样包括全血。
CN202311850778.7A 2023-12-28 2023-12-28 Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用 Pending CN117969822A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311850778.7A CN117969822A (zh) 2023-12-28 2023-12-28 Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311850778.7A CN117969822A (zh) 2023-12-28 2023-12-28 Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117969822A true CN117969822A (zh) 2024-05-03

Family

ID=90850370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311850778.7A Pending CN117969822A (zh) 2023-12-28 2023-12-28 Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117969822A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101678703B1 (ko) 갈렉틴-３ 면역검정
US9128099B2 (en) Determination of sFlt-1:angiogenic factor complex
CN103954778A (zh) 心肌梗塞三联快速检测试剂盒及其制备方法
CN105699659A (zh) 一种多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒
CN104838271B (zh) 心力衰竭疗法的选择中的生物标记物
AU2006214632A1 (en) Stabilized compositions containing natriuretic peptides
CA2601147A1 (en) Biochemical markers for acute pulmonary embolism
US20050014198A1 (en) Assays and kits for detecting and monitoring heart disease
US20080293161A1 (en) Detection of Carbohydrate Biomarkers
CN117969822A (zh) Galectin-3、NT-ProBNP、ST2检测试剂盒及其制备和应用
CN110346570A (zh) 检测糖尿病肾病生物标志物的胶体金试剂盒及方法
EP2126565B1 (en) Method for the assessment of the inhibitory activity of antibodies against insulin-like growth factor i receptor
CN107076760A (zh) 用于评估先兆子痫的生物标志物
JP2010528306A (ja) 心筋梗塞の早期予測因子としてのｈ−ｆａｂｐ
US20110081671A1 (en) Vascular markers in the remodeling of cardiac injury
Ikemoto et al. Development of enzyme-linked immunosorbent assay for acidic fibroblast growth factor and its clinical application
WO2023061388A1 (zh) 半乳糖凝集素-3的免疫测定
Ylätupa et al. Competitive enzyme immunoassay for quantification of the cellular form of fibronectin (EDAcFN) in blood samples
EP2015075A1 (en) Method for the prediction of the likelihood of a major adverse coronary event (MACE) in a patient with acute coronary syndromes (ACS)
Pellicciotta et al. Development of a novel multiplexed assay for quantification of transforming growth factor-b (TGF-b)
JPH10111290A (ja) ＩｇＡ腎症の診断法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination