CN106855577B - 一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测uPA及PAI‑1的试剂盒，该试剂盒包括检测反应载体、uPA标准品、PAI‑1标准品，所述的检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述的试纸条由PVC底板、及位于PVC底板表面的从点样端开始依次为样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。采用本发明提供的试剂盒可同时定量测定样本中的uPA和PAI‑1，通过一次加样操作就能对两者的含量进行测定，大大简化了操作过程，具有较高的检测灵敏度，对uPA检测的最低限度为0.01ng/ml，对PAI‑1检测的最低限度为0.1ng/ml，且对两者的检测没有交叉反应，互不干扰，特异性高，可快速评估肿瘤患者的预后症状。

Description

一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒
技术领域
本发明属于医学生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤严重地威胁着广大人民群众的生命安全及身心健康。早期检测被广泛认为是降低癌症死亡率的最好方法。目前临床应用多种殊检查以期望提高肿瘤的早期诊断率，包括x线检查、超声检查、CT检查、磁共振检查、内腔镜检查等。这些检查手段能够从不同角度、不同侧面对肿瘤进行诊断，各有其局限性。肿瘤标志物的出现使人们对肿瘤的早期诊断寄予了极大希望。肿瘤标志物的检测对肿瘤辅助诊断及判断肿瘤预后、转归、评价疗效，都具有重要的意义。
尿激酶纤溶酶原激活剂系统是由尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)及其特异性受体(uPAR)和抑制剂(PAIs，主要为PAI-1)组成。尿激酶纤溶酶原激活剂系统不仅激活纤溶酶，在细胞外基质和基底膜降解中起重要作用，并促进血管形成。在细胞迁移和侵袭过程中，uPA及PAI-1能激活多种蛋白溶解酶，降解细胞外基质、基底膜，促进肿瘤浸润、转移。研究表明，uPA、PAI-1表达与乳腺癌、胃癌等多种肿瘤侵袭、转移有关，国内外相关研究表明，uPA和PAI-1在乳腺癌组织中的表达水平均高于癌旁组织或乳腺良性肿瘤或正常乳腺组织。在美国临床肿瘤学会乳腺癌肿瘤标志物应用指南更新版(2007年)中，uPA和PAI-1已列入乳腺癌患者的预后指标。
uPA是一种丝氨酸蛋白酶，由多种肿瘤细胞或其他细胞分泌，其与细胞膜上特异性受体uPAR结合，激活纤溶酶原成为纤溶酶，主要对细胞外基质(ECM)蛋白与基膜水解起作用。另外，uPA还激活潜在活性的胶原酶，与纤溶酶一起均促使细胞外基质(包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和Ⅳ型胶原等)和血管基膜的降解，最终导致肿瘤细胞的浸润和转移。除组织中的浓度外，uPA的酶活性受PAIs的调控。
PAIs属丝氨酸蛋白酶抑制因子家族，已知有PAI-1、PAI-2和PAI-3三种。PAI-1是一种相对分子质量为52×103的糖蛋白，是正常人血浆中uPA的主要抑制剂。PAI-1能够促进uPA-uPAR的细胞内吞、降解，避免ECM的过度降解，还可以干扰uPAR与细胞表面黏附因子、ECM成分的结合，使细胞黏附力降低，促进肿瘤细胞迁移。目前有关PAI-1在肿瘤生物学中的确切作用还不清楚，其在纤溶酶原激活系统中可能担当重要的调节剂或者是肿瘤细胞防止自身降解的保护剂，而不是这个系统单纯的抑制剂。也有学者认为，PAI-1在肿瘤浸润转移中与uPA有协同和调节作用。
多项研究发现，uPA、PAI-1在多种肿瘤组织中表达，如乳癌、胃癌、子宫内膜癌等，两者的高表达可促进肿瘤的浸润和转移，uPA和PAI-1的表达增加提示癌症患者具有高的复发率，是恶性肿瘤的不良预后因素。现有技术多采用免疫组化方法或ELISA法检测肿瘤组织或患者血清中uPA、PAI-1的表达，采用免疫组化方法只能对uPA、PAI-1进行定性或半定量测定，因此，不能得到uPA、PAI-1定量检测结果以实现对病情的诊断或治疗情况进行监测。采用ELISA试剂盒虽然可以对uPA或PAI-1进行定量测定，但重复性较差，精密度较低，操作过程繁琐，受人为操作因素影响很大，不利于高通量的全自动检测，特异性和灵敏性有待提高。因此，有必要开发一种操作简单，兼具高的检测灵敏性和特异性，且能同时检测uPA、PAI-1的试剂盒，以满足市场的需求。
免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的一种新型膜检测技术。层析过程中，以结合了标记物的待测液为流动相，通过毛细管作用，在固相膜上与受体发生特异性反应从而富集，根据肉眼可见的标记物(如胶体金、胶体硒等)或酶反应的显色条带来定性检测或定量检测。目前没有关于利用免疫层析技术同时检测uPA、PAI-1的相关研究报道。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于一种操作简单，兼具高的检测灵敏性和特异性，且能同时检测uPA、PAI-1的试剂盒，以满足市场的需求。
本发明另外一个目的在于提供一种所述检测uPA、PAI-1的试剂盒的使用方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒，其包括检测反应载体、uPA标准品、PAI-1标准品，所述的检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述的试纸条由PVC底板、及位于PVC底板表面的从点样端开始依次为样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。
进一步地，所述的荧光标记物结合垫的膜材料为玻璃纤维纸，所述的玻璃纤维纸上包被荧光乳胶标记稳定液，所述的硝酸纤维膜上离加样端较近的一侧依次有uPA检测线、PAI-1检测线、质控线，所述的uPA检测线上包被有uPA抗体，PAI-1检测线上包被有PAI-1抗体，质控线上包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
进一步地，所述的荧光乳胶标记稳定液为含2～6％(w/v)3-(N-吗啉)丙磺酸、1～2％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.5～1％(w/v)海藻酸钠、1～2％(w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液。
优选地，所述的荧光乳胶标记稳定液为含6％(w/v)3-(N-吗啉)丙磺酸、1.5％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.5％(w/v)海藻酸钠、2％(w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液。
其中，上述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液为荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体溶液与荧光乳胶颗粒标记的PAI-1抗体溶液以的1:1的体积比混合。
进一步地，所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体均为鼠源的单克隆抗体。
本发明提供的试剂盒主要依赖抗体抗原特异性结合反应，采用双抗夹心免疫层析和荧光乳胶免疫层析技术来捕获并分离目标物质，具体为：1)当样品中同时存在uPA和PAI-1抗原时，每种抗原首先与荧光乳胶颗粒标记的对应的单抗结合，形成抗原-荧光乳胶标记抗体复合物，通过毛细管作用，层析到检测线处，所述的抗原-荧光乳胶标记抗体复合物与层析线上另一种uPA抗体或PAI-1抗体结合，形成抗体-抗原-荧光乳胶标记抗体的双抗夹心复合物，在uPA检测线和PAI-1检测线均产生红色的条带，未与检测线上抗体结合的荧光乳胶标记抗体继续向上层析，到达质控线，质控线上的羊抗鼠免疫球蛋白IgG会与荧光乳胶标记抗体结合，产生红色条带，判定为阳性结果；2)当样品中只存在uPA或PAI-1抗原时，只产生一条红色的条带(uPA检测线或和PAI-1检测线上)，质控线出现红色条带；3)当样品中不存在uPA和PAI-1抗原时，则检测线处不出现红色条带，只在质控线处出现红色条带，判定为阴性结果；4)当检测线处出现红色条带，但质控线上不出现红色条带，判定结果无效，需重新试验。
本发明还提供一种所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体溶液的制备，其包括以下步骤：
(1)将荧光乳胶微球体溶液在20000rpm离心10min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1012个/mL，在100W超声波中分散30s，得乳胶微球分散液；
(2)往乳胶微球分散液中依次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，震荡混合均匀，置于恒温摇床进行反应30min，然后在10000rpm离心15min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液复溶，调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1010个/mL，即得活化乳胶溶液；
(3)往活化乳胶溶液中加入uPA抗体或PAI-1抗体，震荡混合均匀，置于水平摇床上在室温下进行反应2h，然后在10000rpm下离心洗涤3次，每次10min，往沉淀中加入硼酸盐缓冲溶液稀释至离心前体积，即得荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体溶液，其中，所述的硼酸盐缓冲溶液为含1％(w/v)蔗糖、2％(w/v)BSA，pH7.4，浓度为0.01mol/L的硼酸盐缓冲溶液。
进一步地，所述步骤(2)中1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺在乳胶微球分散液中的终浓度为4～6mg/mL，N-羟基硫代琥珀酰亚胺在乳胶微球分散液中的终浓度为2～4mg/mL；
所述步骤(3)中uPA抗体或PAI-1抗体的浓度为0.3～0.5mg/mL，所述uPA抗体或PAI-1抗体的加入的体积与活化乳胶溶液的体积比为1:5。
进一步地，所述的荧光乳胶微球为疏水性有机染料荧光物质与丙烯酸酯类单体聚合而成，所述荧光乳胶微球的粒径为100～150nm。
上述的疏水性有机染料荧光物质选自罗丹明系列染料、香豆素染料、氟硼类染料、方酸类染料、花菁类染料中的一种或多种。
丙烯酸酯类单体选自丙烯酸丁酯单体、甲基丙烯酸甲酯单体、甲基丙烯酸羟乙酯单体、丙烯酸单体、丙烯酸羟乙酯单体、甲基丙烯酸氨乙酯单体的一种或多种。
本发明所述的荧光乳胶微球可以为市售产品，也可以为自制产品，其制备方法为：将丙烯酸酯类单体、疏水性有机染料荧光物质、超纯水混合、搅拌、加热，在过硫酸盐的作用下发生无皂乳化聚合，得到反应产物，再将反应产物过滤、离心去上清，洗涤沉淀物，即得荧光乳胶颗粒，具体操作可参考公开号为CN 102174144 B的中国专利申请“一种荧光乳胶颗粒及其制备方法”。
进一步地，所述的样品垫和荧光标记物结合垫均经过预处理，其中，样品垫预处理使用的预处理缓冲液为含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐温-20且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液；
荧光标记物结合垫预处理使用的预处理缓冲液为含2％(w/v)BSA、0.05～0.15％(w/v)六偏磷酸钠、0.1～0.4％(w/v)柠檬酸钠、0.1％(v/v)吐温-20、且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
优选地，所述的所述的荧光标记物结合垫预处理使用的预处理缓冲液为含2％(w/v)BSA、0.1％(w/v)六偏磷酸钠、0.25％(w/v)柠檬酸钠、0.1％(v/v)吐温-20、且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
本发明所述的检测反应载体的制备与胶体金测试卡、检测试纸的制备类似，包括以下步骤：
(1)样品垫和结合垫预处理：将样品垫或结合垫置于预处理液中浸泡2h，取出，在37℃条件下烘干；
(2)将荧光乳胶标记稳定液喷涂于经预处理后的结合垫，喷涂量为4μl/cm，37℃条件下烘干，制成荧光标记物结合垫；
(3)在硝酸纤维膜上的uPA检测线、PAI-1检测线、质控线上分别喷涂uPA抗体溶液、PAI-1抗体溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液，所述的uPA抗体溶液、PAI-1抗体溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液的浓度均为1mg/ml，喷涂量均为1μl/cm；uPA检测线、PAI-1检测线和质控线中两线间隔5mm，37℃条件下烘干30min，然后置于封闭液中浸泡60min，取出烘干处理60min；
(4)将样本垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜和吸水纸依次组装在PVC底板上，即得。
其中，上述步骤(3)中的uPA抗体和PAI-1抗体均为鼠抗人单克隆抗体，购自Abcam，用PBS缓冲溶液稀释至1mg/ml；羊抗鼠免疫球蛋白IgG，购自Abnova，用PBS缓冲溶液稀释至1mg/ml。
本发明试剂盒中荧光标记物结合垫的膜材料玻璃纤维纸和硝酸纤维膜均购自Millipore，孔径均为5μm。
此外，本发明提供的试剂盒中还包括uPA标准品、PAI-1标准品，所述的uPA标准品制备为：使用含0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA，pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液将uPA抗原配制成浓度分别为100、300、600、1200、2400、5000pg/ml的标准液，即得。
所述的PAI-1标准品制备为：使用含0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA，pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液将PAI-1抗原配制成浓度分别为5、25、50、100、125、150ng/ml的标准液，即得。
本发明提供的试剂盒除了可对uPA、PAI-1进行定性检测外，还可进行定量检测，分别将不同梯度浓度的uPA标准品、PAI-1标准品滴加到样品垫上，每个浓度设置5个重复，膜层析10min后，使用免疫分析仪器通过采集检测线(T)和质控线(C)上条带的荧光信号，计算T/C信号值，以T/C信号值为纵坐标，对应标准品浓度为横坐标，分别建立uPA和PAI-1的定标曲线。通过检测待测样品uPA和PAI-1的T/C信号值，代入定标曲线，即可求得待测样品中uPA和PAI-1的量。
本发明试剂盒中未提及的试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可以按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。本发明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行，所用检测仪器设备，如免疫分析仪器的使用均按说明书操作进行。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)与传统检测肿瘤标志物的ELISA试剂盒比较，本发明提供的试剂盒可同时定量测定样本中的uPA和PAI-1，通过一次加样操作就能对两者的含量进行测定，大大简化了操作过程，具有较高的检测灵敏度，对uPA检测的最低限度为0.01ng/ml，对PAI-1检测的最低限度为0.1ng/ml，且对两者的检测没有交叉反应，互不干扰，特异性高，可快速评估肿瘤患者的预后症状。
(2)本发明提供的试剂盒结合了双抗夹心免疫层析和荧光乳胶免疫层析技术来捕获并分离uPA和PAI-1，利用抗原-荧光乳胶标记抗体复合物不断地通过膜上的捕获带，不仅对待测物具有浓缩作用，而且也是标记物被自动分离，不需要额外的洗涤步骤，减少了污机会。
(3)本发明提供的试剂盒以疏水性有机染料荧光物质与丙烯酸酯类单体聚合而成的荧光乳胶微球为载体标记相应的抗体，进行荧光检测，大大提高了检测的特异性和灵敏度，比一般的胶体金标记抗体灵敏度提高10～100倍，可有效排除背景颜色的干扰，使结果易于判断。
(4)采用本发明提供的预处理液对荧光结合垫进行预处理，使得试剂盒具有更佳的显色效果，提高检测的灵敏度，同时可大大降低血清样本中其他物质的干扰，提高检测的准确度。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1荧光乳胶颗粒的制备
制备方法：
取10g甲基丙烯酸甲酯、0.02g罗丹明B、0.01g 2-甲基烯丙基磺酸钠和100ml的超纯水置于反应釜中，搅拌加热，搅拌速度为200rpm，并通入氮气，当体系升温至70℃，加入4ml过硫酸钾，保温进行反应120min，反应结束后冷却，使用注射器式滤器调整反应产物的粒径至100nm，然后将反应产物过滤、离心去上清，沉淀物洗涤3次，即得荧光乳胶颗粒，
实施例2荧光乳胶颗粒标记抗体的制备
1.荧光乳胶颗粒标记uPA抗体的制备
制备方法：
(1)将荧光乳胶微球体溶液在20000rpm离心10min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1012个/mL，在100W超声波中分散30s，得乳胶微球分散液；
(2)往乳胶微球分散液中依次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺在乳胶微球分散液中的终浓度为6mg/mL，N-羟基硫代琥珀酰亚胺在乳胶微球分散液中的终浓度为4mg/mL，震荡混合均匀，置于恒温摇床进行反应30min，然后在10000rpm离心15min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液复溶，调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1010个/mL，即得活化乳胶溶液；
(3)往活化乳胶溶液中加入浓度为0.5mg/mL uPA抗体，uPA抗体加入的体积与活化乳胶溶液的体积比为1:5，震荡混合均匀，置于水平摇床上在室温下进行反应2h，然后在10000rpm下离心洗涤3次，每次10min，往沉淀中加入硼酸盐缓冲溶液稀释至离心前体积，即得荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体溶液，其中，所述的硼酸盐缓冲溶液为含1％(w/v)蔗糖、2％(w/v)BSA，pH7.4，浓度为0.01mol/L的硼酸盐缓冲溶液。
2.荧光乳胶颗粒标记PAI-1抗体的制备
制备方法同上述荧光乳胶颗粒标记uPA抗体的制备。
实施例3本发明检测试剂盒的制备
1.样品准备：
(1)荧光乳胶标记稳定液的制备：以配制100mL的荧光乳胶标记稳定液为例，具体为如下：
分别取实施例2制得的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体溶液和荧光乳胶颗粒标记的PAI-1抗体溶液各50mL，混合均匀，加入6g 3-(N-吗啉)丙磺酸、1.5g十二烷基磺酸钠、0.5g海藻酸钠、2g甘氨酸，混合均匀，即得荧光乳胶标记稳定液。
(2)uPA抗体溶液或PAI-1抗体溶液或羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液的制备：取1mg的uPA抗体或PAI-1抗体或羊抗鼠免疫球蛋白IgG，加入1mlPBS缓冲溶液，溶解，即得。
(3)样品垫预处理液的制备：以配制100mL的预处理液为例，具体为如下：
①取0.599g磷酸二氢钠溶于100ml水中，制成浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液，另取0.710g磷酸氢二钠溶于100ml水中，制成浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液，分别取0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液28ml，0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液72ml，混合，制得浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
②取2g BSA、0.1ml吐温-20，加入100ml浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌均匀即得。
(4)结合垫预处理液的制备：以配制100mL的预处理液为例，具体为如下：
取2g BSA、0.1g六偏磷酸钠、0.25g柠檬酸钠、0.1ml吐温-20，加入100ml浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌均匀即得。
2.检测反应载体的制备：
(1)样品垫和结合垫预处理：将样品垫或结合垫置于预处理液中浸泡2h，取出，在37℃条件下烘干；
(2)将荧光乳胶标记稳定液喷涂于经预处理后的结合垫，喷涂量为4μl/cm，37℃条件下烘干，制成荧光标记物结合垫；
(3)在硝酸纤维膜上的uPA检测线、PAI-1检测线、质控线上分别喷涂uPA抗体溶液、PAI-1抗体溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液，所述的uPA抗体溶液、PAI-1抗体溶液、羊抗鼠免疫球蛋白IgG溶液的浓度均为1mg/ml，喷涂量均为1μl/cm；uPA检测线、PAI-1检测线和质控线中两线间隔5mm，37℃条件下烘干30min，然后置于封闭液中浸泡60min，取出烘干处理60min；
(4)将样本垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜和吸水纸依次组装在PVC底板上，即得。
3.uPA标准品、PAI-1标准品的制备：
(1)uPA标准品制备为：使用含0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA，pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液将uPA抗原配制成浓度分别为100、300、600、1200、2400、5000pg/ml的标准液，即得。
(2)PAI-1标准品制备为：使用含0.1mol/L氯化钠、2％(w/v)BSA，pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液将PAI-1抗原配制成浓度分别为5、25、50、100、125、150ng/ml的标准液，即得。
实施例4本发明检测试剂盒的使用
(1)确认血清待测样品(或标准品)和试剂盒各组分已至室温。
(2)往样本垫中加入40μl血清待测样品(或标准品)，膜层析10min以后，置于免疫分析仪器中在470nm的激发光、525nm发射光下，采集uPA或PAI-1检测线(T)和质控线(C)上条带的荧光信号，计算T/C信号值，以T/C信号值为纵坐标，对应标准品浓度为横坐标，分别建立uPA和PAI-1的定标曲线。通过检测待测样品uPA和PAI-1的T/C信号值，代入定标曲线，即可求得待测样品中uPA和PAI-1的量。
实施例5本发明检测试剂盒的方法学检定
按照本领域中常规的制造和检定规程对实施例中制备成的检测试剂盒进行检定，结果如下：
①分析灵敏度
以不同浓度的uPA标准溶液和PAI-1标准溶液进行检测，其中，当uPA标准溶液浓度为0.01ng/ml时，当PAI-1标准溶液浓度为0.1ng/ml时，uPA检测线和PAI-1检测线开始有显色，与阴性结果有明显区别；分别对0.01ng/ml uPA标准溶液和0.1ng/ml PAI-1标准溶液进行重复测定10次，每次测定线均显色，且显色深浅基本一致，故本发明试剂盒中的检测试纸条对uPA抗原测定的最低检出限为0.01ng/ml，对PAI-1抗原测定的最低检出限为0.1ng/ml。
②线性关系
以uPA标准液浓度的对数或PAI-1标准液浓度的对数为横坐标，对应检测的T/C信号值的对数为纵坐标，由双对数数学模型Log-Log函数处理，测得uPA剂量-反应曲线的相关系数为r＝0.9986，表明自制试剂盒在uPA浓度为100-5000pg/ml的范围内具有良好的剂量反应线性关系；测得PAI-1剂量-反应曲线的相关系数为r＝0.9992，表明自制试剂盒在PAI-1浓度为5-150ng/ml的范围内具有良好的剂量反应线性关系。
③精密度
分别对浓度为300、1200、5000pg/ml的uPA标准液和浓度为25、100、150ng/ml的PAI-1标准液进行测定，每个浓度各设10个复孔。分别对同一批次和不同批次的试剂盒中上述3个浓度的uPA标准液和PAI-1标准液进行重复测定10次。并计算测量值的平均值和标准差，按照公式计算变异系数CV＝标准差/平均值╳100％，结果显示，采用本发明试剂盒中的检测试纸条检测uPA的批内变异系数(CV％)为2.2～3.0％，批间变异系数(CV％)为3.8～5.2％，采用本发明试剂盒中的检测试纸条检测PAI-1的批内变异系数(CV％)为1.6～2.8％，批间变异系数(CV％)为2.7～4.0％，符合试剂盒检定规程要求，精密度良好。
④特异性
分别以肿瘤标志性抗原CA 125 100ng/ml、CA 15-3 100ng/ml、血红蛋白50ng/ml和人血白蛋白200ng/ml作为待测样品，用本发明检测试纸条测定，每个浓度重复测定3次，结果均显示为阴性，表明本发明检测试纸条与其他蛋白没有交叉反应，检测的特异性高。
⑤稳定性
将检测试纸条密封分别置于4℃、37℃存放0天、3天、5天和7天，在不同的处理时间之后分别测定uPA和PAI-1标准品，结果显示，各时间点的试剂盒信号值变化不大，线性关系良好，表明本发明检测试剂盒具有良好的热稳定性。
对比例1检测试剂盒的制备
对比例1检测试剂盒的制备与实施例3检测试剂盒的制备基本相同，区别在于，将实施例2制得的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体溶液和荧光乳胶颗粒标记的PAI-1抗体溶液以等体积混合后，直接喷涂于经预处理后的结合垫，喷涂量为4μl/cm，37℃条件下烘干，制成荧光标记物结合垫。
对比例2检测试剂盒的制备
对比例2检测试剂盒的制备与实施例3检测试剂盒的制备基本相同，区别在于，所述的结合垫不进行预处理，直接将荧光乳胶标记稳定液喷涂于结合垫，喷涂量为4μl/cm，37℃条件下烘干，制成荧光标记物结合垫；
实施例6采用对比例1、2和实施例3制得检测试剂盒对食管癌患者血清中uPA和PAI-1检测比较
对比例1、2检测试剂盒的使用方法参考实施例4具体的步骤。
分别采用对比例1、2试剂盒和实施例3试剂盒同时对食管癌病人血清样本40份进行检测，结果见下表。
由对比例1和实施例1可知，采用荧光乳胶标记稳定液而非荧光乳胶颗粒标记抗体混合液，喷涂于经预处理后的结合垫，可显著提高检测试纸条检测的灵敏度，对uPA和PAI-1的最低检测限均可提高10倍，并降低批内、批间变异系数，提高检测的精密度。
由对比例2和实施例1可知，将结合垫预先进行预处理，可使试剂盒具有更佳的显色效果，大大提高检测的灵敏度和精密度。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测反应载体、uPA标准品、PAI-1标准品，所述的检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述的试纸条由PVC底板、及位于PVC底板表面的从点样端开始依次为样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成；
其中，所述的荧光标记物结合垫的膜材料为玻璃纤维纸，所述的玻璃纤维纸上包被荧光乳胶标记稳定液，所述的硝酸纤维膜上离加样端较近的一侧依次有uPA检测线、PAI-1检测线、质控线，所述的uPA检测线上包被有uPA抗体，PAI-1检测线上包被有PAI-1抗体，质控线上包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG；
所述的荧光乳胶标记稳定液为含2~6%(w/v) 3-(N-吗啉)丙磺酸、1~2% (w/v) 十二烷基磺酸钠、0.5~1% (w/v)海藻酸钠、1~2% (w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液；
所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液为荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体溶液与荧光乳胶颗粒标记的PAI-1抗体溶液以的1:1的体积比混合；
所述的样品垫和荧光标记物结合垫均经过预处理，所述样品垫预处理使用的预处理缓冲液为含2% (w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐温-20且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液；
所述的荧光标记物结合垫预处理使用的预处理缓冲液为含2% (w/v) BSA、0.05~0.15%(w/v)六偏磷酸钠、0.1~0.4% (w/v)柠檬酸钠、0.1% (v/v) 吐温-20、且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液；
所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体溶液的制备包括以下步骤：
（1）将荧光乳胶微球体溶液在20000rpm离心10min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1012个/mL，在100W超声波中分散30s，得乳胶微球分散液；
（2）往乳胶微球分散液中依次加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，震荡混合均匀，置于恒温摇床进行反应30min，然后在10000rpm离心15min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液复溶，调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1010个/mL，即得活化乳胶溶液；
（3）往活化乳胶溶液中加入uPA抗体或PAI-1抗体，震荡混合均匀，置于水平摇床上在室温下进行反应2h，然后在10000rpm下离心洗涤3次，每次10min，往沉淀中加入硼酸盐缓冲溶液稀释至离心前体积，即得荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体溶液，其中，所述的硼酸盐缓冲溶液为含1% (w/v)蔗糖、2% (w/v)BSA，pH7.4，浓度为0.01 mol/L的硼酸盐缓冲溶液；
所述的荧光乳胶微球为疏水性有机染料荧光物质与丙烯酸酯类单体聚合而成，所述荧光乳胶微球的粒径为100~150nm；
所述步骤（2）中1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺在乳胶微球分散液中的终浓度为4~6mg/mL，N-羟基硫代琥珀酰亚胺在乳胶微球分散液中的终浓度为2~4mg/mL；
所述步骤（3）中uPA抗体或PAI-1抗体的浓度为0.3~0.5mg/mL，所述uPA抗体或PAI-1抗体的加入的体积与活化乳胶溶液的体积比为1:5。
2. 根据权利要求1所述的检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的荧光乳胶标记稳定液为含6%(w/v) 3-(N-吗啉)丙磺酸、1.5% (w/v) 十二烷基磺酸钠、0.5% (w/v)海藻酸钠、2% (w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液。
3. 根据权利要求1所述的检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的所述的荧光标记物结合垫预处理使用的预处理缓冲液为含2% (w/v) BSA、0.1% (w/v)六偏磷酸钠、0.25% (w/v)柠檬酸钠、0.1% (v/v) 吐温-20、且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
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