CN114249909A - 具有表面拓扑结构的微纳米磁性聚合物微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微纳米磁性聚合物微球，包括磁性纳米粒子和包覆磁性纳米粒子的聚合物，所述磁性聚合物微球具有拓扑表面，粒径为100nm～100μm；所述微球不具有通孔结构，其比表面积是具有与微球相同的粒径尺寸的光滑球形颗粒比表面积的2至100倍；所述微纳米磁性聚合物微球经过表面功能化修饰之后，可以提高检测物的分离效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的微纳米磁性聚合物微球，具体而言，该聚合物微球具有复杂的表面拓扑结构，可广泛用于生物样品的检测与分离领域。
背景技术
免疫磁珠是生命与健康领域中检测分离的核心材料，是实现对核酸、病毒、细菌、细胞等重大疾病标识物高效分离与精准检测的关键。就循环肿瘤细胞的分离检测而言，免疫磁珠法是唯一一个被美国食药监局(FDA)和中国国家药品监督管理局(NMPA)批准的临床诊断技术。
目前磁性微球的制备，常见的方法主要有：(1)将磁性纳米粒子表面直接包裹聚合物功能化外壳，形成核壳结构的磁性微球；(2)将磁性纳米粒子和聚合物单体，引发剂等混合，通过聚合反应，形成磁性纳米粒子均匀分布在内部的磁性微球；(3)先制备聚合物微球，再在其表面负载磁性纳米粒子。依照目前的制备方法，在聚合物微球形成过程中，由于表面张力的限制，所制备的磁性微球多为表面光滑的颗粒。该种表面光滑的磁性微球的比表面积很有限，可以结合的生物功能化结合剂数目较少，并且也无法与例如肿瘤细胞表面的伪足等目标微纳米结构形成良好的拓扑相互作用，因此对于目标的分离效率较低。并且目前有的制备方法中，磁性粒子负载或包覆与形成微球需要分步进行，因此制备工艺复杂，控制手段也具有局限性。另外一些方法虽然直接聚合形成磁性微球，但是在含有磁性纳米粒子的前提下进行聚合反应，微球本身的控制难度增大，聚合条件不易掌握。
发明内容
本发明的目标在于发展新一代表面具有微纳米拓扑结构的免疫磁珠，突破目前免疫磁珠仅通过化学作用实现分离检测的限制，通过免疫磁珠表面的微纳米结构，增强其与分离对象间的拓扑相互作用，实现拓扑结构匹配和分子识别协同的高效的生物分离，为后续的临床诊断、治疗等提供技术支持。
本发明提供一种具有丰富表面拓扑结构的磁性聚合物微球，该磁性聚合物微球经过表面功能化修饰之后，可以与检测物(例如肿瘤细胞等)之间进行拓扑匹配和分子识别的协同作用，从而提高检测物的分离效率。并且该方法制备工艺简单，可控性强。通过简单调控聚合物的分子量、浓度、亲疏水链段比例、反应温度等，即可实现对所得磁性微球大小、表面微纳米形貌等的控制，并且有望实现大规模制备。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种微纳米磁性聚合物微球，其特征在于，所述微纳米磁性聚合物微球包括磁性纳米粒子和包覆磁性纳米粒子的聚合物，所述微纳米磁性聚合物微球具有拓扑表面，粒径为100nm～100μm；
所述拓扑表面是指聚合物微球具有连续、丰富的粗糙起伏表面形貌结构，能够与检测物形成拓扑结构匹配；
所述微球不具有通孔结构，其比表面积是具有与微球相同的粒径尺寸的光滑球形颗粒比表面积的2至100倍；
其拓扑表面可以列举为：褶皱结构、短毛刺结构、长毛刺结构、花状结构、海胆状结构或表面带有小球的核-卫星状结构，其中优选为毛刺结构；
在其中一个优选方案中，所述微球表面具有2根以上的毛刺结构，优选具有5根以上的毛刺结构，更优选具有10根以上毛刺结构，所述毛刺结构为微球表面的柱状、管状或棒状凸起，其中毛刺长短平均值在0.20μm以上，优选在0.5μm以上；横切面直径平均值在0.05μm以上；
在其中一个优选方案中，所述的聚合物为单一种类聚合物，非多种聚合物的共混。
其中聚合物为两亲性嵌段共聚物，具有疏水链段和亲水链段；疏水链段的分子量为5kDa～200kDa；亲水链段的分子量为500Da～100kDa；
疏水链段包括但不限于聚乙交酯/丙交酯共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚丙交酯(PGA)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚异丁烯(PIB)、聚己内酯(PCL)中的一种或多种；
亲水链段包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚-4-乙烯基吡啶(P4VP)、聚丙烯酸(PAA)、聚(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)(PPEGMA)、聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)中的一种或多种；
在其中一种优选的方案中，所述两亲性嵌段共聚物为聚乙交酯/丙交酯共聚物(PLGA)-聚乙二醇(PEG)-聚乙交酯/丙交酯共聚物(PLGA)；
所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，磁性纳米粒子基于微纳米磁性聚合物微球总重量，其重量百分比为1％～90％；
本发明所述的微纳米磁性聚合物微球，通过如下方法进行制备：
将两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，加入磁性纳米粒子，将其乳化分散于含有表面活性剂的水溶液中，采用油水乳液溶剂挥发得到所述微纳米磁性聚合物微球；
其中，有机溶剂包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、三氯乙烷、碳酸二甲酯、二氧六环、四氯化碳、乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或多种；
两亲性嵌段共聚物在有机溶剂中的浓度为饱和浓度以下；进一步优选为1g/L～50g/L，特别优选为10g/L～30g/L；
在其中一种优选的方案中，磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，磁性纳米粒子基于微纳米磁性聚合物微球总重量，其重量百分比为1％～90％；进一步优选为3％～20％；特别优选为4％～15％；
在其中一种优选的方案中，乳化搅拌的具体条件为：温度在0～100℃，进一步优选为30～80℃；搅拌转速为500～20000rpm/min，进一步优选为1000～10000rpm/min；搅拌时长为0～4h，进一步优选为1～3h；
在其中一种优选的方案中，表面活性剂包括但不限于：聚乙烯醇(PVA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，浓度为饱和浓度以下，进一步优选为1g/L～50g/L；
在其中一种优选的方案中，具体采用如下方法制备微纳米磁性聚合物微球，如图1所示：
a)将一种两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，两亲性嵌段共聚物在有机溶剂中的浓度为饱和浓度以下，添加磁性纳米粒子，其重量百分比基于微纳米磁性聚合物微球总重量为1％～90％，搅拌分散；
b)将上述a)溶液加入表面活性剂浓度为饱和浓度以下的水溶液中，进行搅拌形成水包油的乳液，溶剂挥发得到微纳米磁性聚合物微球。其中乳化搅拌的具体条件为：温度在0～100℃，搅拌转速为500～20000rpm/min，搅拌时长为0～4h。
本发明进一步使用所述的微纳米磁性聚合物进行表面功能化修饰，其表面进行功能化修饰的结合剂包括但不限于，DNA、多肽、适配体、抗体中的一种或多种，其中优选为抗体。
在其中一种优选方案中，采用如下方法进行表面修饰：
a)用一定浓度的酸溶液对微纳米磁性聚合物微球进行水解；
b)将步骤a)的微球在配制好的EDC/NHS的MES溶液中浸泡；
c)将步骤b)得到的微球进一步接枝链霉亲和素SA；
d)将步骤c)得到的改性微球接枝生物素化的抗体。
本发明进一步还包括经功能化修饰的微纳米磁性聚合物，尤其是抗体修饰的微纳米磁性聚合物进行生物样品分离的用途，优选进行肿瘤细胞分离的用途。本发明的有益效果是：
根据本发明提供的微纳米磁性聚合物微球，其表面具有丰富的微纳米结构，由于表面结构丰富，相比于现有的免疫磁珠其比表面积增大，可以结合更多的功能化修饰物，例如可以修饰更多的抗体，同时，大量的表面纳米结构可以和检测物，典型的如肿瘤细胞的伪足之间形成良好的拓扑匹配，提高检测物的分离效率。
在制备过程中优选使用乳液溶剂挥发自组装法，通过该法，只需要简单的改变嵌段共聚物的比例，或者制备的温度等，即可实现对该微纳米磁性聚合物微球表面结构的调控，得到微纳米磁性聚合物微球表面可以为光滑，到较短的微纳米结构，到较长的微纳米结构。改变嵌段共聚物的浓度，即可实现对该微纳米磁性聚合物微球尺寸的控制。
同时该方法制备微纳米磁性聚合物微球，无需采用传统的负载/包覆磁性粒子-形成微球两步较为复杂的制备工艺，只需一步简单的乳液溶剂挥发，即可得到具有丰富表面结构的微纳米磁性聚合物微球，产量高，合成工艺简单，有望实现大规模的制备。
附图说明
图1:根据本发明制备微纳米磁性聚合物微球的示意图
图2:实施例1制备得到的微纳米磁性聚合物微球扫描电镜照片
图3:实施例2制备得到的微纳米磁性聚合物微球扫描电镜照片
图4:实施例3制备得到的微纳米磁性聚合物微球扫描电镜照片
图5:实施例4制备得到的微纳米磁性聚合物微球扫描电镜照片
图6:实施例8制备得到的微纳米磁性聚合物微球扫描电镜照片
图7:对比例1商业磁珠扫描电镜照片
图8:实验例1具有表面拓扑结构的微纳米磁性聚合物微球和商业磁珠对于肿瘤细胞分离的扫描电镜照片
图9:实验例1具有表面拓扑结构的微纳米磁性聚合物微球和商业磁珠对于肿瘤细胞分离的分离效率
图10:实验例2具有表面拓扑结构的微纳米磁性聚合物微球和商业磁珠对于少量肿瘤细胞分离的分离效率
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[两亲性嵌段共聚物]
本发明中使用两亲性嵌段共聚物制备得到聚合物微球，利用嵌段不同部分亲疏水性差异，其中亲水段倾向于形成微球的表面，亲油段形成微球的内部。具体可以举例为：
疏水链段选自聚乙交酯/丙交酯共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚丙交酯(PGA)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚异丁烯(PIB)、聚己内酯(PCL)中的一种或多种；
亲水链段选自聚乙二醇(PEG)、聚-4-乙烯基吡啶(P4VP)、聚丙烯酸(PAA)、聚(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)(PPEGMA)、聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)中的一种或多种；
为了得到理想的表面形貌，亲水链段的分子量控制在500Da～100kDa，疏水链段的分子量控制在5kDa～200kDa，改变嵌段共聚物中亲水链段的比例，可以改变微球表面的毛刺结构。随着亲水链段的增加，毛刺的长短先增加后减短，毛刺的粗细先增加后减短。
所选的有机溶剂能够溶解该两亲性的嵌段共聚物，与水互不相容，沸点低于水的沸点，在室温以上100℃以下能够挥发。具体可以列举为：二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、三氯乙烷、碳酸二甲酯、二氧六环、四氯化碳、乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、苯，甲苯，二甲苯，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，丙酮中的一种或多种。
[磁性纳米粒子]
磁性纳米粒子赋予微球磁性，用于后续目标物的分离，本发明中优选顺磁性四氧化三铁纳米粒子，其必须具有良好分散性，粒子之间不发生高度团聚，并且具有较高的结晶度以及在所选择的有机溶剂中具有良好的分散性，目前常见的制备方法有：不同金属盐的共沉淀，高温水热分解，溶胶凝胶法，多元醇还原，电化学方法，微乳液法。具体可以见参考文献：“Magnetic Iron Oxide Nanoparticles:Synthesis,Stabilization,Vectorization,Physicochemical Characterizations,and BiologicalApplications.Chem.Rev.2008,108,2064–2110.”
[微纳米磁性聚合物微球]
本发明所得到的微纳米磁性聚合物微球不仅在微球内部具有磁性纳米粒子，在微球表面具有2根以上的毛刺结构，优选具有5根以上的毛刺结构，更优选具有10根以上毛刺结构，所述毛刺结构为微球表面的柱状、管状或棒状凸起，其中毛刺长短平均值在0.20μm以上，优选在0.5μm以上；横切面直径平均值在0.05μm以上。
研究人员发现，在本发明中优选使用的乳液溶剂挥发自组装法中，对除了改变亲疏水链段的分子量与比例外，制备过程中的温度、搅拌速率对于毛刺的控制存在影响，具体为：
改变制备的温度：随着温度的升高，表面微纳米毛刺逐渐减短。
搅拌速率：搅拌速率主要影响微球的尺寸和溶剂挥发的时间，搅拌速率越大，形成的微球平均尺寸越小，搅拌速率大溶剂挥发速率更快，毛刺较短。
由此可以推测本发明控制机理为：
最初，将嵌段共聚物溶解在有机溶剂中时，聚合物在完全溶解的状态下，分子链在有机溶剂中是舒展的状态，杂乱无规排列。将溶解着嵌段共聚物的有机溶剂乳化于含有表面活性剂的水溶液中，油滴在表面活性剂的稳定作用下呈光滑球状。随着低沸点的有机溶剂从乳液液滴中挥发，油滴逐渐收缩，嵌段共聚物浓度增加，嵌段共聚物中的亲水链段倾向于向油水界面运动，分布在外，疏水的链段排布在内，更多的嵌段共聚物吸附在油/水界面上。亲疏水嵌段和表面活性剂在该界面上的吸附协同导致如乳液液滴与水之间的界面张力降低，乳液液滴的界面不再保持光滑，而是变成波纹状，每个液滴表面都伸出纳米大小的粗糙结构。而当疏水聚合物选择为玻璃状聚合物时，当浓度增加到一定值时，就会变成固体状，形成毛刺结构。
据此，使用乳液溶剂挥发自组装法能够有效的对毛刺结构以及微球表面的粗糙形貌进行可控调节。
[功能化负载修饰]
微纳米磁性聚合物微球的功能化负载修饰，是通过表面修饰的方式引入其它功能分子使微纳米磁性聚合物微球具有更多功能。
通过表面功能化修饰，可以增强微球和分离目标之间的相互作用。其表面进行功能化修饰的结合剂包括但不限于，DNA、多肽、适配体、抗体中的一种或多种，其中优选为抗体，对微纳米磁性聚合物微球进行表面抗体修饰，除了引入抗原-抗体相互作用以外，微球可以与细胞之间形成良好的拓扑匹配，二者协同可以进一步增强对肿瘤细胞的分离。具体过程如下：
a)用一定浓度的酸溶液对微纳米磁性聚合物微球进行水解；
b)将步骤a)的微球在配制好的EDC/NHS的MES溶液中浸泡；
c)将步骤b)得到的微球进一步接枝链霉亲和素SA；
d)将步骤c)得到的改性微球接枝生物素化的抗体。
[肿瘤细胞识别与分离]
将表面修饰好抗体的微球和细胞悬液加入离心管中，在一定的时间和一定的比例下进行混合培养。肿瘤细胞表面过表达的抗原与微球表面修饰的抗体之间会特异性识别，二者之间产生抗原-抗体相互作用；同时细胞表面的伪足会紧紧缠绕并抓住微球表面的纳米结构，聚合物微球表面的微纳米结构和细胞表面的伪足之间产生拓扑相互作用。抗原-抗体的分子识别和结构之间的拓扑匹配，协同促进了细胞和微球之间的相互作用。这个作用强于光滑的磁珠和细胞之间单一的分子识别作用。
当微球和细胞作用一段时间，利用磁装置分离捕获到肿瘤细胞的磁性微球，进行细胞分离。将捕获到的肿瘤细胞分散在新的培养基中，进行细胞计数，计算分离效率。
以下通过具体实施例和对比例来阐明本申请的实施过程，并充分评价实施效果。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1：
具有表面毛刺结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.3g PLGA50k-PEG4k-PLGA50k(山东岱罡生物科技有限公司产品)溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
经SEM表征所合成的磁性聚合物微球表面具有毛刺结构。结果如图2所示。
实施例2
具有表面毛刺结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA50k-PEG4k-PLGA50k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
经SEM表征所合成的磁性聚合物微球表面具有毛刺结构。结果如图3所示。
实施例3
具有表面毛刺结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA50k-PEG4k-PLGA50k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在30℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在30℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
经SEM表征所合成的磁性聚合物微球表面具有毛刺结构，结果如图4所示。
实施例4
表面具有毛刺结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA50k-PEG4k-PLGA50k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在60℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在60℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
经SEM表征所合成的磁性聚合物微球表面具有毛刺结构，结果如图5所示。
实施例5
具有表面毛刺结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA90k-PEG8k-PLGA90k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
实施例6
具有表面毛刺结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA50k-PEG4k-PLGA50k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为20g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
实施例7
具有表面毛刺结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA50k-PEG4k-PLGA50k溶解在10mL三氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
实施例8：
表面具有褶皱结构的微纳米磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.3g聚己内酯-聚乙二醇共聚物PCL-PEG溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
经SEM表征所合成的磁性聚合物微球表面具有褶皱结构，结果如图6所示。
实施例9
表面毛刺结构的磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA70k-PEG4k-PLGA70k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
对比例1：
对比例1为商业磁珠：DynabeadsTM M-280Streptavidin，购买网站为https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11205D#/11205D，经SEM表征所合成的磁性聚合物微球具有相对光滑的表面结构，结果如图7所示。
对比例2
表面光滑的磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA50k-PEG1k-PLGA50k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在40℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在40℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
对比例3
表面光滑的磁性聚合物微球按下列步骤实现：
a)将0.15g PLGA50k-PEG4k-PLGA50k溶解在10mL二氯甲烷中；
b)将200mL的含有浓度为10g/L的聚乙烯醇水溶液在70℃，6000rpm/min下分散搅拌5min；
c)向a)溶液中添加四氧化三铁纳米粒子10mg，搅拌分散；
d)将c)溶液缓慢加入b)中,在70℃，6000rpm/min下搅拌2h；
e)反应所得溶液经去离子水反复洗涤三次，冷冻干燥。
实验例1：
将实施例1和对比例1得到的磁性聚合物微球，进行负载生物素化的上皮细胞黏附分子抗体biotin-anti-EpCAM，对肿瘤细胞进行识别与分离。
1.称取10mg微纳米结构的磁性聚合物微球，加入2mol/L盐酸水解，之后加入5mg/mlEDC，5mg/mlNHS活化，之后修饰链霉亲和素SA，最后接枝抗体biotin-anti-EpCAM。修饰好抗体的微纳米磁性聚合物微球分散于PBS中待用。
2.在商业磁珠DynabeadsTM M-280Streptavidin表面接枝抗体biotin-anti-EpCAM分散于PBS中待用。
3.取密度105个/毫升的细胞悬液1毫升，分别与适量的两种磁珠混合，置于培养箱中孵育，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将微纳米磁性聚合物微球或者商业磁珠捕获到的细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞，计算捕获效率；并通过扫描电镜分别观察细胞和微纳米磁性聚合物微球及磁珠之间的相互作用，结果如图8和图9所示。
可以看到，具有表面微纳米结构的磁性聚合物微球与细胞之间形成了很好的拓扑相互作用，细胞伸出丝状伪足缠绕于微球表面。而对于商业磁珠而言，细胞与其表面无法形成良好的拓扑匹配，伸出的伪足较少。因此从结果来看，表面具有微纳米结构的磁性聚合物微球对于细胞的捕获效率高于商业磁珠，由此体现出本发明中微纳米结构的磁性聚合物微球的优越性。
实验例2：
将实施例1和对比例1得到的磁性聚合物微球，进行负载上抗体biotin-anti-EpCAM，对少量的肿瘤细胞进行识别与分离。
1.称取10mg微纳米结构的磁性聚合物微球，加入2mol/L盐酸水解，之后加入5mg/mlEDC，5mg/mlNHS活化，之后修饰链霉亲和素SA，最后接枝抗体biotin-anti-EpCAM。修饰好抗体的微纳米磁性聚合物微球分散于PBS中待用。
2.在商业磁珠DynabeadsTM M-280Streptavidin表面接枝抗体biotin-anti-EpCAM分散于PBS中待用。
3.分别用细胞计数器计数10，25，50，100，200，500个细胞，分别与适量的两种磁珠混合，置于培养箱中孵育，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠捕获到的细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞，计算捕获效率。结果如图10所示。
从结果来看，表面具有微纳米结构的磁性聚合物微球对于少量细胞的捕获效率高于商业磁珠，由此体现出本发明中微纳米结构的磁性聚合物微球的优越性。
实验例3：
将实施例1，实施例4和对比例2得到的不同形貌的磁性聚合物微球，负载上抗体biotin-anti-EpCAM，对肿瘤细胞进行识别与分离。
1.分别称取10mg实施例1得到的微纳米磁性聚合物微球，实施例4得到的表面具有较短的微纳米结构的磁性聚合物微球和对比例2中得到的表面光滑的磁性聚合物微球，分别加入2mol/L盐酸水解，之后加入5mg/ml EDC，5mg/ml NHS活化，之后修饰链霉亲和素SA，最后接枝抗体biotin-anti-EpCAM。修饰好抗体的微纳米磁性聚合物微球分散于PBS中待用。
2.分别取密度约200个/毫升的细胞悬液1毫升，与适量的三种磁珠混合，置于培养箱中孵育，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠捕获到的细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞，计算捕获效率。如下表所示：
表1-不同表面结构的磁性聚合物微球对肿瘤细胞的捕获效率情况
从结果来看，表面具有较长微纳米结构的磁性聚合物微球对于细胞的捕获效率高于具有较短微纳米结构的磁性聚合物微球，更高于表面光滑的磁性聚合物微球，由此体现出本发明中表面具有拓扑结构的磁性聚合物微球在肿瘤细胞分离中的优越性。
Claims (25)
1.一种微纳米磁性聚合物微球，其特征在于，所述微纳米磁性聚合物微球包括磁性纳米粒子和包覆磁性纳米粒子的聚合物，所述微纳米磁性聚合物微球具有拓扑表面，粒径为100nm～100μm；
所述拓扑表面是指聚合物微球具有连续、丰富的粗糙起伏表面形貌结构，能够与检测物形成拓扑结构匹配。
2.根据权利要求1所述的微纳米磁性聚合物微球，所述微球不具有通孔结构，其比表面积是具有与微球相同的粒径尺寸的光滑球形颗粒比表面积的2至100倍。
3.根据权利要求1至2之一所述的微纳米磁性聚合物微球，其拓扑表面为：褶皱结构、毛刺结构、花状结构、海胆结构或表面带有小球的核-卫星状结构，其中优选为毛刺结构。
4.根据权利要求1至3之一所述的微纳米磁性聚合物微球，表面具有2根以上的毛刺结构，优选具有5根以上的毛刺结构，更优选具有10根以上毛刺结构，所述毛刺结构为微球表面的柱状、管状或棒状凸起，其中毛刺长短平均值在0.20μm以上，优选在0.5μm以上；横切面直径平均值在0.05μm以上。
5.根据权利要求1所述的微纳米磁性聚合物微球，其中所述的聚合物为单一种类聚合物，非多种聚合物的共混。
6.根据权利要求1所述的微纳米磁性聚合物微球，所述的聚合物为两亲性嵌段共聚物，具有疏水链段和亲水链段；
所述的两亲性嵌段共聚物为两嵌段共聚物或三嵌段及以上的共聚物。
7.根据权利要求6所述的微纳米磁性聚合物微球，其中嵌段共聚物疏水链段的分子量为5kDa～200kDa；亲水链段的分子量为500Da～100kDa。
8.根据权利要求6-7之一所述的微纳米磁性聚合物微球，其中疏水链段包括但不限于聚乙交酯/丙交酯共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚丙交酯(PGA)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚异丁烯(PIB)、聚己内酯(PCL)中的一种或多种。
9.根据权利要求6-8之一所述的微纳米磁性聚合物微球，其中亲水链段包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚-4-乙烯基吡啶(P4VP)、聚丙烯酸(PAA)、聚(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)(PPEGMA)、聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)中的一种或多种。
10.根据权利要求6-9之一所述的微纳米磁性聚合物微球，优选两亲性嵌段共聚物为聚乙交酯/丙交酯共聚物(PLGA)-聚乙二醇(PEG)-聚乙交酯/丙交酯共聚物(PLGA)。
11.根据权利要求1-10之一所述的微纳米磁性聚合物微球，其中所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，磁性纳米粒子基于微纳米磁性聚合物微球总重量，其重量百分比为1％～90％。
12.根据权利要求1-11之一所述的微纳米磁性聚合物微球，通过乳液溶剂挥发自组装制备得到；具体为将两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，加入磁性纳米粒子，将其乳化分散于含有表面活性剂的水溶液中，采用油水乳液溶剂挥发得到所述微纳米磁性聚合物微球。
13.根据权利要求12所述的微纳米磁性聚合物微球，其中有机溶剂包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、三氯乙烷、碳酸二甲酯、二氧六环、四氯化碳、乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或多种。
14.根据权利要求12-13所述的微纳米磁性聚合物微球，其中所述两亲性嵌段共聚物在有机溶剂中的浓度为饱和浓度以下。
15.根据权利要求12-14之一所述的微纳米磁性聚合物微球，其中乳化搅拌的具体条件为：温度在0～100℃，搅拌转速为500～20000rpm/min，搅拌时长为0～4h。
16.根据权利要求12-15之一所述的微纳米磁性聚合物微球，其中表面活性剂包括但不限于：聚乙烯醇(PVA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，浓度为饱和浓度以下。
17.根据权利要求1-16之一所述的微纳米磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于：
将两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，加入磁性纳米粒子，将其乳化分散于含有表面活性剂的水溶液中，采用油水乳液溶剂挥发得到所述微纳米磁性聚合物微球。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其中有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、三氯乙烷、碳酸二甲酯、二氧六环、四氯化碳、乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或多种。
19.根据权利要求17-18所述的制备方法，其中所述两亲性嵌段共聚物在有机溶剂中的浓度为饱和浓度以下。
20.根据权利要求17-19之一所述的制备方法，其中乳化搅拌的具体条件为：温度在0～100℃，搅拌转速为500～20000rpm/min，搅拌时长为0～4h。
21.根据权利要求17-20之一所述的微纳米磁性聚合物微球，其中表面活性剂包括但不限于：聚乙烯醇(PVA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，浓度为饱和浓度以下。
22.根据权利要求17所述的制备方法，进一步为：
a)将一种两亲性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，其浓度为饱和浓度以下，添加磁性纳米粒子，其重量百分比基于微纳米磁性聚合物微球总重量为1％～90％，搅拌分散；
b)将上述a)溶液加入表面活性剂浓度为饱和浓度以下的水溶液中，进行搅拌形成水包油的乳液，进一步溶剂挥发得到所述的微纳米磁性聚合物微球，其中乳化搅拌的具体条件为：温度在0～100℃，搅拌转速为500～20000rpm/min，搅拌时长为0～4h。
23.一种经功能化修饰的微纳米磁性聚合物微球，其特征在于，将权利要求1-16的微纳米磁性聚合物微球，表面进行结合剂的功能化修饰，所述的结合剂包括但不限于DNA、多肽、适配体、抗体中的一种或多种。
24.根据权利要求23所述的表面经功能化修饰的微纳米磁性聚合物微球，优选所述结合剂为抗体，其具体修饰方法为：
a)用一定浓度的酸溶液对微纳米磁性聚合物微球进行水解；
b)将步骤a)的微球在配制好的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS的2-吗啉乙磺酸MES溶液中浸泡；
c)将步骤b)得到的微球进一步接枝链霉亲和素SA；
d)将步骤c)得到的改性微球接枝生物素化的抗体，得到抗体修饰的改性微球。
25.利用权利要求23-24的经功能化修饰的微纳米磁性聚合物微球进行生物样品分离的用途，优选进行肿瘤细胞分离的用途。
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