JP5213296B2 - 発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の製造および使用 - Google Patents

Description

本発明は、長寿命の発光を有する発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の組成物、製造および使用に関する。その粒子は、蛍光もしくはリン光シグナル（発光シグナル）を参照するための内部標準として、あるいは生体分子の標識および検出用のマーカーとして用いることができる。長寿命発光色素は固体材料中に不活性形態で組み込まれる。すなわち、気体および液体サンプル中の化学物質および生体物質の影響から遮断される。この組み込み型では、色素の光物理学的特性（スペクトル特性、発光減衰時間および発光異方性）がサンプルパラメータを変えても影響されない。

選択される組み込み用基材は特に、その構造ゆえに、生体分子、小さい中性分子、さらにはイオン性物質の取り込みを排除する、密な無機材料または有機ポリマーである。詳細には、この方法では、発光測定値に対する分子状酸素（有効な蛍光もしくはリン光消光剤）の干渉性の影響が排除されるか、または大幅に低減される。前記ナノ粒子およびミクロ粒子の表面に反応性化学基を設けて、生体分子および／または発光指示色素の共有結合的カップリングを可能とすることができる。さらに、その表面に化学基を設けて、粒子が凝集するのを防止することができる。

発光測定は、生物学的分析および化学分析において極めて一般的な方法である。それの魅力は、高感度、多用途性、さらに放射性標識試薬による放射線被曝の排除によるものである。実際には、高量子収率を特徴とする発光マーカーが通常用いられる。ほとんどの場合、発光マーカーの発光強度は、測定されるサンプルパラメータと相関している。そうした測定方法は、多数の因子が発光強度の量的評価を妨害するという事実により悪影響を受ける。前記因子には第一に、光学系における変動（光源の照射強度、検出器感度および光路の透過率）があるが、サンプルに固有の光学特性（着色または濁り）も含まれる。

前記干渉作用を排除もしくは低減するには、発光シグナルを参照するための好適な方法が必要である。ＷＯ９９／０６８２１号に（Klimant）には、発光シグナルを参照する方法であって、実際の発光マーカーと同様の（良くても同一の）スペクトル特性を有する発光参照色素をサンプルに加えるという操作に基づいた方法が記載されている。この方法では、頻度調節したまたは時間分解した発光測定と併用して、強度データを位相シグナルまたは時間依存的パラメータに変換する。この方法において測定シグナルの正確な参照を行うには、発光特性がサンプルパラメータによって悪影響を受けない不活性な発光参照標準が必要である。この目的に適したものとしては、例えば、サンプルに粉末の形で混合しうるＣｒ（ＩＩＩ）ドープ混合酸化物などのリン光性無機固体がある。他方、この目的には、有機もしくは無機材料製の担体に長寿命発光色素を組み込み、それとサンプルとを混合することも可能である。

蛍光強度シグナルの量的評価に対する別の種類の干渉は、サンプルに固有の蛍光の発生である。特に血液または血清などの天然サンプルは多数の蛍光物質を含むことがある。蛍光アッセイのシグナル強度が非常に低い場合、固有の蛍光によって測定が不可能になることさえある。非特異的なバックグラウンドシグナルから実際の発光シグナルを取り出すための汎用方法は、マーカーとして長寿命の発光を有する発光色素を用いることである。時間分解発光法を併用すると、短寿命のバックグラウンド蛍光から遅延された測定シグナルを時間ごとに分離することができる。この方法は主として、希土類金属のリン光性キレート（特に、ユーロピウムまたはテルビウムのもの）を用いる。しかしながら、前記色素はＵＶ光源によってのみ励起可能であるという欠点を有する。さらにそのキレートは、水系において可溶性形態で用いると、不安定である場合が多い。すなわち配位子が失われる。しかしながら、発光性金属／配位子錯体、特に中心原子としてルテニウム（ＩＩ）を有するものも、好適な長寿命マーカーであり得る。これらの色素を水系に可溶性形態で加えると、それらの発光は通常、分子状酸素、強力な酸化剤または還元剤によって消光される。

さらに、例えばｐＨ、イオンもしくは小分子の濃度または活性を測定する場合、発光強度が、測定対象パラメータとの直接もしくは間接の相互作用のため、例えば分析物との反応、または変換器によって、測定対象パラメータ（例えば分析物の濃度または活性またはｐＨ）に依存する発光指示体を用いることも可能である。

上記のいずれの方法においても、発光色素の光物理学的特性がサンプルパラメータによって影響されないことが必要とされる。これらの前提条件は、そのような色素を溶解した形でサンプルに加える場合や、その色素をサンプルと少なくとも間接的に接触させる場合には満足されない。分子状酸素ならびに酸化性および還元性消光剤による蛍光またはリン光の消光のために、測定シグナルの解釈を誤ることになる。

発光指示体の発光強度を参照するのに使用可能な不活性な長寿命発光性マーカーおよび発光性色素を得るには、発光色素を固体材料に組み込んで、それがサンプルと相互作用できないようにする必要がある。

本願は、発光特性がサンプル組成に依存したとしても無視できる程度である新規な発光性のミクロ粒子およびナノ粒子の両方、ならびにそれらの製造方法について記載するものである。さらに、発光指示体の発光強度を参照する上での、ナノ粒子およびミクロ粒子の形で存在する発光マーカーまたは発光性色素の可能な応用についても記載するものである。

従って本願は、例えばサンプルなどの環境化学パラメータから遮断されるように固体基材中で長期発光減衰時間を有し、量子収率、スペクトル特性、発光減衰時間および／または異方性などの発光特性が例えば個々のサンプル組成などの特定の環境から本質的に独立である、例えば金属／配位子錯体などの発光物質を含む発光性の、特にリン光性のミクロ粒子およびナノ粒子に関するものである。

本願において「独立」とは、本発明の粒子中に存在し、サンプルと少なくとも間接的に接触する発光色素の環境中のｐＯ_２および適宜他の干渉物質に対する発光減衰時間および適宜別の発光特性の依存性が、本発明の遮断を行わない場合におけるサンプルと少なくとも間接的に接触する相当する色素の発光減衰時間および適宜別の発光特性の依存性より低いことを意味している。

好ましくは、本発明の粒子中に存在する発光色素の発光寿命は、室温において、Ｏ_２を含まない環境の場合より、空気飽和環境で多くとも２０％、特に好ましくは多くとも１５％、最も好ましくは多くとも１０％短い。しかしながら遮断を行わないと、Ｏ_２を含まない環境と比較して空気飽和環境では、明らかに８０％を超える発光減衰時間短縮が認められる。

前記発光性金属／配位子錯体は好ましくは、中心金属としてルテニウム（ＩＩ）、オスミウム（ＩＩ）、レニウム（Ｉ）、イリジウム（ＩＩＩ）、白金（ＩＩ）およびパラジウム（ＩＩ）などの遷移金属を有する化合物である。錯体配位子は好ましくは、Ｎ−複素環を有する２座および／または３座の配位子、例えば２，２´−ビピリジン、ビピラジン、フェナントロリン、ターピリジルまたはそれらの誘導体などのポリピリジル配位子から選択される。金属／配位子錯体の特に好ましい例としては、配位子として２，２´−ビピリジル、１，１０−フェナントロリン、４，４−ジフェニルー２，２´−ビピリジルおよび４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンをもつルテニウム（ＩＩ）のトリス錯体である。特に好ましいものは、例えば２，２´−ビピリジルおよび１，１０−フェナントロリンなどのさらに別のポリ−Ｎ−複素環配位子とＲｅ（Ｉ）のカルボニル錯体である。同様に、好ましい金属／配位子錯体は、室温での強力なリン光を特徴とする中心原子としてＰｔ（ＩＩ）またはＰｄ（ＩＩ）をもつポルフィリン錯体である。前記化合物の発光減衰時間は、好ましくは≧１００ナノ秒、特に好ましくは≧４００ナノ秒である。本発明によれば、例えばランタニドであるＴｂ（ＩＩＩ）およびＥｕ（ＩＩＩ）などの希土類金属その他の物質を、長寿命発光色素として用いることも可能である。

発光性のミクロ粒子およびナノ粒子の平均粒径は、好ましくは２０ｎｍ〜１０μｍ、特に好ましくは５０ｎｍ〜１μｍの範囲である。発光性化合物は、水、消光性の気体物質（例：Ｏ_２）および干渉物質の透過率が低い（すなわち、拡散定数が低く、溶解度が低い）ことを特徴とする材料に組み込む。好適な材料の例としては、非多孔質ガラス、特に例えばケイ素、チタン、ジルコニウムまたはスズを含む化合物、例えばスズテトラアルコラート類などのアルコラート類からゾル／ゲル法によって製造されたガラスがある。

標準的な方法によってそのようなガラスを製造すると、微細孔構造を特徴とする材料となってしまう。そうすると、組み込まれた発光色素は溶存サンプル成分および特に酸素と接触し、それによって消光され得る。そのため、本発明に記載のゾルガラスは、特定の製造段階において、例えば２００℃という高温で加熱することで圧縮させる。例えばテトラメトキシシランなどのゾル／ゲル前駆物質を加水分解した後、溶媒を減圧下に留去し、ゾル／ゲルを乾燥させてから、最終的な架橋を行う。このようにして、高密度の非多孔性ガラス基材が形成される。生体分子、さらには化合物もその高密度基材を透過できないことから、組み込まれた色素の発光特性に影響しない。ルテニウム（ＩＩ）−トリス−１，１０−フェナントロリン色素およびルテニウム（ＩＩ）−トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン色素を有し、４０ｍＭ（ＳｉＯ_２のｋｇ基準）以下という色素含有量の不活性リン光性ゾル／ゲルガラスを、この方法に従って製造した。これらの材料は、酸素によって消光されない室温での強い発光を特徴とする。ゾル／ゲルリン光体はこの製造方法では、モノリシック型であるいは薄膜として形成されることから、粉砕によってミクロ粒子を製造しなければならない。その後に粒子をシラン処理することで、発光性の指示体または生体分子の共有結合カップリングに利用可能な反応性表面が得られる。その場合、粒子表面には、例えばアミノ基、エポキシ基、水酸基、チオール基および／またはカルボキシル基を設けることができる。

不活性発光性粒子の別途製造方法は、第１に非常に低い気体透過率（酸素を排除するため）および第２に最小の水分吸収率（イオン性化合物の透過を防止するため）を特徴とする有機ポリマーを包埋用基材として使用するものである。好適なポリマーには、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ（メタ）アクリル酸ポリマー類および特にポリアクリロニトリルならびにそれらの共重合体がある。

ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）は、極めて低い気体透過率、部分的親水性および非常に低い水吸収能力（約２％）を有する。さらに、例えばそのポリマー粒子の表面にあるニトリル基をケン化してカルボキシル基および／またはアミド基を得るかあるいは変換を行ってアミン基を得た後、それを各種生体分子の共有結合的結合に利用することができる。そのためポリアクリロニトリルは、不活性なナノ粒子およびミクロ粒子用の基剤として、発光色素用の最適な包埋用基材である。

さらに、ポリアクリロニトリル共重合体またはポリアクリロニトリルとの混合ポリマー、すなわちアクリロニトリルと別の１以上のモノマーを含むポリマー、詳細には少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、特に好ましくは少なくとも９０重量％のＰＡＮを含むポリアクリロニトリル共重合体または混合ポリマーを用いることも可能である。共重合体は、ポリマー鎖にＰＡＮおよび共重合用モノマーを含む。混合ポリマーは、１つのポリマー鎖にＰＡＮまたはＰＡＮ共重合体成分を含み、別のポリマー鎖に少なくとも１種類の非ＰＡＮ成分を含む。共重合体および混合ポリマーに好適な別のモノマーは、親水性基および／または反応性基、例えばアクリル酸、アクリルアミン類およびアクリル酸エステル類などを有するモノマー、例えばポリエチレングリコールアクリル酸エステル類またはそれらの混合物である。この場合、親水性基を好ましくは粒子の表面上で濃縮する。その後、表面上の親水性基および／または反応性基を用いて、生体分子または発光指示体分子などの結合相手をカップリングさせることができる。さらにこれらの基は、粒子凝集の防止にも寄与し得る。

ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）に基づく発光性のミクロ粒子およびナノ粒子は各種方法で製造することができる。

Ａ．ポリマー溶媒と混和性であるが、溶解度を低下させることで発光色素を有するポリマーを沈殿させる水、ＮａＣｌ溶液などの水溶液その他の液体を制御下に滴下することで、例えばジメチルホルムアミドなどの有機溶媒（混合物）中のＰＡＮまたはＰＡＮ共重合体もしくは混合ポリマーの溶液から粒子を沈殿させる方法。ポリマー溶液は同時に、溶存発光色素を含む。この形態の方法は特に簡単であることから好ましい。

Ｂ．ポリマー溶媒と混和性であるが、ポリマーの沈殿を引き曜こす水、ＮａＣｌ溶液などの水溶液その他の液体を制御下に滴下することで、例えばジメチルホルムアミドなどの有機溶媒（混合物）中のＰＡＮまたはＰＡＮ共重合体もしくは混合ポリマーの溶液から粒子を沈殿させる方法。このポリマー溶液は溶存発光色素を含まない。その後、発光色素を拡散によって粒子中に導入する。

Ｃ．例えば水またはエタノール中に発光色素を含むジメチルホルムアミドなどの有機溶媒（混合物）中のＰＡＮまたはＰＡＮ共重合体もしくは混合ポリマーの溶液を噴霧し、溶媒を蒸発させることで粒子を製造する方法。

いずれのプロトコールにおいても、特に溶液中のポリマーの割合を変えることで粒径を調節することができる。ポリマーの割合を低下させると粒径も低下する。

発光性のミクロ粒子およびナノ粒子を製造および単離した後、例えば、濃水酸化ナトリウム溶液などの塩基中で表面に結合したニトリル基をケン化することで、表面を反応性カルボキシル基によって活性化することができる。２つの理由から、カルボキシル基が必要である。第１に、そうすることで、（ｐＨ−）緩衝系で安定な分散液を製造することができ、第２に生体分子および発光指示体を表面に共有結合的に結合させることができる。

表面を反応性基で修飾した本発明の粒子を用いて、発光指示体および／または生体分子を共有結合的にカップリングさせることができる。発光指示体は、粒子基材に含まれるものと同様の化合物であることができる。含まれている発光性化合物とは対照的に、表面にカップリングした発光指示体は環境と接触することから、環境化学パラメータに作用することができる。このように修飾された粒子を、内部参照での指示体として用いることができる。別法としてあるいは追加の方法として、毒素、ホルモン、ホルモン受容体、ペプチド、蛋白、レクチン、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、抗原、ウィルスおよび細菌などの生体分子を粒子表面にカップリングさせることも可能である。カップリングは、例えば二官能性リンカー分子を使用するなど、公知の方法によって行う。

さらに、例えば分析物の診断測定などの蛍光アッセイで発光強度シグナルを参照するための標準として、上記粒子を用いることができる。

ミクロ粒子およびナノ粒子は一方では、表面に結合したあるいは環境中に存在する発光指示体の発光強度を位相シグナルまたは時間依存性パラメータに変換するための発光標準として用いることができ（例えば、ＷＯ９９／０６８２１号（Klimant）に記載の方法に従って、固相に発光指示体とともに粒子を固定化して、光学発光センサーの発光強度シグナルを参照するため）、他方では生体分子の高感度検出または測定用の発光マーカーとして用いることができる。

従って本発明は、異なる減衰時間を有する２種類の異なる発光色素を用いる生化学的または化学的パラメータの発光測定方法に関するものでもあり、得られる発光応答の時間または位相特性を用いて前記パラメータ測定のための参照パラメータを得るものであり、第１の発光色素は、少なくとも発光強度に関して前記パラメータに対応するものであり、第２の色素は少なくとも発光強度および発光減衰時間に関して前記パラメータには実質的に対応しないものであり、その方法は、第２の発光色素を本発明の粒子の形で用いることを特徴とする。使用される参照パラメータは好ましくは、発光シグナルの合計強度に依存しない２つの発光強度の割合の比である。代替パラメータとして使用可能な参照パラメータは、第２の発光色素の場合と比較した第１の発光色素の発光応答の位相シフトである。さらに参照パラメータは、第１の発光色素のシグナルおよび第２の発光色素の遅延参照シグナルとの合成シグナルの位相シフト測定値とすることもできる。この方法およびその方法を行うための装置に関する詳細については、ＷＯ９９／０６８２１を参照されたい。

以下の実施例は本発明を説明することを目的としたものである。

実施例
実施例１
ポリアクリルニトリルおよび［ルテニウム（ＩＩ）−トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン］ ^２＋ からの発光性ナノ粒子の製造
ｎ−ポリアクリロニトリル（Polysciences Inc.,ＭＷ１５００００）１ｇを、ルテニウム（ＩＩ）−トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン過塩素酸塩１０ｍｇとともに、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍＬに溶かし、１リットルのガラス製ビーカーに導入する。この溶液に絶えず撹拌しながらＨ_２Ｏ ４００ｍＬをゆっくり滴下すると、溶液にわずかな濁りが生じる。その後、同様に絶えず撹拌しながら濃度５％の塩化ナトリウム溶液１０ｍＬを加えると、綿状沈殿が生じ、それは一晩でビーカーの底に沈殿する。この沈殿は色素全量を含有し、遠心によって分離し、次に濃度０．５％のＮａＣｌ溶液２５０ｍＬで３回洗浄する。次の工程で、沈殿をエタノール２００ｍＬで洗浄して、表面に吸着された発光色素を完全に洗い落とす。遠心によって、沈殿からエタノールを除去する。その後、濃度０．０５％のＮａＣｌ溶液での最後の洗浄工程を行う。ナノ粒子からなる沈殿を回収し、Ｈ_２Ｏ ５０ｍＬに取り上げる。

実施例２
ポリアクリルニトリルおよび［ルテニウム（ＩＩ）−トリス−１，１０−フェナントロリン］ ^２＋ からのリン光性ナノ粒子の製造
ｎ−ポリアクリロニトリル１ｇを、ルテニウム（ＩＩ）−トリス−１，１０−フェナントロリンヘキサフルオロリン酸塩１０ｍｇとともに、ジメチルホルムアミド１００ｍＬに溶かし、１リットルのガラス製ビーカーに導入する。この溶液に、絶えず撹拌しながらＨ_２Ｏ ４００ｍＬをゆっくり滴下すると、溶液にわずかな濁りが生じる。その後、同様に絶えず撹拌しながら濃度５％の塩化ナトリウム溶液１０ｍＬを加えると沈殿が生じ、それは一晩でビーカーの底に沈殿する。この沈殿は使用した色素の約９０％を含有し、遠心によって分離し、次に濃度０．５％のＮａＣｌ溶液２５０ｍＬで３回洗浄する。次の工程で、沈殿をエタノール２００ｍＬで洗浄して、表面に吸着された発光色素を完全に洗い落とす。遠心によって、沈殿からエタノールを除去する。その後、濃度０．０５％のＮａＣｌ溶液での最後の洗浄工程を行う。沈殿（ナノ粒子）を回収し、Ｈ_２Ｏ ５０ｍＬに取り上げる。

実施例３
発光性ナノ粒子表面のカルボキシル化
ポリアクリロニトリル２００ｍｇの固体含有量を有する実施例１または２からの粒子懸濁液１０ｍＬを、濃度５％のＮａＯＨ溶液５０ｍＬに取る。粒子沈殿および懸濁液を、激しく撹拌しながら７５℃で４５分間加熱する。強いアンモニア臭が、表面にあるニトリル基の加水分解を示す。濁った溶液が透明になった後、ＨＣｌを加えることで水酸化ナトリウム溶液を中和し、ｐＨ３に調節する。それによって再度、表面がカルボキシル化された粒子が沈殿し、それを遠心によって回収することができる。それを最後にｐＨ３の緩衝液５０ｍＬで洗浄し、遠心によって回収し、蒸留水１０ｍＬに取り上げる。

けん化は、８％ＮａＯＨ中、２５℃で２４時間にわたって同様に行うこともできる。

実施例４ ９０％アクリロニトリルと１０％アクリル酸との共重合体および［ルテニウム（ＩＩ）−トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン］ ^２＋ からなるナノ粒子
自動合成したアクリロニトリル／アクリル酸１０：１共重合体２ｇおよびトリメチルシリルプロパンスルホン酸塩としての［ルテニウム（ＩＩ）−トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン］^２＋（Ｒｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ）_３ ＴＭＳ_２ ）４０ｍｇをＤＭＦ４００ｇに溶かす。撹拌しながら１０^−３ＮのＮａＯＨ １リットルを滴下し、水を加えて２リットルとする。得られる透明懸濁液を０．１ＮのＨＣｌでｐＨ３に調節し、沈殿を遠心によって回収する。遠心沈殿を各回水１．８リットルで３回洗浄し、超音波によって５０ｍＭのＮａ_２ ＨＰＯ_４ ２００ｍＬに再度懸濁させる。透明懸濁液を２０分間にわたって約８０℃まで加熱し、冷却後、ＨＣｌを加えることで再度ｐＨ３に調節し、遠心によって回収し、超音波によって５０ｍＭのＮａ_２ ＨＰＯ_４ ２００ｍＬに再度懸濁させる。

実施例５ ９５％アクリロニトリルと５％アクリル酸との共重合体および［Ｒｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ） _３ ］ ^２＋ を含むナノ粒子
アクリロニトリル／アクリル酸２０：１共重合体２ｇおよびＲｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ）_３ ＴＭＳ_２ ４０ｍｇをＤＭＦ４００ｇに溶かす。撹拌しながら１０^−３Ｎ ＮａＯＨ １リットルを滴下し、水を加えて２リットルとする。得られる透明懸濁液を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ３に調節し、沈殿を遠心によって回収する。遠心沈殿を各回水１．８リットルで３回洗浄し、超音波によって５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ２００ｍＬに再度懸濁させる。透明懸濁液を２０分間にわたって約８０℃まで加熱し、冷却後、ＨＣｌを加えることで再度ｐＨ３に調節し、遠心によって回収し、超音波によって５０ｍＭ Ｎａ_２ ＨＰＯ_４ ２００ｍＬに再度懸濁させる。

実施例６ ９９．５％アクリロニトリルと０．５％アクリルアミンとの共重合体および［Ｒｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ） _３ ］ ^２＋ からなるナノ粒子
アクリロニトリル／３−アミノプロピルアクリルアミド−２００：１共重合体０．５ｇおよびＲｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ）_３ＴＭＳ_２１０ｍｇをＤＭＦ１００ｇに溶かす。撹拌しながら１０^−３Ｎ ＨＣｌ ０．５リットルを滴下し、水を加えて１リットルとする。得られる透明懸濁液を０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９に調節し、沈殿を遠心によって回収する。遠心沈殿を各回水１リットルで３回洗浄し、超音波によって水５０ｍＬに再度懸濁させる。懸濁液を２０分間にわたって約８０℃まで加熱し、冷却後、水で２回洗浄し、再懸濁させる。

実施例７ ９０％アクリロニトリルと５％アクリル酸と５％エチレングリコールモノメチルエーテルアクリレートとの共重合体および［Ｒｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ） _３ ］ ^２＋ からなるナノ粒子
アクリロニトリル／アクリル酸／エチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート２０：１：１共重合体０．５ｇおよびＲｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ）_３ＴＭＳ_２ ５ｍｇをＤＭＦ２００ｇに溶かす。撹拌しながら１０^−３Ｎ ＮａＯＨ １リットルを滴下する。得られる透明懸濁液を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ３に調節し、沈殿を遠心によって回収する。遠心沈殿を各回水１リットルで３回洗浄し、超音波によって１００ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １リットルに再度懸濁させる。ＨＣｌを加えることで透明懸濁液をｐＨ３に調節し、遠心によって回収し、超音波によって１００ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ２００ｍＬに再度懸濁させる。透明懸濁液を２０分間にわたって約８０℃まで加熱し、冷却後、ＨＣｌを加えることで再度ｐＨ３に調節し、遠心によって回収し、超音波によって５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ２００ｍＬに再度懸濁させる。

実施例８ ８５％アクリロニトリルと５％アクリル酸と１０％スルホアクリレートとの共重合体および［Ｒｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ） _３ ］ ^２＋ からなるナノ粒子
アクリロニトリル／アクリル酸／スルホプロピルアクリレート２０：１：２共重合体０．５ｇおよびＲｕ（ｄｐｈｐｈｅｎ）_３Ｃｌ_２ ５０ｍｇをＤＭＦ１００ｇに溶かす。撹拌しながら１０^−３Ｎ ＮａＯＨ ０．５リットルを滴下する。得られる透明懸濁液を０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ３に調節し、沈殿を遠心によって回収する。遠心沈殿を各回水１リットルで３回洗浄し、超音波によって５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １００ｍＬに再度懸濁させる。透明懸濁液を２０分間にわたって約８０℃まで加熱し、冷却後、ＨＣｌを加えることでｐＨ３に調節し、遠心によって回収し、超音波によって５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １００ｍＬに再度懸濁させる。

実施例９ ポリアクリロニトリルまたはアクリロニトリル共重合体に基づく発光性粒子の特性決定
平均直径２０〜１００ｎｍを有し、発光色素ルテニウム（ＩＩ）−トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンを含む列挙した粒子について、２０℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で測定を行った。ナノ粒子をサンプルに分散させた。結果を以下の表１に示してある。

【表１】
ポリアクリロニトリル粒子に基づく各種リン光性ナノ粒子の特性決定
（ここに挙げた粒子の直径は２０〜１００ｎｍであり、いずれの場合も色素はルテニウム（ＩＩ）−トリス−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン錯体である。測定はいずれも、２０℃の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で行った。ナノ粒子をサンプル中に分散させた。）

Claims (17)

1. 発光性ミクロ粒子またはナノ粒子であって、１００ナノ秒以上の発光寿命を有する発光物質を含有し、該発光物質が周囲の化学的、生化学的および気体のパラメータから実質的に遮断されており、前記発光物質が、中心原子としてルテニウム（ＩＩ）、オスミウム（ＩＩ）、レニウム（Ｉ）、イリジウム（ＩＩＩ）、白金（ＩＩ）、パラジウム（ＩＩ）および希土類金属から選択される金属を含む金属／配位子錯体であり、前記発光物質が実質的に遮断されているとは、発光色素の発光寿命が室温においてＯ_２を含まない環境と比較して空気飽和環境で多くとも２０％短いことであり、前記ミクロ粒子またはナノ粒子が、ポリアクリロニトリル、アクリロニトリルとアクリル酸との共重合体、アクリロニトリルと３−アミノプロピルアクリルアミドとの共重合体、アクリロニトリル、アクリル酸とエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレートとの共重合体およびアクリロニトリル、アクリル酸とスルホプロピルアクリレートとの共重合体からなる群から選択される、低い吸水性および／または低い気体透過性を特徴とする有機ポリマーを含有することを特徴とする上記粒子。
   
2. 前記発光物質が、２座または３座のポリピリジル配位子との錯体である、請求項１に記載の粒子。
   
3. 前記２座または３座のポリピリジル配位子が２，２′−ビピリジン、ビピラジン、フェナントロリンおよびターピリジルからなる群から選択される、請求項２に記載の粒子。
   
4. 発光性化合物が、配位子としての２，２′−ビピリジル、１，１０−フェナントロリン、４，４−ジフェニル−２，２′−ビピリジルまたは４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンとルテニウム（ＩＩ）とのトリス錯体である、請求項１〜３のいずれかに記載の粒子。
   
5. 前記発光物質が、２座または３座のポリピリジル配位子とＲｅ（Ｉ）とのカルボニル錯体である、請求項１に記載の粒子。
   
6. 前記２座または３座のポリピリジル配位子が２，２′−ビピリジルまたは１，１０−フェナントロリンである、請求項５に記載の粒子。
   
7. 発光性化合物が、中心原子がＰｔ（ＩＩ）またはＰｄ（ＩＩ）であるポルフィリン錯体である、請求項１に記載の粒子。
   
8. 測定対象パラメータに依存する発光指示色素および／または生体分子の共有結合的カップリングを可能とする反応性基によって表面が修飾された、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子。
   
9. 反応性基がアミノ基、エポキシ基、水酸基、チオール基およびカルボキシル基からなる群から選択される、請求項８に記載の粒子。
   
10. 請求項１に記載の発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の製造方法であって、ポリマー溶媒と混和性であるが、該ポリマーの溶解度を低下させる液体を滴下することで、発光性化合物が可溶性形態で存在するポリマー溶液から前記粒子を沈殿させることを特徴とする、上記方法。
    
11. 水または水溶液を滴下することで、発光性化合物が可溶性形態で存在するジメチルホルムアミドおよびポリアクリロニトリルまたはアクリロニトリル共重合体を含む溶液から前記粒子を沈殿させる、請求項１０に記載の方法。
    
12. 請求項１に記載の発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の製造方法であって、発光性化合物を、溶媒（混合物）からの拡散によって、前もって製造した粒子に組み込むことを特徴とする、上記方法。
    
13. 請求項１に記載の発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の製造方法であって、前記粒子を、発光性化合物が可溶性形態で存在するポリマー溶液を噴霧し、溶媒を蒸発させることによって形成することを特徴とする、上記方法。
    
14. 毒素、ホルモン、ホルモン受容体、ペプチド、蛋白質、レクチン、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、抗原、ウイルスおよび細菌からなる群からの生体分子の標識付けおよび発光検出における請求項１〜９のいずれか１項に記載の発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の使用。
    
15. 蛍光アッセイでの蛍光強度シグナルの参照標準としての請求項１〜９のいずれか１項に記載の発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の使用。
    
16. 光学発光センサーの発光強度シグナルを参照するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の発光性ミクロ粒子およびナノ粒子の使用であって、前記粒子が発光指示体とともに固相に固定化されていることを特徴とする、上記使用。
    
17. 異なる寿命を有する２種類の異なる発光色素を用いる生化学的または化学的パラメータの発光測定方法であって、得られる発光応答の時間または位相特性を用いて前記パラメータ測定のための参照パラメータを得るものであり、第１の発光色素が少なくとも発光強度に関して前記パラメータに対応しており、第２の発光色素が少なくとも発光強度および発光寿命に関して前記パラメータに対応しておらず、その際、第２の発光色素が請求項１〜９のいずれか１項に記載の粒子の形で用いられることを特徴とする、上記方法。