CN114984869B - 一种磁性荧光微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性荧光微球及其制备方法和应用,该磁性荧光微球是通过将亚微米结构的磁性微球、量子点、聚合物溶于油相,经过乳化后分散到水相中得到磁性荧光微球,通过控制量子点的比例和种类实现微球的荧光编码,微球经过表面处理后具有丰富的羧基功能基团。本发明得到的磁性荧光微球在磁场中具有快速的磁响应性,能够在一分钟内快速富集,而且大大降低了磁性颗粒对荧光的猝灭作用,可以高效地被荧光检测系统识别。微球表面丰富的羧基功能基团能够高效地固定生物探针分子,方便进行后续多种生物分子的检测应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,具体涉及一种磁性荧光微球及其制备方法和应用。
背景技术
在临床诊断和药物研发等领域对大规模的分子分析具有巨大需求,固相生物芯片在多种标志物的分析中具有重要作用。但其在检测通量、反应速度、检测灵敏度、自动化方面受到限制。为解决上述问题,基于荧光微球编码的液相芯片具有高通量、反应迅速、检测灵敏度高、使用灵活等优点得到广泛关注。
非磁性的荧光微球在液相芯片的应用中难以自动化使其应用受到限制,磁性荧光微球综合了磁响应性、荧光特性及聚合物微球的生物活性。荧光可以用来进行标记和编码,超顺磁性使得样本可以在磁场中快速富集,容易实现自动化和高通量检测,是近年的研究热点。
对现有技术的文献检索发现,目前磁性荧光编码微球的制备方法主要通过以下三种方法制备。方法一:将油酸修饰的纳米四氧化三铁和不同的荧光材料分散到油相中,然后通过溶剂溶胀法将纳米四氧化三铁分散到微球中。该方法得到磁性荧光编码微球磁响应性和荧光强度都较低,且后续使用过程中微球中的磁性纳米颗粒和荧光材料都有泄露的风险。方法二:通过O/W型乳液干燥法将纳米四氧化三铁微球包埋到聚合物球中。该方法制备的磁性荧光微球很好的解决了磁性纳米颗粒和荧光材料在微球中的泄露问题,但纳米四氧化三铁会导致严重的荧光猝灭。方法三:在微米级磁性微球表面组装量子点等荧光材料,然后进行表面修饰后应用。该方法制备的磁性荧光编码微球能够有效降低磁性纳米颗粒对荧光材料的荧光猝灭作用,但是荧光材料的组装和微球的表面修饰过于繁琐,不适合大规模应用。
进一步检索发现,专利201010129442.8通过将量子点、四氧化三铁纳米颗粒和多孔羧基化聚苯乙烯微球分散到溶胀体系中,待量子点和四氧化三铁纳米颗粒溶胀进入到微球的微孔后将微球分散到不良溶剂中,微球收缩后表面的孔闭合,得到磁性荧光微球。该方法制备的磁性荧光微球磁含量较低,且磁性纳米颗粒对量子点有明显的荧光猝灭作用。
专利202110205927.9以磁性微球为核,表面修饰低交联的聚合物后将量子溶胀到聚合物壳层制备荧光微球,该方法有效避免了磁性微球对量子点的荧光淬灭,但得到的磁性荧光微球粒径较小,荧光信号较低。Wanwan Li等在《Advanced Functional Materials》2016版,26(42)期:7581-7589页发表的“Magnetic/fluorescent barcodes based oncadmium-free near-infrared-emitting quantum dots for multiplexed detection”中报道了将近红外量子点、磁性纳米聚合物分散到氯仿中制备磁性荧光微球,近红外量子点具有较好的抵抗磁性微球造成的猝灭,但近红外量子点使得荧光微球的编码容量降低,而且只能部分降低磁性微球对量子点的荧光猝灭作用。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题,而提供一种磁响应性快、荧光信号强的磁性荧光微球及其制备方法和应用,用不同的荧光信号对微球荧光编码后用于多种标志物的检测。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种磁性荧光微球,所述的荧光微球由亚微米磁性微球、荧光材料和聚合物包埋形成,粒径为1-20微米,所述亚微米磁性微球粒径为100-400nm,内核为四氧化三铁磁簇,中间层为二氧化硅壳层,外层为高度交联的聚合物。
进一步地,所述聚合物为苯乙烯和二乙烯基苯的聚合产物、苯乙烯和亚甲基双丙烯酰胺的聚合产物、苯乙烯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的聚合产物、甲基丙烯酸和亚甲基双丙烯酰胺的聚合产物。
进一步地,所述亚微米磁性微球和聚合物的质量比为1:100-1:1,荧光材料和聚合物的质量比为1:1000-1:2。
进一步地,所述荧光材料包括量子点、上转换纳米材料、荧光素类染料、罗丹明类染料。
一种高荧光强度和快速磁响应的磁性荧光微球的制备方法,包括以下步骤:
(1)双壳层的亚微米磁性微球的制备:以二氧化硅包覆的亚微米磁性微球为核,表面修饰一层高度交联的聚合物;
(2)配置分散性和连续相:将亚微米磁性微球、荧光材料、聚合物分散到有机溶剂中,超声分散均匀后得到分散相。配置一定浓度的表面活性剂溶液得到连续相;
(3)SPG膜乳化制备均一O/W型乳液:将分散相在一定压力下透过SPG膜形成均一液滴并在机械搅拌下进入连续相,液滴迅速被连续相中的表面活性剂包裹形成O/W型液滴;
(4)固化成球:O/W型液滴在一定温度和机械搅拌作用下液滴中的有机溶剂逐渐挥发,液滴内部逐渐固化成磁性荧光微球。对微球表面进行功能基团修饰后备用。
本发明将多壳层包覆后的亚微米四氧化三铁、荧光材料和聚合物分散油相中,超声分散均匀得到油相分散相,在连续相中分散成球后蒸发溶剂固化,得到聚合物包覆的磁性荧光微球,极大的降低了磁性纳米颗粒对荧光信号的影响。微球经过表面羧基修饰后能够高效的与生物探针分子偶联,采用不同的荧光对微球进行编码,实现多种标志物的联合检测。
进一步地,步骤(1)具体方法为,称取二氧化硅包覆后纳米磁性微球并分散在溶液中,加入包括苯乙烯、二乙烯基苯、亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸或亚甲基双丙烯酰胺的组分,以及聚合引发剂,通氮气后加热反应,将反应后的磁性微球在磁场中分离后用水洗涤,加氯仿继续洗涤后分散到氯仿中。
进一步地,步骤(1)中的多壳层的亚微米磁性微球微球粒径为100-400nm,内核是由5-30nm四氧化三铁纳米颗粒组装而成的50-300nm磁核,中间层为二氧化硅,外层为高度交联的聚合物。
进一步地,步骤(1)中亚微米磁性微球外层高度交联的聚合物为苯乙烯和二乙烯基苯的聚合产物、苯乙烯和亚甲基双丙烯酰胺聚合产物、苯乙烯和乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合产物,甲基丙烯酸和亚甲基双丙烯酰胺的聚合产物,能够很好的分散在有机溶剂中。
进一步地,步骤(2)中荧光材料包括量子点、上转换纳米材料、荧光素类染料、罗丹明类染料。
进一步地,步骤(2)中的有机溶解包括但不限于氯仿,正辛烷,甲苯,或者为多种溶剂的混合。
进一步地,步骤(2)中亚微米磁性微球和聚合物的质量比为1:100-1:1。荧光材料和聚合物的质量1:1000-1:2。
进一步地,步骤(2)中表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠,吐温20,曲拉通100中的一种或者多种的混合。
进一步地,步骤(3)中SPG膜的孔径为0.2-20微米,机械搅拌转速为50-600rpm。
进一步地,步骤(4)中的蒸发温度为25-70℃,搅拌速度为50-600rpm,得到的磁性荧光微球的粒径为1-30微米,微球表面功能基团修饰为氨基、羧基、巯基、或羟基等活性功能基团。
另一方面,本发明还提供了根据以上方法制备得到的磁性荧光编码微球在多种生物分子检测中的应用。将不同生物分子连接到磁性荧光编码微球表面,与待测目标分子结合后利用磁场对磁性编码微球进行富集,通过流式细胞仪荧光信号采集对微球进行解码,实现多种标志物联合检测。优选的,连接生物分子包括但不限于待检测的抗原、待测目标核酸、或待检受体分子等。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明提出一种磁性荧光微球及其制备方法,将双壳层的亚微米磁性微球、荧光材料和聚合物膜挤出后干燥成球,有效解决了磁性粒子对荧光的猝灭作用而导致的微球荧光信号降低,得到的磁性荧光微球粒径均一,尺寸可控,磁响应性好,能够高效地在磁场中进行富集。
本发明制备磁性荧光微球方法简单可控,磁性微球表面修饰后能够高效地应用于生物分子地富集和检测,微球的荧光强度和发射光谱种类可以灵活调节,可以实现荧光对微球的编码,适合应用于多种生物分子同时检测。
附图说明
图1为本发明实施的原理示意图。
图2为双壳层修饰后亚微米磁性微球透射电镜下的图像。
图3为本发明中的磁性荧光微球扫描电镜图像。
图4为本发明中的磁性荧光微球荧光显微镜荧光图像。
具体实施方式
下面对本发明实施例进行详细说明,使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,本实施例在本发明技术方案下进行实施,但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1
步骤1、准确称取100mg 200nm二氧化硅包覆后纳米磁性微球并分散在100mL 1%PvP K30水溶液中,向体系中加50μL苯乙烯、50μL二乙烯基苯和2mg过硫酸钾,通氮气30分钟后快速加热到80℃,反应12后停止,将反应后的磁性微球在磁场中分离后用水洗涤2次,加氯仿继续洗涤一次后分散到氯仿中,浓度为5mg/mL。
步骤2、准确称量5g苯乙烯马来酸酐共聚物,加50mL步骤1中磁流体溶液,继续向该溶液中加不同浓度氯仿分散的量子点溶液,量子点的浓度分别为0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.3mg/mL,0.4mg/mL,0.5mg/mL,发射波长为623nm,得到有机分散相。配置0.5%的SDS水溶液得到连续相。
步骤3、将步骤2中的分散相转移到快速膜乳化装置中,在0.2mPa压力下透过孔径为5微米的SPG膜形成均一液滴并在200r机械搅拌下进入连续相,液滴迅速被连续相中的表面活性剂包裹形成O/W型液滴。
步骤4、步骤3中的液滴在室温250rpm机械搅拌作用下干燥24小时,待有机溶剂逐渐挥发后成液滴内部逐渐固化得到粒径为7微米的磁性荧光微球。将得到的磁性荧光微球分散在50mL 0.1mol/L盐酸溶液中,机械搅拌24小时后,用去离子水洗涤3次后分散到水中,得到表面羧基官能化磁性荧光微球。
步骤5、以三种不同荧光强度的磁性荧光微球同时检测SARS-CoV-2,甲型流感,乙型流感N蛋白作为评估本发明制备磁性荧光微球有效性的方法。将的10mg磁性荧光微球用200μL,50mg/mL EDC/NHS活化1小时后,加入单克隆抗体1,37℃孵育1小时后加2%的BSA溶液封闭30分钟,用PBS溶液洗涤三次后保存到200μL PBS溶液得到单克隆抗体1标记的磁性荧光微球复合物。将5μL标记好单克隆抗体1标记的磁性荧光微球、100μL不同浓度待测蛋白溶液、5μL FITC标记单克隆抗体2室温孵育10分钟后用流式细胞仪进行检测。SARS-CoV-2,甲型流感,乙型流感N蛋白的检测下限分别为0.02ng/mL,0.05ng/mL,0.02ng/mL。
实施例2
本实施例中除了采用3μm孔径的SPG膜外,其他步骤与实施例1均相同,得到的磁性荧光微球粒径为5μm。SARS-CoV-2,甲型流感,乙型流感N蛋白的检测下限分别为0.01ng/mL,0.025ng/mL,0.01ng/mL。
实施例3
步骤1、准确称取100mg 200nm二氧化硅包覆后纳米磁性微球并分散在100mL乙腈溶液中,向体系中加50μL苯乙烯、10μL甲基丙烯酸、40μL亚甲基双丙烯酰胺和2mg偶氮二异丁腈,通氮气30分钟后快速加热到80℃,反应12后停止,将反应后的磁性微球在磁场中分离后用水洗涤2次,加氯仿继续洗涤一次后分散到氯仿中,浓度为5mg/mL。
步骤2、准确称量5g聚苯乙烯,加50mL步骤1中磁流体溶液,继续向该溶液中加不同浓度氯仿分散的量子点溶液,量子点的浓度分别为0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.3mg/mL,0.4mg/mL,0.5mg/mL,发射波长为623nm,得到有机分散相。配置0.5%的SDS水溶液得到连续相。
步骤3、将步骤2中的分散相转移到快速膜乳化装置中,在0.2mPa压力下透过孔径为5微米的SPG膜形成均一液滴并在200r机械搅拌下进入连续相,液滴迅速被连续相中的表面活性剂包裹形成O/W型液滴。
步骤4、步骤3中的液滴在室温250rpm机械搅拌作用下干燥24小时,待有机溶剂逐渐挥发后成液滴内部逐渐固化得到粒径为7微米的磁性荧光微球。将50mg磁性荧光微球分散在50mL乙腈中,加20μL苯乙烯、40μL甲基丙烯酸、40μL亚甲基双丙烯酰胺和2mg偶氮二异丁腈,通氮气20分钟后快速升温到90℃,反应4小时后在磁场中富集,用水洗涤3次后分散到水中,得到表面羧基官能化磁性荧光微球。
步骤5、以三种不同荧光强度的磁性荧光微球同时检测SARS-CoV-2,甲型流感,乙型流感N蛋白作为评估本发明制备磁性荧光微球有效性的方法。将的10mg磁性荧光微球用200μL,50mg/mL EDC/NHS活化1小时后,加入单克隆抗体1,37℃孵育1小时后加2%的BSA溶液封闭30分钟,用PBS溶液洗涤三次后保存到200μL PBS溶液得到单克隆抗体1标记的磁性荧光微球复合物。将5μL标记好单克隆抗体1标记的磁性荧光微球、100μL不同浓度待测蛋白溶液、5μL FITC标记单克隆抗体2室温孵育10分钟后用流式细胞仪进行检测。SARS-CoV-2,甲型流感,乙型流感N蛋白的检测下限分别为0.01ng/mL,0.025ng/mL,0.01ng/mL。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种磁性荧光微球,其特征在于,所述的荧光微球由亚微米磁性微球、荧光材料和聚合物包埋形成,粒径为1-20微米,
所述亚微米磁性微球粒径为100-400nm,内核为四氧化三铁磁簇,中间层为二氧化硅壳层,外层为高度交联的聚合物;
所述的磁性荧光微球的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)双壳层的亚微米磁性微球的制备:以二氧化硅包覆的亚微米磁性微球为核,表面修饰一层高度交联的聚合物;
(2)配制分散相和连续相:将亚微米磁性微球、荧光材料、聚合物分散到有机溶剂中,超声分散均匀后得到分散相;配制一定浓度的表面活性剂溶液得到连续相;
(3)SPG膜乳化制备均一O/W型乳液:将分散相在一定压力下透过SPG膜形成均一液滴并进入连续相,液滴迅速被连续相中的表面活性剂包裹形成O/W型液滴;
(4)固化成球:O/W型液滴在搅拌作用下液滴中的有机溶剂逐渐挥发,液滴内部逐渐固化成磁性荧光微球;
步骤(1)具体方法为,称取二氧化硅包覆后纳米磁性微球并分散在溶液中,加入包括苯乙烯、二乙烯基苯、亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸或亚甲基双丙烯酰胺的组分,以及聚合引发剂,通氮气后加热反应,将反应后的磁性微球在磁场中分离后用水洗涤,加氯仿继续洗涤后分散到氯仿中。
2.根据权利要求1所述的一种磁性荧光微球,其特征在于,所述聚合物为苯乙烯和二乙烯基苯的聚合产物、苯乙烯和亚甲基双丙烯酰胺的聚合产物、苯乙烯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的聚合产物、甲基丙烯酸和亚甲基双丙烯酰胺的聚合产物。
3.根据权利要求2所述的一种磁性荧光微球,其特征在于,所述亚微米磁性微球和聚合物的质量比为1:100-1:1,荧光材料和聚合物的质量比为1:1000-1:2。
4.根据权利要求1所述的一种磁性荧光微球,其特征在于,所述荧光材料包括量子点、上转换纳米材料、荧光素类染料、罗丹明类染料。
5.根据权利要求1所述的一种磁性荧光微球,其特征在于,步骤(2)中所述的有机溶剂为氯仿、正辛烷、甲苯,或者为多种溶剂的混合,所述亚微米磁性微球和聚合物的质量比为1:100-1:1,所述荧光材料和聚合物的质量1:1000-1:2。
6.根据权利要求1所述的一种磁性荧光微球,其特征在于,步骤(2)中所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、吐温20、曲拉通100中的一种或者多种的混合。
7.根据权利要求1所述的一种磁性荧光微球,其特征在于,进一步地,步骤(3)中SPG膜的孔径为0.2-20微米,机械搅拌转速为50-600 rpm;
步骤(4)中的蒸发温度为25-70℃,搅拌速度为50-600 rpm。
8.如权利要求1所述的一种磁性荧光微球在生物分子检测中的应用,其特征在于,将不同生物分子连接到磁性荧光编码微球表面,与待测目标分子结合后利用磁场对磁性编码微球进行富集,通过流式细胞仪荧光信号采集对微球进行解码,实现多种标志物联合检测;
所述磁性荧光微球表面处理后带有功能基团,所述功能基团包括氨基、羧基、巯基、或羟基的活性功能基团;
所述生物分子包括待检测的抗原、待测目标核酸、或待检受体分子。
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