KR20070090175A - 자성 나노 입자를 포함하는 가시화 제제 및 이를 이용한가시화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발광 유기 염료로 표지된 자성 나노 입자를 포함하는 가시화 제제, 및 이를 림프 조직 내로 주입하여 조직 내 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)의 유입을 촉진하고, 현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는 림프관 내 봉한관을 가시화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포 해부학 및 생리학 분야에 획기적인 발견을 제공한다. 상기 구조체의 조직학적 특징 및 생리학적 기능에 대한 더 많은 연구는 생물학 및 의학 분야에 중요한 새 개념의 가능성을 제시할 수 있다.

Description

자성 나노 입자를 포함하는 가시화 제제 및 이를 이용한 가시화 방법{VISUALIZING AGENT COMPRISING A MAGNETIC NANOPARTICLE AND VISUALIZING METHOD BY USING THE SAME}

본 발명은 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)를 포함하는 가시화 제제, 및 이를 이용한 가시화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 림프 조직에 자성 나노 입자를 주입하여 염색하고, 현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는 림프관 내 유리된 혈관내 실 구조체를 가시화하는 방법에 관한 것이다.

1960년대 초, 김봉한 (Bonghan Kim)은 혈관계 또는 신경계 (참고문헌 1)와는 완전히 다른 새로운 순환계의 큰 네트워크의 일부로서 림프관 내부에 있는 혈관내 실 구조체 (intravascular threadlike structure)를 발견하였다고 보고하였으나, 실험 결과의 재현성 문제로 인하여 그 방법이 공개되지 않았다. 따라서, 그의 연구는 오랫동안 방치되어 왔다. 한국의 생리학자인 김봉한은 그의 발견이 3번째 순환계를 형성한다고 가정하여 "봉한관 (Bonghan duct)"이라고 불리는 물리학 기초의 침 경락지에 보고하였다. 손상된 조직내 세포를 재생시키는 특이적인 과립구를 포함하는 액체는 이러한 봉한관의 네트웍을 통하여 이동한다. 그의 연구는 1962~1965년까지 한국의학지 (한국)에 5편이 발표되었다. 본 발명의 참조로서 포함된 1번째 참고문헌은 그의 초기 연구의 일부를 요약한 영어 논문이다.

이와 달리, 일본의 해부학자인 후지와라 (Fujiwara)는 김의 실험 결과 (참고문헌 2, 3)를 부분적으로 인정하였으나, 보다 많은 관심을 받기에는 매력적이지 못하다고 주장하였다. 더욱 최근에는, 몇몇 연구자들은 랫트 및 토끼에서 혈액을 천천히 관류시키는 방법 (참고문헌 4, 5)을 이용하여 토끼 및 렛트의 내장 표면에 있는 실 구조체 (참고문헌 6, 7, 8)뿐 아니라 혈관내 실 구조체를 재발견하였다. 비록 김 (Kim)은 림프관 내부에 실 구조체가 있음을 주장하였으나, 이에 대한 어떠한 증거 시진도 제시하지 못했다. 또한, 김의 방법은 공개되지 않았기 때문에, 후지와라를 포함한 어떠한 사람도 그의 주장을 확인할 수 없었다.

완전하게는 아니더라도 림프관이 발견된 후 초기에는, 림프관의 해부학적 구조 및 생리학적 기능 대부분이 밝혀진 것으로 알려졌다 (참고문헌 9). 또한, 림프관의 관강 내에 림프구를 포함하는 유동액이 존재한다는 사실이 명백하게 밝혀지게 되었고, 이외 림프관 내에 다른 구조체는 알려지지 않았다.

이러한 림프관 내에 존재하는 새로운 구조체는 현미경으로는 검출하기가 매우 어렵기 때문에 종래에는 알려지지 않았다. 서양 해부학에서도, 림프관 내부에 유리된 혈관내 실 구조체에 대하여 어떠한 언급도 하지 않았다 (참고문헌 10). 이러한 구조체가 중간규모 (대략 20 ㎛ 정도의 두께를 가진)로 존재하고 있고 많은 외과수술에서도 관찰되지 않았다는 사실은 매우 놀라운 일이다. 분명하게, 이러한 구조체의 광학적 투명도는 이들을 검출하는데 매우 어려움을 주게 된다.

도 1은 실시예 1에 따른 토끼의 조직 내 (in situ) 대정맥 하부 근처에 있는 림프관의 입체상을 나타낸 것이고;

도 2(A)는 미분간섭효과 (differential interference contrast) 현미경 상이고, 도 2(B)는 동일한 시료의 형광현미경 상이고, 및 도 2(C)는 실시예 1에 따른 아크리딘 오렌지 염색법으로 염색한 실 구조체 내 핵 분포를 나타내는 결과이고;

도 3은 공초점 레이저주사현미경 (confocal laser scanning microscope)으로 측정한 동결-절편화된 실 및 미립자 구조체 상이고;

도 4는 공초점 레이저주사현미경 (confocal laser scanning microscope)으로 측정한 동결-고정된 실 및 미립자 구조체의 상이고: (A)는 미분간섭효과 현미경 상이고, (B)는 나노 입자-형광 상이고, (C)는 미립자의 확대 상을 나타낸 것이고;

도 5(A)는 대정맥의 미추 근처에 있는 림프절 및 림프관의 해부도를 나타낸 것이고, 및 도 5(B)는 조직 내 (in situ) 및 생체 내 (in vivo) 존재하는 림프관 내 봉한관 및 미립자를 나타낸 것이고; 및

도 6(A)는 실시예 2에 따른 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 새로운 실 및 미립자 구조체의 조직학적 분석을 나타낸 것이다.

<발명의 요약>

림프관 내부에서 유리된 혈관 내 실 구조체는 육안으로 확인하기 어렵기 때문에, 본 발명자들은 직접적인 표시가 가능하도록 이 부위를 다량으로 염색할 수 있는 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)를 이용한 새로운 방법을 개발하였다. 따라서, 혈관벽에 부착하지 않는 림프관 내 유리된 실 구조체를 발견했다는 것은 매우 놀라운 일이다. 즉, 전세계에 걸쳐 지금까지 림프관에 관한 많은 외과수술 및 연구에도 불구하고 약 20 ㎛의 직경을 가진 실 구조체를 발견하지 못했다는 사실은 도저히 믿어질 수 없는 일이라 여겨졌다.

따라서, 본 발명의 목적은 입체현미경하에서 림프관 내부에 있는 림프판을 통하여 실 구조체의 통로를 명확하게 나타낼 수 있는 유기 염료로 표지된 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)를 포함하는 가시화 제제를 제공하는 것이다. 이러한 새로운 실 모양의 조직 및 그의 조직학적 구조를 특이적으로 염색하는 염료의 개발은 세포 해부학에 대한 이해의 폭을 넓히는데 매우 중요하다.

본 발명의 또 다른 목적은 림프 조직 내로 발광 유기 염료로 표지된 자성 나노 입자를 주입하여 조직 내 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)의 유입을 촉진시키고, 현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는 림프관 내 봉한관을 가시화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 조직 내 (in situ) 또는 생체 내 (in vivo)에 존재하는 봉한관을 염색하는 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)를 이용한 가시화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 나노 입자를 림프 조직에 주입한 후 림프 조직에 자기장 (magnetic field)을 공급하는 단계를 추가로 포함하는 가시화 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 수반되는 도면은 본 발명의 더 많은 이해를 돕기 위하여 본 명세서의 일부로서 구성 및 첨부되었고, 본 발명의 원리를 설명하기 위하여 도면의 설명 및 발명의 실시예를 들어 구체적으로 설명하였다.

발광 유기 염료 (luminescent organic dye)로 표지된 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)를 포함하는 림프관 내부 봉한관의 염색용 가시화 제제. 상기 제제는 조직 내 (in situ) 및/또는 생체 내 (in vivo)에 있는 봉한관 (Bonghan duct) 및/또는 봉한 미립자 (Bonghan corpuscle)를 가시화하는데 사용된다. 상기 제제는 다른 림프 조직에 비하여 봉한관 (Bonghan duct) 및/또는 봉한 미립자 (Bonghan corpuscle)를 다량으로 염색하여 가시화한다.

아울러, 본 발명은 림프 조직 내로 발광 유기 염료로 표지된 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)를 주입하여 조직 내 자성 나노 입자의 유입을 촉진시키고, 현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는 림프관 내 봉한관 (Bonghan Duct)을 가시화하는 방법을 제공한다.

이는, 형광 자성 나노 입자를 림프절 내로 주입하여 렛트의 림프관 내에 존재하는 새로운 실 구조체를 생체내에서 육안으로 관찰할 수 있게 한 최초의 발명이다. 지금까지 관찰되지 못했던 이러한 구조들은 나노 입자들이 림프관 보다 더욱 짙게 염색되어 표출된 것이다. 또한, 나노 입자들은 형광을 띠기 때문에, 림프관 시료의 현미경 상에서 실 구조체 및 이와 관련된 미립자들이 명확하게 관찰될 수 있다. 이러한 실 구조체들은 혈관계 및 림프계와는 완전히 다른 또 다른 순환계의 일부로서 고려될 수 있고; 이러한 급진적인 기술을 현재 통용되는 해부학에 접목시키는 것은 앞으로 수행되어야 할 과제이다.

이하에서는, 림프관 내부에서 유리된 혈관내 실 구조체를 "봉한관 (Bonhan duct)"이라고 명명하였는데, 이는 혈관계 또는 신경계와는 완전히 다른 새로운 순환계의 큰 네트워크 중 일부로서 김봉한 (Bonghan Kim)에 의해 보고되었다. 김봉한의 설명에 의하면, 상기 실 구조체는 유사부교감신경계 (parasymphatomimetic)인 위장관 (gastrointestinal duct)과는 전혀 다른 독특한 이동 양상을 가지고 있다고 주장하였다.

본 발명에서, 상기 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)는 코발트 (cobalt)-페라이트 (ferrite) 입자의 코어 (core), 상기 코어가 코팅된 비결정질 실리카의 셀 (shell), 및 생체적합성 폴리머 (biocompatible polymer)에 의하여 변형된 자성 나노 입자의 표면을 포함하는 구조를 가질 수 있다. 상기 유기 염료 (organic dye)는 로다민 B 이소티오시아네이트 (rhodamine B isothiocyanate), 또는 플루오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate)일 수 있다. 플루오레신 이소티오시아테이트의 예로는 테트라-메틸 로다민 B 이소티오시아네이트 (RITC, 방사 파장 (emission wavelength) λ_max=555 nm)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되어 있는 것은 아니다. 상기 생체적합성 폴리머는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 그 예로 PEG를 포함할 수 있고, 이에 제한된 것은 아니다. 상기 실 구조체를 생체내에서 가시화하는데 중요한 요인 중 하나는 나노 입자 그 자체가 림프관 보다 짙게 염색되는 것일 수 있다. 상기 자성 나노 입자의 평균 크기는 1 nm 내지 100 nm일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 평균 크기가 약 9 nm인 코발트 (cobalt)-페라이트 (ferrite) 자성 나노 입자들은 발광 유기 테트라-메틸 로다민 B 이소티오시아네이트 (RITC, 방사 파장 (emission wavelength) λ_max=555 nm)를 포함하는 비결정질 실리카 셀에 의해 코팅될 수 있다. 코어-셀 자성 나노 입자들의 표면은 생체적합성 폴리에틸렌글리콜 (poly ethylene glycol, PEG)을 이용하여 더욱 변형될 수 있다. 코어-셀 구조의 전체 크기는 약 50 nm일 수 있으며, 주입되는 염료의 양은 0.01 ml일 수 있다. 나노 입자 (MNP-SiO₂(RITC)-PEG)들의 농도는 2.0 mg/cc일 수 있고, 이들을 pH 7.4의 멸균 식염수에 부유시킬 수 있다. 보다 상세하게는, Yoon et al에 기재된 제조 방법을 참조할 수 있다 (Angew, Chem. Int. Ed. 44, 1068, 2005) (참고문헌 11).

본 발명의 바람직한 실시예에서, 2개의 요추 림프절 (lumbar lymph node) 내로 형광 자성 나노 입자를 주입하고, 상기 림프절 및 이와 연결된 림프관의 상부에 자기장을 공급하는 것일 수 있다. 나노 입자들은 실 구조체 내 존재하는 세포들과 고착하는 것 보다는 림프구와 함께 유리될 수 있기 때문에, 이를 방지하기 위해서는 자기장의 공급이 중요한 과정이 될 수 있다. 즉, 실 구조체는 자기장의 공급 없이는 검출될 정도의 충분한 양의 나노 입자를 흡수할 수 없게 된다. 상기 자기장 (magnetic field)은 림프 조직 표면에서 0.1 내지 0.5 테슬라 (Tesla)의 강도로 1분 내지 120분, 보다 바람직하게는 10분 내지 40분 동안 공급하는 것일 수 있다.

또 다른 실시예에서, 자성 나노 입자를 주입한 후, 통상적인 디스크-타입의 Nd-Fe-B 자석 (직경 = 14 nm, 두께 = 5 nm, 자기장 강도 = 표면 당 4000 가우스)을 요추 결절과 연결된 림프관에 넣을 수 있다. 상기 자석의 기능은 주입된 나노 입자들이 실 구조체 내에 존재하는 세포들에 의해 흡수될 수 있는 충분한 시간을 부여하기 위하여 림프절과 림프관에서 나노 입자를 가두게 된다. 이러한 과정 없이는, 상기 나노 입자들은 임파선류 (lymphatic flow)와 함께 유리될 수 있으며, 실 구조체는 검출될 정도의 충분한 양의 나노 입자를 흡수할 수 없게 된다. 상기 자기장은 20분 동안 공급될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 림프절 및 림프관과 같은 림프 조직은 대정맥 미추 근처에 위치하는 것일 수 있다. 도 5A는 이와 관련된 해부도이다. 나노 입자들은 2개의 림프절에 주입되었고, 자기장은 빨간 원 내부에 표시된 부위에 공급되었다. 림프관은 파란색 직사각형 내에서 관찰되었다. 도 5B는 조직 내 (in situ) 및 생체 내 (in vivo)에서 관찰되는 림프관 내 실 구조체와 미립자를 나타내는 것이다.

보다 분명한 관찰을 하기 위하여, 가능한 한 많은 현미경 상의 대조물 (contrast)을 준비할 필요가 있다. 이를 위해, 림프관 주변의 복잡한 부위로부터 림프관만을 순수 분리하여 보다 명확하게 관찰하기 위하여, 림프관 하부에 한 장의 검은 종이를 깔았다. 이러한 방법은 매우 간단하지만, 효과적이며, 차이를 부각시키기 위한 방법일 수 있다. 2개의 광원, 즉 할로겐 (halogen)과 수은등 (mercury lamp)이 이용될 수 있고, 및 3 nm 직경의 광섬유 (optical fiber)를 이용하여 목표 부위를 조명할 수 있다. 조명 방향 (illuminating direction)은 수평면 (북극각 (polar angle) = 80^o)을 기준으로 약 10^o일 수 있고, 방위각 (azimuthal angle)은 림프관의 방향을 기준으로 약 45^o일 수 있다. 최적의 조명 방향은 육안으로 좀처럼 관찰하기 힘든 실 구조체를 판명하는데 매우 중요할 수 있으며, 이를 위해 미세-조작기 (micro-manipulator)에 의해 개폐된 광섬유를 약한 압력을 가하여 그 방향을 조절할 수 있다. 목표 구조가 관찰되었을 때, 최적의 대조물 (contrast)을 얻기 위하여 상기 조명 각을 조절할 수 있다.

림프관 내에서 유리된 상기 염색된 혈관 내 실 구조체는 현미경으로 관찰할 수 있다. 현미경은 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 상기 현미경은 통상적인 방법으로 염색된 구조체를 확인할 수 있는 현미경을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 현미경 관찰은 바람직하게는 입체현미경 (stereomicroscope), 광학현미경 (light microscope), 도립현미경 (inverted microscope), 공초점 레이저주사현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM), 또는 동결주사전자현미경 (cryo scanning electron microscope, Cryo-SEM)으로 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 가시화 방법은 자성 나노 입자를 촉진시킨 후 아크리딘 오렌지를 이용하여 봉한관을 염색하는 단계를 더욱 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 현미경 관찰은 공초점 레어저주사현미경, 또는 도립현미경으로 수행될 수 있다. 상기 도립현미경은 미분간섭효과 (differential interference contrast) 형태, 또는 레드 또는 그린 플루오레신 형태로 수행될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 가시화 방법은 헤마톡실린과 에오신 (hematoxylin and eosin)을 이용하여 염색하고, 조직학적 분석을 위하여 광학현미경으로 관찰하는 단계를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 도면을 보다 상세히 설명한다.

도 1A는 랫트의 대정맥 미추 근처에 있는 림프관의 전형적인 입체현미경 상을 나타낸 것이다. 상기 림프관 (점선으로 그려진 테두리 부위)은 분명하게 관찰되었고, 혈관벽 하부에 있는 지방 부위에서는 림프 판막 (이중으로 그려진 화살표 부위)과 모세혈관 (화살촉 부위)까지도 관찰되었다. 림프관 내부는 분명하게 존재하는 림프액 (lymphatic fluid) 이외에 다른 어떤 것도 존재하지 않음을 누구나 쉽게 판명할 수 있을 정도로 분명하게 표출되었다. 그러나, 단순한 관찰은 잘못된 판단을 내릴 수 있는데, 이를 도 1B에서와 같이 생체 내 (in vivo) 및 조직 내 (in situ)에서 실 구조체 (굵은 화살표 부위)가 관찰됨을 통하여 증명하였다. 상기 구조체는 림프절 내로 주입된 나노 입자의 형광성으로 인해 육안으로 관찰할 수 있다. 미립자들 (화살표 부위)은 림프관을 따라 드물게 위치하고 있고, 실 구조체뿐 아니라 판막에 의해서 연결되어 있음을 관찰할 수 있다. 또한, 명확하고 쉬운 관찰을 위하여 한 장의 검은 종이를 림프관 하부에 위치하도록 하였다. 도 1C는 도 1B의 림프관 절편을 더욱 확대한 상으로, 판막 (이중선 화살표 부위)과 미립자 (화살표 부위)가 관찰된다.

도 1B의 시료와 유사한 한 조각의 림프관을 수취하여 중성화된 완충 포르말린 (NBF 100%) 용액으로 고정시킨 후, 슬라이드에 올려 놓은 다음 도립현미경으로 관찰하였다. 도 2A에서 관찰되는 미분간섭효과 현미경 상에서는 부분적으로 림프관 (점선 화살표 부위)에서 뻗어 나온 실 구조체 (굵은 화살표 부위)가 관찰되었다. 또한, 림프관의 한쪽 끝을 날카로운 미세-바늘을 이용하여 모두 제거하려 하였으나, 일부분은 제거되지 않았다. 도 2B는 동일한 시료의 형광현미경 상이다. 상기 실 구조체를 NBF로 고정시킨 후, 형광 흡수율이 증가된 나노 입자를 이용하여 보다 밝고 명확하게 실 구조체의 존재 유무를 확인하였다. 이러한 실 구조체 내에 존재하는 핵 (화살촉 부위)의 분포 양상은 아크리딘 오렌지 염색에 의하여 표출되었다 (도 2C).

도 3A는 공초점 레이저주사현미경 (confocal laser scanning microscope)으로 측정한 새로운 실 구조체 (NTS)의 교차-단면상이다. NTS (굵은 화살표 부위)는 림프관 벽 (점선 화살표 부위)에 비해 보다 밝은 색을 띠게 되는데, 이는 NTS가 림프관 벽에 비해 보다 많은 수의 나노 입자를 흡수하기 때문이다. 감도가 떨어지는 상 (도 3B)에서, 림프관은 더 이상 육안으로 관찰되지 않으며, NTS 내에 다크 홀 (화살촉 부위)이 관찰된다. 상기 다크 홀은 핵에 위치하고 있다. 상기 나노 입자들은 핵이 아닌 세포질에 흡수된다 (참고문헌 11). 아크리딘 오렌지와 나노 입자의 병합된 상은 림프관 벽 (점선 화살표 부위) 내에 있는 다크 홀 부위에서 녹색을 띤핵으로 관찰된다 (도 3C). 상기 시료는 약 6 um 두께로 동결-절편화하여 준비되었다.

판막 (valve)과 함께 림프관 내부에 존재하는 동결-절편화된 실 구조체 및 미립자의 공초점 레이저주사현미경 상은 도 4에 나타내었다. 도 4 및 도 4B 각각 나노 입자의 미분간섭효과 (differential interference contrast, DIC) 현미경 상과, 나노 입자의 형광현미경 상을 나타내는 것이다. 상기 미립자 (화살표 부위)는 림프관 (점선 화살표 부위) 내 오른쪽 부위에, 뒤엉킨 판막 (이중 화살표 부위)은 림프관 내의 중간 부위에 위치하며, 실 구조체 (굵은 화살표 부위)는 림프관 내의 왼쪽 부위에 각각 위치하고 있다. 상기 실 구조체는 림프 판막 및 림프벽에 비해 보다 밝은 색을 띠게 되는데, 이는 상기 나노 입자가 앞에서 언급한 바와 같이 새로운 구조체에 더욱 강하게 부착하기 때문이다. 또한, 도 4(B)에서는 구형체 내부에 2개의 큰 홀을 갖고 있음을 나타내는데, 이를 확대할 경우, 도 4C에서와 같이 구형체 내부에 2개의 큰 홀이 분명하게 갖고 있음을 알 수 있다. 따라서, 이들은 몇몇 종류의 액체와 과립액의 통로 역할을 하는 누관으로 간주될 수 있으며, 새로운 구조체의 생리적 기능에도 밀접하게 관련되어 있음을 알 수 있다.

김 (Kim) (참고문헌 12)의 이론에 의하면, 봉한관 (Bonghan duct)과 미립자 (corpuscle)의 생리학적 기능은 개체 발달 및 조혈모 과정과 관련되어 있음을 알 수 있으나, 이와 관련해서는 앞으로 더 많은 연구가 필요하다. 이들을 통하여 과립구를 포함하는 몇 종류의 액체들은 유동하게 되며, 이러한 과립구들은 그 직경이 약 1 내지 2 um이며, DNA와 세포질을 포함하고 있고, 얇은 외막 (참고문헌 12)으로 둘러싸여 있음이 후지와라 (Fujiwara) (참고문헌 3), 보다 최근에는 다른 두 그룹(참고문헌 7) 의해서 관찰되었다. 본 발명의 발명자들은 이러한 과립구 내에 DNA가 존재하고 있는지를 증명하기 위하여 포일겐 반응 염색 (Feulgen reaction staining)을 이용하였다 (참고문헌 8). 이러한 과립구들은 미세세포와 형태, 크기, 및 DNA 함량이 유사하다. 게다가, 과립구와 미세세포는 모두 얇은 막으로 둘러싸여 있다 (참고문헌 12, 13). 미세세포 (Microcell)는 세포 융합 기술에 폭넓게 사용되고 있으며, 발암기전 (carcinogenesis) (참고문헌 14) 및 다운증후군 (Downs Syndrome) (참고문헌 15)을 조사하는데 유용한 기술로서 사용되고 있다. 이러한 인자들의 주된 차이점은: 미세세포는 콜세미드 (colcemid) 및 사이토칼라신 (cytochalasin) B (참고문헌 16)와 같은 화합물에 의하여 생체 외 (in vitro)에서 생산되고, 주로 큰 간기 육종 세포 (참고문헌 17)와 같은 병리학적 상태에서 관찰되는 반면, 상기 과립구들은 본질적으로 정상 조직에서 유래되며 실 구조체의 네트워크를 통하여 유동한다. 이러한 과립구들은 손상된 기관 (참고문헌 12)의 상처 조직 부위의 세포를 재생시킬 수 있기 때문에, 현재 사용되고 있는 세포-치료법과 유사한 의학적 용도로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 이때, 본 발명의 바람직한 실시예는 다음과 같다.

실시예 1: 나노 입자 ( nanoparticle )를 함유한 용액의 준비

유기 염료로 표지된 자성 나노 입자들은 본 발명자들 중 한 사람의 실험실에서 합성되었다 (J. K. Lee). 평균 크기가 약 9 nm인 코발트 (cobalt)-페라이트 (ferrite) 자성 나노 입자들은 발광 유기 테트라-메틸 로다민 B 이소티오시아네이트 (RITC, 방사 파장 (emission wavelength) λ_max=555 nm)를 포함하는 비결정질 실리카 셀로 코팅되었다. 코어-셀 자성 나노 입자들의 표면은 생체적합성 폴리에틸렌글리콜 (poly ethylene glycol, PEG)을 이용하여 좀 더 변형되었다. 코어-셀 구조의 전체 크기는 약 50 nm이다. 염료의 주입량은 각 림프절 당 0.03 ml이다. 나노 입자 (MNP-SiO₂(RITC)-PEG)의 농도는 2.0 mg/cc이고, 나노 입자를 함유한 용액을 제조하기 위하여 pH 7.4의 멸균 식염수에 부유시켰다. 보다 상세하게는, Yoon et al에 기재된 제조 방법을 참조할 수 있다 (Angew, Chem. Int. Ed. 44, 1068, 2005) (참고문헌 11).

대상동물 준비 및 수술적 절차:

약 200 g의 몸무게를 갖는 엘빈 위스타 랫트 (수컷 10마리, 암컷 1마리)와 스프라그-돌리 랫트 (수컷 2마리)를 중앙실험동물사로부터 구입하였다. 상기 동물들을 12h 빛/어둠 주기 (dark/light cycle)에서 60% 상대습도를 가지며 일정한 온도로 조절된 환경 (23℃)에서 순응시켰다. 또한, 모든 상기 동물들은 제한 없이 사료와 물을 공급받았다. 실험 동물과 관련된 실험 절차 및 동물의 보호는 현재 통용되는 국제법 및 조약에 따라 실시되었다 (실험 동물 보호 및 사용 지침서, 국 제대학출판, 1996).

상기 렛트는 1.5 g/kg의 우레탄을 복강내로 주입하여 마취하였고, 모든 수술적인 절차는 통상적인 마취하에서 수행되었다. 상기 렛트의 복부면이 완전히 마취된 상태에서 절개하였고, 복막 및 지방을 제거한 후 대정맥 미추 근처에 있는 요추결절 (lumbar node)을 노출시켰다.

조명 ( Illumination ):

림프관 주변의 복잡한 부위로부터 림프관만을 순수 분리하여 보다 명확하게 관찰하기 위하여, 림프관 하부에 한 장의 검은 종이를 깐 후 림프관을 관찰하였다. 2개의 광원, 즉 할로겐 (halogen)과 수은등 (mercury lamp), 및 3 nm 직경의 광섬유 (optical fiber)를 이용하여 목표 부위를 조명하였다. 조명 방향 (illuminating direction)은 수평면 (북극각 (polar angle) = 80^o)을 기준으로 약 10^o이고, 방위각 (azimuthal angle)은 림프관의 방향을 기준으로 약 45^o이다. 최적의 조명 방향은 육안으로 좀처럼 관찰하기 힘든 실 구조체를 판명하는데 매우 중요하며, 이를 위해 미세-조작기 (micro-manipulator)에 의해 개폐된 광섬유를 약한 압력을 가하여 그 방향을 조절하였다. 목표 구조가 관찰되었을 때, 최적의 상 (contrast)을 얻기 위하여 상기 조명 각을 조절하였다.

현미경 ( Microscope ):

실 구조체의 해부 및 관찰은 입체현미경 (Stereomicroscope, SZX12, 올림푸스)과 CCD 카메라 (DP70, 올림푸스)를 통하여 수행되었다. 도 2의 상을 얻기 위하여 사용된 광학현미경은 도립현미경 (inverted microscope, 올림푸스 IX71)이고, 도 6의 상은 광학현미경 (light microscope, 올림푸스 BX51)을 이용하여 얻었다. 공초점 레이저주사현미경 (cofocal laser scanning microscope, CLSM) 상은 Zeiss LSM 510 CLSM를 이용하여 얻었다.

1-1: 랫트 내 림프 조직의 염색

상기 13마리 렛트의 각각의 2개의 림프절 내로, 발광 자성 나노 입자 용액 (각 림프절 당 0.03 ml)을 30-치수 주사기에 적재하여 2-4분 간격으로 천천히 주입하였다. 도 5A는 상기 2개의 림프절 사진이다. 또한, 상기 나노 입자 용액을 2개의 요추 결절 내로 주입하였다. 주입 후, 통상적인 디스크-타입의 Nd-Fe-B 자석 (직경 = 14 nm, 두께 = 5 nm, 자기장 강도 = 표면 당 4000 가우스)을 요추 결절과 연결된 림프관 (점선 화살표)에 넣어 20분간 자기장을 공급하였다. 자기장은 도 5A에 표시된 빨간 원 내부에 공급되었다. 림프관은 파란색 직사각형 내에서 관찰되었다. 도 5B는 조직 내 (in situ) 및 생체 내 (in vivo)에서 관찰되는 림프관 내 실 구조체 (굵은 화살표)와 미립자 (화살표)이다.

1-2: 입체현미경 ( Stereomicroscope ) 관찰

생체 내 (in vivo) 및 조직 내 (in situ)에서 염색된 림프 조직은 입체현미 경 (SZX12, 올림푸스)과 CCD 카메라 (DP70, 올림푸스)를 이용하여 각각 관찰 및 측정하였다. 도 1A는 랫트의 대정맥 미추 근처에 있는 전형적인 입체현미경 상을 나타낸 것이다.

보다 구체적으로, 림프관 주변의 복잡한 부위로부터 림프관만을 순수 분리하여 보다 명확하게 관찰하기 위하여, 림프관 하부에 한 장의 검은 종이를 깐 후 림프관을 관찰하였다. 2개의 광원, 즉 할로겐 (halogen)과 수은등 (mercury lamp), 및 3 nm 직경의 광섬유 (optical fiber)를 이용하여 목표 부위를 조명하였다. 조명 방향 (illuminating direction)은 수평면 (북극각 (polar angle) = 80^o)을 기준으로 약 10^o이고, 방위각 (azimuthal angle)은 림프관의 방향을 기준으로 약 45^o이다. 최적의 조명 방향은 육안으로 좀처럼 관찰하기 힘든 실 구조체를 판명하는데 매우 중요하며, 이를 위해 미세-조작기 (micro-manipulator)에 의해 개폐된 광섬유를 약한 압력을 가하여 그 방향을 조절하였다. 목표 구조가 관찰되었을 때, 최적의 대조물 (contrast)을 얻기 위하여 상기 조명 각을 조절하였다. 도 1B에서 관찰되는 림프관 절편을 보다 확대할 경우, 도 1C에서 보여지듯이 판막 (valve)과 미립자 (corpuscle)가 관찰된다.

도 1은 조직 내 (in situ)에서 측정한 랫트의 림프관 내 존재하는 새로운 실 구조체 (novel threadlike structure, NTS)를 나타낸 것으로, 도 1A는 대정맥 미추 근처에 있는 림프관의 입체현미경 상을 나타낸 것이다. (A)는 입체현미경하에서 관찰된 림프관 (점선으로 그려진 테두리 부위)의 전형적인 상이고, 혈관벽 안 쪽 지방 부위에서 판막 (이중으로 그려진 화살표 부위) 및 미립자 (화살촉 부위)가 관찰되었고, 이때 상기 NTS는 관찰되지 않았다 (Bar, 100 mm). (B)는 조직 내에 존재하는 NTS (굵은 화살표 부위)를 형광 나노 입자를 이용하여 림프관 내에서 관찰한 사진으로, NTS에 의해 연결된 3개의 미립자 (화살표 부위)가 판막과 함께 관찰되었다 (Bar, 50 mm). (C)는 상기 NTS 부위를 보다 확대한 사진으로, 이때 고농도의 나노 입자로 인해 미립자가 붉게 관찰되었다.

1-3: 도립현미경 ( Inverted microcscope ) 관찰

상기에서 설명한 바와 같이, 1.5 g/kg의 우레탄을 렛트의 복강내로 주입하여 마취하였다. 상기 렛트의 복부면이 완전히 마취된 상태에서 절개하였고, 복막 및 지방을 제거한 후 대정맥 미추 근처에 있는 요추 결절 (lumbar node)을 노출시켰다. 도 1B의 시료와 유사한 한 조각의 림프관을 수취하여 중성의 완충 포르말린 용액 (NBF 10%)으로 고정시킨 후, 슬라이드에 올려 놓은 다음 도립현미경으로 관찰하였다 (올림푸스 IX71).

도 2(A)는 미분간섭효과 (differential interference contrast) 현미경 상이고, 도 2(B)는 동일한 시료의 나노 입자-형광현미경 상이다. 도 2A에서 관찰되는 미분간섭효과 현미경 상에서는 부분적으로 림프관에서 뻗어 나온 실 구조체가 관찰되었다. 또한, 림프관의 한쪽 끝을 날카로운 바늘을 이용하여 모두 제거하려 하였으나, 일부분은 제거되지 않았다. 도 2B는 동일한 시료의 형광현미경 상이다. 상기 실 구조체를 NBF로 고정시킨 후, 형광 흡수율이 증가된 나노 입자를 이용하여 보다 밝고 명확하게 실 구조체의 존재 유무를 확인하였다. 도 2B는 림프관 (점선으로 된 화살표 부위) 내 존재하는 NTS (굵은 화살표 부위)를 선명하게 나타낸 사진이다. NTS에서 뻗어 나온 부위를 얻기 위하여, 상기 림프관 벽 상부를 약간 두드린 후 개폐하여 수취하였다 (Bar, 50 mm).

도 2C는 도 2A의 시료를 0.1% (w/v) 아크리딘 오렌지로 염색한 다음 도립현미경으로 관찰한 사진으로, 상기 NTS에서 뻗어 나온 부위 내에 존재하는 핵 (화살촉 부위)이 아크리딘 오렌지 염색에 의해 염색되어 관찰되었다.

1-4: 동결- 절편화된 시료의 공초점 레이저주사현미경 ( CLSM ) 관찰

실시예 1-1에서 준비된 한 조각의 림프관을 수취하여 중성화된 완충 포르말린 (NBF 10%) 용액으로 고정시킨 후, 형광 모드 상태에서 Zeiss LSM 510 공초점 레이저주사현미경 (CLSM)으로 관찰하였다. 도 3A는 공초점 레이저주사현미경을 이용하여 새로운 실 구조체 (novel threadlike structure, NTS)의 교차단면상을 측정한 사진이다. 상기 NTS는 림프관 벽에 비해 보다 많은 나노 입자를 흡수하기 때문에 더 밝은 색을 띠게 된다. 감도가 떨어지는 상 (도 3B)서, 림프관은 더 이상 육안으로 관찰되지 않으며, NTS 내에 다크 홀 (dark hole)들이 나타나게 된다. 이러한 다크 홀들은 핵에 위치하게 되며, 이로 인해 나노 입자들은 핵이 아닌 세포질에 위치하게 된다 (참고문헌 11).

보다 구체적으로, 한 조각의 림프관을 수치하여 중성화된 완충 포르말린 (NBF 10%) 용액으로 고정시킨 후, 1% (w/v) 아크리딘 오렌지로 염색하고, 및 CLSM 으로 관찰하였다. 아크리딘 오렌지와 나노 입자의 병합된 상은 림프관 벽 내에 있는 다크 홀 부위에서 녹색을 띤 핵으로 관찰되었다 (도 3C). 상기 시료는 약 6 um 두께로 동결-절편화하여 준비하였다.

도 3은 공초점 레이저주사현미경 (confocal laser scanning microscope)으로 측정한 새로운 실 구조체 (NTS)의 교차-단면상이다. (A) NTS (굵은 화살표 부위)는 림프관 벽 (점선 화살표 부위)에 비해 보다 밝은 색을 띤다. (B) 감도가 떨어지는 상에 있어서, NTS (굵은 화살표 부위)는 다크 홀 (화살촉 부위)을 나타내나, 림프관 주변은 육안으로 관찰되지 않는다 (Bar, 10 mm). (C) 아크리딘 오렌지로 염색할 경우, NTS 내에 존재하는 핵 (화살촉 부위)의 위치 및 림프관 벽 (점선 화살표 부위)의 위치가 관찰된다. 상기 나노 입자들은 핵에 흡수되지 않는다 (Bar, 20 mm).

1-5: 동결-고정된 시료의 공초점 레이저주사현미경 ( CLSM ) 관찰

실시예 1-1에서 준비된 한 조각의 림프관을 수취하여 중성화된 완충 포르말린 (NBF 10%) 용액으로 고정시켰다. 상기 고정된 시료를 슬롯금속스텁 (slotted metal stub)상에서 마운틴된 리벳으로 묶은 후, 동결-고정을 위하여 20초 동안 액체 질소에 담갔다. 동결 시료는 -170℃의 동결-전달 시스템 (CT1500, Oxford Instruments, Oxon, UK)상에 있는 동결 챔버에 위치시킨 후, Zeiss LSM 510 CLSM으로 관찰하였다. 또한, 판막 (valve)과 함께 림프관 내부에 존재하는 동결-절편화된 미립자의 공초점 레이저주사현미경 상은 도 4에 나타내었다.

도 4(A)는 미분간섭효과 (differential interference contrast, DIC) 현미경 상이고, 도 4(B)는 동일한 시료의 형광현미경 상이다. 도 4C는 DIC 현미경 상과 나노 입자의 형광현미경 상을 병합한 것이다. 판막 (이중 화살표 부위)은 림프관 (점선 화살표 부위)의 중간에 위치하며, 미립자 (화살표 부위)는 오른쪽에, NTS (굵은 화살표 부위)는 왼쪽에 각각 위치하고 있다. 또한, 미립자 내부에는 4개의 누관 (sinus) (화살촉 부위)들이 위치하고 있고, 상기 미립자 부위를 확대할 경우, 도 4C에서 나타내는 바와 같이 구형의 구조 내부에 2개의 큰 홀을 갖고 있음을 알 수 있다. 따라서, 이러한 누관들은 몇몇 종류의 액체와 과립구들의 통로인 누관으로 간주될 수 있으며, 새로운 구조체의 생리적 기능에도 밀접하게 관련되어 있음을 알 수 있다.

1-6: 봉한관 ( Bonghan duct ) 및 미립자 ( corpuscle )의 크기 분석

실시예 1에 따른 13 마리 렛트의 림프 조직 내 실 구조체 및 미립자의 입체현미경 상은 CCD 카메라를 이용하여 분석하였다. 실 구조체 및 미립자의 두께 및 크기는 상 (image)에 표시된 스케일 바를 이용하여 측정하였고, 이로부터 평균값을 얻었다. 실 구조체는 평균 두께가 52±30 um인 두꺼운 부위에서부터 19±9 um인 얇은 부위까지 매우 다양한 두께를 가지고 있다. 미립자는 다양한 타원 형태를 가지며, 평균 크기가 0.52 mm x 0.15 mm이고, 림프관의 평균 두께는 0.24±0.07 mm이다. 상기 미립자들의 수와 크기 또한 서로 매우 다양하다.

실시예 2: 실 ( Threadlike ) 구조체 및 미립자 ( Corpuscular ) 구조체의 헤마톡실린과 에오신 염색 분석

본 발명의 형태학적 분석 방법 외에 추가적으로 새로운 실 구조체 및 미립자 구조체의 조직학적 특징을 분석하기 위하여, 헤마톡실린과 에오신을 이용한 염색 방법이 수행되었다. 도 6A는 림프관 내부에 있는 판막과 미립자를 포함하는 림프관의 교차 단면상을 나타낸 것으로, 하부 (점선 테두리의 안쪽 부위)는 미립자이고, 상부는 미립자와 연결된 매우 두꺼운 실 구조체의 일부분이다. 도 6B는 상기 교차 단면상을 확대한 사진으로, 적혈구를 포함한 다양한 세포들이 존재함을 알 수 있으나, 이러한 세포들의 특징에 관해서는 앞으로 더 많은 연구가 필요하다.

도 6C 및 D는 동일한 시료의 미립자 구조체의 또 다른 단면상을 나타낸 것으로, 여기에서는 판막 대신 관강 (lumen)을 따라 유동하는 3개의 구형 물체가 관찰되었다. 또한, 적혈구의 존재는 새로운 조직의 조혈모 기능과 연관되어 있다는 것을 의미하며, 보다 구체적인 특징에 관해서는 앞으로 더 많은 연구가 필요하다. 도 6E는 미립자와 두꺼운 실 구조체를 포함하는 림프관을 나타낸 도면으로, 만약 교차 단면상이 림프관을 가로지르는 점선을 따라 형성될 경우, 이로 인해 생성된 상은 도 6C와 D의 상과 유사하게 나타날 수 있음을 설명하기 위하여 첨부된 도면이다.

끝으로, 도 6F에서 나타낸 바와 같이 림프구 (lymphocyte)는 림프관의 몇몇 부위에서, 실 구조체는 하부 모서리 부분에서 각각 관찰되었다. 도 6G는 실 구조체의 나노 입자 형광현미경 상이고, 도 6H는 도 6G를 확대한 상으로서, 이를 통해 핵은 나노 입자를 흡수하지 않음을 재확인할 수 있었다.

참고문헌:

1. B. H. Kim, On the Kyungrak System (Med. Sci. Press, Pyongyang, DPR Korea, 1963).

2. S. Fujiwara, Igaku no Ayumi 60, 567 (1967) [in Japanese].

3. S. Fujiwara, Discovery of Acupuncture Meridians (Sogensa, Osaka, 1967) [in Japanese].

4. Jiang X, Kim HK, Soh KS, et al., Method for observing intravascular Bonghan duct. Korean J. Orient. Prevent Med. Soc. 6: 162-166 (2002).

5. Lee, B. C., Baik, K. Y., Johng, H. M., Nam, T. J., Lee, J., Sung, B., Choi, C., Park, W. H., Park, E. S., Park, D. H., Yoon, Y. S., Soh, K. S., Acridine orange staining method to reveal the characteristic features of an intravascular threadlike structure. Anat. Record 278B: 27-30 (2004).

6. Lee, K. J. et al. Unique duct system and the corpuscle-like structures found on the surface of the liver. J. Intl. Soc. Life Info. Sci. 22, 460 (2004).

7. Lee, B. C., Park, E. S., Nam T. J., Johng, H. M., Baik, K. Y., Sung, B., Yoon, Y. S., Soh, K. S., Bonghan Ducts on the Surface of RAT Internal Organs. J. Int. Soc. Life Info. Sci. 22: 455-459 (2004); Johng, H. M. et al., Bonghan ducts on the surface of rat liver. J. Int. Soc. Life Info. Sci. 22, 469 (2004).

8. Hak-Soo Shin, Hyeon-Min Johng, Byung-Cheon Lee, Sung-Il Cho, Kyung-Soon Soh, Ku-Youn Baik, Jung-Sun Yoo, Kwang-Sup Soh, Feulgen reaction study of novel threadlike structures (Bonghan ducts) on the surfaces of mammalian organs. Anat. Record 284B: 35-40 (2005).

9. Podgrabinska, S., Braun, P., Velasco, P., Kloos, B., Pepper, M., Jackson, D.G., Skobe M., Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 99(25), 16069-16074 (2002).

10. Hangai-Hoger, N., Cabrales, P., Briceno, J.C., Tsai, A.G. and Intaglietta M., Microlymphatic and tissue oxygen tension in the rat mesentery. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286: H868-H883 (2004).

11. Yoon T. J. et al. Multifunctional nanoparticles possessing a "magnetic motor effect" for drug or gene delivery. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 2-5 (2005).

12. Kim, B. H., Sanal Theory. J. Acad. Med. Sci. DPR Korea 168: 39-62 (1965).

13. D. M. Prescott, J. B. Kirkpatrick, in Methods Cell Physiol., D. M. Prescott, Ed. (N. Y. Academic Press, N. Y., 1972), pp. 189-202.

14. Q. Ran, O. M. Pereira-Smith, Exp. Gerontol. 35, 7 (2000).

15. M. Kabota, Y. Shirayoshi, M. Oshimura, Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 599 (2002).

16. E. Stubblefield, M. Pershouse, Somat. Cell Mol. Genet. 18, 485 (1992).

17. I. Buikis, L. Harju, T. Frievalds, Anal. Cell Pathol. 18, 73 (1999).

Claims (17)

1. 발광 유기 염료로 표지된 자성 나노 입자 (magnetic nanoparticle)를 림프 조직에 주입하고,

   현미경으로 관찰하는 단계를 포함하는,

   림프관 내부의 봉한관 (Bonghan Duct)을 가시화하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 조직 내 (in situ) 또는 생체 내 (in vivo)의 봉한관을 염색하는 것인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 림프 조직에 자기장 (magnetic filed)을 공급하는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 자기장은 그 강도가 림프 조직 부위에서 0.1 내지 0.5 테슬라 (Tesla)인 것인, 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 자기장은 1분 내지 120분 동안 공급하는 것인, 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 현미경 관찰은 입체현미경 (stereomicroscope), 광학현미경 (light microscope), 도립현미경 (inverted microscope), 공초점 레이저주 사현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM), 또는 동결주사전사현미경 (cryo scanning electron microscope, Cryo-SEM)으로 수행하는 것인, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 방법은 봉한관을 헤마톡실린과 에오신 (hematoxylin and eosin)으로 염색하는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 현미경 관찰은 광학현미경으로 수행하는 것인, 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 방법은 봉한관을 아크리딘 오렌지 (acridine orange)로 염색하는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 현미경 관찰은 공초점 레이저주사현미경, 또는 도립현미경으로 수행하는 것인, 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 코발트-페라이트 입자의 코어 (core), 및 상기 코어에 코팅된 비결정질 실리카의 셀 (shell)을 포함하며,

    상기 자성 나노 입자의 표면은 생체적합성 폴리머 (biocompatible polymer)에 의하여 변형된 것인, 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 유기 염료는 로다민 B 이소티오시아네이트 (rhodamine B isothiocyanate), 또는 플루오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate)인 것인, 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 코발트-페라이트 입자의 코어 (core) 및 상기 코어에 코팅된 비결정질 실리카의 셀 (shell)을 포함하며, 상기 자성 나노 입자의 표면이 생체적합성 폴리 (에틸렌 글리콜) 올리고머 (MNP-SiO₂(RITC)-PEG)에 의하여 더욱 변형된 것이고, 테트라-메틸 로다민 B 이소티오시아네이트 (RITC)로 표지된 것인, 방법.
14. 유기 염료로 표지된 자성 나노 입자를 포함하는 림프관 내부 봉한관 (Bonghan duct)용 가시화 제제.
15. 제14항에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 코발트-페라이트 입자의 코어 (core), 및 상기 코어에 코팅된 비결정질 실리카의 셀 (shell)을 포함하며,

    상기 자성 나노 입자의 표면은 생체적합성 폴리머 (biocompatible polymer)에 의하여 변형된 것인, 가시화 제제.
16. 제14항에 있어서, 상기 유기 염료는 로다민 B 이소티오시아네이트 (rhodamine B isothiocyanate), 또는 플루오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate)인 것인, 가시화 제제.
17. 제14항에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 코발트-페라이트 입자의 코어 (core) 및 상기 코어에 코팅된 비결정질 실리카의 셀 (shell)을 포함하며, 상기 자성 나노 입자의 표면이 생체적합성 폴리 (에틸렌 글리콜) 올리고머 (MNP-SiO₂(RITC)-PEG)에 의하여 더욱 변형된 것이고, 테트라-메틸 로다민 B 이소티오시아네이트 (RITC)로 표지된 것인, 가시화 제제.

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