CN113425863A - 一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法及其在血栓超声分子影像中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种血小板膜‑脂质体融合膜微气泡的制备方法及其在血栓超声分子影像中的应用，包括如下步骤：将血小板膜与脂质体融合得到血小板膜‑脂质体融合膜囊泡，对融合膜囊泡使用超声辅助法制备血小板膜‑脂质体融合膜微气泡。本发明对血小板膜‑脂质体混合物溶液采用反复液氮冷冻‑室温融化的方式促进磷脂双分子层之间的融合并得到融合膜囊泡，随后利用超声辅助将六氟化硫气体充入融合膜囊泡，得到一种结构稳定的血小板膜‑脂质体融合膜微气泡。

Description

一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法及其在血栓 超声分子影像中的应用
技术领域
本发明涉及一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法及其在血栓超声分子影像中的应用，可用于生物医学工程及超声分子影像学技术领域。
背景技术
超声成像是在临床上使用频率仅次于核磁共振的成像技术，具有非侵入性、便携性、无电离辐射和实时成像的优点。靶向对比增强超声(TCEU)技术是一种通过微气泡表面偶连的配体与疾病区域受体结合，从而获得特异性超声诊断信息的技术手段。靶向对比增强超声提供的超声分子影像已经在血栓、肿瘤血管、缺血性心血管疾病、炎症的靶向上展示出潜力。对于靶向对比增强超声技术，如何提高微泡在血液循环中的靶向效率同时避免被自身免疫系统过快清除是关键科学问题及技术瓶颈。
血小板表面天然具有如整合素αIIβ3、α2β1以及糖蛋白GPIb-IX-V等配体，能够靶向血栓处的纤维蛋白、胶原等组分。靶向血栓的配体均位于血小板膜上，利用血小板膜包裹的纳米颗粒可以继承血小板靶向血栓的能力。人工磷脂同时具有亲水端及疏水端长链，是超声微泡的主要构成材料，具有成分可控、标准化程度高的优点。利用磷脂脂质体可与细胞膜融合的特点，将脂质体与血小板膜融合，形成的融合膜不仅具有血小板膜天然的血栓靶向能力，同时还可以有效稀释血小板膜磷脂疏水端的胆固醇，允许惰性气体的进入形成结构稳定的微气泡。
发明内容
本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的上述问题，提出一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法及其在血栓超声分子影像中的应用。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，包括如下步骤：将血小板膜与脂质体融合得到血小板膜-脂质体融合膜囊泡，对融合膜囊泡使用超声辅助法制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡。
优选地，该方法包括如下步骤：
S1：差速离心法提取血小板膜；
S2：薄膜水化法制备磷脂脂质体；
S3：将所述S1步骤提取的血小板膜与S2步骤制备的脂质体用液氮冻融循环法制备血小板膜-脂质体融合膜囊泡；
S4.对所述S3制备步骤的血小板膜-脂质体融合膜囊泡使用超声辅助法制备血小板膜 -脂质体融合膜微气泡。
优选地，所述S1步骤包括以下步骤：
S11：将新鲜全血与CPD缓冲液按照体积比为10∶1的比例混合，再加入终浓度为 1μM的前列腺素E1；
S12：将所述S11步骤配置好的血液在医用离心机中于25℃，200×g的条件离心15min 沉淀红白细胞，用移液枪小心吸取淡黄色上清，避免吸到白膜层，所得即为富血小板血浆；
S13：将所述S12步骤得到富血小板血浆转移至新的离心管中，按照与富血小板血浆体积比为1∶1的比例加入HEPES缓冲液和终浓度为1μM的前列腺素PGE1，在25℃， 200×g，15min的条件下进一步沉淀红细胞和白细胞，得到纯化的富血小板血浆；
S14：将所述S13步骤得到的纯化的富血小板血浆在25℃，800×g，20min的条件下离心沉淀得到血小板，弃去上清，用Tyrode’s缓冲液重悬血小板并加入终浓度为42mM 的甘露糖、终浓度为1μM的PGE1和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物，得到纯化的血小板；
S15：在所述S14步骤得到的血小板中加入终浓度为42mM的甘露糖、终浓度为1μM的前列腺素E1，和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物并于常温下孵育2h，将配置后的血小板悬液放置于-80℃冰箱中冷冻1小时，随后在37℃恒温水浴槽中融化，反复该冻融循环三次后将血小板悬液在4℃，12000×g条件下离心15min得到血小板膜沉淀；用超纯水重悬该沉淀得到血小板膜悬液。
优选地，在所述S11步骤中，所述CPD缓冲液为16mM柠檬酸，90mM柠檬酸钠，16mM磷酸氢二钠，142mM右旋葡萄糖，pH 7.4；在所述S13步骤中，HEPES缓冲液为140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，3.8mM HEPES，在所述S14步骤中，Tyrode's缓冲液为134mM氯化钠，12mM碳酸氢钠，2.9mM氯化钾，0.34mM磷酸氢二钠，1mM 氯化镁，10mM HEPES。
优选地，所述S2步骤包括以下步骤：
S21：所述S2步骤得到的磷脂脂质体按照二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000、硬脂酸、二硬脂酸磷脂甘油质量比例为10∶10∶10∶4溶解在体积比为1∶1的氯仿和甲醇中；
S22：将S21步骤制备的有机溶液于50℃，100rpm的条件下旋蒸直到圆底烧瓶底部出现一层均匀的薄膜，取下圆底烧瓶，真空干燥2小时，干燥后的烧瓶中按照每17mg 脂质体加入2ml 0.01M磷酸缓冲溶液，并在50℃恒温摇床中于50℃、20rpm条件下水化 1小时，随后在100w、53kHZ的条件下水浴超声得到脂质体溶液，并调节脂质体溶液的PH为7.4。
优选地，所述S3步骤包括以下步骤：
S31：将所述S1步骤得到的血小板膜悬液与S2步骤得到的脂质体溶液按照血小板膜悬液蛋白与脂质体质量的比例为1∶10，1∶25，1∶50的比例在37℃恒温箱中共孵育 30分钟，所述的血小板膜悬液蛋白与脂质体质量的比例为1∶10；
S32：将所述S31步骤得到的混合溶液在液氮中放置5分钟，随后在37℃下融化，重复该循环5次，冻融循环后得到血小板膜-脂质体融合膜溶液；
S33：将所述S32步骤得到的血小板膜-脂质体融合膜溶液置于冰上，用功率为10w，频率为25Khz的探头超声，控制超声5秒开时间，5秒关时间，总时间为2分钟，得到血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液。
优选地，所述S4步骤包括以下步骤：
S41：将所述S3步骤制备的血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液取2ml置于10ml西林瓶中并通入100mg六氟化硫或全氟丙烷或全氟丁烷或氮气或其组合；
S42：将所述S41步骤通入六氟化硫后的血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液置于冰上，将超声探头置于血小板膜-脂质体融合膜溶液与六氟化硫气体的界面，控制超声的功率为200w，频率为25Khz，开时间为5秒，关时间为5秒，总时间为1分钟，制得血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液；
S43：在10ml西林瓶中加入S42步骤得到的血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液2ml，再加入0.5ml浓度为42mM的甘露醇，随后放置于-80℃冰箱中冷冻1小时，取出后于-42℃冻干机中进行冷冻干燥得到冻干粉；
S44：在所述S43步骤得到的冻干粉瓶中充入60mg六氟化硫气体，胶塞封瓶，铝盖钳口，保存于常温。
优选地，在所述S41步骤中，通入100mg六氟化硫；所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的平均粒径为1.8μm，zeta电位为-55mV。
优选地，所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的壳层由血小板膜与磷脂脂质体构成，所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的壳层表达血小板膜整合素αIIβ3，及糖蛋白CD62p。
优选地，能够应用在血栓超声分子影像中。
本发明采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：本发明对血小板膜- 脂质体混合物溶液采用反复液氮冷冻-室温融化的方式促进磷脂双分子层之间的融合并得到融合膜囊泡，随后利用超声辅助将六氟化硫气体充入融合膜囊泡，得到一种结构稳定的血小板膜-脂质体融合膜微气泡。在血小板膜-脂质体融合膜微气泡的表面检测出血小板膜表面的整合素αIIβ3，及糖蛋白CD62p，在大鼠下腔静脉血栓模型实验中，与商用超声造影剂声诺维相比本发明的血小板膜-脂质体融合膜微气泡能够特异性靶向急性血栓，增强血栓部位的超声造影信号，可作为临床诊断急性血栓的超声分子影像造影剂。
附图说明
图1为本发明的血小板膜-脂质体融合膜微泡制备示意图。
图2为本发明的血小板膜、血小板膜-脂质体融合膜囊泡、血小板膜-脂质体融合膜微气泡、声诺维的表征图；1)血小板膜、血小板膜-脂质体融合膜囊泡、血小板膜-脂质体融合膜微气泡、商业超声造影剂SonoVue的粒径及Zeta电位表征图；2)血小板膜脂质体融合微气泡的显微镜成像图及粒径分布图，标尺＝5μm 3)SonoVue的显微镜成像图及粒径分布图，标尺＝5μm。
图3为本发明的血小板膜-脂质体融合膜的表征图，分别DiO及DiI标记血小板膜及脂质体，融合后，用460nm波长的激光作为激发光，在480-680nm的范围内接收的荧光发射光谱图。
图4为本发明的血小板膜-脂质体融合膜的表征图表征图，1)血小板膜透射电镜表征图，标尺＝500nm；2)血小板膜-脂质体融合膜囊泡透射电镜表征图，标尺＝1μm；3)血小板膜-脂质体融合膜微气泡透射电镜表征图，标尺＝2μm。
图5为本发明的血小板膜-脂质体融合膜微气泡蛋白表征图，血小板脂质体融合膜微气泡共聚焦表征，1)绿光来自FITC标记Rat anti-mouse CD62P荧光抗体2)红光来自于嵌膜染料DiI，3)FITC与DiI染料荧光共定位图4)血小板膜-脂质体融合膜微气泡明场图，标尺＝5μm。
图6为本发明的血小板膜脂质体融合膜微气泡蛋白表征图，微气泡荧光抗体标记流式表征，淡蓝色曲线表示血小板膜脂质体融合膜微气泡，绿色曲线表示脂质体微气泡。
图7为本发明的血小板膜脂质体融合膜微气泡蛋白表征图，血小板及血小板膜-脂质体融合微气泡的SDS-PAGE表征图。
图8为本发明的血小板膜脂质体融合膜微气泡蛋白表征图，WesternBlot表征结果图。
图9为本发明的血小板膜脂质体融合膜微气泡蛋白表征图，血小板、血小板膜及血小板膜脂质体融合微气泡的免疫金标记透射电镜表征图，透射电镜图标尺＝200nm。
图10为本发明的大鼠下腔静脉血栓模型的手术构建图。
图11为本发明的大鼠下腔静脉血栓模型的B模式及多普勒超声造影图。
图12为本发明的静脉注射血小板膜脂质体融合膜微气泡及商用超声造影剂声诺维后，对大鼠下腔静脉血栓的靶向效果图。
图13为本发明的血管血栓处目标区域的对比增强信号强度曲线图。
具体实施方式
本发明的目的、优点和特点，将通过下面优选实施例的非限制性说明进行图示和解释。这些实施例仅是应用本发明技术方案的典型范例，凡采取等同替换或者等效变换而形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
本发明揭示了一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡超声造影的制备方法，如图1所示，本发明将细胞膜与磷脂脂质体混合物在液氮中冷冻，随后在高于细胞膜相转变温度的条件下融化，重复数次后，细胞膜中的磷脂与脂质体充分融合再使用探头超声的方式充入六氟化硫气体制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡。
一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1：差速离心法提取血小板膜；
S2：薄膜水化法制备磷脂脂质体；
S3：将所述S1步骤提取的血小板膜与S2步骤制备的脂质体用液氮冻融循环法制备血小板膜-脂质体融合膜囊泡；
S4.对所述S3制备步骤的血小板膜-脂质体融合膜囊泡使用超声辅助法制备血小板膜 -脂质体融合膜微气泡。
所述S1步骤包括以下步骤：S11：将新鲜全血与CPD缓冲液按照体积比为10∶1 的比例混合，再加入终浓度为1μM的前列腺素E1；
S12：将所述S11步骤配置好的血液在医用离心机中于25℃，200×g的条件离心15min 沉淀红白细胞，用移液枪小心吸取淡黄色上清，避免吸到白膜层，所得即为富血小板血浆；
S13：将所述S12步骤得到富血小板血浆转移至新的离心管中，按照与富血小板血浆体积比为1∶1的比例加入HEPES缓冲液和终浓度为1μM的前列腺素PGE1，在25℃， 200×g，15min的条件下进一步沉淀红细胞和白细胞，得到纯化的富血小板血浆；
S14：将所述S13步骤得到的纯化的富血小板血浆在25℃，800×g，20min的条件下离心沉淀得到血小板，弃去上清，用Tyrode's缓冲液重悬血小板并加入终浓度为42mM 的甘露糖、终浓度为1μM的PGE1和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物，得到纯化的血小板；
S15：在所述S14步骤得到的血小板中加入终浓度为42mM的甘露糖、终浓度为1μM的前列腺素E1，和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物并于常温下孵育2h，将配置后的血小板悬液放置于-80℃冰箱中冷冻1小时，随后在37℃恒温水浴槽中融化，反复该冻融循环三次后将血小板悬液在4℃，12000×g条件下离心15min得到血小板膜沉淀；用超纯水重悬该沉淀得到血小板膜悬液。
在所述S11步骤中，所述CPD缓冲液为16mM柠檬酸，90mM柠檬酸钠，16mM 磷酸氢二钠，142mM右旋葡萄糖，pH 7.4；在所述S13步骤中，HEPES缓冲液为140mM 氯化钠，2.7mM氯化钾，3.8mM HEPES，在所述S14步骤中，Tyrode's缓冲液为134mM 氯化钠，12mM碳酸氢钠，2.9mM氯化钾，0.34mM磷酸氢二钠，1mM氯化镁，10mM HEPES。
所述S2步骤包括以下步骤：S21：所述S2步骤得到的磷脂脂质体按照二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000、硬脂酸、二硬脂酸磷脂甘油质量比例为10∶10∶10∶4溶解在体积比为1∶1的氯仿和甲醇中；
S22：将S21步骤制备的有机溶液于50℃，100rpm的条件下旋蒸直到圆底烧瓶底部出现一层均匀的薄膜，取下圆底烧瓶，真空干燥2小时，干燥后的烧瓶中按照每17mg 脂质体加入2ml 0.01M磷酸缓冲溶液，并在50℃恒温摇床中于50℃、20rpm条件下水化 1小时，随后在100w、53kHZ的条件下水浴超声得到脂质体溶液，并调节脂质体溶液的PH为7.4。
所述S3步骤包括以下步骤：S31：将所述S1步骤得到的血小板膜悬液与S2步骤得到的脂质体溶液按照血小板膜悬液蛋白与脂质体质量的比例为1∶10，1∶25，1∶50的比例在37℃恒温箱中共孵育30分钟，所述的血小板膜悬液蛋白与脂质体质量的比例为 1∶10；
S32：将所述S31步骤得到的混合溶液在液氮中放置5分钟，随后在37℃下融化，重复该循环5次，冻融循环后得到血小板膜-脂质体融合膜溶液；
S33：将所述S32步骤得到的血小板膜-脂质体融合膜溶液置于冰上，用功率为10w，频率为25Khz的探头超声，控制超声5秒开时间，5秒关时间，总时间为2分钟，得到血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液。
所述S4步骤包括以下步骤：S41：将所述S3步骤制备的血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液取2ml置于10ml西林瓶中并通入100mg六氟化硫或全氟丙烷或全氟丁烷或氮气或其组合；
S42：将所述S41步骤通入六氟化硫后的血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液置于冰上，将超声探头置于血小板膜-脂质体融合膜溶液与六氟化硫气体的界面，控制超声的功率为200w，频率为25Khz，开时间为5秒，关时间为5秒，总时间为1分钟，制得血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液；
S43：在10ml西林瓶中加入S42步骤得到的血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液2ml，再加入0.5ml浓度为42mM的甘露醇，随后放置于-80℃冰箱中冷冻1小时，取出后于-42℃冻干机中进行冷冻干燥得到冻干粉；
S44：在所述S43步骤得到的冻干粉瓶中充入60mg六氟化硫气体，胶塞封瓶，铝盖钳口，保存于常温。
在所述S41步骤中，通入100mg六氟化硫；所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的平均粒径为1.8μm，zeta电位为-55mV。
所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的壳层由血小板膜与磷脂脂质体构成，所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的壳层表达血小板膜整合素αIIβ3，及糖蛋白CD62p。
该血小板膜-脂质体融合膜微气泡，能够应用在血栓超声分子影像中。
在本技术方案中，所选的血小板来自人、大鼠、小鼠、兔、牛、猪的全血；所选的磷脂为二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000、硬脂酸、二硬脂酸磷脂甘油的组合。
所述全血提取出的血小板，加入终浓度为42mM的甘露糖、终浓度为1μM的前列腺素E1，和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物，得到浓度为2×108个/ml的血小板悬液。将血小板悬液在-80℃冰箱中冷冻1小时，随后在37℃恒温水浴箱中融化，反复三次后于4℃，12000×g条件下离心15分钟得到血小板膜沉淀并重悬于超纯水中得到血小板膜悬液。
所述磷脂按照二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000、硬脂酸、二硬脂酸磷脂甘油的质量比例为10∶10∶10∶4将磷脂溶解在体积比为1∶1的氯仿和甲醇中，于50℃，100rpm的条件下旋蒸直到圆底烧瓶底部出现一层均匀的薄膜，取下烧瓶，真空干燥8小时。往干燥后的烧瓶中加入磷酸缓冲液并在50℃、100w、53kHZ 的条件下水浴超声得到脂质体溶液，并调节脂质体溶液的PH为7.4。
分别取20ul的血小板、血小板膜、血小板膜-脂质体融合膜，加入到2ml 10％(w/v)的葡萄糖溶液中，用ZetaPALS激光粒度仪进行粒径的测量，另各取20ul各组分稀释于 2ml超纯水中插入电极进行Zeta电位的测量，得到的粒径及Zeta电位结果在图2中显示。
用BCA法测定细胞膜蛋白的含量，然后分别用过量的DiO和DiI对血小板膜和脂质体进行染色，随后用12000g，15min，4℃的条件去除未嵌膜的染料。按照膜蛋白：脂质体的质量比例分别为1∶10，1∶25，1∶50的比例添加两种膜材并在37℃恒温箱中共孵育30分钟，取出后在液氮中放置1分钟，随后放置于37℃融化，重复该循环5 次。冻融循环后的融合膜溶液置于冰上，用功率为10w，频率为25Khz的探头超声，控制超声5秒开时间，5秒关时间，总时间为2分钟，得到荧光标记血小板膜-脂质体融合膜囊泡。在3ml的石英比色皿加入2ml水和20ul样品，用460nm波长的激光作为激发光，接收480-680nm的发射光。
由于DiI与DiO分子在距离小于10nm时会发生Foster荧光共振能量转移(FRET)，嵌在磷脂双分子层中疏水端的分子彼此接近且小于10nm可以证明血小板膜与脂质体的磷脂进行了相互的融合。随着膜蛋白与脂质体的比例增大，508nm处供体Dio的荧光强度逐渐降低，而在562nm处受体DiI的荧光强度逐渐增大，说明两种膜的融合程度增大，荧光光谱结果在图3中显示。
将血小板膜-脂质体融合膜溶液转移到10ml西林瓶中，用冰水孵育。往瓶中通入足量六氟化硫，将
Figure RE-GDA0003191711110000101
探头置于溶液与的界面，超声的功率为200w，频率为25Khz，开时间为5秒，关时间为5秒，总时间1分钟为的方式制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡，观察到悬液由澄清变为乳状，所得乳浊液即为血小板膜-脂质体融合膜微气泡。将血小板 -脂质体融合膜微气泡乳浊液与商用超声造影剂声诺维分别稀释10倍，放置于凹槽载玻片上，盖上盖玻片用显微镜的40倍物镜观察并拍照，将拍的照片按照标尺用Image J软件分析粒径，血小板-脂质体融合膜微气泡与声诺维的显微镜图像及粒径统计结果分别在图2(2)与图2(3)中显示。将制备好的微气泡悬液放置于-80℃冰箱中冷冻30分钟，取出后放在冻干机中进行冷冻干燥；干燥之后往瓶中充入足量六氟化硫气体，盖上瓶盖，保存于常温。
取血小板膜悬液稀释100倍，用2.5％戊二醛固定过夜，取10ul沉降于200目铜网上，待其自然风干后，用1％的醋酸双氧铀负染3次，每次1min；取血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液稀释100倍，滴10ul沉降于200目的铜网上，待其自然风干，用1％的醋酸双氧铀负染3次，每次1min；取血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液悬液稀释100倍，滴10ul沉降于200目铜网上，待其自然风干，用1％的醋酸双氧铀负染3次，每次1分钟；使用日立HT7700透射电镜在100kv的加速电压下对上述样品进行表征。血小板膜的形貌在图4(1)中显示，血小板膜-脂质体融合膜囊泡的形貌在图4(2)中显示，血小板膜-脂质体融合膜微气泡的形貌在图4(3)中显示。
用过量的DiI对脂质体进行染色，随后用12000g，15min，4℃的条件去除未嵌膜的染料。按照血小板膜蛋白：脂质体的质量比例分别为1∶10的比例添加两种膜材并在37℃恒温箱中共孵育30分钟，取出后在液氮中放置1分钟，随后放置于37℃融化，重复该循环5次。冻融循环后的融合膜溶液置于冰上，用功率为10w，频率为25Khz的探头超声，控制超声5秒开时间，5秒关时间，总时间为2分钟。制备的血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液取2ml置于10ml西林瓶中并通入100mg六氟化硫将超声探头置于血小板膜-脂质体融合膜溶液与六氟化硫气体的界面，控制超声的功率为200w，频率为25Khz，开时间为5秒，关时间为5秒，总时间为1分钟，制得DiI标记脂质体的血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液。将制备的DiI标记脂质体的血小板膜-脂质体融合膜微气泡与 FITC标记的Rat anti-mouseCD62P抗体先涡旋混合2分钟，再放于37℃中缓慢搅拌孵育30分钟，取出后在200×g，2分钟的离心条件将微气泡与未结合的抗体分离。取微气泡稀释20倍后滴于带有凹槽的载玻片中，再盖上盖玻片，分别用484nm和559nm的激发光源拍摄共聚焦显微镜，共聚焦显微镜的拍摄结果在图5中显示。
另取血小板膜-脂质体融合膜微气泡以及脂质体微气泡100u1分别与10ul FITC标记的 Rat anti-mouseCD62P抗体孵育进行流式细胞仪的表征，收集100，000个气泡的荧光信号，用Flow软件进行荧光的分析，并进行荧光归一化的分析，结果在图6中显示。
配置SDS-PAGE电泳液、6％的分离胶10ml和5％的浓缩胶2ml，在胶板中先加入6％的分离胶，加催化聚合剂之后，聚合1h；再加浓缩胶，插入梳齿后聚合。将血小板、血小板膜-脂质体融合膜微气泡按照相同的蛋白浓度的比例稀释，随后加入蛋白上样液，用沸水煮3分钟，放置室温冷却备用。从左到右分别加入10-180kDa的预染Marker、血小板上样液、血小板膜-脂质体融合膜微气泡上样液各10ul。电压设置为80v，电泳时间设置为1h，待彩色Marker显示两条彩色条带时说明电泳完成。电泳结束后小心割下胶块，在考马斯亮蓝G250染液中染3h，染色完成后再用脱色液进行脱色即可得到SDS-PAGE 胶图，结果在图7中显示。
SDS-PAGE完成后预先将转膜液4℃预冷。打开转移槽，在内面铺上己经用转膜缓冲液浸湿的海绵垫，其上放三层浸有转膜缓冲液的Whatman3MM滤纸，注意排净气泡。在滤纸上铺上经甲醇和转膜液浸湿的NC膜。膜、滤纸和凝胶的大小，大致相同。小心撬开玻璃板，将胶放置含有转膜液的托盘内，将含有目的条带的分离胶切下，用转膜液浸泡后置于NC膜上。在分离胶上再放三层浸过转膜液的Whatman滤纸，排净气泡。放上第二块海绵垫，使整个转印夹层依次形成“纤维垫-滤纸-NC膜-凝胶-滤纸-纤维垫”层次，关闭转印夹，放入转移槽中。
打开Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统电源，进行转膜。转膜结束后，取出NC膜并作好标记，用TBST洗膜5分钟×3次。将NC膜放入平皿中，加入含5％脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡2h。封闭结束后，用TBST洗膜5分钟×3次。将膜放入含一抗(用 westem一抗稀释液稀释)的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜。第二天取出，室温振荡30 分钟，吸弃一抗，TBST洗10分钟×3次。用二抗稀释液稀释二抗，室温摇床振荡反应 2h。
二抗反应结束后，回收二抗。然后用TBsT洗膜5分钟×3次。将EcL化学发光试剂盒中的A、B两种液体按1∶1等体积混合，配置成工作液备用。将NC膜从TBsT中取出，甩掉多余的液体，将含有蛋白质的膜正面朝上，放在保鲜膜，滴加适量工作液，用保鲜膜覆盖。使用G：BOX chemiXR5成像，Western Blot的结果在图8中显示。
取10μl稀释后的血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液滴于铜网上，1h后用除菌的 PBS(含有1％BSA与50×10-9M甘氨酸)冲洗铜网。取10μl兔抗鼠CD62p抗体滴在铜网上，室温下孵育30分钟后吸走液体并用1％BSA封闭15分钟。
取10μl山羊抗兔IgG标记的20nm金球(5×10-9M)滴于铜网上，室温孵育1h，吸走液体后用除菌的PBS(含有1％BSA与50×10-9M甘氨酸)润洗铜网2-3遍，吸走液体后铜网在真空干燥箱中放置30分钟后用10μl 1％醋酸双氧铀染5分钟，用超纯水清洗后再放置在真空干燥箱中干燥2h后使用日立HT7700透射电镜在100kv的加速电压下进行表征，血小板-脂质体融合膜微气泡免疫金标记透射电镜的结果在图9中显示。
用10％的水合氯醛麻醉大鼠，开腹后找到下腔静脉，并用一段长为8mm，宽为4mm的滤纸条泡在20％的三氯化铁中，取出后贴在下腔静脉表面，1分钟后取走滤纸条，并用PBS重洗该处，手术构建大鼠下腔静脉血栓模型的过程在图10中显示。
超声造影设备采用GE公司生产的LOGIQ E9型全身应用超高端彩超，首先选用18MHz探头机械指数MI调节为1.0，在B模式下对下腔静脉进行造影，对血栓的大小及位置进行判断，在多普勒模式下对血栓处的血流进行造影，血栓处B模式与多普勒模式的超声图像在图11中显示。分别用5ml注射器抽取5ml生理盐水加入到血小板膜-脂质体融合膜微气泡冻干粉以及意大利Bracco公司生产的SonoVue冻干粉中，用力震荡复溶分别形成血小板膜-脂质体融合膜微气泡以及SonoVue。
将血小板膜-脂质体融合膜微气泡以及SonoVue通过尾静脉分别注射入大鼠的尾静脉中。再选用9MHz的探头，机械指数MI调节为0.14，在对比增强模式(CEUS) 下对下腔静脉进行造影，血管灌注及血栓靶向时的对比增强超声图像在图12中体现。连续采集5分钟内的图像，并使用MATLAB软件对图像感兴趣区域的信号强度进行分析，并根据超声强度的标尺来确定感兴趣区域的超声信号值，感兴趣区域超声信号曲线在图 13中显示。
实施例1
1、提取大鼠全血血小板，制备血小板膜悬液。大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，采用毛细管眼眶取血的方式收集新鲜全血，将全血与CPD缓冲液(16mM柠檬酸，90 mM柠檬酸钠，16mM磷酸氢二钠，142mM右旋葡萄糖，pH 7.4)按照体积比为10∶ 1的比例混合，再加入终浓度为1μM的前列腺素E1。将配置好的血液在医用离心机中以25℃，200×g，15min，的条件离心沉淀红白细胞，用移液枪小心吸取淡黄色上清，但避免吸到白膜层，所得即为富血小板血浆。将富血小板血浆转移至10ml离心管中，按照与富血小板血浆体积比为1∶1的比例加入HEPES缓冲液(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，3.8mM HEPES)和终浓度为1μM的前列腺素PGE1，在25℃，200×g，15min的条件下进一步沉淀红细胞和白细胞，得到纯化的富血小板血浆。纯化的富血小板血浆在25℃， 800×g，20min的条件下离心沉淀得到血小板，弃去上清，用Tyrode's缓冲液(134mM氯化钠，12mM碳酸氢钠，2.9mM氯化钾，0.34mM磷酸氢二钠，1mM氯化镁，10mM HEPES)重悬血小板并加入终浓度为42mM的甘露糖、终浓度为1μM的PGE1，和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物，得到纯化的血小板悬液。吸取10μl的纯化的血小板悬液滴于血球计数板中，并在显微镜下观察计数。将血小板悬液转移至-80℃冰箱中冷冻1小时后再取出放在37℃恒温水浴箱中融化，重复这个步骤3次使得血小板破裂。将反复冻融后的血小板悬液于离心机中在4℃，12000×g，20min的条件下沉淀血小板膜并用超纯水重悬得到血小板膜悬液，用BCA法定量血小板膜总蛋白浓度，将血小板膜悬液保存在-80℃冰箱中备用。
2、制备脂质体溶液。在100ml圆底烧瓶中加入按照质量比为10∶10∶10∶4的比例依次加入二硬脂酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)、硬脂酸和二硬脂酸磷脂甘油(DPPG)，将其溶解在体积比为1∶1 的氯仿与甲醇混合溶液中。将圆底烧瓶于50℃，100rpm的条件下旋蒸直到大部分有机溶剂挥发，继续抽真空2h进一步去除有机溶剂，可见烧瓶底部有一层均匀的乳白色薄膜。干燥后的烧瓶中按照每17mg脂质体加入2ml 0.01M磷酸缓冲溶液，并在50℃恒温摇床中于50℃、20rpm条件下水化1小时，随后在100w、53kHZ的条件下水浴超声得到脂质体溶液，并调节脂质体溶液的PH为7.4。往干燥的烧瓶中加入磷酸盐缓冲液PBS并在 50℃、100w、53kHZ的条件下水浴超声得到脂质体溶液。
3、制备血小板-脂质体融合膜溶液。将上述步骤制备的血小板膜悬液与脂质体按照血小板膜总蛋白与脂质体质量比为1∶10的比例在37℃恒温箱中共孵育30min，取出后在液氮中放置5min，随后放置于37℃融化，重复5次并在冰上用功率为10w，频率为 25Khz的探头超声，5s开时间，5s关时间，总时间为2分钟，得到血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液。
4、制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡。将重悬的血小板膜-脂质体融合囊泡悬液转移到10ml西林瓶中，用冰水孵育。往瓶中通入100mg六氟化硫，将φ6探头置于溶液与的界面，超声的功率为200w，频率为25Khz，开时间为5s，关时间为5s，总时间为1min 的方式制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡。将制备好的微气泡悬液放置于-80℃冰箱中冷冻30min，取出后放在冻干机中进行冷冻干燥；干燥之后往瓶中充入足量SF6，盖上瓶盖，保存于常温。
5、血小板膜脂质体融合膜微气泡血栓超声靶向造影。用10％的水合氯醛麻醉大鼠，开腹后找到下腔静脉并分离表面的被膜。用一段长为8mm，宽为4mm的滤纸条泡在20％的三氯化铁中，取出后贴在下腔静脉表面损伤血管，3min后取走滤纸条，并用PBS清洗表面，30min后进行血栓的观察。超声造影设备采用GE公司生产的LOGIQ E9型全身应用超高端彩超，首先选用18MHz探头机械指数MI调节为1.0，在B模式下对下腔静脉进行造影，对血栓的大小及位置进行判断。分别用5ml注射器抽取5ml生理盐水加入到血小板膜脂质体融合膜微气泡冻干粉以及意大利Bracco公司生产的SonoVue冻干粉中，用力震荡复溶分别形成血小板膜脂质体融合膜微气泡以及SonoVue。将融合膜微气泡以及SonoVue通过尾静脉分别注射入大鼠的尾静脉中。再选用9MHz的探头，机械指数 MI调节为0.14，在对比增强模式(CEUS)下对下腔静脉进行造影，并连续采集5min 内的图像，用MATLAB分析感兴趣区域的超声信号强度。
本发明将细胞膜与磷脂脂质体混合物在液氮中冷冻，随后在室温融化，重复5次后，细胞膜中的磷脂与脂质体充分融合；使用超声辅助的方式充入六氟化硫气体制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡。在三氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓模型中，本发明的血小板膜-脂质体融合膜微气泡能够特异性靶向急性血栓，增强血栓部位的超声造影信号。
本发明提出了一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，将具有血栓靶向能力的血小板膜与人工磷脂进行融合得到了超声性能稳定的融合膜微气泡。融合膜微气泡继承了血小板膜表面丰富的蛋白，在血液循环中的靶向效率得以提高同时避免被自身免疫系统过快清除，在动物模型中验证了融合膜微气泡的血栓超声分子影像。
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将血小板膜与脂质体融合得到血小板膜-脂质体融合膜囊泡，对融合膜囊泡使用超声辅助法制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡。
2.根据权利要求1所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1：差速离心法提取血小板膜；
S2：薄膜水化法制备磷脂脂质体；
S3：将所述S1步骤提取的血小板膜与S2步骤制备的脂质体用液氮冻融循环法制备血小板膜-脂质体融合膜囊泡；
S4.对所述S3制备步骤的血小板膜-脂质体融合膜囊泡使用超声辅助法制备血小板膜-脂质体融合膜微气泡。
3.根据权利要求2所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：
所述S1步骤包括以下步骤：
S11：将新鲜全血与CPD缓冲液按照体积比为10∶1的比例混合，再加入终浓度为1μM的前列腺素E1；
S12：将所述S11步骤配置好的血液在医用离心机中于25℃，200×g的条件离心15min沉淀红白细胞，用移液枪小心吸取淡黄色上清，避免吸到白膜层，所得即为富血小板血浆；
S13：将所述S12步骤得到富血小板血浆转移至新的离心管中，按照与富血小板血浆体积比为1∶1的比例加入HEPES缓冲液和终浓度为1μM的前列腺素PGE1，在25℃，200×g，15min的条件下进一步沉淀红细胞和白细胞，得到纯化的富血小板血浆；
S14：将所述S13步骤得到的纯化的富血小板血浆在25℃，800×g，20min的条件下离心沉淀得到血小板，弃去上清，用Tyrode’s缓冲液重悬血小板并加入终浓度为42mM的甘露糖、终浓度为1μM的PGE1和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物，得到纯化的血小板；
S15：在所述S14步骤得到的血小板中加入终浓度为42mM的甘露糖、终浓度为1μM的前列腺素E1，和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物并于常温下孵育2h，将配置后的血小板悬液放置于-80℃冰箱中冷冻1小时，随后在37℃恒温水浴槽中融化，反复该冻融循环三次后将血小板悬液在4℃，12000×g条件下离心15min得到血小板膜沉淀；用超纯水重悬该沉淀得到血小板膜悬液。
4.根据权利要求3所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：在所述S11步骤中，所述CPD缓冲液为16mM柠檬酸，90mM柠檬酸钠，16mM磷酸氢二钠，142mM右旋葡萄糖，pH 7.4；在所述S13步骤中，HEPES缓冲液为140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，3.8mM HEPES，在所述S14步骤中，Tyrode’s缓冲液为134mM氯化钠，12mM碳酸氢钠，2.9mM氯化钾，0.34mM磷酸氢二钠，1mm氯化镁，10mM HEPES。
5.根据权利要求2所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：所述S2步骤包括以下步骤：
S21：所述S2步骤得到的磷脂脂质体按照二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000、硬脂酸、二硬脂酸磷脂甘油质量比例为10∶10∶10∶4溶解在体积比为1∶1的氯仿和甲醇中；
S22：将S21步骤制备的有机溶液于50℃，100rpm的条件下旋蒸直到圆底烧瓶底部出现一层均匀的薄膜，取下圆底烧瓶，真空干燥2小时，干燥后的烧瓶中按照每17mg脂质体加入2ml 0.01M磷酸缓冲溶液，并在50℃恒温摇床中于50℃、20rpm条件下水化1小时，随后在100w、53kHZ的条件下水浴超声得到脂质体溶液，并调节脂质体溶液的PH为7.4。
6.根据权利要求2所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：
所述S3步骤包括以下步骤：
S31：将所述S1步骤得到的血小板膜悬液与S2步骤得到的脂质体溶液按照血小板膜悬液蛋白与脂质体质量的比例为1∶10，1∶25，1∶50的比例在37℃恒温箱中共孵育30分钟，所述的血小板膜悬液蛋白与脂质体质量的比例为1∶10；
S32：将所述S31步骤得到的混合溶液在液氮中放置5分钟，随后在37℃下融化，重复该循环5次，冻融循环后得到血小板膜-脂质体融合膜溶液；
S33：将所述S32步骤得到的血小板膜-脂质体融合膜溶液置于冰上，用功率为10w，频率为25Khz的探头超声，控制超声5秒开时间，5秒关时间，总时间为2分钟，得到血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液。
7.根据权利要求2所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：
所述S4步骤包括以下步骤：
S41：将所述S3步骤制备的血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液取2ml置于10ml西林瓶中并通入100mg六氟化硫或全氟丙烷或全氟丁烷或氮气或其组合；
S42：将所述S41步骤通入六氟化硫后的血小板膜-脂质体融合膜囊泡悬液置于冰上，将超声探头置于血小板膜-脂质体融合膜溶液与六氟化硫气体的界面，控制超声的功率为200w，频率为25Khz，开时间为5秒，关时间为5秒，总时间为1分钟，制得血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液；
S43：在10ml西林瓶中加入S42步骤得到的血小板膜-脂质体融合膜微气泡乳浊液2ml，再加入0.5ml浓度为42mM的甘露醇，随后放置于-80℃冰箱中冷冻1小时，取出后于-42℃冻干机中进行冷冻干燥得到冻干粉；
S44：在所述S43步骤得到的冻干粉瓶中充入60mg六氟化硫气体，胶塞封瓶，铝盖钳口，保存于常温。
8.根据权利要求7所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：在所述S41步骤中，通入100mg六氟化硫；所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的平均粒径为1.8μm，zeta电位为-55mV。
9.根据权利要求1所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法，其特征在于：所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的壳层由血小板膜与磷脂脂质体构成，所述血小板膜-脂质体融合膜微气泡的壳层表达血小板膜整合素αIIβ3，及糖蛋白CD62p。
10.如权利要求1～8任一项所述的一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡，其特征在于：能够应用在血栓超声分子影像中。
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