CN113769118A - 一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途 - Google Patents

一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113769118A
CN113769118A CN202110718964.XA CN202110718964A CN113769118A CN 113769118 A CN113769118 A CN 113769118A CN 202110718964 A CN202110718964 A CN 202110718964A CN 113769118 A CN113769118 A CN 113769118A
Authority
CN
China
Prior art keywords
platelet membrane
phospholipid
platelet
mbs
ultrasonic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110718964.XA
Other languages
English (en)
Inventor
杨静
缪小燕
关宇
陈素芳
张政
尹庭辉
姚伟锋
黑子清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Original Assignee
Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University filed Critical Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Priority to CN202110718964.XA priority Critical patent/CN113769118A/zh
Publication of CN113769118A publication Critical patent/CN113769118A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
    • A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
    • A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres

Abstract

本发明公开了一种血小板膜仿生超声微泡，包含壳膜材料和填充气体，所述壳膜材料包含磷脂和血小板膜，所述血小板膜覆盖于磷脂上和/或分散于磷脂中。其在体外具备良好的稳定性、超声成像能力、细胞相容性和胶原靶向性，且血小板膜仿生超声微泡体内循环时间长、能显著保留于肾脏中，基于血小板膜功能蛋白修饰、超声靶向成像和定向微泡破坏技术可实现对脓毒症肾损伤早期血管损伤粘附信号的检测，实现对脓毒症肾损伤的早期诊断。基于本发明提供的血小板膜仿生超声微泡，结合超声设备能提供一种简单、方便的脓毒症肾损伤监测方法，有利于实现早期诊断，以克服现有技术诊断标准所存在的缺陷，使患者尽早得到相应的治疗，从而获得良好的临床结果。

Description

一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途
技术领域
本发明涉及超声分子影像学和生物医学工程领域，更具体地，涉及一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)指短时间内由于各种原因肾小球滤过率突然下降导致含氮物质蓄积，从而引起水、电解质、酸碱平衡和全身并发症快速发展的临床综合征。而脓毒症及脓毒症休克则是造成重症患者AKI最主要的原因，调查显示ICU超过50％的AKI与脓毒症相关。同时，脓毒症致急性肾损伤(sepsis-induced acute kidneyinjury,SAKI)不同于非脓毒症所致AKI，具有独特的病理生理机制，所以虽然近年来针对SAKI的基础研究和临床疗法取得了很大进步，但仍无法满足实际治疗需求，脓毒症肾损伤的死亡率仍然居高不下。脓毒症致急性肾损伤(sepsis-induced acute kidney injury,SAKI)的防治已成为现代医疗技术面临的重大医疗问题。
近年来，现有研究证实，SAKI的早期诊断及治疗可以显著降低患者死亡率、减少肾脏替代治疗。所以，SAKI的早期诊断对SAKI的治疗显得至关重要，通过早期诊断有利于及时治疗，并良好的预后，以降低患者死亡率、减少肾脏替代治疗。
目前，脓毒症急性肾损伤诊断仍然是结合AKI和脓毒症的诊断结果作为诊断依据，诊断依据主要包括血肌酐的增加、尿量的减少。但肌酐基线值的难以确定性、滞后性以及尿量变化不敏感、检测难度，极大限制了SAKI的早期诊断，对于SAKI的早期诊断较难提供较为准确的参考结果。而对于后期的诊断，其确诊时间的推迟已然使患者错过了最佳治疗时期，仍然难以避免不良结局。即现有技术中肌酐、尿量作为诊断标准仍存在一定的缺陷，不利于SAKI的早期诊断。除此之外，部分现有技术还研究有标记物的方式用于SAKI的诊断，包括尿微球蛋白、尿N-乙酰-'D-氨基葡萄糖苷、白蛋白等，但是，该类标记物同样存在各自的缺陷，如：易受炎症状态、营养水平等混杂因素的影响，仍然难以应用并实现有效的SAKI早期诊断。现有技术亟需一种能应用在SAKI病症早期诊断中的相关物质、方法等。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途，通过所述血小板膜仿生超声微泡能够实现对脓毒症肾损伤早期血管损伤的检测，实现对脓毒症肾损伤的早期诊断，更能实现在制备用于检测血小板可靶向部位是否损伤的超声造影剂上的用途，该血小板膜仿生超声微泡的制备方法简单、便于操作，有利于投入实际生产、广泛应用。
本发明的一个目的在于提供一种血小板膜仿生超声微泡，包含壳膜材料和填充气体，所述壳膜材料包含磷脂和血小板膜，所述血小板膜覆盖于磷脂上和/或分散于磷脂中。
靶向超声造影成像是一门新兴的将超声造影技术与靶向超声微泡造影剂相结合，对体内组织器官微观病变进行分子水平探测与成像的方法。其通过对超声微泡表面进行配体修饰，可在细胞和分子水平表征疾病，具有极好的灵敏度和特异性。但是，现有技术中的传统靶向超声微泡也存在部分缺陷，其壳膜材料可能需要以外源性化合物作为组成成分，而外源性特性则容易引发生物安全性的问题。且在实际应用中，该类传统靶向超声微泡也容易增加网状内皮系统和生物粘附引起的滞留等，触发机体免疫清除机制，不仅靶向造影效果低，且可能引起机体的不适、过敏反应等。基于现有技术中传统超声微泡的缺陷，现有技术提出用通过细胞膜作为壳膜材料形成的超声微泡，经细胞膜包被后，不仅获得了天然细胞膜的理化性质增加了材料的免疫安全性，而且由于完整的膜蛋白和免疫分子的保留，具备天然多靶向性。
脓毒症致急性肾损伤过程中，同样会涉及到多种细胞之间、细胞膜与配体之间的配合，而利用脓毒症病理、生理相关细胞膜包被形成超声微泡，再进行靶向超声成像，则有利于提供脓毒症急性肾损伤早期诊断的有效方案。目前，脓毒症急性肾损伤的机制尚未完全阐明，但本发明人发现其病理机制至少与微循环障碍、免疫反应和细胞功能障碍有关。在上述生化过程中，血小板在其中扮演着重要角色，不仅发挥常规的凝血作用，还与其他免疫细胞相互作用介导脓毒症的免疫反应。脓毒症发生时，循环毒素作用于血管内皮，降低微循环血流量并产生大量炎性反应介质，引起微血管内皮屏障破坏和糖萼脱落。内皮损伤暴露出vWF、各种胶原、纤维蛋白原和其他粘附分子，作为循环系统的哨兵，血小板会通过GPIb-V-IX复合物连接到胶原与vWF相互作用，随后通过整合素α2β1、GPVI与胶原相互作用，稳定而牢固地粘附到内皮下层，继续介导脓毒症的演变。而肾损伤同样会涉及到血管损伤多个层面，本发明人就此设计有拟血小板的靶向超声微泡，以主动靶向肾脏血管损伤部位进行靶向超声成像，从而实现脓毒症急性肾损伤(SAKI)的早期诊断。
本发明提供的血小板膜仿生超声微泡，其包括血小板膜与磷脂共同形成的壳膜材料和填充于壳膜内的填充气体，所述磷脂能为超声微泡的形成和超声微泡在超声成像中的应用提供足够的稳定性，所述壳膜中的血小板膜则能提供拟血小板功能，超声微泡通过壳膜上血小板膜表面蛋白靶向于血小板能靶向粘附的部位。对于现有的脓毒症急性肾损伤，通过本发明的血小板膜仿生超声微泡能靶向粘附肾脏血管损伤部位，超声成像并与正常肾脏比较则能确定肾脏血管是否受损伤、损伤位置、损伤程度，便于监测以确认是否发生脓毒症致急性肾损伤。进一步地，所述血小板膜仿生超声微泡壳膜材料中所述血小板膜覆盖于磷脂上和/或分散于磷脂中，即所述血小板膜覆盖于超声微泡外壁、内壁和/或分散于磷脂之间。进一步地，所述血小板膜分散于磷脂之间包括血小板膜穿插在相邻磷脂之间。进一步地，所述血小板膜选自哺乳动物的血小板膜。
进一步地，磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、叠氮磷酸二苯酯中的一种或多种。
进一步地，磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和叠氮磷酸二苯酯(DPPA)，且二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和叠氮磷酸二苯酯的质量比为18:3.5:1。在本发明的一个以上实施例中，采用DPPC:DSPE-PEG2000:DPPA质量比18:3.5:1混合形成磷脂，该基于该磷脂形成的微泡能提供稳定的结构和成像能力。
进一步地，所述填充气体选自氟碳气体、空气、氧气、氢气、氮气、二氧化碳、氦气、六氟化硫中的一种或几种的混合物。
进一步地，氟碳气体选自六氟丙烷、全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷中的一种或几种。超声微泡可以增强超声的背向散射，从而增强回波信号，实现包括病变部位等靶向部位的回声增强，从而提高显影增强。而填充气体的选择会影响到超声微泡的稳定性、持续时间、回声效果等，而氟碳气体则是目前使用较为成熟的填充气体，形成的超声微泡具有良好的稳定性、回波特性。进一步地，全氟乙烷、全氟丙烷和全氟丁烷均属于全氟化碳，全氟化碳较于其他氟碳气体，具有更好的稳定性、更长的组织内循环时间、更高的生物安全性、更持久地抵抗外界压力及机械应力变化的能力，能够实现体内长效超声成像效果，更有利于检测观察病灶部位。
进一步地，本发明的一个实施例中填充气体为全氟丙烷。
进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1：2～1000。
更进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1:2～600。
更进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1:2～500。
更进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1:10～500。
更进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1:2～100。
更进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1:10～50。
更进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1:10～20。
更进一步地，血小板膜与磷脂的质量比为1:20。
磷脂较血小板膜比例高有利于超声微泡的稳定性，在本发明的一个以上实施例中，发现随着磷脂的增加，超声微泡的稳定性逐渐增强。但同时，为了充分利用血小板膜的靶向作用，提高超声微泡靶向、稳定等方面的综合性能，还需设置血小板膜与磷脂的比例于一定范围内。在本发明的一个以上实施例中，血小板膜与磷脂质量比为1:0～500时均能形成超声微泡，由于磷脂的增加会使超声微泡结构更稳定，所以磷脂比例在1:500基础上进一步提高占比后，形成携带血小板膜的超声微泡同样是可预期的。进一步地，在血小板膜与磷脂质量比为1:10～500该比例范围下，形成的超声微泡均具有更佳的稳定性和成像效果。进一步地，在本发明的一个以上实施例中，在血小板膜与磷脂质量比为1:10～50时，形成的超声微泡既具有优秀的稳定性和成像效果，又相对于其他混合比例形成的超声微泡更多的保留血小板膜及其上蛋白，兼具优秀的靶向性。进一步地，在本发明的一个以上实施例中，在血小板膜与磷脂质量比为1:10～50时，通过定量分析可知综合性能仍然存在差异，且1:10、1:20较1:50表现更优。为了兼具超声微泡的稳定性和成像效果，血小板膜与磷脂质量比为可采用1:20。
本发明的另一目的在于提供一种上述血小板膜仿生超声微泡的制备方法，包括步骤：
A1、从外周血中提取出血小板，并分离纯化获得血小板膜；
A2、通过薄膜分散法制备脂质体；
A3、将A1制备的血小板膜与A2制备的脂质体混合并通入填充气体，机械震荡形成血小板膜材料覆盖于磷脂上和/或分散于磷脂中的超声微泡。
进一步地，步骤A1包括：
A11、收集全血加入抗凝剂，离心去除红细胞、白细胞并获得富血小板血浆；
A12、进一步纯化富血小板血浆，加入PEG1抑制血小板激活，离心获得血小板
A13、反复冻融法分离血小板膜、细胞器，最后离心获得纯化血小板膜。
进一步地，步骤A2包括：
A21、将磷脂溶于氯仿，通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，形成磷脂薄膜；
A22、在制备的磷脂薄膜中加入水化液，于摇床中恒温水化，形成脂质体。
本发明的再一目的在于提供上述血小板膜仿生超声微泡在制备靶向血小板以粘附的部位、靶向脓毒症致血管损伤的器官与组织和/或靶向肾脏血管损伤部位的超声造影剂中的用途。
本发明的再一目的在于提供上述血小板膜仿生超声微泡在制备用于诊断脓毒症肾损伤的超声造影剂中的用途。
由于本发明所述血小板膜仿生超声微泡兼具血小板膜蛋白作为引导，能够实现拟血小板功能，靶向血小板可粘附部位，而在脓毒症发展过程中，其会导致包括肾脏器官的损伤，且直接表现包括血管损伤，通过具有拟血小板功能的血小板膜仿生超声微泡则能靶向该类病变部位，以实现相应器官损伤的监测。尤其是，本发明一个以上实施例表明，本发明的血小板膜仿生微泡具有肾脏靶向性，结合脓毒症的表征，本发明所述血小板膜仿生超声微泡能应用于脓毒性急性肾损伤的诊断，包括在制备用于诊断脓毒性急性肾损伤的超声造影剂上的应用。
进一步地，本发明的再一目的在于提供上述血小板膜仿生超声微泡在制备靶向人类IV型胶原蛋白的超声造影剂中的用途。本发明的至少一个实施例表明，形成的超声微泡兼具微泡稳定、成像能力和血小板膜靶向能力，而覆于磷脂上或分散于磷脂中的血小板膜则保留了与血管内皮结合的功能，在本发明的一个实施例中，血小板膜超声微泡能结合到人类IV型胶原蛋白上，所以，除了上述提及的用途外，本申请中的超声微泡还能具体应用于制备靶向人类IV型胶原蛋白的超声造影剂中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：提供一种血小板膜仿生超声微泡，其在体外具备良好的稳定性、超声成像能力、细胞相容性和胶原靶向性，在大鼠脓毒症肾损伤模型中，血小板膜仿生超声微泡体内循环时间更长且肾脏显影明显、保留多，重要的是，基于血小板膜功能蛋白修饰、超声靶向成像和定向微泡破坏技术可实现对脓毒症肾损伤早期血管损伤粘附信号的检测，实现对脓毒症肾损伤的早期诊断。在本发明所述血小板膜仿生超声微泡基础上，仅通过简单的床边超声设备即能实现脓毒症肾损伤的预警和监测，从而及时预防、控制脓毒症肾损伤，大大减轻对脓毒症患者的影响。即基于本发明提供的血小板膜仿生超声微泡，结合超声设备能提供一种简单、方便的脓毒症肾损伤监测方法，有利于实现早期诊断，以克服现有技术诊断标准所存在的缺陷，使患者尽早得到相应的治疗，从而获得良好的临床结果。同时，本发明血小板膜仿生超声微泡制备方法简单，便于操作，有利于批量生产和应用，促进实际临床应用。基于该超声微泡特性，至少还能应用于相关靶向、诊断用试剂的制备中，所述靶向、诊断用试剂包括靶向血小板以粘附的部位、靶向脓毒症致血管损伤的器官与组织、靶向肾脏血管损伤部位、用于诊断脓毒症肾损伤的超声造影剂等。
附图说明
图1为血小板膜超声微泡Pla-MBs的表征：(A)为对照微泡Con-MBs(左)、血小板膜微泡Pla-MBs(右)的TEM图像，比例尺＝1μm；(B)为对照微泡Con-MBs(左)、血小板膜微泡Pla-MBs(右)的SEM图像，比例尺＝1μm；(C)为荧光显微镜下Pla-MBs的图像，磷脂(Phospholipid)由DiO标记为绿色，血小板膜(PM)由Dil标记为红色，比例尺＝10μm；(D)为DLS测定Con-MBs和Pla-MBs的平均流体动力学直径和表面电荷(ζ电位)(n＝3，mean±SD)，*p<0.05，**p<0.01；(E)显示血小板(PLT)、血小板膜(PM)和Pla-MBs经SDS-PAGE电泳分离的代表性蛋白条带以及经Western blot测定蛋白CD41和CD61的代表性蛋白条带。
图2显示血小板膜超声微泡Pla-MBs的体外稳定性、成像能力、安全性和靶向性：(A)为利用琼脂糖模具对血小板膜∶磷脂不同比例形成的超声微泡的稳定性、成像效果测定；(B)CCK8法测定不同浓度Con-MBs、Pla-MBs对HUVEC的细胞相容性(n＝4，mean±SD)，p>0.05，one-way ANOVA；(C)免疫荧光图像显示Con-MBs(红色)、Pla-MBs(红色)在接种有HUVEC的胶原蛋白包被培养玻片上的粘附定位，Con-MBs、Pla-MBs都由Dil标记为红色，HUVEC核由Dapi标记为蓝色，HUVEC细胞质由Actin标记为绿色，比例尺＝50μm；(D)荧光定量分析Con-MBs、Pla-MBs的胶原粘附能力(n＝3，mean±SD)，**p<0.01，t检验。
图3显示Pla-MBs对CLP大鼠肾脏的靶向超声成像及定量诊断：(A)血小板膜∶磷脂不同比例形成的超声微泡在体的肾脏靶向超声成像效果；(B)Con-MBs、Pla-MBs对不同时间点CLP肾脏的靶向超声成像效果；(C)血小板膜∶磷脂不同比例形成的超声微泡在体超声定量分析的NID值(n＝6，mean±SD)，**p<0.01，***p<0.001，one-way ANOVA；(D)Con-MBs、Pla-MBs对不同时间点CLP肾脏超声定量分析的NID值(n＝6，mean±SD)，***p<0.001，one-wayANOVA。
图4显示Pla-MBs的体内分布与在体安全性：(A)Con-MBs、Pla-MBs小鼠近红外光荧光成像结果；(B)Con-MBs、Pla-MBs小鼠离体器官心、肺、肝、脾和肾近红外光荧光成像结果；(C)注射100倍常规剂量的Con-MBs或Pla-MBs，1天后重要脏器H&E染色的代表性病理组织图像，从左到右依次为心、肺、肝、脾、肾和胰，比例尺＝200μm；(D～K)注射100倍常规剂量的Con-MBs或Pla-MBs，1天后血清生化值及炎症水平，依次为尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、AST、ALT、CK、CK-MB、IL-6及IL-1β水平，(n＝5，mean±SD)，*p<0.05，one-way ANOVA。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
实施例1
(一)提取血小板膜
通过穿刺腹主动脉方式从SD大鼠收集全血，并使用乙二胺二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂。具体的，采用EDTA10mM抗凝，将全血22℃(无制动)100g离心20min去除红细胞和白细胞，将所得的富血小板血浆PRP进行100g、20min离心，去除残余的红细胞。
向纯化的PRP上清加入终浓度为1μM的前列腺素E1PGE1以抑制血小板激活，并进行800g、20min离心，离心后所得沉淀即为血小板。
获得血小板后，本实施例进一步地的采用反复冻融法分离血小板膜和细胞器。以含蛋白酶抑制剂的PBS重悬血小板，液氮速冻血小板后室温溶解，反复此操作7次后，于4℃、4000g条件离心3min，并反复洗涤3次，最终获得纯化的血小板膜。
(二)制备脂质体
将磷脂(18mg DPPC、3.5mg DSPE-PEG2000和1mg DPPA)溶于4ml氯仿，旋转蒸发30min(温度50-60℃，转速100-120rpm)，然后加入4ml PBS，在60℃温摇床中水化30min，形成脂质体。
(三)制备杂化血小板膜仿生超声微泡(Pla-MBs)、对照脂质微泡(Con-MBs)
吸取500μL脂质体与50μl步骤(一)获得的血小板膜混合后，在超声破碎仪下混匀。然后，通入10ml C3F8气体置换瓶中空气，机械震荡45s，形成杂化血小板膜仿生超声微泡。
进一步地，以3000rpm、3min条件离心2次，以获得纯化的杂化血小板膜仿生超声微泡。
对于对照脂质微泡(Con-MBs)，采取了相同的制备步骤，但未添加血小板膜。即吸取500μl上述脂质体，通入C3F8气体置换瓶中空气，机械震荡45s，形成Con-MBs。
实施例2
杂化血小板膜仿生超声微泡Pla-MBs的表征
(一)采用扫描电镜(SEM)观察微泡的表面形态及大小，采用透射电镜(TEM)观察微泡的内部结构及大小。
TEM结果如图1a所示，Pla-MBs与Con-MBs都呈球形结构，但Pla-MBs直径更大、内部更加不均匀，这可能是血小板膜包被的结果。图中Pla-MBs微泡代表直径为0.3～3.5μm。
SEM结果如图1b所示，经血小板膜杂化后，Pla-MBs的尺寸稍大，表面比Con-MBs更加不均匀，这与TEM结果一致。
(二)采用荧光显微镜观察杂化血小板膜仿生超声微泡表面人工磷脂和血小板膜的融合。
在制备实施例1杂化血小板膜仿生超声微泡相同的过程中，于磷脂进行Dio标记，于血小板进行DiI标记，从而获得荧光杂化血小板膜仿生超声微泡。
将所获荧光杂化血小板膜仿生超声微泡以PBS稀释100倍后，滴加适量微泡悬液于载玻片，荧光显微镜下进行观察。
荧光显微镜下，Dio标记的磷脂绿色荧光和DiI标记的血小板膜PM红色荧光完全重合，证实了血小板膜和磷脂的成功杂合，如图1c所示。
(三)采用动态光散射(DLS)测定Con-MBs、Pla-MBs的平均流体动力学直径和表面电荷(ζ电位)
采用实施例1相同步骤制备杂化血小板膜仿生超声微泡，以去离子水适当稀释微泡，采用动态光散射(DLS)获得微泡的流体动力学尺寸和表面zeta电位。
如图1d所示，Con-MBs、Pla-MBs两种微泡的流体动力学的平均直径分别为850.1nm和1028.4nm，血小板膜仿生超声微泡Pla-MBs略大。
同时，Pla-MBs电位负值更低，更接近于血小板膜的电位，这也侧面说明了血小板膜的成功包被，具体的，Con-MBs、Pla-MBs的电位分别为-17.4±1.2mV、-25.6±0.9mV，(p<0.01)。
具体的，对于上述制备获得的杂化血小板膜仿生超声微泡悬液，肉眼观察呈乳白色混悬液，显微镜明场下，Pla-MBs呈透明球形结构，均匀分散，直径约1μm，这与SEM、TEM和DLS结果一致。
(四)Pla-MBs的蛋白组成分析
本实施例中，上样PLT、PM、Pla-MBs相等蛋白量进行SDS-PAGE分析，以分析获得Pla-MBs的蛋白组成。结果显示，与PLT相比，血小板PLT的大部分蛋白都转移到了血小板膜PM上，而PM的蛋白都基本转移到了Pla-MBs，没有明显损失，如图1e所示。即表明本发明中的Pla-MBs较全的保留了血小板的蛋白，有利于血小板膜仿生超声微泡实现血小板的基本靶向功能。
本实施例还通过Western Blot以测定血小板膜仿生超声微泡上血小板膜关键蛋白，结果如图1f所示，Western Blot结果揭示了Pla-MBs包括整合αIIb和整合素β3的主要血小板膜关键蛋白的特征性表达，进一步证实了Pla-MBs成功的实现了血小板膜涂覆。
实施例3
血小板膜超声微泡Pla-MBs的体外稳定性、成像能力、安全性和拟血小板功能
(一)不同比例血小板膜、磷脂混合所得Pla-MBs的稳定性、成像能力检测
为了评估血小板膜和磷脂合适的混合比例，设置血小板膜、磷脂不同比例，按照实施例1步骤制备，获得不同混合比例下的血小板膜仿生超声微泡，体外进行Pla-MBs超声成像观察。具体的，对于不同混合比例下的血小板膜仿生超声微泡，采取下述相同步骤进行成像检测。
将1ml血小板膜仿生超声微泡稀释液加入2％琼脂糖模型，用小动物超声成像系统(MX250高频线阵探头、非线性谐波成像模式，成像参数：频率18MHz、功率10％、成像深度25mm)进行，将焦点放置于样品孔中央，在不同时间点(0，10，20，30，60，90，120，150min)进行成像。
如图2a所示，前三个血小板膜较高纯度(血小板膜∶磷脂质量比分别为1:0、1:2、1:5)的Pla-MBs在60min左右开始融合消散，同时，结合血小板膜∶磷脂质量比分别为1:10、1:20、1:50、1:100、1:500的Pla-MBs的稳定时间分析可得，随着磷脂浓度的增加，血小板膜仿生超声微泡的稳定性和成像效果更佳，且血小板膜∶磷脂混合比例为1:10至1:500的Pla-MBs均至少可稳定2h。即在适当比例下，本发明中的血小板膜超声微泡Pla-MBs具有充分的稳定性，并能形成清晰的成像。
由于血小板膜的存在是Pla-MBs发挥主动靶向作用的关键，在保证微泡稳定性的同时兼顾血小板膜蛋白的保留尤为重要。因此，选择1:10、1:20和1:50混合比例所得血小板膜仿生超声微泡作为后续在体验证的初步比例。
(二)CCK-8分析检测HUVEC细胞的细胞存活率以评估杂化血小板膜仿生超声微泡的细胞毒性
采用CCK8评估Pla-MBs的细胞毒性，将HUVEC细胞于不同浓度的Con-MBs、Pla-MBs悬液中孵育，Con-MBs、Pla-MBs采用实施例1条件制备所得，即Con-MBs为体积500μl脂质体制备形成，Pla-MBs为体积50ul血小板、500ul脂质体比例(质量比为后续验证的在体比例血小板膜∶磷脂＝1:20)制备形成。孵育相同时间后进行HUVEC细胞活力检测，结果如图2b所示，与空白细胞Blank组相比，不同浓度的Pla-MBs对细胞的生存活力没有显著影响，而且在Con-MBs和Pla-MBs之间也未观察到显著差异。该结果表明，Pla-MBs具有足够的体外细胞相容性，基本无细胞毒性。
(三)血小板膜超声微泡Pla-MBs的拟血小板功能
本实施例中通过研究Pla-MBs对人类IV型胶原蛋白(内皮下主要成分)的结合以确定Pla-MBs的体外拟血小板功能。Con-MBs、Pla-MBs采用实施例1条件制备所得，即Con-MBs为体积500μl脂质体制备形成，Pla-MBs为体积50ul血小板、500ul脂质体比例(质量比为后续验证的在体比例血小板膜∶磷脂＝1:20)制备形成。如图2c所示，Con-MBs的粘附很少，而Pla-MBs滞留明显增多，且主要粘附在细胞区域之外。荧光定量分析如图2d所示，与Con-MBs相比，Pla-MBs的保留率显著增加，表明这是血小板膜涂覆所特异的，说明Pla-MBs保留了血小板的胶原粘附能力。
实施例4
基于大鼠脓毒症急性肾损伤模型，在体超声以评估杂化血小板膜仿生超声微泡的靶向成像能力、定量分析以评估杂化血小板膜仿生超声微泡对脓毒性肾损伤的诊断及监测能力
(一)不同杂化比例Pla-MBs下脓毒症肾脏的靶向成像
构建大鼠脓毒症急性肾损伤模型：(1)对大鼠称重后，按照50mg/kg用量腹腔注射2％戊巴比妥钠以麻醉大鼠；(2)备皮消毒，于下腹正中作2cm切口，钝性分离皮下及肌肉组织，找到盲肠后小心移至腹腔外，以回盲瓣为准，用3号丝线结扎1/2盲肠，18G针头避开血管贯通穿刺1次并挤出少许肠内容物；(3)然后将盲肠小心移回腹腔，逐层缝合肌肉及皮肤；(4)2ml/100g生理盐水于背部皮下补充液体，然后将大鼠置于保温炉旁直至苏醒。
假手术组仅开腹，将盲肠从腹腔取出后，再放回腹腔。
靶向超声成像：大鼠麻醉后，固定于操作台上。采用临床超声成像系统(GE LOGIQE9)，9L高频线阵探头固定于动物右侧肾脏冠状面，成像参数：频率11MHz、增益15dB、成像深度3cm、机械指数0.13，所有实验组的成像条件均保持一致。
将Pla-MBs、Con-MBs悬液稀释至108/ml，以随机顺序经尾静脉注射50μL的Pla-MBs、50μL的Con-MBs微泡，Pla-MBs、Con-MBs微泡之间的注射需间隔30min。以随机顺序为先后注射Pla-MBs、Con-MBs为例，即先经尾静脉注射50μL的Pla-MBs，间隔30min后再经尾静脉注射50μL的Con-MBs。靶向超声成像通过击破-再灌注方法实现：即在注射微泡60s后，给予一次高机械指数(0.24，1s)击破脉冲“flah”击破该区域循环和靶向结合的微泡；待10s再灌注后，采集循环中游离微泡的超声图像。
为获取稳定性和靶向性最佳的Pla-MBs，首先将体外超声初步确定的三个混合比例对应血小板膜仿生超声微泡进行在体超声成像，即血小板膜∶磷脂混合比例分别为1:10、1:20和1:50的血小板膜仿生超声微泡。以随机顺序经尾静脉注射50μL的Pla-MBs(1:10)、50μL的Pla-MBs(1:20)、50μL的Pla-MBs(1:50)微泡(浓度108/ml)。相邻两次注射之间均间隔30min。注射微泡后，靶向超声成像如前述。
如图3a所示，与Con-MBs相比，三种不同比例的Pla-MBs都可显著提高CLP大鼠肾脏的成像效果，实现脓毒症肾脏的靶向成像。
NID(归一化强度差异法)定量分析结果如图3c所示，与Con-MBs相比，Pla-MBs的NID值更高，1:50、1:20和1:10组NID值依次升高，且存在统计学差异(6.26±0.57％，14.72±0.41％，20.66±0.70％，22.22±3.20％)；在Pla-MBs的1:10、1:20和1:50组间进行两两比较，Pla-MBs 1:20组与Pla-MBs 1:50组有差异，但Pla-MBs 1:10与Pla-MBs 1:20没有统计学差异。
为了兼顾Pla-MBs的成像效果和的稳定性，选择血小板膜:磷脂＝1:20的比例作为后续实施例Pla-MBs的杂化比例。
(二)检测Pla-MBs对脓毒症急性肾损伤早期诊断的有效性
为了探索Pla-MBs对脓毒症急性肾损伤早期诊断的有效性，于不同时间点的CLP注射等量的Con-MBs和Pla-MBs(比例1:20)悬液，进行靶向超声成像。
将大鼠随机分为4组，每组6只，假手术组(Sham组)、CLP 4h组、CLP 8h组和CLP 18h组。以随机顺序经尾静脉注射25μl的Pla-MBs、25μl的Con-MBs悬液(浓度108/ml)，两次注射之间间隔30min。注射微泡后，靶向超声成像如前述。
结果如图3b、3d所示，当注射Con-MBs悬液时，与Sham组相比，CLP 4h组、CLP 8h组和CLP 18h组的靶向超声信号强度没有明显变化，定量分析NID值分别为6.58±1.59％、4.67±1.27％、8.2±2.29％和6.59±3.25％，各组间没有统计学差异。
然而，当注射Pla-MBs悬液时，与Sham组相比，CLP 4h组、CLP 8h组和CLP 18h组的粘附超声信号逐渐增强，各组定量分析NID值分别为5.49±2.08％、18.16±1.47％、19.99±1.35％和23.43±3.78％。与Sham组相比，CLP 4h组、CLP 8h组和CLP 18h组NID值都具有统计学意义。表明本发明中的Pla-MBs随着脓毒症的发展会具有逐渐增强的粘附超声信号，且在早期也能提供明显的超声信号，有利于实现脓毒症急性肾损伤的早期诊断。
实施例5
杂化血小板膜仿生超声微泡的在体分布及在体安全性评估
(一)通过注射DIR标记MBs来评价Pla-MBs的生物分布。
将大鼠随机分为2组：第1组进行脓毒症建模并注射DiR标记的Con-MBs；第2组进行脓毒症建模并注射DiR标记的Pla-MBs。所有组的大鼠通过尾静脉注射微泡(浓度108/ml)。
对于体内近红外荧光成像，使用近红外荧光体内成像系统以预定的时间间隔(pre，1min 5min 30min 1h、2h、4h和6h)获得成像结果。具体的，本实施例中在成像过程中使用气体麻醉面罩用1％异氟烷麻醉大鼠。
结果如图4a所示，各组注射微泡后，荧光信号主要集中于腹部脏器，且随着时间的延长，荧光信号逐渐增强。与Con-MBs相比，不同时间点的Pla-MBs组整体荧光信号更强，表明Pla-MBs的靶向更强，循环时间更长。
为了评估Pla-MBs在器官中的全身分布，Pla-MBs注射后6小时将大鼠处死，通过盐水和多聚甲醛灌注去除血液。获取器官包括心脏，肺，肝，脾，肾，进行近红外光荧光成像。离体器官荧光成像结果如图4b所示，与Con-MBs相比，Pla-MBs组的肾脏荧光信号更强，表明肾脏Pla-MBs的靶向富集。
(二)通过观察高剂量Pla-MBs对机体重要脏器的影响及机体相应的整体炎症反应来评估Pla-MBs的在体安全性。
将大鼠随机分为3组，每组5只，第1组注射PBS，第2组注射Con-MBs，第3组注射Pla-MBs。每组大鼠经尾静脉注射100倍剂量的微泡，注射1天后，处死大鼠收集全血进行生化分析、收集主要脏器包括心、肺、肝、脾、肾和胰进行病理组织分析。
如图4c所示，与对照组相比，高剂量Pla-MBs静脉注射1天后，主要脏器包括心、肺、肝、脾、肾和胰均未出现明显的器质性损伤。
生化结果如图4d～4k所示，Pla-MBs体内注射后1天，未引起大鼠体内发生显著的炎症反应(IL-1β、IL-6)。此外，脏器功能指标包括肝功能(AST和ALT)、肾功能(肌酐Cre、尿素氮BUN)、心功能(CK、CK-MB)，与对照组相比，各组间都没有显著差异。这些结果都表明了在体使用Pla-MBs的安全性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血小板膜仿生超声微泡，其特征在于，包含壳膜材料和填充气体，所述壳膜材料包含磷脂和血小板膜，所述血小板膜覆盖于磷脂上和/或分散于磷脂中。
2.根据权利要求1所述的血小板膜仿生超声微泡，其特征在于，磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、叠氮磷酸二苯酯中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的血小板膜仿生超声微泡，其特征在于，磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和叠氮磷酸二苯酯，且二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和叠氮磷酸二苯酯的质量比为18:3.5:1。
4.根据权利要求1所述的血小板膜仿生超声微泡，其特征在于，所述填充气体选自氟碳气体、空气、氧气、氢气、氮气、二氧化碳、氦气、六氟化硫中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的血小板膜仿生超声微泡，其特征在于，血小板膜与磷脂的质量比为1：2～1000。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的血小板膜仿生超声微泡的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A1、从外周血中提取出血小板，并分离纯化获得血小板膜；
A2、通过薄膜分散法制备脂质体；
A3、将A1制备的血小板膜与A2制备的脂质体混合并通入填充气体，机械震荡形成血小板膜材料覆盖于磷脂上和/或分散于磷脂中的超声微泡。
7.根据权利要求6所述的血小板膜仿生超声微泡的制备方法，其特征在于，步骤A1包括：
A11、收集全血加入抗凝剂，离心去除红细胞、白细胞并获得富血小板血浆；
A12、进一步纯化富血小板血浆，加入PEG1抑制血小板激活，离心获得血小板；
A13、反复冻融法分离血小板膜、细胞器，最后离心获得纯化血小板膜。
8.根据权利要求6所述的血小板膜仿生超声微泡的制备方法，其特征在于，步骤A2包括：
A21、将磷脂溶于氯仿，通过旋转蒸发仪进行旋转蒸发，形成磷脂薄膜；
A22、在制备的磷脂薄膜中加入水化液，于摇床中恒温水化，形成脂质体。
9.权利要求1～5任一项所述血小板膜仿生超声微泡在制备靶向血小板以粘附的部位、靶向脓毒症致血管损伤的器官与组织和/或靶向肾脏血管损伤部位的超声造影剂中的用途。
10.权利要求1～5任一项所述血小板膜仿生超声微泡在制备用于诊断脓毒症急性肾损伤的超声造影剂中的用途。
CN202110718964.XA 2021-06-28 2021-06-28 一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途 Pending CN113769118A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110718964.XA CN113769118A (zh) 2021-06-28 2021-06-28 一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110718964.XA CN113769118A (zh) 2021-06-28 2021-06-28 一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113769118A true CN113769118A (zh) 2021-12-10

Family

ID=78835797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110718964.XA Pending CN113769118A (zh) 2021-06-28 2021-06-28 一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113769118A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115944752A (zh) * 2022-12-27 2023-04-11 南京邮电大学 一种工程化融合膜气泡、其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935257A (zh) * 2006-08-30 2007-03-28 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡及其制备方法
CN103100093A (zh) * 2013-01-23 2013-05-15 中山大学附属第三医院 一种负载小干扰rna的纳米级脂质微泡超声造影剂及制备方法
CN110090310A (zh) * 2019-04-01 2019-08-06 东南大学 一种血小板膜自组装纳米气泡及其制备方法和应用
CN111330025A (zh) * 2020-03-03 2020-06-26 中山大学附属第三医院 一种仿生微泡超声造影剂及制备方法
CN111374945A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 复旦大学 一种仿血小板脂质体递药系统及其制备方法与用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935257A (zh) * 2006-08-30 2007-03-28 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡及其制备方法
CN103100093A (zh) * 2013-01-23 2013-05-15 中山大学附属第三医院 一种负载小干扰rna的纳米级脂质微泡超声造影剂及制备方法
CN111374945A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 复旦大学 一种仿血小板脂质体递药系统及其制备方法与用途
CN110090310A (zh) * 2019-04-01 2019-08-06 东南大学 一种血小板膜自组装纳米气泡及其制备方法和应用
CN111330025A (zh) * 2020-03-03 2020-06-26 中山大学附属第三医院 一种仿生微泡超声造影剂及制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIJUN WANG等: "Platelet-membrane-biomimetic nanoparticles for targeted antitumor drug delivery", 《JOURNAL OF NANOBIOTECHNOLOGY》 *
SHUYAN WANG等: "Drug Targeting via Platelet Membrane Coated Nanoparticles", 《SMALL STRUCT.》 *
X.B. ZHOU等: "Platelet-targeted microbubbles inhibit re-occlusion after thrombolysis with transcutaneous ultrasound and microbubbles", 《ULTRASONICS》 *
王瑞雪: "血小板在脓毒症中的关键作用", 《临床与病理杂志》 *
陶涛等: "血小板膜受体在脓毒症中的作用研究进展", 《现代医药卫生》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115944752A (zh) * 2022-12-27 2023-04-11 南京邮电大学 一种工程化融合膜气泡、其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Nanobubble–Affibody: Novel ultrasound contrast agents for targeted molecular ultrasound imaging of tumor
Zhang et al. The optimized fabrication of a novel nanobubble for tumor imaging
Liu et al. Low-intensity focused ultrasound (LIFU)-activated nanodroplets as a theranostic agent for noninvasive cancer molecular imaging and drug delivery
GB1578776A (en) Hemoglobin liposome and method of making the same
CN108451929B (zh) 一种包载固相内核的重组脂蛋白及其制备和应用
IE55051B1 (en) A liquid composition for absorbing and stabilising gas bubbles,and its manufacture and use as a contrast medium for ultrasonic diagnosis
CN111330025B (zh) 一种仿生微泡超声造影剂及制备方法
CA2213615A1 (en) Use of methylenemalondiester derivatives for the production of gas-containing microparticles for ultrasound diagnosis, as well as media that contain said particles
CN113616810A (zh) 一种靶向p-选择素的工程化细胞外囊泡组合物及其制备方法和应用
CN113952461A (zh) 一种仿中性粒细胞纳米递药系统及其制备方法和应用
CN113769118A (zh) 一种血小板膜仿生超声微泡及其制备方法、用途
CN114732796B (zh) 一种双靶向载药微泡及其制备方法和应用
CN113425863A (zh) 一种血小板膜-脂质体融合膜微气泡的制备方法及其在血栓超声分子影像中的应用
CN101780284A (zh) 磁性分子靶向超声造影剂微球及其制备方法
CN112870388A (zh) 纳米级amh靶向超声造影剂及其制备方法和应用
CN107648620A (zh) 携载caix适体的靶向超声纳米泡及其制备方法
WO2023005401A1 (zh) 一种多模态微泡造影剂及其制备方法和应用
US20080200862A1 (en) Method To Administer Stem Cells In Combination With One Or More Acoustically Active Materials And Ultrasound Energy
CN110946992A (zh) 一种阳离子微泡的制备方法及应用
CN113577102B (zh) 铁纳米簇用于制备抗败血症及其诱发的心肌损伤药物的应用
EP0082877A1 (en) Preparation of synthetic erythrocytes
CN100496615C (zh) 一种利用机械振荡来制备超声造影剂的方法
CN116327726B (zh) 一种血小板膜包被的仿生纳米颗粒及其制备方法和应用
CN114748646B (zh) 一种超声、荧光双重显影负载量子点纳米泡及其制备方法和应用
CN112826942B (zh) 靶向颅脑损伤病灶的脂质纳米递药系统及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination