CN111330025A - 一种仿生微泡超声造影剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学领域，涉及一种由细胞膜构建的仿生脂质微泡超声造影剂及其制备方法。所述的制备方法为先分离细胞；提取细胞膜；将细胞膜与磷脂超声震荡制备细胞膜与磷脂混合的脂质体；最后向脂质体通入气体，机械振荡制备靶向微泡超声造影剂。本发明所公开的仿生脂质微泡超声造影剂将细胞膜的生物学特性整合到超声造影剂内，突破了传统微泡超声造影剂的使用范围。本发明的仿生脂质体制备方法，具有天然靶向性、易于临床转化的优点。
Description
技术领域
本发明涉及超声分子影像学和生物医学工程领域，具体地涉及一种仿生微泡超声造影剂及其制备方法。
技术背景
超声分子影像是将靶向微泡造影剂作为分子探针，以超声造影为成像模式，对活体生物化学过程进行细胞和分子水平上的定性和定量研究的分子影像学方法，可提高超声诊断的准确性和敏感性，在心血管、炎症性、肿瘤等疾病领域具有重要的应用前景。
超声成像的优势在于其操作简单快速，并且可实时观察血管损伤病灶的动态发展，经济实惠，减轻了患者的经济压力。但其不足之处在于超声成像分辨率较低，需要造影剂增强超声成像的对比度，提高分辨率。
传统的超声造影剂是以脂质、白蛋白以及聚合物包裹的微泡。以磷脂为材料的超声造影剂，如Sonovue(意大利，Bracco)等已被FDA批准并广泛应用于临床超声诊断，具有安全性高、稳定性良好、可产生丰富的谐波信号的特点，有效地提高了疾病诊断的敏感性，目前已写进多个疾病诊疗应用指南。
然而这些传统超声微泡造影剂以外源性物质作为膜材料，不仅增大了其生物安全性方面的问题，同时由于传统的超声微泡造影剂缺乏天然靶向性，无法特异性识别靶组织高表达的黏附分子，因此也难以实现靶向成像。此外，传统超声微泡造影剂还因为其不稳定的问题，导致其在体内循环时间短，也限制了其在分子影像方面的应用与发展。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有微泡超声造影剂缺乏天然靶向性及稳定性差的缺陷，提供一种仿生微泡超声造影剂。
本发明的另一目的在于提供上述仿生微泡超声造影剂的制备方法。
以细胞膜为材料的仿生粒子具有免疫原性低，生物相容性良好，不易被网状内皮系统快速清除，循环周期长，稳定性良好等特点，而且可通过激活细胞膜过表达某些特异性黏附分子，增加其在靶向组织的聚集。目前已有将细胞膜作为药物包覆膜方面的应用，然而用细胞膜制备超声造影剂的研究还非常有限。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一方面，本发明提供了一种微泡超声造影剂，包含细胞膜和脂质体；所述细胞膜选自哺乳动物的血细胞膜，所述脂质体选自磷脂。
在一些实施方案中，所述细胞膜选自大鼠、小鼠、兔、狗、猪或人血细胞的细胞膜。
在一些实施方案中，所述细胞膜选自红细胞、白细胞、或血小板细胞膜中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述细胞膜选自白细胞的细胞膜。
在一些实施方案中，所述的磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)三者的组合。
在一些实施方案中，所述的磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)的摩尔质量比为18：1：1～5，更优选18：1：1。
在一些实施方案中，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为(20～1000)：1。
在一些实施方案中，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为(20～800)：1。
在一些实施方案中，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为(40～700)：1。
在一些实施方案中，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为50：1。
在一些实施方案中，所述微泡超声造影剂的大小为0.2-4.4μm。
另一方面，本发明还提供了所述的脂质微泡超声造影剂的制备方法，包括如下步骤：将细胞膜与脂质体混合并通入气体，机械振荡形成包含细胞膜的脂质微泡。
在一些实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：
S1.从外周血中分离血细胞；
S2.差速离心法提取细胞膜；
S3.薄膜-水化法制备脂质体；
S4.将S2制备的细胞膜与S3制备的脂质体混合并通入气体，机械振荡形成包含细胞膜的脂质微泡。
在一些实施方案中，所述的制备方法，步骤S1包括以下步骤：
S11.取血样于抗凝采血管中；
S12.将与S11中血样等体积的血细胞分离液加入离心管中，吸取血样并将其平铺于细胞分离液的液面之上，18℃-22℃下400-1000g离心20-40min；
S13.步骤S12离心后，吸取分离液中的所需血细胞；优选地，所需血细胞为白细胞；
S14.向步骤S13吸取的血细胞中加入2-5倍细胞体积的裂解液，吹打混匀后裂解5-20min后200g-400g离心5-15min，弃上清；
S15.重复步骤S14一次即得所需血细胞；
S16.向步骤S15所得的血细胞中加入5-15ml细胞洗涤液混匀细胞，200-400g离心5-15min，弃上清；
S17.重复步骤S16三遍，得到纯化的血细胞。
在一些实施方案中，步骤S2包括以下步骤：
S21.向步骤S1分离的血细胞中加入10-20ml低渗裂解溶液重悬，转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆15-30次，得到匀浆液。
在一些实施方案中，所述低渗裂解溶液包含30mM pH7.5 Tris-HCl，225mM D-甘露醇，75mM蔗糖，0.2mM EGTA，蛋白酶抑制剂和磷脂酶抑制剂。
S22.将步骤S21所得的匀浆液加入离心管中，10,000g离心15-30min，吸取上层清液，100,000g离心30-50min，弃去上层清液，留沉淀。
S23.将步骤S22所得的沉淀用三蒸水重悬为溶液，重悬的溶液-70至-90℃冷冻后，真空冻干得到血细胞膜，-15至-25℃保存。
在一些实施方案中，将步骤S22所得的沉淀用三蒸水重悬为溶液时，加入DiI染料。
在一些实施方案中，步骤S3包括以下步骤：
S31.将磷脂和氯仿混匀；
S32.将S31制备的溶液在旋转蒸发仪真空作用下形成磷脂薄膜；
S33.在S32制备的磷脂薄膜中加入水化液，并在旋转蒸发仪加热水浴下水化，形成脂质体；所述水化液选自双蒸水、氯化钠或磷酸盐缓冲液(PBS)；优选地，水化液与磷脂的比例为3-8ml:20mg。
在一些实施方案中，步骤S31中，所述氯仿与磷脂的比例为3-8ml:20mg。
在一些实施方案中，向S31制得的脂质体中加入染料DiO。
在一些实施方案中，步骤S32中，旋转蒸发仪的转速为100-120rpm，温度为50-70℃，优选为60℃；
在一些实施方案中，步骤S33中，水化温度为50-60℃，水化时间为20-40min，优选30min；
在一些实施方案中，步骤S4包括以下步骤：
S41.气体置换：将步骤S3制备的脂质体与步骤S2制备的血细胞膜混合，通入气体置换空气。
S42.将步骤S41的混合溶液机械震荡40-50s形成细胞膜仿生脂质微泡；优选地，将混合溶液机械震荡45s；优选地，机械震荡频率为3000-5000cpm，更优选4350cpm；
在一些实施方案中，步骤S41中，通入的气体为全氟丙烷C3F8；优选地，通入气体为5-15ml，更优选10ml。
又一方面，本发明还提供了所述的微泡超声造影剂在制备靶向超声造影剂中的应用。
在一些实施方案中，所述微泡超声造影剂靶向炎症部位。
本发明方法的有益效果是：
传统微泡超声造影剂的使用范围仅限于血液循环中非靶向诊断成像，本发明的脂质微泡超声造影剂，以细胞膜为膜材料，可以将细胞膜的生物学特性整合到超声造影剂内，具备天然靶向性，可靶向识别炎症部位。此外，该制备方法克服了纯磷脂材料制备造影剂生物相容性低和纯细胞膜仿生材料造影剂产率低和稳定性差的缺点。
附图说明
图1是仿白细胞膜脂质微泡倒置荧光显微镜下结构；
图中A代表DiO标记的脂质微泡膜，B代表DiI标记的细胞膜，C为A和B叠加图，D为仿白细胞膜微泡明场下图像。
图2分别是对照微泡的粒径分布(2A)、Zeta电位(2C)，和仿白细胞膜脂质微泡的粒径分布(2B)、Zeta电位(2D)分布图。
图3是仿白细胞膜脂质微泡流式结果，A、C分别为对照微泡和仿生微泡分布图，B、D分别为对照微泡和仿生微泡CD45表达图。
图4是仿白细胞膜脂质微泡免疫印迹结果，表示仿生微泡、白细胞膜和白细胞总体蛋白表达情况基本一致。主要表达CD47和炎症相关配体Mac-1/LFA-1，L-selectin等。
图5是仿白细胞膜脂质微泡在缺血再灌注大鼠模型和对照动物的靶向超声图像，在对照组动物中，注射对照微泡和仿白细胞膜微泡时，超声信号强度无明显差异；在缺血再灌注动物模型中，注射仿白细胞膜微泡后的超声信号强度高于对照微泡。
图6是不同质量比例的白细胞膜蛋白与脂质体混合制备的仿生微泡超声造影剂在不同时间点的成像图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1：仿白细胞微泡超声造影剂的制备
大鼠腹腔内注射LPS 1.5mg/kg，6h后，七氟醚吸入麻醉后，打开腹腔暴露腹主动脉以取血于抗凝采血管中。另取一支50ml离心管，加入与血样等体积的大鼠外周血白细胞分离液(Solarbio)；使用巴斯德吸管吸取血样，将其小心平铺于分离液液面之上，1000g离心30min。离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为单个核细胞层，下层细胞为白细胞层。用吸管小心吸取分离液中的白细胞层，加入3倍细胞体积的红细胞裂解液(Solarbio)，轻轻吹打混匀，裂解10min，300g离心10min，弃红色上清；重复裂解步骤一次，即得白细胞。向所得细胞中加入10ml细胞洗涤液混匀细胞，250g离心10min，弃上清；重复清洗步骤，得到纯化的白细胞。
采用差速离心法提取白细胞膜，向上述所得白细胞中加入12ml低渗裂解溶液(30mMpH7.5 Tris-HCl，225mM D-甘露醇，75mM蔗糖，0.2mM EGTA，蛋白酶抑制剂和磷脂酶抑制剂)重悬，转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆20次。将所得溶液加入离心管中，10,000g离心20min。吸取上层清液，100,000g离心40min。弃去上层清液，沉淀用三蒸水重悬(必要时加入适量DiI染料)。溶液-80℃冷冻后，真空冻干得到白细胞膜，-20℃保存；
采用薄膜水化法制备脂质体，称取18mg DPPC、3.5mg DSPE-PEG2000和1mg DPPA(摩尔质量比18：1：1)溶于4ml氯仿中。置于旋转蒸发仪上进行真空干燥形成磷脂薄膜(60℃，120rpm)；在磷脂薄膜中加入4ml PBS水化液，并在旋转蒸发仪加热水浴下水化30min(60℃，120rpm)，形成脂质体。
将上述400μl脂质体与100μl白细胞膜混合，通入C3F8置换空气；将混合溶液进行机械震荡(45s，4350cpm)形成仿白细胞膜脂质微泡。作为对照，吸取500μl上述脂质体，通入C3F8置换空气后进行机械震荡(45s，4350cpm)形成对照微泡。
在制备细胞膜时加入适量荧光染料DiI，脂质体中加入染料DiO，形成仿生细胞膜脂质微泡后，在倒置荧光显微镜下观察微泡结构。
结果显示：脂质体带有绿色荧光，细胞膜带红色荧光，两种荧光几乎完全重叠，表明细胞膜整合到脂质微泡膜上，仿细胞膜脂质微泡成功制备。
采用动态光散射系统测定微泡的粒径和电位，将微泡稀释至1×107个/ml，取3ml加入样品池中进行测定。
结果显示：对照微泡和仿白细胞膜脂质微泡的粒径分别为1.06±0.02μm和1.01±0.02μm；电位分别为-14.87±1.57mv和-27.07±3.45mv。
实施例2：仿生微泡靶向配体的检测
将上述制备的对照和仿生微泡进行离心纯化(2000rpm，2min)，弃去下层液体，加入500μl PBS重悬，再加入4.5μg CD45流式抗体，室温下孵育30分种。随后再次离心(2000rpm，2min)，弃去下层液体去除游离的抗体，加入500μl PBS重悬，稀释至105个/ml，采用流式细胞术检测微泡CD45的表达情况。
结果显示：仿生微泡(MBm)CD45的表达水平(30.6％)明显高于对照微泡(MBcon)(3.34％)(图3)，表明仿生微泡携带白细胞膜特异性蛋白CD45。
将上述制备的对照和仿生微泡进行离心纯化(2000rpm，2min)，弃去下层液体，加入500μl PBS重悬。向微泡、上述提取的白细胞和白细胞膜种加入500μl RIPA裂解液裂解微泡30min，随后离心(2000rpm，2min)，取上清。采用免疫印迹法(Western blotting)检测其特异性蛋白的表达情况。
结果显示：仿白细胞膜脂质微泡(MBm)、白细胞膜(LEUm)和白细胞(LEU)总体蛋白表达基本一致(图4)，主要表达躲避网状内皮细胞识别的配体CD47，炎症相关配体Mac-1/LFA-1，L-selectin等。
上述结果表明，本发明制备的仿生微泡有交保留了相关蛋白质及配体，具有靶向性。
实施例3：仿生微泡超声造影剂的超声成像能力检测
建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)模型：大鼠术前禁食8-12h，使用氯胺酮(60mg/kg)与甲苯噻嗪(100mg/kg)复合液腹腔注射麻醉。固定大鼠于手术台上，行腹部正中切口，暴露腹腔，游离肝门部血管，用血管夹夹闭肝左叶及中叶血流，在60min后解除血管夹，缝合切口。对照组缺血0min采取开腹后缝合操作。
动物麻醉后，固定于操作台上。沿腹正中切口剪开缝线，将超声探头(彩色多普勒超声诊断系统，飞利浦EPQ7，5-12L高频线阵探头12MHz)固定于肝脏左叶和中叶上方，成像参数如下：频率10MHz，增益20-40dB，成像深度2.5-4.0cm，机械指数0.07。将实施例1制备的仿白细胞膜微泡和对照微泡稀释至约108/ml，随机顺序尾静脉注射100μl微泡，两次注射之间间隔30min。靶向超声成像通过击破-再灌注的方法进行，即在注射微泡后60s后，给予一次“flash”高机械指数超声(0.24，1s)击破循环中游离和靶向结合的微泡，随后10s采集循环中游离微泡的超声图像。
结果显示：超声成像结果采用归一化强度差异法(Normalized IntensityDifference,NID)进行分析，即信号强度＝(击破前-击破后)/背景信号×100％。在对照组大鼠中，尾静脉注射对照微泡和仿白细胞膜微泡，信号强度无明显差异(6.23％±2.14％vs8.23％±1.12％)。在IRI大鼠中，注射靶向微泡后的信号强度高于对照微泡(8.20％±2.00％vs18.19％±3.12％)，上述结果表明仿白细胞膜微泡具有靶向于缺血再灌注炎症部位的能力(图5)。
实施例4：不同的方法参数对仿生微泡超声造影剂的影响
目前，如何制备性能稳定和超声成像效果良好的仿生微泡是本领域的最主要的障碍，以下探索不同质量比例的磷脂和细胞膜的稳定性和超声成像能力。
不同质量比例的白细胞膜与脂质体磷脂混合后(白细胞膜蛋白：磷脂＝1：0，1:2，1:5，1:10，1:50，1:100，1:300，1:600)，超声震荡混合均匀后，通入10ml C3F8气体置换空气，机械震荡45s形成微泡。稀释1000倍后，进行体外稳定性检测，将1ml微泡加入仿体中，在不同时间点进行成像(0，10，20，30，40，50，60min)进行成像，观察微泡的稳定性和成像能力。
结果显示：如图6所示，微泡稳定性随时间改变而降低；在相同时间点，随着白细胞膜比例增加，微泡稳定性呈降低趋势。纯细胞膜的稳定性和成像效果均欠佳，无法达到超声成像的要求。白细胞膜蛋白：脂质体磷脂质量比例为1：50-600时微泡稳定性较好。
Claims (10)
1.一种微泡超声造影剂，其特征在于，包含细胞膜和脂质体；所述细胞膜选自哺乳动物的血细胞膜，所述脂质体选自磷脂。
2.如权利要求1所述的微泡超声造影剂，其特征在于，所述细胞膜选自大鼠、小鼠、兔、狗、猪或人血细胞的细胞膜；
优选地，所述细胞膜选自红细胞、白细胞、或血小板细胞膜中的一种或多种；
优选地，所述细胞膜选自白细胞的细胞膜。
3.如权利要求1所述的微泡超声造影剂，其特征在于，所述的磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)中的一种或多种；
优选地，所述的磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)三者的组合；
优选地，所述的磷脂含有二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)的摩尔质量比为18：1：1～5，更优选18：1：1。
优选地，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为(20～1000)：1；
优选地，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为(20～800)：1；
优选地，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为(40～700)：1；
更优选地，所述脂质体磷脂与细胞膜蛋白的质量比为50：1；
优选地；所述微泡超声造影剂的大小为0.2-4.4μm。
4.一种如权利要求1-3任一所述的脂质微泡超声造影剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将细胞膜与脂质体混合并通入气体，机械振荡形成包含细胞膜的脂质微泡。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1.从外周血中分离血细胞；
S2.差速离心法提取细胞膜；
S3.薄膜-水化法制备脂质体；
S4.将S2制备的细胞膜与S3制备的脂质体混合并通入气体，机械振荡形成包含细胞膜的脂质微泡。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤S1包括以下步骤：
S11.取血样于抗凝采血管中；
S12.将与S11中血样等体积的血细胞分离液加入离心管中，吸取血样并将其平铺于细胞分离液的液面之上，18℃-22℃下400-1000g离心20-40min；
S13.步骤S12离心后，吸取分离液中的所需血细胞；优选地，所需血细胞为白细胞；
S14.向步骤S13吸取的血细胞中加入2-5倍细胞体积的裂解液，吹打混匀后裂解5-20min后200g-400g离心5-15min，弃上清；
S15.重复步骤S14一次即得所需血细胞；
S16.向步骤S15所得的血细胞中加入5-15ml细胞洗涤液混匀细胞，200-400g离心5-15min，弃上清；
S17.重复步骤S16三遍，得到纯化的血细胞。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤S2包括以下步骤：
S21.向步骤S1分离的血细胞中加入10-20ml低渗裂解溶液重悬，转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆15-30次，得到匀浆液；
优选地，所述低渗裂解溶液包含30mM pH7.5 Tris-HCl，225mM D-甘露醇，75mM蔗糖，0.2mM EGTA，蛋白酶抑制剂和磷脂酶抑制剂；
S22.将步骤S21所得的匀浆液加入离心管中，10,000g离心15-30min，吸取上层清液，100,000g离心30-50min，弃去上层清液，留沉淀；
S23.将步骤S22所得的沉淀用三蒸水重悬为溶液，重悬的溶液-70至-90℃冷冻后，真空冻干得到血细胞膜，-15至-25℃保存；
优选地，将步骤S22所得的沉淀用三蒸水重悬为溶液时，加入DiI染料。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤S3包括以下步骤：
S31.将磷脂和氯仿混匀；
S32.将S31制备的溶液在旋转蒸发仪真空作用下形成磷脂薄膜；
S33.在S32制备的磷脂薄膜中加入水化液，并在旋转蒸发仪加热水浴下水化，形成脂质体；所述水化液选自双蒸水、氯化钠或磷酸盐缓冲液(PBS)；优选地，水化液与磷脂的比例为3-8ml:20mg；
优选地，步骤S31中，所述氯仿与磷脂的比例为3-8ml:20mg；优选地，向S31制得的脂质体中加入染料DiO；
优选地，步骤S32中，旋转蒸发仪的转速为100-120rpm，温度为50-70℃，优选为60℃；
优选地，步骤S33中，水化温度为50-60℃，水化时间为20-40min，优选30min。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤S4包括以下步骤：
S41.气体置换：将步骤S3制备的脂质体与步骤S2制备的血细胞膜混合，通入气体置换空气。
S42.将步骤S41的混合溶液机械震荡40-50s形成细胞膜仿生脂质微泡；优选地，将混合溶液机械震荡45s；优选地，机械震荡频率为3000-5000cpm，更优选4350cpm；
优选地，步骤S41中，通入的气体为全氟丙烷C3F8；优选地，通入气体与脂质体比例为5-15：0.5ml，更优选10：0.5ml。
10.如权利要求1-3任一所述的微泡超声造影剂在制备靶向超声造影剂中的应用；
优选地，所述微泡超声造影剂靶向炎症部位。
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