CN106267247A - Rgd靶向造影微泡及其制备方法与应用 - Google Patents

Rgd靶向造影微泡及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种RGD靶向造影微泡及其制备方法与应用。本发明采用机械振荡法制备RGD靶向脂质微泡，光镜下本发明的RGD靶向脂质微泡大小基本一致，分布均匀，分散性较好；平均粒径为：3.71±0.58μm；平均电位为：‑37.3±3.44mV；多肽结合率为98.62％，说明靶向连接率高；本发明的微泡对于活化血小板的趋向性及粘附性明显，在光镜显微镜下可以观察到本发明的RGD靶向脂质微泡向血小板趋向游动明显，能够活化血小板上的GpⅡb/Ⅲa受体可特异性地识别该序列。本发明RGD靶向造影微泡的制备方法简单、成泡率高、靶向连接率高，生物兼容性好，可用于制备体内脏器渗血的靶向显影剂。

Description

RGD靶向造影微泡及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及超声造影技术领域，具体地，涉及RGD靶向造影微泡及其制备方法与在脏器渗血超声造影诊断中的应用。
背景技术
腹部实质脏器渗血多发生于创伤后，包括外伤、手术或微创治疗，临床上对于失血的判断主要通过患者的症状(乏力、口干等)体征(如血压降低、心率增快、睑结膜及皮肤苍白等)、实验室检查(血红蛋白、红细胞计数及红细胞压积降低等)，而由于渗血速度缓慢，在早期失血量不多的情况下，很难判断是否存在渗血及渗血的程度如何，实验室检查也存在一定的滞后性，因此多数情况下临床无法直接观察渗血，因而不易使临床医生得到足够重视，而持续渗血若得不到及时纠正和改善，同样会导致失血性休克。
在腹部实质脏器创伤出血的诊断方面，常规超声、增强CT和腹腔灌洗是三大传统诊断技术，并被沿用至今，尤其是超声技术，其具备快捷、方便、无辐射、床旁操作、可反复检查等优点在临床的应用越来越广泛,尤其是血流动力学不稳定的患者。FAST(FocusedAssessment with Sonography for Trauma)，即创伤重点超声评估法已成为急诊创伤患者检查有无腹腔实质脏器出血最快捷、最有效的检查方法。由于超声可以敏感地显示腹腔积液而被作为创伤后首选的检查手段，但多数情况下其不能确定创伤灶及出血部位。增强CT是评价腹部实质脏器创伤较准确的方法，但对于腹部创伤灶的渗血诊断价值并不高，加之存在放射性损伤和造影剂过敏，在临床应用中也存在一定局限性。诊断性腹腔灌洗同样可以判断腹腔是否存在出血，但不能确定出血位置。数字剪影血管造影(DSA)是诊断腹部实质脏器创伤出血的关键技术，一直被作为“金标准”，然而，其难以诊断出血速度小于5ml/min的缓慢渗血。近年来发展起来的超声造影(Contrast Enhanced Ultrasound，CEUS)被誉为超声技术的“第三次革命”，CEUS可以诊断腹部脏器创伤及创伤后活动性出血，但其同样很难识别创伤后的缓慢出血。而对于诊断不明确的渗血进行开腹手术也会造成不必要的损伤，从另一方面证实了可疑渗血处理的盲目性。
在过去十余年的时间里，CEUS的应用逐渐增加，其较之于常规US在评价血流灌注方面有明显的优势，而这一功能是通过超声造影剂(Ultrasound Contrast Agents,UCAs)来实现的。通常所说的UCAs，即超声脂质造影微泡(Microbubbles，MBs)，一般由两部分构成，一是相对稳定的气体，通常为惰性气体，构成微泡的中心部分，二是包裹气体的壳，通常是白蛋白、磷脂或聚合物。由于充气微泡在声能作用下有很强的反射信号，因此可以增强组织在声波下的反射信号，达到增强显像的目的。它可显著增强组织的声学信号，作为人体血管及组织的影像对比增强剂和血流示踪剂，大大改善了传统US缺乏良好对比度的状况，增强了超声显影效果。靶向超声造影剂(Targeted Ultrasound Contrast Agents，tUCAs)是将特异性抗体或配体连接到微泡表面，依靠抗原抗体或配体受体之间的特异性结合，通过血液循环积聚到靶器官或靶组织，从而使其在超声显像中得到特异性增强或起到靶向治疗的作用。tUCAs与普通UCAs相比，前者能够从分子水平识别并结合病变部位，从而实现靶区增强显影。构成MB壳层的磷脂表面可进行多种修饰，使之能与不同分子结合，实现靶向显影。目前tUCAs还处于基础研究阶段，除了用于肿瘤、血栓、炎症、血管再生等临床常见且风险较高的疾病进行诊断外，其还可作为药物递送系统进行载药，在靶向显影的基础上进行治疗。
RGD肽是一类含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽，广泛存在于人体内，是整合素与其配体蛋白作用的识别位点，此结构作为受体广泛存在于细胞外基质成份中，如纤维蛋白原、玻璃体结合蛋白、骨桥蛋白等，在血管再生、血栓、炎症、肿瘤等机体病理活动中发挥了重要作用，因此，该多肽及其衍生物成为肿瘤及血栓靶向治疗等疾病关注与研究的热点。在机体出血启动凝血反应的过程中，血小板发挥了重要作用。静止的血小板膜表面存在着许多糖蛋白(GP)，其中GPIIb/IIIa复合物，即αIIbβ3整合素，是血小板含量最多的糖蛋白，30％的GPIIb/IIIa复合物是以隐蔽状态分布于开放管道系统和α颗粒上。当血小板活化时，处于隐蔽状态的GPIIb/IIIa复合物全部表达在膜表面并发生空间构型的改变，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列是血小板GPIIb/IIIa受体特异性的识别、结合位点，纤维蛋白原便是通过该识别序列与血小板结合。包含RGD序列的多肽对于GPIIb/IIIa有很强的粘附性，其中环状RGD多肽[Cyclic(c)RGD，cRGD]较之于线性RGD多肽有更强的粘附性，前者是后者的30倍，在体内高速血流条件下Cyclic(c)RGD更具有粘附活化血小板的优势。与血栓形成相似，在创伤出血时，机体凝血瀑布样反应即刻启动，血小板受到损伤血管等因素的刺激后活化、聚集，成为血小板凝块，起到初期止血作用，活化血小板表面暴露的GpⅡb/Ⅲa可以特异性地与RGD肽结合。RGD多肽作为活化血小板GPIIb/IIIa受体的特异性识别序列，目前多用于动脉粥样硬化不稳定斑块显影及靶向治疗的基础研究中。
目前临床上对于腹部实质脏器损伤的出血，尤其是活动性出血，基本可以诊断，但是对于渗血，CEUS仍无法观察。目前尚未见CEUS诊断渗血的文献报道及该方面研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RGD靶向造影微泡及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供RGD靶向造影微泡结合CEUS技术在体内脏器渗血的靶向显影诊断中的应用。
本发明提供的RGD靶向造影微泡，通过以下方法制备得到：包括以下步骤：
(1)DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal加入到容器中，并加入CH2Cl2，待其完全溶解后进行干燥，至容器底部成一层脂质薄膜；
(2)向步骤(1)中容器中加入PBS与甘油的混悬液，摇动使脂质薄膜均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；加入RGD溶液，过夜反应；
(3)将步骤(2)中过夜反应的液体转移至有盖容器中，封口，向有盖容器里的空气置换为C3F8气体，机械震荡，得到乳白色混悬液；
(4)将乳白色混悬液倒入干净容器中，加入PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBRGD，即RGD靶向造影微泡。
本发明的DPPC为二棕榈酰磷脂酰胆碱的缩写，DSPE-PEG(2000)-Mal为二硬脂酰磷脂乙醇胺-聚乙二醇(2000)-马来酰亚胺。RGD为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。RAD为精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸。
上述步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为4-6:1-3。
优选地，步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为5:2。
上述步骤步骤(1)的干燥温度为40-48℃。优选干燥温度为45℃。
本发明的RGD靶向造影微泡，其制备方法的步骤(2)中PBS与甘油的混悬液中，PBS与甘油的体积比为9：1。
进一步地，步骤(2)是按照RGD：Mal的摩尔比1:30加入RGD溶液的。
本发明的RGD靶向造影微泡，其制备方法的步骤(4)中加入的PBS与乳白色混悬液的体积比为3-10:1。
含有本发明RGD靶向造影微泡的显影剂属于本发明的保护范围。
本发明提供了RGD靶向造影微泡在制备机体内渗血的靶向显影剂中的应用。
本发明提供了RGD靶向造影微泡在制备机体内脏器渗血的靶向显影剂中的应用。
进一步地，本发明提供了RGD靶向造影微泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal加入到容器中，并加入CH2Cl2，待其完全溶解后进行干燥，至容器底部成一层脂质薄膜；
(2)向步骤(1)中容器中加入PBS与甘油的混悬液，摇动使脂质薄膜均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；加入RGD溶液，过夜反应；
(3)将步骤(2)中过夜反应的液体转移至有盖容器中，封口，向有盖容器里的空气置换为C3F8气体，机械震荡，得到乳白色混悬液；
(4)将乳白色混悬液倒入干净容器中，加入PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBRGD，即RGD靶向造影微泡。
本发明的有益效果在于：本发明RGD靶向造影微泡的制备方法简单、成泡率高、靶向连接率高，生物兼容性好，可用于制备体内脏器渗血的靶向显影剂。本发明制备得到的RGD靶向造影微泡大小基本一致，分布均匀，分散性较好；平均粒径为：3.71±0.58μm；平均电位为：-37.3±3.44mV；多肽结合率为98.62％，说明靶向连接率高，对于活化血小板的趋向性及粘附性明显，在光镜显微镜下可以观察到本发明的RGD靶向脂质微泡向血小板趋向游动明显，能够活化血小板上的GpⅡb/Ⅲa受体可特异性地识别该序列，在脏器渗血诊断中，靶向显影明显，可作为tUCAs用于创伤性渗血的诊断。
附图说明
图1为普通光镜下观察MBRGD的图像(×400)粒径较均一，分散性好。
图2为MBRGD的粒径检测结果。
图3为MBRGD的电位测试结果。
图4为倒置荧光显微镜下观察MB表面多肽连接情况，上图为MBRGD-FITC，下图为MBRAD-FITC，微泡周围环绕绿色荧光，证明多肽连接成功连接至MB上。
图5为流式细胞仪检测多肽连接率，从上到下：MBMal、MBRGD及MBRAD，其中RGD连接率为98.62％，RAD连接率为98.94％。
图6连接RGD多肽后质谱分析复合物的分子量。
图7为MB体外增强超声显像图像。
图8为MB体外寻靶结果，图8A、图8B、图8C分别为MBMal、MBRGD及MBRAD，黑色箭头示活化聚集的血小板，可见MBRGD在血小板周围聚集现象明显，而MBMal、MBRAD则未见明显聚集。
图9A为MBMal+MBRGD组出血灶超声造影图，圆圈所示位置为同一病灶对比图，MBRGD可见较明显的微泡聚集。图9B为MBMal+MBRAD组创伤灶超声造影图，圆圈所示位置为同一病灶对比图，两者造影效果无明显差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 RGD靶向造影微泡的制备及特性检测
1、试剂材料与仪器设备：c(RGDfC)-FITC，c(RADfC)-FITC，c(RGDfC)，c(RADfC)，购自上海翱博生物科技有限公司；DPPC(850355P)，DSPE-PEG(2000)-Mal(880126P)，购自美国Avanti公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析仪(Autoflex III LRF200-CID)，Bruker公司；酶标仪(Model 680)，Bio-Rad公司；纳米粒度及Zeta电位分析仪(ZS90)，英国马尔文公司；流式细胞仪，美国BD公司；彩色超声诊断仪Mylab 90，意大利百胜公司。
2、实验动物：6周龄新西兰大白兔3只，雌雄不限，体重2.2～2.5kg，由解放军总医院实验动物中心提供。
3、实验方法
3.1马来酰亚胺脂质造影剂，即普通造影剂(MBMal)的制备
采用机械振荡法制备马来酰亚胺脂质造影剂：
(1)称取适量DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal按照质量比5:2的比例加入到圆底烧杯中，并加入适量的CH2Cl2中，待其完全溶解后于旋转蒸发仪上进行干燥，温度为45℃，待去除所有的CH2Cl2后，瓶底形成一层脂质薄膜；
(2)向步骤(1)中的圆底烧瓶中加入PBS与甘油的混悬液(9:1)0.5mL，不停摇晃直至薄膜完全自瓶底脱落并均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；
(3)将步骤(2)中溶有磷脂的白色浑浊液体转移至1.5mL管形瓶中，橡胶瓶塞封口，向管形瓶里空气置换为全氟丙烷(C3F8)气体，在银汞胶囊调合器上进行机械震荡50s，得到乳白色混悬液；
(4)将悬液倒入青霉素小瓶中，加入4.5mL PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBMal，即空白超声造影剂。
3.2 RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)靶向造影微泡(MBRGD)和同型对照RAD(即Arg-Gla-Asp，精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸)造影微泡(MBRAD)的制备
(1)重复3.1的(1)至(2)步骤；
(2)按照RGD(或RAD多肽)：Mal(M：M)＝1:30的比例加入RGD(RAD)溶液，4℃条件下过夜反应；
(3)余步骤同3.1的(3)、(4)，静置洗涤，除去未形微泡的材料及未反应的多肽，得到MBRGD与MBRAD。
3.3靶向造影微泡与同型对照微泡多肽连接情况检测
(1)分别取少量造影剂(FITC标记后的多肽)即MBRGD-FITC和MBRAD-FITC，稍加稀释后涂于载玻片上，加盖盖玻片后在倒置荧光显微镜下观察两组造影微泡的多肽连接情况；
(2)分别取同一数量级浓度造影剂(DiI、FITC分别标记磷脂和多肽)MBMal、MBRGD-FITC和MBRAD-FITC，用流式细胞仪检测RGD与RAD多肽结合微泡的能力；
(3)分别取适量MBRGD及MBRAD，40℃加热致微泡破裂，酶联免疫吸附法(ELISA法)测定两种造影微泡结合多肽的质量(m)，结合多肽分子量(M.W)计算摩尔(Mol)数。
Mol＝m/M.W 1Mol＝6.02×1023
(4)进一步验证RGD多肽是否与磷脂连接成功：取少量MBRGD溶液待其自然晾干后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，分析连接后复合物的分子量(M.W)。
3.4微泡体外增强超声显像
(1)取适量造影剂MBMal、MBRGD与MBRAD，并调整各自浓度在同一数量级，以脱气水做对照，分别将其加入至凝胶模型中进行超声显像，参数设置相同(增益40％，深度70mm，机械指数0.09)。
(2)DFY图像定量分析软件脱机分析图像：于图像的上选取9个测点(圆形的的八等分点内侧及中心)，取样面积相同，测平均灰度值。
3.5微泡体内增强超声显像
造影实验前用3％戊巴比妥钠溶液耳缘静脉注射麻醉新西兰大白兔(1mL/kg)，以8％硫化钠作为脱毛剂脱去兔肝区体毛，仰卧位固定于实验台上。使用百胜彩色超声诊断仪及其匹配成像技术，探头(LA523)置于剑突下，参数设置为增益50％，显像深度固定为30mm，机械指数0.09。经耳缘静脉以团注形式注射造影微泡(0.5ml/kg,108个/mL)，并立即跟追1.0mL 0.9％氯化钠溶液，自微泡注射开始计时，观察肝脏灌注情况，至微泡消失停止计时实时记录图像并进行脱机分析，分别对不同新西兰兔进行MBMal、MBRGD与MBRAD显影。脱机分析时每隔1min对图像进行分析，采用DFY软件取每帧图像进行分析，取肝实质部分，尽量避开血管及胆道，分别取8处测量平均灰度值。
3.6造影微泡体外寻靶能力检测
(1)制备富含血小板血浆：对新西兰兔进行心脏抽血5mL将其置于枸橼酸盐抗凝的抽血管中，低温离心机内1000rpm离心10min后取上清液，即富含血小板血浆，分别取1mL上述血浆加入到3个培养皿中。
(2)血小板活化：向上述各培养皿中分别加入7μmol/L的ADP溶液50μL，并于室温下放置摇床中100rpm 10min，使之与血浆充分混匀。
(3)分别取相同数量级(108个/mL)MBMal、MBRGD与MBRAD各50μL加入上述富含血小板血浆中，室温条件下在摇床中混匀(60rpm 10min)，使得血小板与微泡充分接触。
(4)取少量于干净载玻片上，并加盖盖玻片，于倒置显微镜下观察MBs与血小板的粘附结合情况。
3.7观察指标
(1)在光学显微镜下观察超声造影剂的大小及分布情况；
(2)Malvern激光粒径测量仪检测造影微泡的平均粒径，Malvern表面电位测量仪检测造影微泡的平均表面电位；
(3)用血球计数板计算造影微泡的浓度；微泡浓度(个/mL)＝80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数
(4)微泡表面连接多肽状况及数量；
(5)三种微泡在动物体内的显影状况，用不同时间点的平均灰度值表示；
(6)MBMal、MBRGD与MBRAD对活化血小板的粘附能力。
3.8统计 计量数据均采用平均数±标准差表示，应用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01认为差异有显著统计学意义。
4、结果
4.1三组MBs的一般物理特性
(1)在光学显微镜下观察三组造影微泡：大小基本一致，分布均匀，分散性较好(图1)；
(2)Malvern激光粒径测量仪测得的MBMal、MBRGD及MBRAD的平均粒径分别为：4.25±0.67μm，3.71±0.58μm，4.18±0.86μm(图2)；Malvern表面电位测量仪测得的MBMal、MBRGD及MBRAD的平均电位分别为：0.01±7.86mV，-37.3±3.44mV，-34.5±5.21mV(图3)。
(3)血球计数板计算MBMal、MBRGD及MBRAD的浓度分别是：2.52±0.26×108个/mL,2.74±0.12×108个/mL,2.34±0.46×108个/mL。
4.2靶向造影微泡结合多肽的能力
(1)倒置荧光显微镜观察：MBRGD及MBRAD表面发出明亮的绿色荧光(图4)，表明MBRGD及MBRAD表面均已成功连接多肽。
(2)流式细胞仪检测：以MBMal作为对照，MBRGD多肽结合率为98.62％，MBRAD的多肽结合率为98.94％(图5)。
(3)ELISA法检测多肽的结合量分别是：9.76±0.91×104个RGD/MBRGD，10.13±0.34×104个RAD/MBRAD。
(4)质谱分析结果显示聚合物最高分子量为3551.741，与反应之前DSPE-PEG(2000)-Mal分子量2941.605相比，分子量增加且接近c(RGDfC)的分子量(578.66)，证明RGD多肽连接成功(图6)。
4.3微泡体外增强超声显像结果
比较三种超声造影MB的体外增强显影，在108～106数量级浓度时，前方显像增强，由于气体阻挡导致后方显像缺失；105数量级浓度时，增强显影明显，后方无阻挡；在104-102数量级浓度时，显像亮度较105逐渐降低(图7)。DFY软件分析结果显示三种MB的平均灰度值，在相同数量级浓度条件下各组MBs平均灰度值统计无明显差异，P值均大于0.05(表1)。
表1 MB体外增强显影平均灰度值比较
*所示数值为平均灰度值
4.4微泡体内增强超声显像结果
自耳缘静脉注射超声造影剂后10s左右肝脏开始出现增强，持续时间均在10min左右，肝组织内增强显影明显。DFY软件分析不同时间点肝脏显影情况见表2；相同时间点三种造影MBs平均灰度值均无明显差异，P值均大于0.05。
表2MB体内增强显像平均灰度值比较
*所示数值为平均灰度值
4.5三组MBs体外寻靶能力检测结果
镜下观察各种造影微泡对于活化血小板的寻靶能力，MBRGD微泡聚集于凝集的血小板周围或内部，分散的微泡较少；MBMal与MBRAD则与活化的血小板粘附性较差，微泡分布较分散，无明显团聚或粘附现象(图8A-图8C)。
本发明采用成泡前连接方式，即将RGD/RAD多肽在成泡之前通过共价连接于磷脂材料上，然后再机械震荡形成微泡。成泡后连接，即先使磷脂材料形成微泡，然后再通过共价反应将RGD/RAD多肽连接于微泡上。在发明过程中，申请人也分别尝试了两种方法进行了靶向超声微泡制作，成泡后连接的方式有以下不足：(1)成泡后连接配体易造成配体浪费，因为微泡成形后为混悬液，静置放置时因为其内充满气体的缘故，微泡会悬浮于上层，这样微泡不易与多肽接触，从而使反应时间延长，且反应效率降低；(2)成泡后连接配体，镜下观察常出现粒径较大的微泡(>10μm)，分析原因为悬浮于液体上层的微泡因放置时间较长(共价反应时间为过夜)，微泡间的相互作用力致微泡间融合增大或气体逸出致微泡破裂，即使置于摇床上反应也会出现此种情况。因此在本发明中采用了成泡前连接多肽的方式进行靶向微泡的制备。为验证RGD多肽成功连接到磷脂，即DSPE-PEG2000-Mal上，除去荧光标记直接显示外，还采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)对连接多肽后的磷脂进行分子量分析鉴定，同样证明RGD与DSPE-PEG2000-Mal反应成功。
FITC标记的RGD靶向微泡制备成功后，首先于普通光镜下观察微泡的粒径及分散性，制备较好的微泡粒径均一，约在4μm左右，与临床常用超声造影剂声诺维(注射用六氟化硫微泡，Bracco，Milan)的粒径范围(90％MBs粒径＜8μm)是一致的，可以通过肺循环。随后在荧光显微镜下观察微泡表面多肽连接情况，FITC标记的RGD在荧光显微镜下发出绿色荧光，围绕于微泡表面形成一圈绿色荧光，进一步验证了RGD多肽成功地连接于微泡的磷脂壳上。因磷脂具有双分子层结构，在成泡过程中疏水端朝向微泡内部，亲水端朝向微泡外面，本实施例所用磷脂材料DSPE-PEG2000-Mal的亲水端为反应端，因此RGD多肽是连接于微泡表面而非微泡内部。
本实施例共制备了三种超声造影微泡，即MBMal，MBRGD和MBRAD，分别为未修饰的、连接RGD多肽和连接RAD多肽的MBs。其中RAD多肽为c(RADfc)，即环状RAD多肽，其分子量与电荷均与c(RGDfc)相似，其末端为半胱氨酸，可以与马来酰亚胺基团反应形成硫醚键，但其不是血小板GpⅡb/Ⅲa受体的特异性片段，无法与上述受体结合。制备MBRAD为下一部分试验的阴性对照MBs。比较三种超声造影MB的粒径及浓度，均在同一水平及数量级范围内，且MBRGD与MBRAD两种MBs所带电荷亦相似。将标有FITC的RGD、RAD多肽连接于DiI磷脂材料，制成微泡MBRGD与MBRAD，以MBMal作为对照，应用流式细胞仪(Flow Cytometry，FCM)检测两种连接多肽的MBs，其连接率均达到了98％以上，说明该微泡制备方法靶向连接率高。制备MBMal的目的在于作为空白对照UCAs，为下一部分动物实验时观察有无活动性出血作CEUS用。
本发明MBs体外显影实验证实了自行制备的MBs显著提高了组织散射强度，易被超声显像，并通过体外显影摸索最佳显影条件，探头超声频率固定、深度及机械指数固定，稀释不同倍数致微泡浓度在同一数量级，观察最佳显影效果：微泡浓度过高，导致前方气体反射增强，后方显影不清；微泡浓度过低，组织灌注低，显影不清晰。体外显影试验结果还表明，微泡浓度在105时显影效果最佳。因此在动物实验中，将一定量的超声造影剂微泡注射至动物体内，根据动物血容量，计算体内微泡浓度，最终确定微泡的用量，本实施例中确定的注射量为0.5mL/kg，在此剂量时CEUS显像为最佳状态，既没有因微泡浓度过高致后方声衰减，也没有出现实质充盈不全现象。
在体外寻靶试验中，血小板在ADP作用下活化并聚集，不同性质MBs对血小板的粘附能力不同，MBRGD较之于MBMal、MBRAD，其对于活化血小板的趋向性及粘附性明显，在光镜显微镜下可以观察到MBRGD向血小板趋向游动较明显，而其他两种则不明显。此方法虽不能完全模拟靶向微泡体内寻靶情况，但是仍能较明显地说明RGD多肽与活化血小板的结合能力。
实施例2 RGD靶向造影微泡在肝脏创伤渗血诊断中的应用研究
1、肝脏创伤渗血模型的建立
(1)经耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液(1mL/kg)，8％硫化钠作为脱毛剂脱去兔肝前区体毛，仰卧位固定于实验台上。于左侧耳缘静脉进行静脉置管(21G)，接三通管，用于推注0.9％氯化钠注射液、MBs及追加麻醉剂用。
(2)消毒胸部及腹部皮肤，铺无菌洞巾，自剑突下缘沿腹部中线纵行切开皮肤，长度约5cm，逐层分离皮下组织、肌肉层及腹膜，打开腹腔，暴露肝脏中叶外缘，用纱布将肝左中叶包裹并自切口处轻轻拖拽至体外。
(3)为使肝脏显像更清楚，于肝叶上方放置水囊，使用百胜彩色超声诊断仪，在二维超声及彩色多普勒条件下观察肝脏实质及血流情况，选择进针穿刺点。16G病理穿刺活检针对肝中叶进行穿刺(避开大血管)，取出一条22mm长度肝组织，致肝组织出血。肉眼观可见暗红色血液自穿刺口缓慢流出，为使针道及出血灶显像清晰，避免拔针后肝组织回缩致针道消失，故于穿刺进针处放入一尖端圆钝软管，提前用肝素钠生理盐水浸泡，软管长度为10cm，直径为2mm，放置深度约为5mm。于组织上放置一脱气水的水囊，探头置于水囊上进行超声观察。
2、RGD靶向造影微泡肝脏创伤渗血诊断的动物实验
采用实施例1制备得到的MBMal、MBRGD及MBRAD。
(1)使用百胜彩色超声诊断仪及其匹配成像技术，参数设置为增益40％，机械指数0.09，显像深度固定为37～40mm，对出血灶进行CEUS检查。
(2)将12只新西兰兔随机分为两组，分别为MBMal+MBRGD组(即空白+靶向对照组)和MBMal+MBRAD组(即空白+阴性对照组)。首先确认渗血模型成功，即创伤后对创伤灶立即行MBMal超声造影：0.5mL/kg经耳缘静脉置管进行团注，后追加1mL 0.9％氯化钠注射液，计时并记录造影图像，造影时间为10min，10min时观察到无活动性出血但软管内仍有血液溢出为确认肝脏渗血模型制作成功。立即采用flash键(瞬间高机械指数MI＝1.2)将肝组织中及血管中的少量剩余微泡进行超声触发击破，探头尽量避开血肿区域；紧接着对同一出血病灶进行MBRGD或MBRAD超声造影，注射剂量同MBMal，计时并记录造影图像，并脱机分析。CEUS时避免同一部位辐照过长时间。应用DFY软件，自静脉推注造影剂开始，每间隔1min测量感兴趣区平均灰度值(AGVs)，每个区测3次，取均值。
各组不同时间点的AGVs用平均数±标准差表示，分别采用配对t检验及随机对照t检验，P<0.05认为差异有统计学意义，P<0.01认为差异有显著统计学意义。
3、结果
3.1模型建立情况各组中均有1只新西兰兔造模过程因穿刺损伤动脉造成活动性大出血，每组中各有5只成功建立了肝脏创伤渗血模型，模型成功率为83％。
3.2造影结果
3.2.1 MBMal+MBRGD组(空白组+靶向对照组)
在出血后即刻静脉推注MBMal进行超声造影检查，于血肿区或针道处呈现无增强区或低增强区，持续时间短；10min后行MBRGD进行超声造影，则可见同一观察区域内出现微泡聚集显影，并持续较长时间(图9A)。
3.2.2 MBMal+MBRAD组(空白组+阴性对照组)
在出血后即刻静脉推注MBMal进行超声造影检查，于血肿区或针道处呈现无增强区或低增强区，持续时间短；10min后行MBRAD进行超声造影，同一观察区域内未见微泡聚集(图9B)。
实验结果表明，在普通MB未聚集的血肿区域内，靶向UCAs，即MBRGD在血肿区域内聚集，并持续较长时间，而对照组UCAs，即MBRAD没有出现这一现象，证明了MBRGD的趋向性和靶向性，在一定程度上证明了MBRGD在肝脏渗血诊断中的价值。
3.3 DFY分析结果
3.3.1 MBMal+MBRGD组前后自身对照分析结果
靶向造影微泡MBRGD较之于空白微泡MBMal在造影早期即1～3min的表现相似，创伤灶的AGVs相比无统计学意义，P1min、P2min、P3min均大于0.05；自第4min开始，MBRGD开始在创伤灶内有少量聚集，至第6min，MBRGD超声造影的AGVs较之于MBMal均有统计学意义，P4min＜0.01，P5min＜0.01，P6min＜0.05；第7min时两者AGVs比较无统计学意义，P7min＞0.05；第8、9min时MBRGD的AGVs较前降低，但较之于MBMal仍有统计学意义，P8min＜0.05，P9min＜0.05；至第10min时，两者的AGVs比较无统计学差异，P10min＞0.05(详见表3)。
表3 MBMal+MBRGD组微泡超声造影的平均灰度值比较
*所示数值为平均灰度值
3.3.2 MBMal+MBRAD组前后自身对照分析结果
阴性对照微泡MBRAD较之于空白微泡MBMal在各个时间点的AGVs比较均无统计学差异，P值均大于0.05(详见表4)。
表4 MBMal+MBRAD组微泡超声造影的平均灰度值比较
*所示数值为平均灰度值
3.3.3 MBRGD与MBRAD随机对照分析结果
靶向微泡MBRGD与阴性对照微泡MBRAD超声造影的AGVs在各个时间点相比，第4、10min比较差异无统计学意义，P4min＞0.05，P10min＞0.05；其余时间点比较则均有统计学意义，其中，第2、3、6、8min比较差异有显著统计学意义，P2min、P3min、P6min、P8min＜0.01；第1、5、7、9min比较差异有统计学意义，P1min、P5min、P7min、P9min＜0.05(表5)。
表5 MBRGD与MBRAD超声造影的平均灰度值比较
*所示数值为平均灰度值
由于超声影像学的诊断存在一定主观性，因此本实施例除外进行脱机实时动态图像分析外，还采用DFY图像定量分析软件对创伤病灶进行平均灰度值，即AGVs测定，进行定量分析，以进一步明确靶向微泡的体内靶向效果及各时间点显像的差异。结果表明，靶向微泡MBRGD其在诊断肝脏创伤渗血时，自静脉注射造影剂后4min，创伤病灶区即血肿部位开始出现少量微泡聚集，AGVs明显升高，并持续至第6min而同一时间点的空白微泡MBMal图像的AGVs则无明显变化。随后各时间点MBRGD的造影图像显示病灶区的AGVs呈逐渐下降趋势，但第8、9min时MBRGD较之于MBMal的平均AGVs仍有统计学意义。而阴性对照组微泡MBRAD的平均灰度值在各个时间点较之于空白微泡MBMal则均无差异。由此推断并得到以下推论：第一，本发明的靶向微泡MBRGD除具备普通微泡显影特点外，其对于特异性受体还存在趋向性，但由于体内血流速度快，剪切力大，受体数量有限等因素，并非所有的靶向微泡全部与受体结合，而是很少一部分靶向MB与特异性受体结合，实现靶向显影的目的；第二，由于渗血本身血流速度慢，靶向MB自血管破损处漏出时并不表现为活动性出血时动脉期即可出现的“云雾”样或“泉涌”样团聚，仅表现血肿充盈缺损区的散在增强显影，出现时间较晚，在无长时间辐照条件下，可持续较长时间；第三，在CEUS的后期阶段，MBRGD的平均灰度值逐渐降低，考虑主要由两个因素造成，一是随着时间延长，MB会随循环逐渐破坏，其内C3F8气体经肺脏时弥散至体外，二是反复辐照也易造成微泡的破坏，但即使AGVs降低，但仍较MBMal测值高，亦表明MBRGD的靶向性。本实施例还比较了MBRGD与MBRAD两者CEUS诊断肝脏创伤渗血的差异性，同样以时间为节点，结果显示10min内大部分时间点(除第4、10min外)的AGVs均有统计学差异，进一步说明MBRGD在肝脏创伤渗血诊断中的靶向显影优势。
本实施例研究结果证实，在肝脏创伤渗血的诊断中，载RGD的靶向脂质微泡较之于普通微泡具有明显的优势，可作为tUCAs用于创伤性渗血的诊断。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种RGD靶向造影微泡，其特征在于，通过以下方法制备得到：包括以下步骤：
(1)DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal加入到容器中，并加入CH2Cl2，待其完全溶解后进行干燥，至容器底部成一层脂质薄膜；
(2)向步骤(1)中容器中加入PBS与甘油的混悬液，摇动使脂质薄膜均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；加入RGD溶液，过夜反应；
(3)将步骤(2)中过夜反应的液体转移至有盖容器中，封口，向有盖容器里的空气置换为C3F8气体，机械震荡，得到乳白色混悬液；
(4)将乳白色混悬液倒入干净容器中，加入PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBRGD，即RGD靶向造影微泡。
2.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为4-6:1-3。
3.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(1)中DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal的质量比为5:2。
4.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(1)的干燥温度为40-48℃。
5.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(2)中PBS与甘油的混悬液中，PBS与甘油的体积比为9：1。
6.如权利要求1所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(2)是按照RGD：Mal的摩尔比1:30加入RGD溶液的。
7.如权利要求1-6任一所述的RGD靶向造影微泡，其特征在于，步骤(4)中加入的PBS与乳白色混悬液的体积比为3-10:1。
8.含有权利要求1-7任一所述RGD靶向造影微泡的显影剂。
9.权利要求1-7任一所述的RGD靶向造影微泡在制备机体内渗血的靶向显影剂中的应用。
10.权利要求1-7任一所述RGD靶向造影微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DPPC与DSPE-PEG(2000)-Mal加入到容器中，并加入CH2Cl2，待其完全溶解后进行干燥，至容器底部成一层脂质薄膜；
(2)向步骤(1)中容器中加入PBS与甘油的混悬液，摇动使脂质薄膜均匀溶于上述混悬液中，形成均质白色浑浊液体；加入RGD溶液，过夜反应；
(3)将步骤(2)中过夜反应的液体转移至有盖容器中，封口，向有盖容器里的空气置换为C3F8气体，机械震荡，得到乳白色混悬液；
(4)将乳白色混悬液倒入干净容器中，加入PBS进行稀释，并静置洗涤3次，弃下层清液，除去未形成微泡的材料，得到MBRGD，即RGD靶向造影微泡。
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