CN110180509A - 一种荧光分子印迹聚合物空心微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种荧光分子印迹聚合物空心微球及其制备方法和应用，属于分子印迹聚合物技术领域。包括制备二氧化硅纳米粒子SiO2，制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC‑APTES的聚合物；制备荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC‑APTES@MIP，并将其蚀刻成空心荧光分子印迹聚合物FITC‑APTES@MIP。优点是：制备出能够快速高效特异性检测目标分析物且合成过程较为安全、环保的空心荧光分子印迹聚合物，具体表现为对目标分析物特异性吸附并产生荧光淬灭，在20min内有较为显著的淬灭效果，从而缩短检测时间。

Description

一种荧光分子印迹聚合物空心微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子印迹聚合物技术领域，特别涉及一种荧光分子印迹聚合物空心微球 及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，通过化学合成方法开发含有特征结构域的功能材料越来越受重视，其中通 过分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique or Technology,MIT)开发的分子印迹聚 合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIP)就是一种具有代表性的仿生功能材料，由于分 子印迹聚合物具有结构可预测性，识别特异性和应用普遍性等三大特征且理化性质稳 定，制备方法简便，成本低廉及较强的催化和降解能力，故其在纯化和分离，化学、生 物传感，人工抗体，药物递送等领域受到广泛关注。分子印迹技术是一种通过模拟自然界中“抗原-抗体”分子识别作用的仿生分子识别技术。该技术利用化学交联反应将模板分子与功能单体通过分子间相互作用生成稳定的聚合物，洗脱模板分子后生成分子印迹聚合物。分子印迹聚合物保留有与原模板分子大小形状完全匹配的结合位点和立体空穴， 这样的结构就像锁与钥匙，能够对模板分子表现出特异的选择性和识别性，并具有较强 的稳定性。荧光分子印迹技术是将荧光检测技术与分子印迹技术相结合的一种新型技 术，可以制备出对目标分子具有高度选择性能力且具有荧光效应的高分子材料。荧光分 子印迹聚合物在检测过程中亦具有灵敏度高、操作简便、重现性好、设备简单等特点， 近年发展迅速。
文献“王吉祥，孙琳，汪云云，闫永胜.硅球表面制备荧光分子印迹聚合物检测高效氟氯氰菊酯的研究[J].化学试剂，2017，39(09)：907-912”(简称文献1)与专利“分子 印迹和荧光共轭聚合物构建的复合材料、制备及应用CN 101381438B”(简称文献2)。 文献1中含有荧光分子印迹聚合物制备技术，主要内容是“利用Stover法制备SiO2纳 米粒子，将SiO2纳米粒子表面硅烷化并接枝荧光基团。再用沉淀聚合法，以高效氟氯 氰菊酯(Beta-cyhalothrin，BC)为模板分子，甲基丙烯酸甲酯(MMA)为功能单体，三 羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)作为交联剂，在乙腈溶液中并在氮气保护下60℃ 300r/min反应24h后得到荧光分子印迹聚合物”。文献2中含有荧光分子印迹聚合物制 备技术，主要内容是“先制备对TNT敏感的聚合物骨架，在聚合物骨架上引入长链。 链的一端和荧光共轭聚合物骨架相连，另一端的端基引入可形成分子印迹聚合物的活性 单元。然后加入模版分子(爆炸物分子)和其它用于形成分子印迹聚合物的交联剂，引发 共聚形成分子印迹聚合物，除去模版分子，得到荧光共轭聚合物-分子印迹聚合物复合 物”。
文献1中描述了以高效氟氯氰菊酯(Beta-cyhalothrin，BC)为模板分子的荧光分子印迹聚合物制备技术。首先，上述技术中的功能单体仅为甲基丙烯酸甲酯(MMA)， 化学结构如下：
甲基丙烯酸甲酯只能提供-CH3与＝O，不能提供常见的-OH与-NH2，缺少足够的电子供体与电子受体基团。因此，单独采用甲基丙烯酸甲酯为功能单体所能有效结合的模 版分子有较大的局限性，即文献1中功能单体、交联剂、引发剂及反应条件的限制下， 仅能制备出可高效特异性检测高效氟氯氰菊酯的荧光分子印迹聚合物，而不能有效制备 出能特异性检测其他物质的荧光分子印迹聚合物。其次，文献1中二氧化硅纳米粒子的 合成过程中，需要先搅拌30min混匀体系，再添加反应物质，然后室温搅拌反应24h， 反应结束后干燥需12h；二氧化硅纳米粒子表面硅烷化过程需要反应24h并干燥12h； 二氧化硅纳米粒子表面接枝荧光基团过程需反应12h并干燥12h；荧光分子印迹聚合物 制备过程中需要预聚合6h，再反应24h，经过洗涤后再干燥12h。不考虑操作时间只计 算反应时间，文献1的荧光分子印迹聚合物制备过程至少需要138.5h，大约6天时间， 较为耗时。
在文献2中描述了一种分子印迹聚合物-荧光共轭聚合物复合物的制备过程，该发明提供了一种同时检测多种生物和化学物质的分析方法。该方法的检测对象不仅局限于同类结构相近的物质，还可以是结构差别较大的物质，可以同时是化学物质，可以同时 是生物物质，还可以同时是生物和化学物质。在实施例中荧光共轭聚合物-分子印迹聚 合物复合物可同时检测多种爆炸物分子(TNT、奥克托今、黑索金、硝胺四种炸药)。 在文献2提供的合成步骤的印迹过程中，同时加入多种模版分子，以达到最终的聚合物 中同时存在多种模版分子的印迹空穴，进而实现同时检测多种物质的目标。由于对比文 献2的聚合物内荧光共轭聚合物是相同的，只是印迹空穴不同，因此，其聚合物对不同 物质进行同时检测的过程中产生的检测信号是相同的，即不论检测到几种物质，检测信 号都是荧光淬灭。故在检测TNT、奥克托今、黑索金、硝胺四种炸药混合物过程中，单 一的检测信号，是不能反应各组分含量的，较为适用于多组分总含量的检测。
因此，文献2制备的荧光分子印迹聚合物对模版分子的特异性不足，在实际检测过程中无法排除其他物质的干扰，易出现假阳性。再者，文献2中聚合物的响应时间较 长，在20min时荧光淬灭率无法达到20％，原因可能有两方面，一者为其为实心聚合 物，表面积没空心聚合物大，降低了聚合物对模版分子的吸附效率，二者为其聚合物含 有多种模版分子的印迹空穴，在聚合物吸附模版分子的过程中，各种模版分子互相干扰 影响吸附效率。另外，文献2所述合成方法中对聚合物洗涤溶剂为甲苯乙醇溶液，根据 《危险化学品安全管理条例》、《易制毒化学品管理条例》甲苯受公安部门管制，文献2 的洗涤过程会使用大量甲苯溶液，不仅具有极大的安全风险，还有一定环境污染风险。
发明内容
本发明提供一种荧光分子印迹聚合物空心微球及其制备方法和应用，以解决目前存在的不能快速高效特异性检测目标分析物、合成过程不安全、不环保的问题。
本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：
步骤一：制备二氧化硅纳米粒子SiO2
首先，配置乙醇-去离子水混合液，向其中加入氨水，经过超声处理10min得到混合液A；将混合液A置于常温下磁力搅拌，在惰性气体保护下，通过滴定管缓慢加入正 硅酸乙酯TEOS进行反应，等到溶液由原来的澄清透明变成奶白色后，继续反应6h后， 通过离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅纳米粒子；在 本步骤中，氨水：乙醇：水：正硅酸乙酯为2:25:25:2，磁力搅拌600rpm，离心速度为 10000-11000rpm/min，时间为5-10min；
步骤二：制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
首先，将0.026mmol异硫氰酸荧光素FITC与0.858mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅 烷APTES混合，在经过10min超声除气的0.5mL无水乙醇溶液中，将混合物液在惰 性气体保护下超声处理20min后，再常温300rpm/min振摇反应6h得到混合液B；将 200mg二氧化硅纳米粒子SiO2通过超声分散在13.5mL氨水-乙醇-去离子水1:6:20混 合液中，再在惰性气体保护下，常温状态进行600rpm/min的磁力搅拌，然后将混合液 B缓慢加入，反应6h后，通过离心速度为10000-11000rpm/min，时间为5-10min离 心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧 光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
步骤三：制备荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP
首先制备水相，将聚乙二醇10000PEG-10000溶解在60mL热水中得到溶液C，将 溶液C移入100mL棕色两口烧瓶，70℃油浴磁力搅拌，搅拌速度为300-1200rpm/min；
之后制备有机相，将10mg二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES 的聚合物溶解在3mL氯仿中，超声分散5-10min，待聚合物均匀分散后，加入0.1mmol 模版分子以及0.6mmol功能单体，功能单体采用α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、 4-乙烯基吡啶4-VP(4:1:1)-(1:2:2)，经过超声5min后加入10mg偶氮二异丁腈AIBN 和0.4mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA混匀后得到溶液D；
然后将溶液D在惰性气体保护下缓慢加入到溶液C中，溶液D转移完毕后停止通 氮气，将两口瓶密封反应6h后得到实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP 沉淀；
最后对实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀进行洗涤，并将其 蚀刻成空心荧光分子印迹聚合物FITC-APTES@MIP，通过10000-11000rpm/min，5-10 min离心分离聚合物沉淀，将聚合物沉淀用30mL 50％乙醇混匀并超声10-20min，待聚 合物完成均匀分散后，再将聚合物置于90℃水浴10min后，再次进行离心收集沉淀； 用30mL无水乙醇混匀并超声10-20min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀， 用30mL去离子水混匀并超声10-20min、待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉 淀；然后，将聚合物沉淀用30mL甲醇：乙酸9:1溶液混匀，并超声60min以除去模版 分子后，进行离心收集沉淀，重复一次后用30mL无水乙醇混匀并超声10-20min待聚 合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，将聚合物沉淀混匀在30mL的10％氢氟酸 乙醇溶液中，超声10min后静置15min，然后经过乙醇和去离子水的洗涤并真空干燥 8h，得到空心的荧光分子印迹聚合物。
本发明所述步骤一中，离心速度为10000rpm/min，时间为10min。
本发明所述步骤二中，离心速度为10000rpm/min，时间为10min。
本发明所述步骤三中，搅拌速度为600rpm/min。
本发明所述步骤三中，所述模版分子包括：农药，有害化学物质，兽药物质，性激素，精神药品和毒品。
本发明所述模版分子中：
农药包括：有机氯农药、有机磷及氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药；
有害化学物质包括：黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OT)、三聚氰胺；
兽药包括：盐酸克仑特罗(Clenbuterol Hydrochloride)、沙丁胺醇(Salbutamol)、 莱克多巴胺(Ractopamine)；
性激素包括：β-受体激动剂，己烯雌酚(Diethylstibestrol)、雌二醇(Estradiol)、戊 酸雌二醇(EstradiolValerate)；
精神药品包括：(盐酸)氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrochloride)、安定(地西泮)(Diazepam)、异戊巴比妥钠(Amobarbital Sodium)；
毒品包括：可卡因(Cocaine)、四氢大麻酚(THC)、甲基苯丙胺(Methamphetamine)。
本发明一种荧光分子印迹聚合物空心微球在检测目标分析物中的应用。
本发明优点是：通过改变功能单体的组成、交联剂的种类、反应溶剂的类型、聚合温度、时间、搅拌速度，制备出能够快速高效特异性检测目标分析物且合成过程较为安 全、环保的空心荧光分子印迹聚合物。
本发明制备的荧光分子印迹聚合物可以通过荧光强度的变化对目标分析物进行高 效、快速、特异性的检测。具体表现为对目标分析物特异性吸附并产生荧光淬灭，在20min内有较为显著的淬灭效果(大于50％)。
本发明制备的荧光分子印迹聚合物是一种空心的聚合物，相对于实心结构的聚合物 具有较大的比表面积，有利于聚合物对目标分析物的吸附，从而缩短检测时间。
本发明合成体系中功能单体是合剂型，即三种功能单体混合使用，三种功能单体分 别是甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)，结构式如下：
本发明的功能单体合剂可以提供足够的电子供体与受体，不同比例的功能单体合剂 能够满足大部分化合物为模版分子的印迹合成需要。
本发明能够以多种类型的目标分析物为模版分子进行荧光分子印迹聚合物的制备， 产物对目标分析物具有特异性吸附能力，目标分析物即模版分子包括：农药，如有机氯农药、有机磷及氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药；有害化学物质，如黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OT)、三聚氰胺等；兽药物质，如盐酸克仑特罗(ClenbuterolHydrochloride)、沙丁胺醇(Salbutamol)、莱克多巴胺(Ractopamine)等β-受体激动剂， 己烯雌酚(Diethylstibestrol)、雌二醇(Estradiol)、戊酸雌二醇(EstradiolValerate)等性激素；(盐酸)氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrochloride)、安定(地西泮)(Diazepam)、 异戊巴比妥钠(Amobarbital Sodium)等精神药品；毒品，如可卡因(Cocaine)、四氢大 麻酚(THC)、甲基苯丙胺(Methamphetamine)等。
本发明的合成过程仅需要44h左右，相对于文献1的6天时间，耗时大为缩短。
本发明相对于文献2，聚合物能够对模版分子产生特异性吸附并在20min内产生50％的荧光淬灭率，变化较为迅速显著。另外，本发明洗涤溶剂为甲醇溶液相对于甲苯 较为安全。
附图说明
图1a是透射电子显微镜(TEM)表征以腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物过程中的产物二氧化硅纳米粒子(SiO2)；
图1b是透射电子显微镜(TEM)表征以腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物过程中的产物二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素(SiO2@FITC-APTES)的聚合物；
图1c是透射电子显微镜(TEM)表征以腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物过程中的产物实心荧光分子印迹聚合物(SiO2@FITC-APTES@MIP)；
图1d是透射电子显微镜(TEM)表征以腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物过程中的产物空心荧光分子印迹聚合物(SiO2@FITC-APTES@MIP)；
图2是荧光分子印迹聚合物对各目标分析物进行单独检测的荧光光谱图；
图3是荧光分子印迹聚合物对各目标分析物进行混合检测的荧光光谱图；
图4是荧光分子印迹聚合物吸附腐霉利的动态吸附曲线图。
具体实施方式
实施例1
包括下列步骤：
步骤一：制备二氧化硅纳米粒子SiO2
首先，配置乙醇-去离子水混合液，向其中加入氨水，经过超声处理10min得到混合液A；将混合液A置于常温下磁力搅拌，在惰性气体保护下，通过滴定管缓慢加入正 硅酸乙酯TEOS进行反应，等到溶液由原来的澄清透明变成奶白色后(约20min内出 现明显变化)，继续反应6h后，通过离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥 8h后得到二氧化硅纳米粒子；氨水：乙醇：水：正硅酸乙酯为2:25:25:2，磁力搅拌600 rpm，离心速度为10000rpm/min，时间为10min，
步骤二：制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
首先，将0.026mmol异硫氰酸荧光素FITC与0.858mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅 烷APTES混合，在经过10min超声除气的0.5mL无水乙醇溶液中，将混合物液在惰 性气体保护下超声处理20min后，再常温300rpm/min振摇反应6h得到混合液B；将 200mg二氧化硅纳米粒子SiO2通过超声分散在13.5mL氨水-乙醇-去离子水1:6:20混 合液中，再在惰性气体保护下，常温状态进行600rpm/min的磁力搅拌，然后将混合液 B缓慢加入，反应6h后，通过10000rpm/min，10min离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤 与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚 合物；
步骤三：制备荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP
首先制备水相，将聚乙二醇10000PEG-10000溶解在60mL热水中得到溶液C，将 溶液C移入100mL棕色两口烧瓶，70℃油浴磁力搅拌，搅拌速度为600rpm/min；
之后制备有机相，将10mg二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES 的聚合物溶解在3mL氯仿中，超声分散5-10min，待聚合物均匀分散后，加入0.1mmol 模版分子以及0.6mmol功能单体，功能单体包括α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、 4-乙烯基吡啶4-VP1:1:1，经过超声5min后加入10mg偶氮二异丁腈AIBN和0.4mmol 乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA混匀后得到溶液D，混匀过程不产生气泡为佳；
然后将溶液D在惰性气体保护下缓慢加入到溶液C中，溶液D转移完毕后停止通 氮气，将两口瓶密封反应6h后得到实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP 沉淀；
最后对实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀进行洗涤，并将其 蚀刻成空心荧光分子印迹聚合物FITC-APTES@MIP，通过10000rpm/min，10min离心 分离聚合物沉淀，将聚合物沉淀用30mL 50％乙醇混匀并超声10min，待聚合物完成均 匀分散后，再将聚合物置于90℃水浴10min后，再次进行离心收集沉淀；用30mL无 水乙醇混匀并超声10min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，用30mL去 离子水混匀并超声10min、待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀；然后，将聚 合物沉淀用30mL甲醇：乙酸9:1溶液混匀，并超声60min以除去模版分子后，进行离 心收集沉淀，重复一次后用30mL无水乙醇混匀并超声10min待聚合物完成均匀分散 后，进行离心收集沉淀，将聚合物沉淀混匀在30mL的10％氢氟酸乙醇溶液中，超声10min后静置15min，然后经过乙醇和去离子水的洗涤并真空干燥8h，得到空心的荧 光分子印迹聚合物。
实施例2
包括下列步骤：
步骤一：制备二氧化硅纳米粒子SiO2
首先，配置乙醇-去离子水混合液，向其中加入氨水，经过超声处理10min得到混合液A；将混合液A置于常温下磁力搅拌，在惰性气体保护下，通过滴定管缓慢加入正 硅酸乙酯TEOS进行反应，等到溶液由原来的澄清透明变成奶白色后(约20min内出 现明显变化)，继续反应6h后，通过离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥 8h后得到二氧化硅纳米粒子；氨水：乙醇：水：正硅酸乙酯为2:25:25:2，磁力搅拌600 rpm，离心速度为10500rpm/min，7.5min，
步骤二：制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
首先，将0.026mmol异硫氰酸荧光素FITC与0.858mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅 烷APTES混合，在经过10min超声除气的0.5mL无水乙醇溶液中，将混合物液在惰 性气体保护下超声处理20min后，再常温300rpm/min振摇反应6h得到混合液B；将 200mg二氧化硅纳米粒子SiO2通过超声分散在13.5mL氨水-乙醇-去离子水1:6:20混 合液中，再在惰性气体保护下，常温状态进行600rpm/min的磁力搅拌，然后将混合液 B缓慢加入，反应6h后，通过10500rpm/min，7.5min离心收集、乙醇-水溶液反复洗 涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的 聚合物；
步骤三：制备荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP
首先制备水相，将聚乙二醇10000PEG-10000溶解在60mL热水中得到溶液C，将 溶液C移入100mL棕色两口烧瓶，70℃油浴磁力搅拌，搅拌速度为300rpm/min；
之后制备有机相，将10mg二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES 的聚合物溶解在3mL氯仿中，超声分散5-10min，待聚合物均匀分散后，加入0.1mmol 模版分子以及0.6mmol功能单体，功能单体包括α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、 4-乙烯基吡啶4-VP，4:1:1，经过超声5min后加入10mg偶氮二异丁腈AIBN和0.4mmol 乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA混匀后得到溶液D(混匀过程不产生气泡为佳)；
然后将溶液D在惰性气体保护下缓慢加入到溶液C中，溶液D转移完毕后停止通 氮气，将两口瓶密封反应6h后得到实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP 沉淀；
最后对实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀进行洗涤，并将其 蚀刻成空心荧光分子印迹聚合物FITC-APTES@MIP，通过10500rpm/min，7.5min离 心分离聚合物沉淀，将聚合物沉淀用30mL 50％乙醇混匀并超声15min，待聚合物完成 均匀分散后，再将聚合物置于90℃水浴10min后，再次进行离心收集沉淀；用30mL无 水乙醇混匀并超声10-20min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，用30mL去 离子水混匀并超声15min、待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀；然后，将聚 合物沉淀用30mL甲醇：乙酸9:1溶液混匀，并超声60min以除去模版分子后，进行离 心收集沉淀，重复一次后用用30mL无水乙醇混匀并超声15min待聚合物完成均匀分 散后，进行离心收集沉淀，将聚合物沉淀混匀在30mL的10％氢氟酸乙醇溶液中，超 声10min后静置15min，然后经过乙醇和去离子水的洗涤并真空干燥8h，得到空心的 荧光分子印迹聚合物。
实施例3
包括下列步骤：
步骤一：制备二氧化硅纳米粒子SiO2
首先，配置乙醇-去离子水混合液，向其中加入氨水，经过超声处理10min得到混合液A；将混合液A置于常温下磁力搅拌，在惰性气体保护下，通过滴定管缓慢加入正 硅酸乙酯TEOS进行反应，等到溶液由原来的澄清透明变成奶白色后(约20min内出 现明显变化)，继续反应6h后，通过离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥 8h后得到二氧化硅纳米粒子；氨水：乙醇：水：正硅酸乙酯为2:25:25:2，磁力搅拌600 rpm，离心速度为11000rpm/min，5min；
步骤二：制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
首先，将0.026mmol异硫氰酸荧光素FITC与0.858mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅 烷APTES混合，在经过10min超声除气的0.5mL无水乙醇溶液中，将混合物液在惰 性气体保护下超声处理20min后，再常温300rpm/min振摇反应6h得到混合液B；将 200mg二氧化硅纳米粒子SiO2通过超声分散在13.5mL氨水-乙醇-去离子水1:6:20混 合液中，再在惰性气体保护下，常温状态进行600rpm/min的磁力搅拌，然后将混合液 B缓慢加入，反应6h后，通过11000rpm/min，5min离心收集、乙醇-水溶液反复洗 涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的 聚合物；
步骤三：制备荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP
首先制备水相，将聚乙二醇10000PEG-10000溶解在60mL热水中得到溶液C，将 溶液C移入100mL棕色两口烧瓶，70℃油浴磁力搅拌，搅拌速度为1200rpm/min；
之后制备有机相，将10mg二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES 的聚合物溶解在3mL氯仿中，超声分散5-10min，待聚合物均匀分散后，加入0.1mmol 模版分子以及0.6mmol功能单体，功能单体包括α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、 4-乙烯基吡啶4-VP，1:2:2，经过超声5min后加入10mg偶氮二异丁腈AIBN和0.4 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA混匀后得到溶液D(混匀过程不产生气泡为佳)；
然后将溶液D在惰性气体保护下缓慢加入到溶液C中，溶液D转移完毕后停止通 氮气，将两口瓶密封反应6h后得到实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP 沉淀；
最后对实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀进行洗涤，并将其 蚀刻成空心荧光分子印迹聚合物FITC-APTES@MIP，通过11000rpm/min，5min离心 分离聚合物沉淀，将聚合物沉淀用30mL 50％乙醇混匀并超声20min，待聚合物完成均 匀分散后，再将聚合物置于90℃水浴10min后，再次进行离心收集沉淀；用30mL无 水乙醇混匀并超声20min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，用30mL去 离子水混匀并超声20min、待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀；然后，将聚 合物沉淀用30mL甲醇：乙酸9:1溶液混匀，并超声60min以除去模版分子后，进行离 心收集沉淀，重复一次后用用30mL无水乙醇混匀并超声20min待聚合物完成均匀分 散后，进行离心收集沉淀，将聚合物沉淀混匀在30mL的10％氢氟酸乙醇溶液中，超 声10min后静置15min，然后经过乙醇和去离子水的洗涤并真空干燥8h，得到空心的 荧光分子印迹聚合物。
上述实施例在步骤三中，根据目标分析物的不同加入不同的模版分子，不同的模版 分子，功能单体的加入比例不同，并且聚合物的收集过程中离心速度以使聚合物沉淀但不结块为佳。
所述模版分子包括：农药，如有机氯农药、有机磷及氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药；有害化学物质，如黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OT)、三聚氰胺等；兽 药物质，如盐酸克仑特罗(Clenbuterol Hydrochloride)、沙丁胺醇(Salbutamol)、莱克 多巴胺(Ractopamine)等；性激素，如β-受体激动剂，己烯雌酚(Diethylstibestrol)、 雌二醇(Estradiol)、戊酸雌二醇(EstradiolValerate)等；精神药品，如(盐酸)氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrochloride)、安定(地西泮)(Diazepam)、异戊巴比妥钠(Amobarbital Sodium)等；毒品，如可卡因(Cocaine)、四氢大麻酚(THC)、甲基苯丙胺(Methamphetamine)等。
下面通过具体实验例对本发明作进一步说明。
实验例1：以有机氯农药中腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物
按步骤一制备二氧化硅纳米粒子(SiO2)，按步骤二制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素(SiO2@FITC-APTES)的聚合物，按步骤三制备荧光分子印迹聚合物 (SiO2@FITC-APTES@MIP)，在步骤三中α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、4-乙烯 基吡啶4-VP的比例为1:1:1。当步骤三水相搅拌速度为300rpm/min时，产物为微米级 大颗粒，团聚成块，无法单分散，不适合作为检测器；当步骤三水相搅拌速度为1200 rpm/min时，产物粒径在100nm以下，无法通过离心收集，产率为0，当步骤三水相搅 拌速度为600rpm/min时，产物能够单分散，粒径在600±50nm且较为均一，产率87％。 当产物未进行蚀刻时，实心荧光分子印迹聚合物吸附腐霉利，荧光淬灭率达到50％，需 要40-50min，当产物进行蚀刻，空心荧光分子印迹聚合物，荧光淬灭率达到50％，需 要15-20min。
以腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物的表征如图1所示，由图1可知以腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物制备过程各部分产物合成成功。
以腐霉利(PCD)、六六六(BHC)、马拉硫磷(MLT)五氯硝基苯(PCNB)、克百 威(CBD)五种农药作为干扰物，结构式如下：
均制备成浓度为800nM的农药水溶液，然后配置成含有0.066mg/mL荧光分子印 迹聚合物的检测液进行荧光分子印迹聚合物的特异性表征，见图2、图3；
由图2可知以腐霉利为模版分子制备荧光分子印迹聚合物对腐霉利及其他干扰物质 的淬灭效率有显著差异，因此，荧光分子印迹聚合物对腐霉利具有较好的特异性吸附能力。从图3可以看出在农药混合的情况下，荧光分子印迹聚合物对腐霉利亦是具有较好 的特异性吸附能力。因此，荧光分子印迹聚合物对腐霉利具有较好的特异性吸附能力。
参见图4，荧光分子印迹聚合物动态吸附能力表征：
荧光分子印迹聚合物吸附腐霉利后会发生荧光淬灭，随着吸附得到饱和，荧光淬灭 率不在变化。由图4可知荧光分子印迹聚合物能够在30min内达到平衡状态，并在 15-20min达到50％的淬灭率，具有较快的检测速度。
实验例2：以有毒物质中黄曲霉毒素为模版分子制备荧光分子印迹聚合物，黄曲霉毒素结构式如下：
按步骤一制备二氧化硅纳米粒子(SiO2)，按步骤二制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素(SiO2@FITC-APTES)的聚合物，按步骤三制备荧光分子印迹聚合物 (SiO2@FITC-APTES@MIP)，在步骤三中α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、4-乙烯 基吡啶4-VP的比例为4:1:1。产率90％。配置含有800nM黄曲霉毒素与0.07mg/mL荧 光分子印迹聚合物的检测液，20min内荧光淬灭率达到40％。
实验例3：以兽药物质中盐酸克仑特罗为模版分子制备荧光分子印迹聚合物，盐酸克仑特罗结构式如下：
按步骤一制备二氧化硅纳米粒子(SiO2)，按步骤二制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素(SiO2@FITC-APTES)的聚合物，按步骤三制备荧光分子印迹聚合物 (SiO2@FITC-APTES@MIP)，在步骤三中α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、4-乙烯 基吡啶4-VP的比例为1:2:1。产率88％。配置含有800nM盐酸克仑特罗与0.07mg/mL 荧光分子印迹聚合物的检测液，20min内荧光淬灭率达到45％。
实验例4：以性激素中己烯雌酚为模版分子制备荧光分子印迹聚合物，己烯雌酚化学结构式如下：
按步骤一制备二氧化硅纳米粒子(SiO2)，按步骤二制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素(SiO2@FITC-APTES)的聚合物，按步骤三制备荧光分子印迹聚合物 (SiO2@FITC-APTES@MIP)，在步骤三中α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、4-乙烯 基吡啶4-VP的比例为1:2:2。产率83％。配置含有800nM己烯雌酚与0.07mg/mL荧光 分子印迹聚合物的检测液，20min内荧光淬灭率达到50％。
实验例5：以精神药品中(盐酸)氯丙嗪(结构如下)为模版分子制备荧光分子印 迹聚合物，(盐酸)氯丙嗪化学结构式如下：
按步骤一制备二氧化硅纳米粒子(SiO2)，按步骤二制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素(SiO2@FITC-APTES)的聚合物，按步骤三制备荧光分子印迹聚合物 (SiO2@FITC-APTES@MIP)，在步骤三中α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、4-乙烯 基吡啶4-VP的比例为2:2:1。产率86％。配置含有800nM(盐酸)氯丙嗪与0.07mg/mL 荧光分子印迹聚合物的检测液，20min内荧光淬灭率达到40％。

Claims (10)

1.一种荧光分子印迹聚合物空心微球，其特征在于，是由下列步骤得到的：
步骤一：制备二氧化硅纳米粒子SiO2
首先，配置乙醇-去离子水混合液，向其中加入氨水，经过超声处理10min得到混合液A；将混合液A置于常温下磁力搅拌，在惰性气体保护下，通过滴定管缓慢加入正硅酸乙酯TEOS进行反应，等到溶液由原来的澄清透明变成奶白色后，继续反应6h后，通过离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅纳米粒子；在本步骤中，氨水：乙醇：水：正硅酸乙酯为2:25:25:2，磁力搅拌600rpm，离心速度为10000-11000rpm/min，时间为5-10min；
步骤二：制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
首先，将0.026mmol异硫氰酸荧光素FITC与0.858mmol3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES混合，在经过10min超声除气的0.5mL无水乙醇溶液中，将混合物液在惰性气体保护下超声处理20min后，再常温300rpm/min振摇反应6h得到混合液B；将200mg二氧化硅纳米粒子SiO2通过超声分散在13.5mL氨水-乙醇-去离子水1:6:20混合液中，再在惰性气体保护下，常温状态进行600rpm/min的磁力搅拌，然后将混合液B缓慢加入，反应6h后，通过离心速度为10000-11000rpm/min，时间为5-10min离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
步骤三：制备荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP
首先制备水相，将聚乙二醇10000 PEG-10000溶解在60mL热水中得到溶液C，将溶液C移入100mL棕色两口烧瓶，70℃油浴磁力搅拌，搅拌速度为300-1200rpm/min；
之后制备有机相，将10mg二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物溶解在3mL氯仿中，超声分散5-10min，待聚合物均匀分散后，加入0.1mmol模版分子以及0.6mmol功能单体，功能单体采用α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、4-乙烯基吡啶4-VP(4:1:1)-(1:2:2)，经过超声5min后加入10mg偶氮二异丁腈AIBN和0.4mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA混匀后得到溶液D；
然后将溶液D在惰性气体保护下缓慢加入到溶液C中，溶液D转移完毕后停止通氮气，将两口瓶密封反应6h后得到实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀；
最后对实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀进行洗涤，并将其蚀刻成空心荧光分子印迹聚合物FITC-APTES@MIP，通过10000-11000rpm/min，5-10min离心分离聚合物沉淀，将聚合物沉淀用30mL50％乙醇混匀并超声10-20min，待聚合物完成均匀分散后，再将聚合物置于90℃水浴10min后，再次进行离心收集沉淀；用30mL无水乙醇混匀并超声10-20min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，用30mL去离子水混匀并超声10-20min、待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀；然后，将聚合物沉淀用30mL甲醇：乙酸9:1溶液混匀，并超声60min以除去模版分子后，进行离心收集沉淀，重复一次后用30mL无水乙醇混匀并超声10-20min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，将聚合物沉淀混匀在30mL的10％氢氟酸乙醇溶液中，超声10min后静置15min，然后经过乙醇和去离子水的洗涤并真空干燥8h，得到空心的荧光分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述一种荧光分子印迹聚合物空心微球，其特征在于，步骤一中，离心速度为10000rpm/min，时间为10min。
3.根据权利要求1所述一种荧光分子印迹聚合物空心微球，其特征在于，步骤二中，离心速度为10000rpm/min，时间为10min。
4.根据权利要求1所述一种荧光分子印迹聚合物空心微球，其特征在于，步骤三中，搅拌速度为600rpm/min。
5.根据权利要求1所述一种荧光分子印迹聚合物空心微球，其特征在于，步骤三中，所述模版分子包括：农药，有害化学物质，兽药物质，性激素，精神药品和毒品。
6.根据权利要求5所述一种荧光分子印迹聚合物空心微球，其特征在于，所述模版分子中：
农药包括：有机氯农药、有机磷及氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药；
有害化学物质包括：黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OT)、三聚氰胺；
兽药包括：盐酸克仑特罗(Clenbuterol Hydrochloride)、沙丁胺醇(Salbutamol)、莱克多巴胺(Ractopamine)；
性激素包括：β-受体激动剂，己烯雌酚(Diethylstibestrol)、雌二醇(Estradiol)、戊酸雌二醇(EstradiolValerate)；
精神药品包括：(盐酸)氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrochloride)、安定(地西泮)(Diazepam)、异戊巴比妥钠(Amobarbital Sodium)；
毒品包括：可卡因(Cocaine)、四氢大麻酚(THC)、甲基苯丙胺(Methamphetamine)。
7.一种荧光分子印迹聚合物空心微球的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤一：制备二氧化硅纳米粒子SiO2
首先，配置乙醇-去离子水混合液，向其中加入氨水，经过超声处理10min得到混合液A；将混合液A置于常温下磁力搅拌，在惰性气体保护下，通过滴定管缓慢加入正硅酸乙酯TEOS进行反应，等到溶液由原来的澄清透明变成奶白色后，继续反应6h后，通过离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅纳米粒子；在本步骤中，氨水：乙醇：水：正硅酸乙酯为2:25:25:2，磁力搅拌600rpm，离心速度为10000-11000rpm/min，时间为5-10min；
步骤二：制备二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
首先，将0.026mmol异硫氰酸荧光素FITC与0.858mmol3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES混合，在经过10min超声除气的0.5mL无水乙醇溶液中，将混合物液在惰性气体保护下超声处理20min后，再常温300rpm/min振摇反应6h得到混合液B；将200mg二氧化硅纳米粒子SiO2通过超声分散在13.5mL氨水-乙醇-去离子水1:6:20混合液中，再在惰性气体保护下，常温状态进行600rpm/min的磁力搅拌，然后将混合液B缓慢加入，反应6h后，通过离心速度为10000-11000rpm/min，时间为5-10min离心收集、乙醇-水溶液反复洗涤与真空冷冻干燥8h后得到二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物；
步骤三：制备荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP
首先制备水相，将聚乙二醇10000 PEG-10000溶解在60mL热水中得到溶液C，将溶液C移入100mL棕色两口烧瓶，70℃油浴磁力搅拌，搅拌速度为300-1200rpm/min；
之后制备有机相，将10mg二氧化硅表面接枝异硫氰酸荧光素SiO2@FITC-APTES的聚合物溶解在3mL氯仿中，超声分散5-10min，待聚合物均匀分散后，加入0.1mmol模版分子以及0.6mmol功能单体，功能单体采用α-甲基丙烯酸MAA、丙烯酰胺AM、4-乙烯基吡啶4-VP(4:1:1)-(1:2:2)，经过超声5min后加入10mg偶氮二异丁腈AIBN和0.4mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA混匀后得到溶液D；
然后将溶液D在惰性气体保护下缓慢加入到溶液C中，溶液D转移完毕后停止通氮气，将两口瓶密封反应6h后得到实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀；
最后对实心荧光分子印迹聚合物SiO2@FITC-APTES@MIP沉淀进行洗涤，并将其蚀刻成空心荧光分子印迹聚合物FITC-APTES@MIP，通过10000-11000rpm/min，5-10min离心分离聚合物沉淀，将聚合物沉淀用30mL50％乙醇混匀并超声10-20min，待聚合物完成均匀分散后，再将聚合物置于90℃水浴10min后，再次进行离心收集沉淀；用30mL无水乙醇混匀并超声10-20min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，用30mL去离子水混匀并超声10-20min、待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀；然后，将聚合物沉淀用30mL甲醇：乙酸9:1溶液混匀，并超声60min以除去模版分子后，进行离心收集沉淀，重复一次后用30mL无水乙醇混匀并超声10-20min待聚合物完成均匀分散后，进行离心收集沉淀，将聚合物沉淀混匀在30mL的10％氢氟酸乙醇溶液中，超声10min后静置15min，然后经过乙醇和去离子水的洗涤并真空干燥8h，得到空心的荧光分子印迹聚合物。
8.根据权利要求7所述一种荧光分子印迹聚合物空心微球的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，离心速度为10000rpm/min，时间为10min；
所述步骤二中，离心速度为10000rpm/min，时间为10min；
所述步骤三中，搅拌速度为600rpm/min；
所述步骤三中，所述模版分子包括：农药，有害化学物质，兽药物质，性激素，精神药品和毒品，其中：
农药包括：有机氯农药、有机磷及氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药；
有害化学物质包括：黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OT)、三聚氰胺；
兽药包括：盐酸克仑特罗(Clenbuterol Hydrochloride)、沙丁胺醇(Salbutamol)、莱克多巴胺(Ractopamine)；
性激素包括：β-受体激动剂，己烯雌酚(Diethylstibestrol)、雌二醇(Estradiol)、戊酸雌二醇(EstradiolValerate)；
精神药品包括：(盐酸)氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrochloride)、安定(地西泮)(Diazepam)、异戊巴比妥钠(Amobarbital Sodium)；
毒品包括：可卡因(Cocaine)、四氢大麻酚(THC)、甲基苯丙胺(Methamphetamine)。
9.一种荧光分子印迹聚合物空心微球在检测目标分析物中的应用。
10.如权利要求9所述的一种荧光分子印迹聚合物空心微球在检测目标分析物中的应用，其特征在于：所述目标分析物包括农药，有害化学物质，兽药物质，性激素，精神药品和毒品，其中：
农药包括：有机氯农药、有机磷及氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药；
有害化学物质包括：黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素(OT)、三聚氰胺；
兽药包括：盐酸克仑特罗(Clenbuterol Hydrochloride)、沙丁胺醇(Salbutamol)、莱克多巴胺(Ractopamine)；
性激素包括：β-受体激动剂，己烯雌酚(Diethylstibestrol)、雌二醇(Estradiol)、戊酸雌二醇(EstradiolValerate)；
精神药品包括：(盐酸)氯丙嗪(Chlorpromazine Hydrochloride)、安定(地西泮)(Diazepam)、异戊巴比妥钠(Amobarbital Sodium)；
毒品包括：可卡因(Cocaine)、四氢大麻酚(THC)、甲基苯丙胺(Methamphetamine)。
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