CN101914189A - 硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种生物检测技术领域的棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物制备方法与应用。包括以下步骤：首先硅胶表面预处理；通过硅胶表面硅烷化制备APTS-硅胶，引入氨基；通过脱水酯化法或酰氯中介法制备ACPA-硅胶，在硅胶表面接枝上偶氮引发剂；最后以棒曲霉素结构类似物2-羟基烟酸作模板替代分子，以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、三氟甲基丙烯酸为功能性单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂，在乙腈、吡啶溶剂中通过热引发途径获得硅胶表面分子印迹聚合物。本发明的优点在于，作为苹果汁及相关产品中痕量棒曲霉素液相色谱检测分析的前处理方法，本发明制备的基于硅胶表面分子印迹聚合物可以特异性吸附富集棒曲霉素，样品处理简单、快速、可以多次重复使用，而且此聚合物耐酸碱处理、常温保存；同时，避免了由传统液液萃取方法碱洗除杂和旋蒸去除有机溶剂步骤造成的回收率损失，降低了有机溶剂的使用量。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物检测技术领域的聚合物制备方法与应用，尤其是一种可作为苹果汁及相关产品中痕量棒曲霉素液相色谱检测分析的硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物制备方法与应用。
技术背景
棒曲霉素主要是由青霉属、曲霉属等真菌产生的有毒次级代谢物。近来，苹果汁中的棒曲霉素因其毒副作用，其检测技术成为国内外研究的热点。如根据检索发现中国专利申请号：CN03160299.1，名称：展青霉素免疫层析检测试纸的制作方法与应用，该技术称：快速检测方法。该发明的检测试纸，包括衬垫，样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫，检测线，质控线；在衬垫上按顺序有样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫；示踪粒子结合物垫上有示踪粒子标记的抗展青霉素的抗体，硝酸纤维素膜上还设有检测线和质控线，检测线上有展青霉素检测抗原，质控线上有抗抗体，其中抗抗体是抗展青霉素的抗体的抗体。其优点是有放射免疫分析和酶联免疫吸附试验ELISA的优点；同时，该发明有简单、快速、常温保存、单份测定、一次试验测出展青霉素、除商品试剂外不需任何仪器设备的优点，特别适合展青霉素的现场快速检测。
与其他真菌毒素不同，现在还没有商品化的棒曲霉素ELISA试剂盒，关键问题是作为小分子的棒曲霉素很难制作特异性理想的抗体，尽管在研究上有所尝试，但都处于实验室阶段。目前，棒曲霉素检测的常见方法包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。其中，HPLC结合紫外或荧光检测器分析检测棒曲霉素已经逐渐成为常规的方法。然而，传统的HPLC方法的样品处理方法以及产品中因加热等因素所产生的共存的干扰物5-羟甲基糠醛严重影响了棒曲霉素检测的速度和准确性。所以开发快捷、方便并具有较高特异性的样品处理方法结合常规的HPLC仪器检测分析果汁样品中棒曲霉素已经非常必要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物的制备方法，作为苹果汁及相关产品中痕量棒曲霉素液相色谱检测分析的前处理聚合物或基质材料，不仅特异性富集样品中痕量待检成分，而且还避免了由传统液-液萃取方法碱洗除杂和旋蒸去除有机溶剂步骤造成的回收率损失，降低了有机溶剂的使用量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及的硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物制备方法，包括以下步骤：
①首先，硅胶表面预处理；
②通过硅胶表面硅烷化制备3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)-硅胶，引入氨基；
③通过两种方法在硅胶表面接枝上偶氮引发剂，制备ACPA[4，4’-Azobis(4-cyanopentanoic acid)，4，4’-偶氮-(4-氰戊酸)]-硅胶；
④以棒曲霉素结构类似物2-羟基烟酸作模板替代分子，以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、三氟甲基丙烯酸为功能性单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂，在乙腈、吡啶溶剂中通过热引发途径获得硅胶表面分子印迹聚合物；
步骤①中所述的预处理，其方法为：取微孔硅胶20g，用10％盐酸回流洗涤6h或50％硝酸浸泡24h，以除去硅胶中的少量无机杂质并增加硅胶表面羟基数目。去离子水洗至中性后，用丙酮洗涤去除硅胶中的有机物质。110℃烘干后于充满氮气的干燥器中保存。
步骤②中所述的APTS-硅胶，其制备方法为：
取2g活化硅胶分散于25ml甲苯中，加入1mlAPTS，氮气保护下105℃下搅拌回流反应6h；反应结束后过滤，依次用甲苯、乙醚洗涤，室温下真空干燥至恒重。
接枝后APTS-硅胶的N、C、H元素分析，即三个元素含量的增加，可以帮助判断接枝是否成功。正常硅胶原料或活化硅胶中不含有N、C元素。
步骤③中所述的ACPA-硅胶，其制备方法为：
采用两种途径制备ACPA-硅胶：
A：酰氯中介法：
首先，ACPC[4，4’-Azobis(4-cyanopentanoic acid)chlorides，4，4’-偶氮-(4-氰戊酸)酰氯]的制备，其制备方法为：
向盛有25ml二氯甲烷的100ml三颈瓶中加入10ml SOCl2，连接好尾气处理装置后置冰浴中搅拌回流。另取ACPA 3g，加入到15ml二氯甲烷中形成悬浊液，通过恒压漏斗分批滴加到三颈瓶中。滴加完毕后让冰浴自然升温至室温，搅拌回流反应24小时。反应结束后，过滤去除白色未反应ACPA，将滤液旋蒸浓缩至10ml，加入20ml干燥正己烷，4℃条件下静置12h结晶出白色针状物。结晶用5ml干燥正己烷洗涤两次，得到ACPA相应的酰氯化物ACPC，室温真空干燥后密封避光保存。
以ACPC制备ACPA-硅胶，其制备方法为：
向盛有0.12ml三乙胺(缚酸剂)的25ml二氯甲烷溶液的100ml三颈瓶中加入APTS-硅胶2g，再通过恒压漏斗逐滴加入0.25gACPC的二氯甲烷15ml溶液，氮气保护下室温搅拌回流反应12h。待反应结束后过滤，将滤渣依次用二氯甲烷，50％乙醇，乙醇，乙醚洗涤，室温下真空干燥得ACPA-硅胶。
B：DCC脱水酯化法：向盛有20ml二甲基甲酰胺(DMF)的100ml三颈瓶中加入1g APTS-硅胶、0.2663g ACPA和0.0232g DMAP(催化剂)，氮气保护下冰浴下搅拌回流至体系冷却，再加入0.2156g DCC作脱水剂，待体系缓慢升至室温后反应4h。反应结束后过滤，将滤渣依次用DMF，石油醚洗涤，洗至石油醚洗液加入乙醇不再产生沉淀。室温真空干燥，密封避光保存备用。
活化硅胶、APTS-硅胶、ACPA-硅胶傅立叶红外光谱(漫反射)可以分析鉴别接枝效果。APTS-硅胶红外光谱3368cm-1、3288cm-1处吸收峰为APTS-硅胶氨基基团N-H反对称、对称伸缩振动吸收峰，2930cm-1处吸收峰为CH2反对称伸缩振动吸收峰，1480cm-1处吸收峰为CH2反对称变形振动吸收峰，这些都说明硅胶表面硅烷化成功。ACPA-硅胶光谱中，2242cm-1处吸收峰代表N＝N伸缩振动，1654cm-1处吸收峰代表羰基伸缩振动，也可以说明硅胶表面偶氮引发剂ACPA的引入成功。
同样，ACPA与ACPC傅立叶红外光谱(KBr压片)可以分析鉴别接枝效果。ACPA光谱中2722cm-1、2658cm-1处吸收峰说明ACPA作为一种羧酸以羧酸纯品常见的二聚物形态存在，而ACPC中并不存在二聚物。对比二者光谱，ACPC中1716cm-1处吸收峰吸收强度明显减小，而1796cm-1处吸收峰出现并且是强峰，可说明ACPA一部分羧基转化成酰氯而形成ACPC。
步骤④中所述的通过热引发途径，其步骤为：
a、取35ml乙腈或20ml的吡啶/DMF/DMSO，0.065g 2-羟基烟酸，4.0mmol单体AM(或MAA/TFMAA/4-VP)、3.54ml EDMA和0.5gACPA-硅胶于100ml三颈瓶中，于瓶口塞一团棉花，70℃下搅拌反应24h；
b、过滤将所得滤渣用氯仿-甲醇(4∶1，V/V)洗涤至洗涤残液遇乙醇无沉淀现象；
c、再将滤渣用10％乙醇回流提取6h，去除模板分子2-羟基烟酸，最后用乙醇、乙醚洗涤，室温真空干燥得到棒曲霉素分子印迹聚合物(MIPs)。
本发明涉及如上所述的制备方法制备的硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物的应用：
本发明制备所述的聚合物在饮料中检测棒曲霉素的应用。可以特异性吸附富集棒曲霉素，样品处理简单、快速、可以多次重复使用，而且此聚合物耐酸碱处理、常温保存；同时，避免了由传统液液萃取方法碱洗除杂和旋蒸去除有机溶剂步骤造成的回收率损失，降低了有机溶剂的使用量。
所述的苹果汁前处理方法为：取1ml固相萃取空管，采用干法装柱，制成棒曲霉素分子印迹聚合物固相萃取柱，装填高度1.2cm，印迹聚合物含量0.12g。将固相萃取柱固定于自制支架上，在萃取柱末端用BUCHI V-500真空泵控制压力在恒定范围内，使液体流量在2-3ml/min。首先依次用2ml乙酸乙酯、吡啶洗涤活化印迹聚合物，用2ml正己烷除去残留吡啶。将正己烷抽干后继续抽空气10-15min时间，待萃取柱干燥后上样约1ml。待样液液面接近印迹聚合物表面时，立即用2ml正己烷洗涤柱子，再次抽干后用0.05mol/l的醋酸钠溶液(pH4.0)将吸附在印迹材料上的棒曲霉素洗脱下来，微孔滤头过滤后HPLC进样。
本发明主要用于棒曲霉素检测，分子印迹聚合物的使用单位主要为果汁饮料生产加工单位以及相关的食品加工生产企业、食品卫生检验部门、产品质量监督部门等。本发明在硅胶表面接枝并分子印迹聚合物作为HPLC定量分析检测果汁原料中可能产生的棒曲霉素的前处理材料基质。本发明为首先对硅胶表面预处理活化，然后在火化后的硅胶表面硅烷化接上氨基，接下来在硅烷化的硅胶表面采用两种途径(酰氯中介法或脱水酯化法)通过偶氮引发剂ACPA的引入制备ACPA-硅胶，最后以棒曲霉素结构类似物2-羟基烟酸作虚拟模板分子，以甲基丙烯酸(MAA)、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺为模板分子，以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，通过热引发途径在硅胶表面聚合反应制备硅胶表面分子印迹聚合物。该聚合物可以高度特异选择性吸附样品中待分析检测的棒曲霉素，经洗脱液洗脱后棒曲霉素得到富集，从而供进一步HPLC定量分析检测，避免了由传统液-液萃取方法碱洗除杂和旋蒸去除有机溶剂步骤造成的回收率损失，降低了有机溶剂的使用量。
附图说明
图13-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)-硅胶制备；
图24，4’-偶氮-(4-氰戊酸)(ACPC)制备；
图3ACPA-硅胶制备(酰氯中介法)；
图4ACPA-硅胶制备(DCC脱水酯化法)；
图5三种处理方法处理样品后HPLC分子检测棒曲霉素色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一
(1)硅胶表面活化
取微孔硅胶20g，用10％盐酸回流洗涤6h，离子水洗至中性后，用丙酮洗涤去除硅胶中的有机物质，10℃烘干后于充满氮气的干燥器中保存。
(2)APTS-硅胶制备，其制备方法的反应方程式如图1所示：
取2g活化硅胶分散于25ml甲苯中，加入1mlAPTS，氮气保护下105℃下搅拌回流反应6h；反应结束后过滤，依次用甲苯、乙醚洗涤，室温下真空干燥至恒重。
(3)ACPC制备
向盛有25ml二氯甲烷的100ml三颈瓶中加入10ml SOCl2，连接好尾气处理装置后置冰浴中搅拌回流。另取ACPA 3g，加入到15ml二氯甲烷中形成悬浊液，通过恒压漏斗分批滴加到三颈瓶中。滴加完毕后让冰浴自然升温至室温，搅拌回流反应24小时，反应方程式如图2所示。反应结束后，过滤去除白色未反应ACPA，将滤液旋蒸浓缩至10ml，加入20ml干燥正己烷，4℃条件下静置12h结晶出白色针状物。结晶用5ml干燥正己烷洗涤两次，得到ACPA相应的酰氯化物ACPC，室温真空干燥后密封避光保存。
(4)ACPA-硅胶制备
向盛有0.12ml三乙胺(缚酸剂)的25ml二氯甲烷溶液的100ml三颈瓶中加入APTS-硅胶2g，再通过恒压漏斗逐滴加入0.25gACPC的二氯甲烷15ml溶液，氮气保护下室温搅拌回流反应12h。待反应结束后过滤，将滤渣依次用二氯甲烷，50％乙醇，乙醇，乙醚洗涤，室温下真空干燥得ACPA-硅胶。反应方程式如图3所示。
(5)棒曲霉素分子印迹聚合物制备
取35ml乙腈的吡啶，0.065g 2-羟基烟酸，4.0mmol单体丙烯酰胺(AM)、3.54ml二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)和0.5gACPA-硅胶于100ml三颈瓶中，于瓶口塞一团棉花，70℃下搅拌反应24h；过滤将所得滤渣用氯仿-甲醇(4∶1，V/V)洗涤至洗涤残液遇乙醇无沉淀现象；再将滤渣用10％乙醇回流提取6h，去除模板分子2-羟基烟酸，最后用乙醇、乙醚洗涤，室温真空干燥得到棒曲霉素分子印迹聚合物(MIPs)。
所述的聚合物在苹果汁饮料样品中检测棒曲霉素的应用。
取1ml固相萃取空管，采用干法装柱，制成棒曲霉素分子印迹聚合物固相萃取柱，装填高度1.2cm，印迹聚合物含量0.12g。将固相萃取柱固定于自制支架上，在萃取柱末端用BUCHI V-500真空泵控制压力在恒定范围内，使液体流量在2-3ml/min。首先依次用2ml乙酸乙酯、吡啶洗涤活化印迹聚合物，用2ml正己烷除去残留吡啶。将正己烷抽干后继续抽空气10-15min时间，待萃取柱干燥后上样约1ml。待样液液面接近印迹聚合物表面时，立即用2ml正己烷洗涤柱子，再次抽干后用0.05mol/l的醋酸钠溶液(pH4.0)将吸附在印迹材料上的棒曲霉素洗脱下来，微孔滤头过滤后HPLC进样。
将棒曲霉素特异性吸附材料应用于自制苹果汁的固相萃取前处理。取苹果200g，加入400ml水，打浆，细纱布过滤，调节苹果汁pH至2.95，离心去除沉淀物质。以浓度均为10mg/L棒曲霉素和5-羟甲基糠醛添加强化后用0.22μm滤膜过滤，通过固相萃取柱，液相色谱分析固相萃取柱所得进样残液、醋酸盐缓冲液第一次洗涤液和醋酸盐缓冲液第二次洗涤液，棒曲霉素回收率达到95.65％。
实施例二
(1)硅胶表面活化
硅胶表面预处理其方法为：取微孔硅胶20g，用50％硝酸浸泡24h，去离子水洗至中性后，用丙酮洗涤去除硅胶中的有机物质，10℃烘干后于充满氮气的干燥器中保存。
(2)APTS-硅胶制备
制备方法同实施例一。
(3)ACPA-硅胶制备
向盛有20ml二甲基甲酰胺(DMF)的100ml三颈瓶中加入1g APTS-硅胶、0.2663g ACPA和0.0232g DMAP(催化剂)，氮气保护下冰浴下搅拌回流至体系冷却，再加入0.2156g DCC作脱水剂，待体系缓慢升至室温后反应4h，反应方程式如图4所示。反应结束后过滤，将滤渣依次用DMF，石油醚洗涤，洗至石油醚洗液加入乙醇不再产生沉淀。室温真空干燥，密封避光保存备用。
(4)棒曲霉素分子印迹聚合物制备
取20ml的DMF，0.065g 2-羟基烟酸，4.0mmol单体甲基丙烯酸(MAA)、3.54ml EDMA和0.5gACPA-硅胶于100ml三颈瓶中，于瓶口塞一团棉花，70℃下搅拌反应24h；过滤将所得滤渣用氯仿-甲醇(4∶1，V/V)洗涤至洗涤残液遇乙醇无沉淀现象；再将滤渣用10％乙醇回流提取6h，去除模板分子2-羟基烟酸，最后用乙醇、乙醚洗涤，室温真空干燥得到棒曲霉素分子印迹聚合物(MIPs)。
所述的聚合物在苹果汁饮料中检测棒曲霉素的应用。
取1ml固相萃取空管，采用干法装柱，制成棒曲霉素分子印迹聚合物固相萃取柱，装填高度1.4cm，印迹聚合物含量0.13g。将固相萃取柱固定于自制支架上，在萃取柱末端用BUCHI V-500真空泵控制压力在恒定范围内，使液体流量在2-3ml/min。首先依次用2ml乙酸乙酯、吡啶洗涤活化印迹聚合物，用2ml正己烷除去残留吡啶。将正己烷抽干后继续抽空气10-15min时间，待萃取柱干燥后上样约1ml。待样液液面接近印迹聚合物表面时，立即用2ml正己烷洗涤柱子，再次抽干后用0.05mol/l的醋酸钠溶液(pH4.0)将吸附在印迹材料上的棒曲霉素洗脱下来，微孔滤头过滤后HPLC进样。
将棒曲霉素特异性吸附材料应用于从欧尚超市购买的浓缩苹果汁的固相萃取前处理。苹果汁以浓度均为10mg/L棒曲霉素和5-羟甲基糠醛添加强化后，调节pH至2.95，再用0.22μm滤膜过滤，通过固相萃取柱，液相色谱分析固相萃取柱所得进样残液、醋酸盐缓冲液第一次洗涤液和醋酸盐缓冲液第二次洗涤液，棒曲霉素回收率达到94.59％。
实施例三
(1)硅胶表面活化，制备方法同实施例二。
(2)APTS-硅胶制备，制备方法同实施例一。
(3)ACPA-硅胶制备，制备方法同实例二。
(4)棒曲霉素分子印迹聚合物制备
取20ml的DMSO，0.065g 2-羟基烟酸，4.0mmol单体三氟甲基丙烯酸(TFMAA)、3.54ml EDMA和0.5gACPA-硅胶于100ml三颈瓶中，于瓶口塞一团棉花，70℃下搅拌反应24h；过滤将所得滤渣用氯仿-甲醇(4∶1，V/V)洗涤至洗涤残液遇乙醇无沉淀现象；再将滤渣用10％乙醇回流提取6h，去除模板分子2-羟基烟酸，最后用乙醇、乙醚洗涤，室温真空干燥得到棒曲霉素分子印迹聚合物(MIPs)。
所述的聚合物在苹果汁中检测棒曲霉素的应用。
取1ml固相萃取空管，采用干法装柱，制成棒曲霉素分子印迹聚合物固相萃取柱，装填高度1.5cm，印迹聚合物含量0.15g。将固相萃取柱固定于自制支架上，在萃取柱末端用BUCHI V-500真空泵控制压力在恒定范围内，使液体流量在2-3ml/min。首先依次用2ml乙酸乙酯、吡啶洗涤活化印迹聚合物，用2ml正己烷除去残留吡啶。将正己烷抽干后继续抽空气10-15min时间，待萃取柱干燥后上样约1ml。待样液液面接近印迹聚合物表面时，立即用2ml正己烷洗涤柱子，再次抽干后用0.05mol/l的醋酸钠溶液(pH4.0)将吸附在印迹材料上的棒曲霉素洗脱下来，微孔滤头过滤后HPLC进样。
取红富士苹果500g，榨汁机榨汁后过滤备用。取50ml苹果汁于65℃下加热30min。取20ml经过0.45μm滤膜过滤。取9ml苹果汁，加入1ml标准样品(10mg/L棒曲霉素+10mg/L5-羟甲基糠醛)混匀，用冰醋酸调pH值至2.95，经固相萃取后，用pH4.0的醋酸盐缓冲液进行洗脱，收集残液和第一次、第二次洗脱液，经过0.22μm滤膜过滤，棒曲霉素回收率达到91.21％。
如图5所示，液-液萃取，ACCU BONDⅡ ODS-C18预处理柱固相萃取以及本发明制备的棒曲霉素分子印迹聚合物固相萃取处理样品后检测苹果之中棒曲霉素含量HPLC色谱图。三种方法对应的样品是，液-液萃取和分子印迹聚合物固相萃取处理味同一样品，而ACCU BONDⅡ ODS-C18预处理柱为该样品添加棒曲霉素后处理检测。ACCU BONDⅡ ODS-C18预处理柱为从市场购得的安捷伦科技有限公司生产的专供棒曲霉素等真菌毒素分析检测样品前处理商品预处理柱，其吸附非棒曲霉素为特异性。
上述实施例制备的聚合物可以高度特异选择性吸附样品中待分析检测的棒曲霉素，经洗脱液洗脱后棒曲霉素得到富集，从而供进一步HPLC定量分析检测，分子印迹聚合物的使用单位主要为果汁饮料生产加工单位以及相关的食品加工生产企业、食品卫生检验部门、产品质量监督部门等。
Claims (6)
1.一种棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①首先硅胶表面预处理；
②通过硅胶表面硅烷化制备APTS-硅胶，引入氨基；
③通过脱水酯化法制备ACPA-硅胶，在硅胶表面接枝上偶氮引发剂；
④最后以棒曲霉素结构类似物2-羟基烟酸作模板替代分子，以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、三氟甲基丙烯酸为功能性单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂，在乙腈、吡啶溶剂中通过热引发途径获得硅胶表面分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤①中所述的预处理，其方法为：取微孔硅胶20g，用10％盐酸回流洗涤6h或50％硝酸浸泡24h，以除去硅胶中无机杂质并增加硅胶表面羟基数目；去离子水洗至中性后，用丙酮洗涤去除硅胶中的有机物质，110℃烘干后于充满氮气的干燥器中保存。
3.根据权利要求1所述的棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤②中所述的APTS-硅胶制备方法为：
取2g活化硅胶分散于25ml甲苯中，加入1mlAPTS，氮气保护下105℃下搅拌回流反应6h；反应结束后过滤，依次用甲苯、乙醚洗涤，室温下真空干燥至恒重。
4.根据权利要求1所述的棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤③中所述的ACPA-硅胶制备方法为：向盛有20ml二甲基甲酰胺的100ml三颈瓶中加入1gAPTS-硅胶、0.2663g ACPA和0.0232g DMAP，氮气保护下冰浴下搅拌回流至体系冷却，再加入0.2156g DCC作脱水剂，待体系缓慢升至室温后反应4h；反应结束后过滤，将滤渣依次用DMF，石油醚洗涤，洗至石油醚洗液加入乙醇不再产生沉淀；室温真空干燥，密封避光保存备用；
或者通过酰氯中介法制备ACPA-硅胶，制作方法为：首先制备ACPC，向盛有25ml二氯甲烷的100ml三颈瓶中加入10ml SOCl2，连接好尾气处理装置后置冰浴中搅拌回流，另取ACPA 3g，加入到15ml二氯甲烷中形成悬浊液，通过恒压漏斗分批滴加到三颈瓶中，滴加完毕后让冰浴自然升温至室温，搅拌回流反应24小时，反应结束后，过滤去除白色未反应ACPA，将滤液旋蒸浓缩至10ml，加入20ml干燥正己烷，4℃条件下静置12h结晶出白色针状物，结晶用5ml干燥正己烷洗涤两次，得到ACPA相应的酰氯化物ACPC，室温真空干燥后密封避光保存；然后，再制备ACPA-硅胶，向盛有0.12ml三乙胺(缚酸剂)的25ml二氯甲烷溶液的100ml三颈瓶中加入APTS-硅胶2g，再通过恒压漏斗逐滴加入0.25gACPC的二氯甲烷15ml溶液，氮气保护下室温搅拌回流反应12h，待反应结束后过滤，将滤渣依次用二氯甲烷，50％乙醇，乙醇，乙醚洗涤，室温下真空干燥得ACPA-硅胶。
5.根据权利要求1所述的棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征是，步骤④中所述的通过热引发途径，其步骤为：
a、取35ml乙腈或20ml的吡啶/DMF/DMSO，0.065g 2-羟基烟酸，4.0mmol单体AM或MAA/TFMAA/4-VP、3.54ml EDMA和0.5gACPA-硅胶于100ml三颈瓶中，于瓶口塞一团棉花，70℃下搅拌反应24h；
b、过滤将所得滤渣用氯仿：甲醇体积比4∶1，洗涤至洗涤残液遇乙醇无沉淀现象；
c、再将滤渣用10％乙醇回流提取6h，去除模板分子2-羟基烟酸，最后用乙醇、乙醚洗涤，室温真空干燥得到棒曲霉素分子印迹聚合物。
6.一种采用权利要求1所述的的制备方法制备的棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物，其特征在于，所述的棒曲霉素特异性硅胶表面分子印迹聚合物在苹果汁中检测棒曲霉素的应用。
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