CN110243892A - 一种以花状三氧化钨复合材料为基础的光电化学降钙素原生物传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以花状三氧化钨复合材料为基础的光电化学降钙素原生物传感器的制备方法，属于光电化学传感器领域。利用水热合成的方法，合成了独特的花状三氧化钨WO₃，多孔结构赋予其较大比表面积，用氮掺杂碳量子点NCQDs敏化，增强了WO₃的光电化学活性，随后，利用Sb³⁺和S^2‑的反应原位生长硫化锑Sb₂S₃作为信号放大材料，制备出光电信号显著增强且稳定的花状三氧化钨复合材料WO₃/NCQDs/Sb₂S₃，通过层层自组装方法和抗原抗体之间的特异性结合来构建操作简单的光电化学降钙素原生物传感器，实现对降钙素原的超灵敏检测，这对降钙素原的分析检测具有重要的意义。

Description

一种以花状三氧化钨复合材料为基础的光电化学降钙素原生 物传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及一种以花状三氧化钨复合材料为基础的光电化学降钙素原生物传感器的制备方法，使用电化学工作站以三电极体系进行测试，以LED灯为光电化学发光信号源，花状三氧化钨复合材料WO₃/NCQDs/Sb₂S₃作为基底材料，制备了一种以WO₃/NCQDs/Sb₂S₃复合材料为基础的光电化学降钙素原生物传感器，属于光电化学传感器领域。

背景技术

作为一种与免疫系统高度相关的蛋白质，降钙素原PCT在人体内扮演了一种重要的角色。它的浓度会在细菌、真菌、寄生虫入侵人体时升高，而人体的自身免疫、过敏和病毒感染不会导致这一情况出现。出于以上原因，降钙素原可以成为区别细菌性感染和病毒性感染以及量化炎症感染程度的标志物，是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标，其存在严重威胁人类的健康，因此，对降钙素原的早期诊断很重要。

目前，检测PCT的实验室方法有很多，不仅可以定性，亦可以定量。常用的方法有如下几种：胶乳增强免疫透射比浊法、双抗夹心免疫化学发光法、均匀纳米颗粒分析法等。应当注意的是，虽然降钙素原的检测方法很多，但因其定量测定受到许多因素的影响，具有灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，选择性好，操作快速简便的光电化学免疫分析方法。

本发明设计了一种光电化学生物传感器，以独特的花状三氧化钨复合材料WO₃/NCQDs/Sb₂S₃为基底材料。该复合材料具有非常优异的光电化学活性，提高了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，实现了对降钙素原的超灵敏分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测降钙素原提供了新途径。

发明内容

本发明的目的之一是合成具有独特花状结构的WO₃，用NCQDs来敏化WO₃，以原位生长窄带隙的Sb₂S₃作为信号放大材料，制备出花状三氧化钨复合材料WO₃/NCQDs/Sb₂S₃。

本发明的目的之二是以WO₃/NCQDs/Sb₂S₃复合材料为基底材料，利用抗原抗体的特异性结合，构建一种选择性好、快速且超灵敏的光电化学生物传感器，实现对降钙素原的快速、灵敏检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种以花状三氧化钨复合材料为基础的光电化学降钙素原生物传感器的制备方法，所述的花状三氧化钨复合材料为氮掺杂碳量子点NCQDs和硫化锑Sb₂S₃共敏化的花状三氧化钨复合材料WO₃/NCQDs/Sb₂S₃，所述的光电化学降钙素原传感器由ITO工作电极、WO₃/NCQDs/Sb₂S₃、降钙素原抗体、牛血清白蛋白、降钙素原抗原组成；

其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：

WO₃/NCQDs/Sb₂S₃的制备；

光电化学降钙素原生物传感器的制备；

其中，步骤一制备WO₃/NCQDs/Sb₂S₃的具体步骤为：

（1）将9 ~ 11 mmol的Na₂WO₄∙2H₂O在连续搅拌的条件下溶于16 ~ 20 mL超纯水中，然后将4 ~ 6 mol/L的HCl溶液逐滴加入到上述溶液中调节其pH值为1.5左右，然后将18 ~ 22mmol的NaCl和0.8 ~ 1 mmol的H₂C₂O₄加入到上述混合液，连续搅拌20 ~ 30 min后，再加入40 ~ 50 mL超纯水，最后，将所得溶液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在150℃下加热1 h，冷却至室温，将所得混合物分别用超纯水和乙醇离心洗涤3次，在真空中干燥，最后得到WO₃黄色粉末，将其溶于超纯水中，得到WO₃悬浮液；

（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，在烘箱中140℃干燥2 h，将8 ~ 10 µL的WO₃悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/WO₃电极；

（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰3 ~ 6 µL、浓度为1 ~ 6 mg/mL的NCQDs溶液，室温下晾干，在电极表面进一步修饰3 ~ 6 µL、0.06 mol/L的SbCl₃乙醇溶液，室温下反应20~ 40 min，超纯水冲洗，继而修饰3 ~ 6 µL、0.1 mol/L的Na₂S，室温下反应20 ~ 40 min，超纯水冲洗，制得WO₃/NCQDs/Sb₂S₃；

其中，步骤二制备光电化学降钙素原传感器的具体步骤为：

（a）在步骤一中得到的WO₃/NCQDs/Sb₂S₃修饰的ITO工作电极表面修饰3 ~ 6 µL、0.1mol/L的聚多巴胺，室温下晾干，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL、0.8 ~ 1 µg/mL的降钙素原抗体，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL的1%牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学降钙素原生物传感器。

2. 所制备的光电化学降钙素原传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：

a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的降钙素原标准溶液；

b. 工作电极修饰：将所制备的光电化学降钙素原生物传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的降钙素原标准溶液分别滴涂到工作电极表面；

c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用I-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0 V，运行时间100 s，激发光源为LED灯；检测对不同浓度的降钙素原标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的降钙素原标准溶液的光电流强度记为I _i，I _i与降钙素原标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制I _i - logc工作曲线；

d. 降钙素原的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的降钙素原标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中降钙素原的含量；

所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。

本发明的有益成果

（1）本发明合成了具有独特花状的WO₃，多孔结构赋予其较大的比表面积，有利于对功能材料的负载，提高材料的导电性，而且WO₃具有高稳定性和低成本等优点，能有效减小背景信号，增强传感器的灵敏度；

（2）用NCQDs来敏化WO₃，其具有很强的水溶性和电子运输能力，加速了电子空穴对的分离，增加了材料的导电性和光电化学活性，从而提高了传感器的光电性能；

（3）利用Sb³⁺和S^2-的反应原位生长Sb₂S₃，Sb₂S₃和WO₃间完美的带隙匹配有效的调节了材料的带隙宽度，有利于光生电子空穴的分离；另外，Sb₂S₃作为信号放大材料明显的提高了材料的性能，与WO₃和NCQDs的进一步结合得到了具有优异的光电化学活性的WO₃/NCQDs/Sb₂S₃复合材料，进一步增强传感器的光电活性；

（4）以WO₃/NCQDs/Sb₂S₃复合材料为基底材料，它优异的光电活性提高了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，另外，抗原抗体的特异性结合赋予了该传感器的优异的稳定性和选择性，实现了对降钙素原的超灵敏检测。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此

实施例1 制备WO₃/NCQDs/Sb₂S₃的具体步骤为：

（1）将9 mmol的Na₂WO₄∙2H₂O在连续搅拌的条件下溶于16.36 mL超纯水中，然后将4.9mol/L的HCl溶液逐滴加入到上述溶液中调节其pH值为1.5左右，然后将18 mmol的NaCl和0.83 mmol的H₂C₂O₄加入到上述混合液，连续搅拌30 min后，再加入41 mL超纯水，最后，将所得溶液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在150℃下加热1 h，冷却至室温，将所得混合物分别用超纯水和乙醇离心洗涤3次，在真空中干燥，最后得到WO₃黄色粉末，将其溶于超纯水中，得到WO₃悬浮液；

（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，在烘箱中140℃干燥2 h，将8 µL的WO₃悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/WO₃电极；

（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰3 µL、浓度为1 mg/mL的NCQDs溶液，室温下晾干，在电极表面进一步修饰3 µL、0.06 mol/L的SbCl₃乙醇溶液，室温下反应20 min，超纯水冲洗，继而修饰3 µL、0.1 mol/L的Na₂S，室温下反应20 min，超纯水冲洗，制得WO₃/NCQDs/Sb₂S₃。

实施例2制备WO₃/NCQDs/Sb₂S₃的具体步骤为：

（1）将10 mmol的Na₂WO₄∙2H₂O在连续搅拌的条件下溶于18.2 mL超纯水中，然后将5.45mol/L的HCl溶液逐滴加入到上述溶液中调节其pH值为1.5左右，然后将20 mmol的NaCl和0.9 mmol的H₂C₂O₄加入到上述混合液，连续搅拌30 min后，再加入45.45 mL超纯水，最后，将所得溶液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在150℃下加热1 h，冷却至室温，将所得混合物分别用超纯水和乙醇离心洗涤3次，在真空中干燥，最后得到WO₃黄色粉末，将其溶于超纯水中，得到WO₃悬浮液；

（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，在烘箱中140℃干燥2 h，将9 µL的WO₃悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/WO₃电极；

（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰4 µL、浓度为2 mg/mL的NCQDs溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰4 µL、0.06 mol/L的SbCl₃乙醇溶液，室温下反应20 min，超纯水冲洗，继而修饰4 µL、0.1 mol/L的Na₂S，室温下反应20 min，超纯水冲洗，制得WO₃/NCQDs/Sb₂S₃。

实施例3制备WO₃/NCQDs/Sb₂S₃的具体步骤为：

（1）将11 mmol的Na₂WO₄∙2H₂O在连续搅拌的条件下溶于20 mL超纯水中，然后将6 mol/L的HCl溶液逐滴加入到上述溶液中调节其pH值为1.5左右，然后将22 mmol的NaCl和1 mmol的H₂C₂O₄加入到上述混合液，连续搅拌30 min后，再加入50 mL超纯水，最后，将所得溶液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在150℃下加热1 h，冷却至室温，将所得混合物分别用超纯水和乙醇离心洗涤3次，在真空中干燥，最后得到WO₃黄色粉末，将其溶于超纯水中，得到WO₃悬浮液；

（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，在烘箱中140℃干燥2 h，将10 µL的WO₃悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/WO₃电极；

（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰6 µL、浓度为6 mg/mL的NCQDs溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰6 µL、0.06 mol/L的SbCl₃乙醇溶液，室温下反应40 min，超纯水冲洗，继而修饰6 µL、0.1 mol/L的Na₂S，室温下反应40 min，超纯水冲洗，制得WO₃/NCQDs/Sb₂S₃。

实施例4制备光电化学降钙素原传感器的具体步骤为：

（a）在步骤一中得到的WO₃/NCQDs/Sb₂S₃修饰的ITO工作电极表面修饰4 µL、0.1 mol/L的聚多巴胺，室温下晾干，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰4 µL、0.8 µg/mL的降钙素原抗体，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰4 µL的1%牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学降钙素原生物传感器。

实施例5制备光电化学降钙素原传感器的具体步骤为：

（a）在步骤一中得到的WO₃/NCQDs/Sb₂S₃修饰的ITO工作电极表面修饰6 µL、0.1 mol/L的聚多巴胺，室温下晾干，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰5 µL、1 µg/mL的降钙素原抗体，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰5 µL的1%牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学降钙素原生物传感器。

实施例6所制备的光电化学降钙素原传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：

a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的降钙素原标准溶液；

b. 工作电极修饰：将所制备的光电化学降钙素原生物传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的降钙素原标准溶液分别滴涂到工作电极表面；

c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用I-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0 V，运行时间100 s，激发光源为LED灯；检测对不同浓度的降钙素原标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的降钙素原标准溶液的光电流强度记为I _i，I _i与降钙素原标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制I _i - logc工作曲线；

d. 降钙素原的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的降钙素原标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中降钙素原的含量；

所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。

Claims (2)

1.一种以花状三氧化钨复合材料为基础的光电化学降钙素原生物传感器的制备方法，所述的花状三氧化钨复合材料为氮掺杂碳量子点NCQDs和硫化锑Sb₂S₃共敏化的花状三氧化钨WO₃/NCQDs/Sb₂S₃，所述的光电化学降钙素原传感器由ITO工作电极、WO₃/NCQDs/Sb₂S₃、降钙素原抗体、牛血清白蛋白、降钙素原抗原组成；

其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：

WO₃/NCQDs/Sb₂S₃的制备；

光电化学降钙素原生物传感器的制备；

其中，步骤一制备WO₃/NCQDs/Sb₂S₃的具体步骤为：

（1）将9 ~ 11 mmol的Na₂WO₄∙2H₂O在连续搅拌的条件下溶于16 ~ 20 mL超纯水中，然后将4 ~ 6 mol/L的HCl溶液逐滴加入到上述溶液中调节其pH值为1.5左右，然后将18 ~ 22mmol的NaCl和0.8 ~ 1 mmol的H₂C₂O₄加入到上述混合液，连续搅拌20 ~ 30 min后，再加入40 ~ 50 mL超纯水，最后，将所得溶液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，在150℃下加热1 h，冷却至室温，将所得混合物分别用超纯水和乙醇离心洗涤3次，在真空中干燥，最后得到WO₃黄色粉末，将其溶于超纯水中，得到WO₃悬浮液；

（2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30min，在烘箱中140℃干燥2 h，将8 ~ 10 µL的WO₃悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/WO₃电极；

（3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰3 ~ 6 µL、浓度为1 ~ 6 mg/mL的NCQDs溶液，室温下晾干，在电极表面进一步修饰3 ~ 6 µL、0.06 mol/L的SbCl₃乙醇溶液，室温下反应20~ 40 min，超纯水冲洗，继而修饰3 ~ 6 µL、0.1 mol/L的Na₂S，室温下反应20 ~ 40 min，超纯水冲洗，制得WO₃/NCQDs/Sb₂S₃；

其中，步骤二制备光电化学降钙素原生物传感器的具体步骤为：

（a）在步骤一中得到的WO₃/NCQDs/Sb₂S₃修饰的ITO工作电极表面修饰3 ~ 6 µL、0.1mol/L的聚多巴胺，室温下晾干，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL、0.8 ~ 1 µg/mL的降钙素原抗体，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰4 ~ 5 µL的1%牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即制得光电化学降钙素原生物传感器。

2.如权利要求1所述的制备方法所制备的光电化学降钙素原生物传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：

a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的降钙素原标准溶液；

b. 工作电极修饰：将所制备的光电化学降钙素原生物传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的降钙素原标准溶液分别滴涂到工作电极表面；

c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用I-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0 V，运行时间100 s，激发光源为LED灯；检测对不同浓度的降钙素原标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的降钙素原标准溶液的光电流强度记为I _i，I _i与降钙素原标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制I _i - logc工作曲线；

d. 降钙素原的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的降钙素原标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中降钙素原的含量；

所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。