CN111426847A - 一种微流控芯片、检测试剂盒、微流控检测系统及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微流控芯片、检测试剂盒、微流控检测系统及其用途。本发明的微流控芯片能够基于免疫荧光法检测新型冠状病毒抗原、IgM抗体或IgG抗体。本发明的微流控检测系统能同时检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体。本发明通过微流控技术进一步提升了新型冠状病毒检测能力，一次可实现三个项目的检测，检测效率高，根据三个检测结果综合分析能够更为准确地分析感染人群的病程阶段，满足急诊、ICU等紧急使用场景的快检需求。

Description

一种微流控芯片、检测试剂盒、微流控检测系统及其用途
技术领域
本发明属于医疗检测领域，尤其涉及一种微流控芯片、检测试剂盒、微流控检测系统及其用途。
背景技术
自2019年12月以来，新型冠状病毒肆虐全球，截止北京时间3月15日17时，确诊病例全球达153517例，死亡病例全球达5735例。多国疫情出现爆发式增涨，形势日趋严峻。世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”(Corona Virus Disease2019)。国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”(Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2)。该病毒属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。由双层脂质的囊膜组成，其中包含S蛋白(Spike glycoprotein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)、膜蛋白(Membrane glycoprotein，M)以及核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。该病毒经呼吸道飞沫、气溶胶、接触等传播，传播性强，人群普遍易感，感染后潜伏期长，据报道，潜伏期最长一例达到了24天。因此，准确有效的对疑似病人筛查及确诊是最有效遏制新型冠状病毒传播最有效的途径之一。
目前市场上诊断新型冠状病毒的检测多以核酸为主。核酸检测目前都需要大概2小时左右，除了操作复杂以外，时间也比较长，需要特定的实验室和设备。且据报道用核酸检测新冠肺炎敏感性即阳性率只有30-50％之间。假阴性对于隐形病例的确诊带来极大困难，漏检导致感染人群成为潜在传播者。
当前尚无用于新型冠状病毒特定治疗方法或者用于预防的疫苗，并且被感染但无症状的情况陆续出现，可能在完全不知情的情况下将病毒传播给其他人。新型冠状病毒感染的隐蔽性和长潜伏期，使得大规模、彻底地筛查变得更加关键。作为现在临床诊断主要工具的核酸检测方法诸多限制，社会迫切需要一种快速、简单易用、灵敏且准确的测试方法用来快速识别感染者，以阻止疫情扩散。
目前也有研究人员尝试采用血清抗体检测。IgM/IgG抗体是人体感染病毒后出现的特异性抗体，是近期感染的标志，通过检测血清中的IgM/IgG抗体可以辅助诊断病毒感染。在感染过程中IgM是免疫系统中最先出现的特异性抗体，然后IgG抗体出现。利用IgM和IgG进行双抗体检测有敏感度高、诊断及时，能判定疑似者是否感染等优点。从准确性、便捷性、时效性来说，抗体检测略胜一筹。而且IgM/IgG抗体阳性率很高。根据《国际检验医学杂志》3月4日在线首发的论文《SARS-CoV-2IgM/IgG抗体检测在新型冠状病毒肺炎诊断中的价值》，针对25例确诊患者的检测，IgM/IgG抗体阳性24例，临床灵敏度高达96％。
但目前该技术的产品多以单个抗体检测为主，有少部分是双抗体检测。市场上现有的少部分的双抗体检测主要以胶体金免疫层析试纸条技术为主。该技术以胶体金颗粒作为探针示踪物标记物，通过肉眼判读检测结果。该技术的优点是操作简单，无需仪器。但该技术难以突破主要来自于纸质基材本身对免疫反应的影响，硝酸纤维素膜对蛋白固定能力有限、手工组装步骤多等因素，普遍存在批内和批间精密度较大、灵敏度较低，导致弱阳性的感染人群没能被检测出来的漏检情况经常出现。因此在实际新型冠状病毒的双抗体检测临床检验使用中在检测准确度、灵敏度等方面存在问题，同时仅用抗体检测是无法检出尚处于潜伏期的人群，但目前市场暂无抗原检测试剂盒。
发明内容
发明要解决的问题
为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种能够检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体的微流控芯片和检测试剂盒以及用途。
本发明还提供一种微流控检测系统，该检测系统能够同时检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体。
用于解决问题的方案
本发明提供了如下技术方案：
【1】一种微流控芯片，所述微流控芯片包括三层，芯片上层设置加样区和格挡，芯片中间层为设有样本流动通道的双面胶层，芯片下层包括凹槽和点样区，所述点样区包括N-SARS-CoV-2抗体-荧光微球标记复合物、抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物或抗人IgG抗体-荧光微球标记复合物。
【2】根据【1】所述的微流控芯片，所述芯片上层朝向所述芯片中间层的一侧表面设置两条不同长度的格挡。
【3】根据【1】或【2】所述的微流控芯片，所述芯片上层朝向所述芯片中间层的一侧表面经过磨砂处理。
【4】根据【1】-【3】任一个技术方案所述的微流控芯片，所述样本流动通道包括加样孔区、流道检测区、废液槽区，所述流道检测区为弧形，所述流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度小于流道检测区流道中间弧形段的宽度。
【5】根据【1】-【4】任一个技术方案所述的微流控芯片用于制备新型冠状病毒抗原、IgM抗体或IgG抗体检测试剂盒的用途，其特征在于，当所述微流控芯片用于制备新型冠状病毒抗原检测试剂盒时，其点样区内包括N-SARS-CoV-2抗体-荧光微球标记复合物，当所述微流控芯片用于制备检测新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒时，其点样区内包括抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物，当所述微流控芯片用于制备检测新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒时，其点样区内包括抗人IgG抗体-荧光微球标记复合物。
【6】一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如【1】-【4】任一个技术方案所述的微流控芯片。
【7】一种微流控检测系统，所述微流控检测系统包括三个如【1】-【4】任一个技术方案所述的微流控芯片以及一个离心免疫检测装置，所述离心免疫检测装置包括固定装置，所述固定装置能同时固定三个所述微流控芯片，所述固定装置包括一个托盘上壳和一个同轴的圆形托盘底座，所述托盘上壳具有三个弧形侧面，所述圆形托盘底座设有光源透过区和用于固定所述微流控芯片的脚柱孔。
【8】根据【7】所述的微流控检测系统，所述微流控检测系统能同时检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体。
【9】根据【8】所述的微流控检测系统，利用所述微流控检测系统获得新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体的检测结果所需8～12分钟。
【10】根据【7】-【9】任一个技术方案所述的微流控检测系统，所述离心免疫检测装置还包括离心装置，检测时，离心装置的转速设为施加2000rpm，离心时间设为10秒。
发明的效果
本发明的微流控芯片能够检测新型冠状病毒抗原、IgM抗体或IgG抗体，试剂常温保存，无需冷链运输且待测样品类型齐全，具有良好的灵敏度和精确度。本发明的微流控检测系统可以同时检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体，8～12分钟即可获得三个指标的测试结果，根据三指标的测试结果综合判断受测者是否被感染以及感染的病程，检测效率高，满足急诊、ICU等紧急使用场景的快检需求。
附图说明
图1：本发明的一个实施方式的固定装置的结构示意图。
图2：新型冠状病毒RNA和抗原、IgM抗体、IgG抗体在感染者体内水平与病程相关性示意图。
图3：本发明制备例提供的微流控芯片的芯片上层朝向芯片中间层的一侧表面结构示意图。
图4：本发明制备例提供的微流控芯片的芯片中间层结构示意图。
图5：本发明制备例提供的微流控芯片的芯片下层结构示意图。
附图标记说明
微流控芯片 1
固定装置 2
芯片上层 100
芯片下层 200
芯片中间层 300
加样区 101
加样孔 102
加样区通气孔 103
废液池通气孔 104
磨砂表面 105
格挡 106
芯片下层的凹槽 201
有胶区 301
无胶区 302
加样孔区 303
流道检测区 304
废液槽区 305
流道检测区流道中间弧形段的宽度 a
流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度 b
托盘上壳 401
圆形托盘底座 402
光源透过区 403
脚柱孔 404
插销 405
包被抗体的荧光微球复合标记物点样区 4
质控抗体点样区 5
检测抗体点样区 6
具体实施方式
为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
应当理解，在本申请说明书和附加的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。
本说明书中，所提及的“一个或一些具体/优选的实施方式/方案”、“另一个或另一些具体/优选的实施方式/方案”、“一个或另一个实施方式/方案”、“一个或另一个技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本说明书中，“受试者”是指人或非人雌性生物体，优选受试者是人类，最优选是“患者”。
本说明书中，“诊断”是指本领域技术人员通过其可估计和/或确定患者是否患有给定的疾病或病状的可能性的方法。这里的“诊断”是“确定”，但不意味着暗示诊断是100％准确。
除非另有说明，本文中所使用的术语“IgM”是指免疫球蛋白M。
除非另有说明，本文中所使用的术语“IgG”是指免疫球蛋白G。
除非另有说明，本文中所使用的术语“Ag”是抗原的英文简称。
除非另有说明，本文中所使用的术语“N-SARS-CoV-2抗体”是指重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N蛋白)抗体。
<微流控芯片及基于其的检测试剂盒>
本发明提供了一种基于免疫荧光法检测新型冠状病毒抗原、IgM抗体或IgG抗体的微流控芯片。
免疫荧光法是指将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，检测荧光反应信号的方法。该方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
本发明所用的基于免疫荧光法分别检测新型冠状病毒抗原、IgM抗体和IgG抗体的微流控芯片的主体结构均相同，区别在于点样区的部分点样试剂不同。
本发明微流控芯片的主体结构包含叠置的三层：芯片上层、芯片下层、芯片中间层。芯片上层设置加样区和格挡，芯片中间层为设有样本流动通道的双面胶层，芯片下层包括凹槽和点样区。
芯片的形状可以是类椭圆形、方形、长方形、多边形或者圆形，优选地，其形状为类椭圆形以实现更好地握持。在本发明的一个具体实施方式中，芯片上下层的厚度均为1.5～2.5mm，如果厚度太薄，则芯片加载样本量过小并且容易变形，如果厚度太厚，透光性会受到影响，影响检测结果，同时也不符合芯片小型化的需求。芯片中间层的厚度为0.05～0.5mm。芯片上层和下层之间靠中间层粘贴或者中间层粘贴和卡扣共同进行密合固定。
芯片上层和芯片下层的材料选自聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、玻璃或聚碳酸酯中的一种；优选的，所述芯片上层和芯片下层的材料选自聚碳酸酯；所述芯片中间层为聚对苯二甲酸乙二醇酯胶或聚甲基丙烯酸甲酯胶。
芯片上层主要用于将待测样本引入检测区域，所述芯片上层包含加样区，在其上设有用于添加样本的孔，孔可设计成可与生物实验中常规实验的标准规格的移液枪枪头严密匹配的圆形，直径可在2mm～3mm之间，通过孔添加的样本可以沿着样本流动通道流动。由于本发明采用的重力和毛细管作用自驱动和短时离心相结合，本发明的加样区中无需固定有全血过滤装置如全血滤膜等，可以减少样本浪费，提高样本利用效率。加样区的形状与芯片中间层的加样孔区形状相对应。在一种可能的实施方式中，加样区为不规则扇形。芯片上层还包括通气孔，即加样区通气孔和废液池通气孔。所述通气孔为与大气相通的通孔，优选是圆形通孔以改善样本溶液的流动性，直径可在0.5～2.0mm范围内。在一种可能的实施方式中，芯片上层设置1个加样区通气孔和1个废液池通气孔。在另一种可能的实施方式中，加样区通气孔可以设置多个，取决于加样区的个数。
为了提高新冠病毒检测的灵敏度，本发明在芯片上层朝向芯片中间层的一侧表面(即与样本接触的表面)设置有格挡，通过格挡可以有效地节流样本，使得待测样本缓慢地进入样本流动通道，与点样区的荧光微球充分混合，使得反应更加充分和完全，从而进一步提高反应灵敏度和均一性。芯片完成组装后，芯片上层的格挡位于所述流道检测区靠近所述加样孔区的上方。在本发明的一些优选的实施方式中，设置两条不同长度的格挡可以更好地改变样本流动状态，促进液体在通道中不断接触交汇、相互牵制，进一步减缓样本流速。在本发明的一些实施方式中，两条不同长度的格挡的高度比为1.5～2.5:1，长度比为1.2～2:1。在本发明的一个具体实施方式，长的格挡长度为5.00mm，宽度为0.10mm，高度为0.10mm，短的格挡长度为3.00mm，宽度为0.10mm，高度为0.05mm。带有格挡的芯片上层可以通过常规的注塑成型方法获得。
为了进一步改善液体在样本流动通道中的流动状态，在本发明的一个优选的实施方式中，通过对芯片上层与样本接触的表面进行表面粗糙处理来实现。芯片材料本身具有不均一的亲水性，液体流经芯片表面时，由于接触角大小不一致会导致液体在通道中分布不均，流速差异大。将芯片上层接触液体样本的表面设置为粗糙表面后，由于其具有许多微小突出，突出之间存在较多沟壑，液体在表面流动时受到张力和重力作用，使得液体在进入体积较小的沟壑中时压强较大，迅速向四周扩散释放压力，通道会被快速充满，同时液体在沟壑中不断接触交汇、相互牵制，速度趋于一致，直至流过通道。本领域技术人员可以根据样本流动情况确定所需的粗糙程度。在本发明的多个实施方式中，采用磨砂处理的方式，芯片上层的一个表面为平均表面粗糙度Ra在0.05～0.15范围内的磨砂表面，采用该范围的粗糙程度，可以保证样本流速合适且流动均匀，另外也不会对透光性有过多影响，保证检测结果，如果超过上限，则会导致流动阻力的增大。优选地，芯片上层的一个表面为平均表面粗糙度Ra在0.05～0.10范围内，进一步优选0.05～0.08范围内，更优选0.06的磨砂表面。所述平均表面粗糙度Ra是指用表面粗糙度测量仪对芯片表面粗糙度进行测量，测量50片，同时用显微镜配合显微标尺复核，取平均值。在本发明的一个具体实施方式中，使用经表面粗糙处理的磨砂模具制备得到具有磨砂表面的芯片上层。具体地，使用高精密喷砂工具在普通上盖模具表面均匀喷射，模具成型后，材料注塑，便可以形成芯片粗糙表面。
本发明的芯片中间层为双面胶层，在所述双面胶层上用有胶区和无胶区分隔出样本流动通道，所述样本流动通道包括加样孔区、流道检测区、废液槽区，其中所述加样孔区与所述芯片上层的加样区相对应，所述废液槽区至少覆盖所述芯片下层的凹槽(即芯片下层的废液槽)，所述流道检测区为弧形。当将芯片上下层和中间层密合后，所述废液槽区的主要作用在于存储废液，即相当于废液池。在本发明的一个优选实施方式中，减小流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度，使其小于流道检测区流道中间弧形段的宽度，这样就使得即使施加短的离心时间时离心后的废液也能够完全停留在废液槽内，进一步提高了检测准确度。在本发明中“宽度”均采用游标卡尺测试10次获得的平均宽度。优选地,流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度比流道检测区流道中间弧形段的宽度＝1:1.5～2.5，进一步优选为1:2。在本发明的一个具体实施方式中，流道检测区的弯曲半径25～35mm(以离心免疫检测装置的固定装置的托盘底座离心轴心为圆心的半径)，弧度在1.8～2.2rad范围内，所述流道中间弧形段宽度为2-4mm，进一步优选所述流道中间弧形段宽度为2.5-4mm，所述拐弯处流道宽度为1-2mm，进一步优选1-1.5mm。
本发明的芯片下层设有凹槽(即芯片下层的废液槽)以便于收集离心时流道检测区甩出的残余废液，凹槽对应于芯片中间层的废液槽区的下半部分，为异形，深度在1-2mm。在本发明的芯片下层对应于芯片中间层流道检测区的位置处设有点样区(C、T、R区)，在点样区进行点样，通过固定荧光微球-抗体标记物和抗体以进行免疫指标检测，通过设立质控抗体点样区以减少产品批间和/或批内变异，提高产品质量。在本发明的一个优选实施方式中，顺着样本流动的方向，依次设置包被抗体的荧光微球点样区(R区)、检测抗体点样区(T区)、质控抗体点样区(C区)。
在本发明中，用于检测新型冠状病毒抗原的微流控芯片的R区点样试剂包括N-SARS-CoV-2抗体-荧光微球标记复合物；用于检测新型冠状病毒IgM抗体的微流控芯片的R区点样试剂包括抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物；用于检测新型冠状病毒IgG抗体的微流控芯片的R区点样试剂包括抗人IgG抗体-荧光微球标记复合物。包被抗体的荧光微球标记复合物的制备是通过将抗体加入到经活化处理的荧光微球溶液中，混匀，加入淬灭剂、封闭剂，离心清洗获得。荧光微球活化处理的方法可参见本申请人的在先申请(专利文献1：CN110773246A)，荧光微球的粒径为200-300nm，可商购获得。在本发明中N-SARS-CoV-2抗体、抗人IgM抗体、抗人IgG抗体相对于荧光微球溶液(固含量为1％)的添加量为：0.03-0.1mg：0.03-0.06mL。淬灭剂可选自Gly缓冲液(甘氨酸缓冲液)或乙醇胺。封闭剂可选自牛血清白蛋白(BSA)。将包被抗体的荧光微球标记复合物用荧光微球标记物复合物的稀释液(稀释液含有3％海藻糖和1％BSA)稀释至0.2-2.0mg/mL进而得到R区点样试剂。在本发明的一些具体实施方式中，R区点样量为0.5-5.0μL/点。
在本发明中配制C、T点样的方法如下：按实际浓度取适量包被抗体(新冠病毒抗原试剂盒)或抗原(IgM/IgG抗体试剂盒)用稀释液将抗体稀释至浓度为0.2-2.0mg/mL，为T区点样试剂；按照实际浓度取适量羊抗兔(抗原试剂盒)羊抗鼠(IgM/IgG抗体试剂盒)质控抗体用稀释液将抗体稀释至浓度为0.2-2.0mg/mL，用于C区点样试剂。在本发明的一个具体实施方式中，C、T点样稀释液为磷酸盐缓冲液(0.02M，含1-3％海藻糖，含0.05-0.1％曲拉通-100)。在本发明的一些具体实施方式中，C、T区点样量为0.2-2.0μL/点。
另外，为了便于与固定装置的固定，本发明的微流控芯片的芯片下层还设有脚柱以与固定装置的圆形托盘底座固定，另外在一些优选的实施方式中，本发明的微流控芯片的侧面可设有凸起，与固定装置的托盘上壳的弧形侧面上的插销配合以防止微流控检测芯片与托盘上壳之间发生周向移动。
本发明的微流控芯片制备方法包括：i)通过注塑成型的方式获得具有加样区和格挡的芯片上层，在本发明的一个优选实施方式中，使用高精密喷砂工具在普通上盖模具表面均匀喷射，模具成型后，材料注塑，在芯片上层形成平均表面粗糙度Ra在0.05～0.15范围内的磨砂表面；ii)通过激光在双面胶层刻蚀样本流体通道，在一个优选的实施方式中，刻蚀时减小流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度，使其小于流道检测区流道中间弧形段的宽度；iii)配制点样试剂；iv)将配制好的点样试剂点在芯片下层的点样区里；v)将点样完成的芯片下层干燥处理，贴上步骤ii)制备得到的双面胶层，盖上芯片上层，压紧。
本发明进一步提供了本发明的微流控芯片用于制备新型冠状病毒抗原、IgM抗体或IgG抗体检测试剂盒的用途，当用于制备新型冠状病毒抗原检测试剂盒时，微流控芯片的点样区内包括N-SARS-CoV-2抗体-荧光微球标记复合物，当用于制备检测新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒时，微流控芯片点样区内包括抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物，当用于制备检测新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒时，微流控芯片点样区内包括抗人IgG抗体-荧光微球标记复合物。
本发明进一步提供一种检测试剂盒，其包括本发明的微流控芯片、稀释液以及任选用于进行测试的说明书。
<微流控检测系统>
本发明的微流控检测系统包括三个本发明所述的微流控芯片以及一个离心免疫检测装置。离心免疫检测装置包括固定装置，固定装置能同时固定三个所述微流控芯片，所固定装置包括一个托盘上壳和一个同轴的圆形托盘底座，托盘上壳具有三个弧形侧面，圆形托盘底座设有光源透过区和用于固定微流控芯片的脚柱孔。本发明的底座设为整个圆盘，便于结构的加工，减少在一些复杂情况下加工、运输过程变形的可能性，同时增加了结构的强度，减少在离心速度很高情况下微流控芯片变形的可能性。
在本发明的一个具体实施方式中，固定装置具有图1所示结构。图1中固定装置2包括一个托盘上壳401和一个同轴的圆形托盘底座402。托盘上壳401具有三个弧形侧面，分别标记为A/B/C以区分不同位置的微流控芯片，圆形托盘底座402设有三个光源透过区403和十二个脚柱孔404，光源透过区403具有一弧形区域与本发明微流控片的流道检测区同轴心，对应于托盘上壳401的每一个弧形侧面，在圆形托盘底座402设有一个光源透过区403和四个用于固定微流控芯片的脚柱孔404。托盘上壳401和圆形托盘底座402可以通过螺栓等方式进行紧固。
在一些优选的实施方式中，为了增强固定的稳定性，在托盘上壳401的每个弧形侧面设置有两个插销405，插销上设有孔，每个微流控检测芯片的侧面设有凸起，凸起结构与插入到插销405的孔内以防止微流控检测芯片与托盘上壳之间发生周向移动。
离心免疫检测装置还包括离心装置，检测时，离心免疫检测装置的离心装置将带动固定装置转动进而实现三个微流控芯片的高速离心，之后利用检测模块对荧光信号进行检测，读取T峰荧光信号值，输出检测结果。本发明在检测时，离心装置的转速设为2000rpm，离心时间设为10秒。因本发明设计的微流控芯片结构、待测样本所需量少，粘稠度低，无需更高离心力也能将液体彻底离心干净，离心的转速可由通常的3000rpm降到2000rpm，可以缩短读取荧光值时间，进而可以使得读取结果更快，同时还能保证较高的灵敏度。
<微流控检测系统的用途>
本发明的微流控检测系统可用于同时快速检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体。同时检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体对于准确判断感染人群的病程阶段具有重要意义。
图2是研究机构有关RNA、抗原或抗体水平随着感染时间变化示意图，如图2所示，当感染者在被感染7天左右时，IgM开始可以被检测到，之后在感染者体内的浓度越来越高，然后约10天左右开始降低，14天开始IgG随之出现，并持续增高至病程二十八天左右。而无症状期(或潜伏期)人群在没有发病之前体内并没有这两种抗体出现，但抗原是存在的。
因此，新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体三合一联合检测的优势在于根据三指标的测试结果综合判断受试者是否被感染，以及感染的病程。当新型冠状病毒抗原(Ag)测试结果为阳性时，但IgG和IgM为阴性，说明该受试者可能已经是潜在感染人群(或处于窗口期)，只是暂时没有临床症状；当Ag测试结果为阳性时，IgM测试结果为阳性，IgG检测结果是阴性，说明该受试者可能在感染早期；当Ag测试结果为阳性，且IgG和IgM也为阳性时，若IgG强于IgM时，说明受试者为正在感染人群，且感染病程已经7天以上，若IgM强于IgG时，说明受试者为正在感染人群，且为症状初期；当Ag测试结果为阳性时，IgM测试结果为阴性，IgG检测结果是阳性，说明该受试者可能在感染后期或在康复期；当Ag测试结果为阴性时，IgG和IgM为阳性或IgG为阳性、IgM为阴性，说明该受试者很可能是曾经感染人群，已经治愈。三者联合检测，既能区分是潜在感染者还是正在感染者或者是已经感染并治愈人群，而且对医生进一步了解病程，对病人动态持续检测，可以帮助医生更好的辅助诊断和了解病人病情。
本发明的待测样本类型全面，样本需求量少。检测新型冠状病毒IgM抗体和IgG抗体的微流控检测芯片的待测样本可选自血清、血浆或全血样本；检测新型冠状病毒抗原的微流控检测芯片的待测样本可选自粪便或咽拭子样本。对于血清、血浆或全血样本，只需10μL，加入3～5滴稀释剂(比如约60～100μL磷酸稀释剂)后即可以进样测试。对于粪便或咽拭子样本，一般取其溶液样本30～45μL，加入2～4滴稀释剂后即可以进样测试。
检测时，根据样本类型取10～45μL适量样本加样到本发明的微流控芯片上层的加样区，同时加入2～5滴稀释液，样本在重力作用和毛细管作用下在样本流动通道内流动，反应10分钟，然后将三个微流控芯片(分别检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体)固定在离心免疫检测装置的固定装置上。施加10秒短时离心力以甩干流道检测区的残余废液，之后读取读取T峰荧光信号值。利用本发明的微流控检测系统可以实现定性和半定量的新型冠状病毒检测。
实施例
以下说明本发明的实施例，但本发明不限定于下述的实施例。
制备例：制备芯片三层结构
采用模具制备得到芯片上层和下层，采用激光雕刻机对双面胶层进行刻蚀获得芯片中间层。
如图3-图5所示，实施例1所使用的微流控芯片包含如下三层结构：芯片上层100、芯片下层200、芯片中间层300。
芯片上层100的材质是PC，形状为类椭圆形，上层100的厚度为2.0mm。图3所示是芯片上层朝向芯片中间层的表面(即与液体样本接触的表面)结构图，芯片上层100包含加样区101，加样区101上设有加样孔102，用于添加样本，加样孔102直径为4mm。加样区101的形状为不规则扇形。在加样区旁边设置两条长度不一的格挡106，格挡的宽度均为均为0.10mm，较长的格挡的长度为5mm，高度为0.1mm，较短的格挡的长度为3mm，高度为0.05mm。芯片上层100还包括2个通气孔，即图3所示的加样区通气孔103和废液池通气孔104。所述通气孔为与大气相通的圆形通孔以改善样本溶液的流动性，直径为1.0mm。芯片上层与液体样本接触的表面105为平均表面粗糙度Ra约0.06的磨砂表面。
芯片中间层300为双面胶层，材质为PET胶，厚度为0.05mm。采用激光雕刻机对双面胶层进行刻蚀，用有胶区301和无胶区302分隔出样本流动通道(即无胶区302)，如图4所示。所述样本流动通道可细分为加样孔区303、流道检测区304、废液槽区305三个区域，其中所述加样孔区303与所述芯片上层的加样区101形状相同，所述废液槽区305完全覆盖所述芯片下层的凹槽201，其面积大于凹槽的面积。流道中间弧形段宽度a为3mm，长度为30mm，所述流道检测区的弯曲半径32mm，弧度2.09rad，流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度b为1.2mm，该宽度采用游标卡尺测试拐弯处流道宽度10次，取平均值。
芯片下层200的材质是PC，形状与芯片上层相匹配，芯片下层200的厚度为2.0mm。如图5所示，芯片下层200包括一收集离心时残余废液的凹槽201，为异形，长宽深的最大尺寸为32mm×3.3mm×1.5mm。芯片下层还包括三个点样区：R区即包被抗体的荧光微球复合标记物点样区4、C区即质控抗体点样区5，T区即检测抗体点样区6。
实施例1：制备用于检测新型冠状病毒IgG抗体的微流控芯片
1.抗体-荧光微球标记复合物的制备
1.1取0.05mL羧基修饰的荧光微球(粒径为200nm，固含量为1％)于0.95mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(0.05M，pH6.1)中，充分混匀，洗涤1次，2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清；
1.2在1.1中加入1mL MES缓冲液(0.05M，pH6.1)，20％功率下超声1分钟(超1秒停1秒)，再分别加入1mg/mL的EDC溶液0.02mL和1mg/mL的sulfo-NHS溶液0.05mL，充分混匀，20-37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应30min；
1.3 2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清，再加入1mLMES缓冲液(0.05M，pH6.1)缓冲液超声重悬；
1.4取抗人IgG抗体(商购)用0.02-0.05mg，加入到0.5mL的1.3稀释液中的一种，完全混匀；
1.5将1.3加入到1.4稀释好的抗体中，快速充分混匀，37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应2.5小时；
1.6然后在1.5中加入0.1mL Gly缓冲液(0.5M，pH8.0)淬灭剂，37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应30min；
1.7然后再1.6中加入封闭剂0.1mL 10％BSA封闭60min；
1.8 2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清，沉淀用含有1％BSA和2％海藻糖的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(0.05M，pH7.4)悬浮，超声分散均匀，制备好的荧光微球2-8℃条件下避光保存备用。
2.C、T线包被液的制备
2.1配制C、T点样稀释液：磷酸缓冲液(PB)(0.02M，含2％海藻糖，含0.05％曲拉通-100)；
2.2按实际浓度取适量新型冠状病毒的包被抗原用2.1稀释液将抗体稀释至浓度为0.5mg/mL，为T区点样试剂；
2.3按照实际浓度取适量羊抗鼠质控抗体用2.1稀释液将抗体稀释至浓度为0.5mg/mL，用于C区点样试剂。
3.抗体-荧光微球复合物点样试剂稀释液的配制
用含2％海藻糖和1％BSA的HEPES稀释液(0.05M，pH7.4)将1.7标记好的抗人IgG抗体-荧光微球标记复合物溶液稀释至400倍，命名为R区点样试剂。
4.点样包被
用点样仪将配制好的试剂点在制备例得到的芯片下层点样区。其中C、T区点样量为0.5μL/点，R区点样量为3μL/点。
5.芯片组装工艺
点样完成的芯片下层置于37℃干燥箱内干燥老化18小时。干燥好的芯片下层置于组装治具上，依次贴上双面胶，盖上芯片上层，压卡仪压紧并用铝箔袋密封保存备用。
实施例2：制备检测新型冠状病毒IgM抗体的微流控芯片
1.抗体-荧光微球标记复合物的制备
1.1取0.05mL羧基修饰的荧光微球(粒径为200nm，固含量为1％)于0.95mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(0.05M，pH6.1)中，充分混匀，洗涤1次，2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清；
1.2在1.1中加入1mL MES缓冲液(0.05M，pH6.1)，20％功率下超声1分钟(超1秒停1秒)，再分别加入1mg/mL的EDC溶液0.05mL和1mg/mL的sulfo-NHS溶液0.05mL，充分混匀，37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应30min；
1.3 2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清，再加入1mLMES缓冲液(0.05M，pH6.1)缓冲液超声重悬；
1.4取抗人IgM抗体(商购)用0.02-0.05mg，加入到0.5mL的1.3稀释液中的一种，完全混匀；
1.5将1.3加入到1.4稀释好的抗体中，快速充分混匀，37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应2.5小时；
1.6然后在1.5中加入0.1mL Gly缓冲液(0.5M，pH8.0)，37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应30min；
1.7然后再1.6中加入封闭剂0.1mL 10％BSA封闭60min；
1.8 2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清，沉淀用含有1％BSA和2％海藻糖的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(0.05M，pH7.4)悬浮，超声分散均匀，制备好的荧光微球2-8℃条件下避光保存备用。
2.C、T线包被液的制备
2.1配制C、T点样稀释液：磷酸缓冲液(PB)(0.02M，含2％海藻糖，含0.05％曲拉通-100)；
2.2按实际浓度取适量新型冠状病毒抗原用2.1稀释液将抗体稀释至浓度为0.5mg/mL，为T区点样试剂；
2.3按照实际浓度取适量羊抗鼠质控抗体用2.1稀释液将抗体稀释至浓度为0.5mg/mL，用于C区点样试剂。
3.抗体-荧光微球复合物点样试剂稀释液的配制
用含2％海藻糖和1％BSA的HEPES稀释液(0.05M，pH7.4)将1.7标记好的抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物溶液稀释至400倍，命名为R区点样试剂。
4.点样包被
用点样仪将配制好的试剂点在制备例得到的芯片下层点样区。其中C、T区点样量为0.5μL/点，R区点样量为3μL/点。
5.芯片组装工艺
点样完成的芯片下层置于37℃干燥箱内干燥老化18小时。干燥好的芯片下层置于组装治具上，依次贴上双面胶，盖上芯片上层，压卡仪压紧并用铝箔袋密封保存备用。
实施例3：制备检测新型冠状病毒抗原的微流控芯片
1.抗体-荧光微球标记复合物的制备
1.1取0.05mL羧基修饰的荧光微球(粒径为200nm，固含量为1％)于0.95mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(0.05，pH6.1)中，充分混匀，洗涤1次，2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清；
1.2在1.1中加入1mL MES缓冲液(0.05M，pH6.1)，20％功率下超声1分钟(超1秒停1秒)，再分别加入1mg/mL的EDC溶液0.02mL和1mg/mL的sulfo-NHS溶液0.05mL，充分混匀，25℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应30min；
1.3 2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清，再加入1mLMES缓冲液(0.05M，pH6.1)种缓冲液超声重悬；
1.4取N-SARS-COV-2抗体(商购)用0.05mg，加入到0.5mL的1.3稀释液中的一种，完全混匀；
1.5将1.3加入到1.4稀释好的抗体中，快速充分混匀，37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应3小时；
1.6然后在1.5中加入0.1mL Gly缓冲液(0.5M，pH8.0)37℃条件下，置于摇摆混匀仪上避光反应30min；
1.7然后再1.6中加入封闭剂0.1mL 10％BSA封闭60min；
1.8 2-8℃、15000rpm条件下离心30分钟后去上清，沉淀用含有1％BSA和2％海藻糖的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(0.05M，pH7.4)悬浮，超声分散均匀，制备好的荧光微球2-8℃条件下避光保存备用。
2.C、T线包被液的制备
2.1配制C、T点样稀释液：磷酸缓冲液(PB)(0.02M，含2％海藻糖，含0.05％曲拉通-100)；
2.2按实际浓度取适量新型冠状病毒包被抗体用2.1稀释液将抗体稀释至浓度为0.8mg/mL，为T区点样试剂；
2.3按照实际浓度取适量羊抗兔质控抗体用2.1稀释液将抗体稀释至浓度为0.5mg/mL，用于C区点样试剂。
3.抗体-荧光微球复合物点样试剂稀释液的配制
用含2％海藻糖和1％BSA的HEPES稀释液(0.05M，pH7.4)将1.7标记好的抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物溶液稀释至500倍，命名为R区点样试剂。
4.点样包被
用点样仪将配制好的试剂点在制备例得到的芯片下层点样区。其中C、T区点样量为0.5μL/点，R区点样量为3μL/点。
5.芯片组装工艺
点样完成的芯片下层置于37℃干燥箱内干燥老化18小时。干燥好的芯片下层置于组装治具上，依次贴上双面胶，盖上芯片上层，压卡仪压紧并用铝箔袋密封保存备用。
应用例
取10-45μL样本加样到实施例1、实施例2或实施例3制备得到的微流控芯片上，同时加入3滴稀释液反应10分钟，将微流控芯片装在离心免疫检测仪的固定装置中，施加2000rpm逆时针离心力10秒，然后通过荧光读数仪，读取T峰荧光信号值。
应用例1：实施例1和实施例2检测IgG抗体和IgM抗体效果测试
1.企业参考品测试结果
1.1阴性参考品符合率
取季节性H1N1流感病毒、合胞病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、肺炎支原体、肠病毒抗体阳性样本等10种血清样本作为企业阴性参考品，每一种阴性参考品分别测试IgG和IgM试剂各3次，通过读取T峰荧光信号值，当荧光信号值在[50-200]区间内判断为阴性(-)，符合率100％，参见表1。
表1.IgG/IgM阴性参考品符合率
Figure BDA0002445387220000171
Figure BDA0002445387220000181
1.2阳性参考品符合率
将来源于上海市某三甲医院的3例IgG和IgM临床阳性样本和宁波市某三甲医院的2例IgG和IgM临床阳性样本，共5例，分别稀释5倍作为企业自制阳性参考品，分别测试3次，通过读取T峰荧光信号值，当荧光信号值在[201-500]区间内判断为阳性(+)，当荧光信号值在[501-1000]区间内判断为阳性(++)，当荧光信号值＞1000时判断为阳性(+++)，且符合率100％，参见表2。
表2.IgG/IgM阳性参考品符合率
Figure BDA0002445387220000191
1.3最低检测限
将IgG2企业阳性参考品和IgM4企业阳性参考品分别稀释2倍作为企业自制最低检测限参考品，检测20次，结果为阴性的结果≤2次，参见表3。
表3.IgG/IgM最低检测限参考品符合率
Figure BDA0002445387220000192
Figure BDA0002445387220000201
1.4精密度
将阳性参考品IgG4和IgG1作为IgG精密度参考品，将阳性参考品IgM2和IgM5作为IgM精密度参考品，分别测试10次，T峰值CV≤15％，参见表4。
表4.IgG/IgM精密度测试结果
Figure BDA0002445387220000202
2.临床样本测试
取上海市某三甲医院的临床诊断结果的样本进行测试，用已获得CFDA注册证的第三方生产的新型冠状病毒IgG/IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)进行对比。
结果参见表5。
表5.IgG/IgM临床样本测试结果
Figure BDA0002445387220000211
应用例2：实施例3检测新冠病毒抗原性能效果测试
1.企业参考品测试结果
1.1阴性参考品符合率
取以下10种经灭活的病毒阳性咽拭子作为企业阴性参考品，分别3次，通过读取T峰荧光信号值，当荧光信号值在[50-200]区间内判断为阴性(-)，符合率100％，结果见表6。
表6.抗原阴性参考品符合率
Figure BDA0002445387220000221
1.2阳性参考品符合率
在上海某三甲医院内收集的经灭活的1例强阳咽拭子样本Ag5，用PBS 2倍逐级稀释为Ag4、Ag3、Ag2、Ag1，分别测试3次，通过读取T峰荧光信号值，当荧光信号值在[201-500]区间内判断为阳性(+)，当荧光信号值在[501-1000]区间内判断为阳性(++)，当荧光信号值＞1000时判断为阳性(+++)，符合率100％，参见表7。
表7.抗原阳性参考品符合率
Figure BDA0002445387220000222
1.3最低检测限
将Ag 2企业阳性参考品稀释2倍作为企业自制最低检测限参考品，检测20次，通过读取T峰荧光信号值，荧光信号值在[201-500]区间内判断为阳性(+)，结果为阴性的结果≤2次，参见表8。
表8.抗原最低检测限参考品符合率
测试次 Ag峰值(结果)
1 223(+)
2 221(+)
3 235(+)
4 239(+)
5 227(+)
6 243(+)
7 241(+)
8 217(+)
9 228(+)
10 235(+)
11 232(+)
12 239(+)
12 254(+)
14 233(+)
15 239(+)
16 253(+)
17 232(+)
18 239(+)
19 253(+)
20 251(+)
阴性结果(个) 0
1.4精密度
将阳性参考品Ag1和Ag4作为精密度参考品，分别测试10次，T峰值CV≤15％参见表9。
表9.抗原精密度测试结果
Figure BDA0002445387220000241
2.临床样本测试
来自于上海市某三甲医院的灭活咽拭子2例，其中1例阳性，1例阴性；粪便样本4例，1例阳性3例阴性，结果参见表10。
表10.抗原临床样本测试结果
Figure BDA0002445387220000242
以上实施例仅用于阐明本发明的若干实施方案，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明的范围产生任何限制。应当明确的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括三层，芯片上层设置加样区和格挡，芯片中间层为设有样本流动通道的双面胶层，芯片下层包括凹槽和点样区，所述点样区包括N-SARS-CoV-2抗体-荧光微球标记复合物、抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物或抗人IgG抗体-荧光微球标记复合物。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述芯片上层朝向所述芯片中间层的一侧表面设置两条不同长度的格挡。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述芯片上层朝向所述芯片中间层的一侧表面经过磨砂处理。
4.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述样本流动通道包括加样孔区、流道检测区、废液槽区，所述流道检测区为弧形，所述流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度小于流道检测区流道中间弧形段的宽度。
5.根据权利要求1-4任一项所述的微流控芯片用于制备新型冠状病毒抗原、IgM抗体或IgG抗体检测试剂盒的用途，其特征在于，当所述微流控芯片用于制备新型冠状病毒抗原检测试剂盒时，其点样区内包括N-SARS-CoV-2抗体-荧光微球标记复合物，当所述微流控芯片用于制备检测新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒时，其点样区内包括抗人IgM抗体-荧光微球标记复合物，当所述微流控芯片用于制备检测新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒时，其点样区内包括抗人IgG抗体-荧光微球标记复合物。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的微流控芯片。
7.一种微流控检测系统，其特征在于，所述微流控检测系统包括三个如权利要求1-4任一项所述的微流控芯片以及一个离心免疫检测装置，所述离心免疫检测装置包括固定装置，所述固定装置能同时固定三个所述微流控芯片，所述固定装置包括一个托盘上壳和一个同轴的圆形托盘底座，所述托盘上壳具有三个弧形侧面，所述圆形托盘底座设有光源透过区和用于固定所述微流控芯片的脚柱孔。
8.根据权利要求7所述的微流控检测系统，其特征在于，所述微流控检测系统能同时检测新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体。
9.根据权利要求8所述的微流控检测系统，其特征在于，利用所述微流控检测系统获得新型冠状病毒抗原和IgM抗体、IgG抗体的检测结果所需8～12分钟。
10.根据权利要求7或8所述的微流控检测系统，其特征在于，所述离心免疫检测装置还包括离心装置，检测时，离心装置的转速设为施加2000rpm，离心时间设为10秒。
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