CN1880961B - 一种检测b型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸及其制备方法。该免疫层析试纸，包括样品垫1、紧密连接于所述样品垫一端的含有B型葡萄球菌肠毒素特异性抗体标记胶体金探针的金标垫2、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)3和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫4；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线5和质控线6，所述检测线为B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体，所述质控线为羊抗兔IgG。本发明用于临床标本、污染物和环境中B型金黄的葡萄球菌肠毒素的检出，也可用于制备B型金黄色葡萄球菌肠毒素的鉴定。

Description

一种检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的试纸及其制备方法，特别涉及一种检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸，还涉及其制备方法。

背景技术

葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生的蛋白质外毒素，可分为A～I多个血清型。其中以葡萄球菌肠毒素B(SEB)产毒量最高(高树德，汪美先，主编，防疫检验手册，p83-85，1982，人民卫生出版社)。由于SEB是重要的失能性毒素，因此作为经典的生物战剂被列入《国际禁止生物武器公约》核查清单。“9.11事件”以后，美国在其国家反恐预案中又将SEB与炭疽杆菌等烈性微生物一起，列为最有可能用于进行生物恐怖活动的生物战剂。

SEB造成中毒的特点是潜伏期短，进入体内后1～3小时发病。主要症状为恶心、呕吐，也有腹痛和腹泻。一般一天左右痊愈，极少死亡。人感受剂量估计为20μg，但也有1～7μg而发病者。对2～3kg小猴胃内半数呕吐量为5μg，腹腔注射幼猫SEB致呕吐剂量为0.5μg(高树德，汪美先，主编，防疫检验手册，p83-85，1982，人民卫生出版社)。

各血清型葡萄球菌肠毒素间存在交叉抗原，这与各型葡萄球菌肠毒素基因间所编码的核苷酸序列有较高的同源性有关，如SEB基因核苷酸序列与SEA有30％的同源性，与SEC有75％的同源性。

目前研究认为，SEB为超抗原(SAg)，它们具有强大的刺激能力，可与抗原提呈细胞(APC)上的主要组织相容性复合物II类分子(MHC II)形成复合物，不经加工直接与T细胞抗原受体的β链V区(TCRVβ)结合。由于TCRVβ区基因核苷酸序列非常保守，同一个体内T细胞可具有相同的Vβ成分。因此，单一的SAg在极低浓度(1～10μg/L)即可激活大量T细胞(数量可达全部T细胞的5％～10％，甚至40％)。

利用动物试验测定肠毒素是经典的方法(高树德，汪美先，主编，防疫检验手册，p83-85，1982，人民卫生出版社；雷祚荣，编著，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，p119-140，1992，中国科学技术出版社)，但只有很少数动物对肠毒素敏感，如乳猫和猴。这些动物成本高，来源困难，试验操作繁琐，费时长。另外，猫呕吐试验是不特异的，其他非肠毒素类产物也致猫呕吐；猴试验测定肠毒素虽然是特异的，但葡萄球菌肠毒素食物中毒的多数食品含毒量往往低于1μg/100g食品，不能致试验猴产生感受而出现症状。因此，动物试验测定肠毒素一般仅用于科学研究，而不用于毒素检测。

免疫学方法(雷祚荣，编著，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，p119-140，1992，中国科学技术出版社)测定SEB主要有免疫双扩法(DD)、反向间接血凝法(RPHA)、反向乳胶凝集实验(RPLA)、固相放射免疫技术(SPRIA)、免疫印迹技术(Immunobloting)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)等。

最早用于定量检测肠毒素的是DD法，因其灵敏度较低、所需标本量大且操作繁琐，未能推广。SPRIA方法在灵敏度和特异性方面均有所提高，SPRIA测定各种食品提取液的灵敏度为5～10ng/g食品。免疫印迹、RPHA和RPLA方法灵敏度与SPRIA相当，但这些方法操作烦琐，难以推广使用。

ELISA是目前较常用的免疫学方法，测定肠毒素的ELISA采用双抗体夹心法。该法以抗SEB多抗作为捕获抗体包被聚氯乙烯96孔板，与样品中的SEB结合，并通过HRP酶标记抗体显色，整个检测过程方便、快捷、且敏感性和特异性均较高，测定细菌培养物上清液灵敏度可达0.5～2.5ng/ml，而且可以用于SEB的定量。但该法的缺陷仍然是耗时较长，需4小时左右，且步骤较为烦琐。

几种常见免疫学方法检测SEB的比较见表1。

表1几种常见免疫学方法检测SEB的比较

试验类型	灵敏度	局限性
			双向琼脂扩散反向间接血凝反向乳胶凝集固相放射免疫ELISA	μg5～10ng/g食品5～10ng/g食品5～10ng/g食品0.5～2.5ng/ml	不敏感不稳定容易有非特异反应有放射性耗时长，步骤烦琐
免疫印迹	5～10ng/g食品	耗时长，步骤烦琐

近年来发展的测定SEB免疫学方法有光纤生物传感器和免疫胶体金技术。光纤生物传感器用于检测SEB灵敏度可达ng/ml的浓度，但目前光纤生物传感器离实用还有一段距离(Slavik R，Homola J，Brynda E，A miniature fiber optic surface plasmon resonancesensor for fast detection of staphylococcal enterotoxin B，BiosensBioelectron，2002，17：591-595)。

免疫胶体金技术测定SEB的原理与ELISA相同，也是双抗体夹心法，即将抗SEB抗体包被在硝酸纤维素(NC)膜上用于捕捉SEB，然后用抗SEB抗体标记的免疫胶体金探针进行检测，阳性标本经过2-10分钟左右的纸层析后，出现肉眼可见的沉淀线。胶体金方法已用于肉毒毒素的快速检测，具有很高的敏感度(左庭婷，端青，姜永强等，A型肉毒毒素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制，军事医学科学院院刊，2003年第6期)。

免疫胶体金技术与其它方法比较，优势在于：检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。美国军方以及几家试剂公司已经开始研制该检测试剂。

目前尚未见到免疫层析试纸检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸(Immuno-Chromatographic Assay，ICA)。

本发明所提供的检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸，包括样品垫1、紧密连接于所述样品垫一端的含有B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体标记胶体金探针的金标垫2、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(NC膜)3和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫4；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线5和质控线6，所述检测线为B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体，所述质控线为羊抗兔IgG。

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料可以是多种多样的，如塑料、树脂等。

所述B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体优选为兔抗体，所述质控线优选为羊抗兔IgG。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸的方法。

本发明所提供的制备上述检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体，将B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-4小时，然后将其一端粘贴在吸水纸垫上。

2)制备含有B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体标记免疫胶体金探针溶液，取5ml，加入0.5g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干即得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端。

3)在步骤2)中的金标垫上面再贴样品垫，得到检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸。

为了使用更加方便，所述吸水垫的下面还粘贴背板。

本发明所提供的检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸及其制备方法中，所述B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体标记胶体金探针可由下述方法制备：

1)将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下准确加入1.6ml的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；

2)取50ml胶体金，加0.2M K₂CO₃或0.1M HCl 0.5ml调pH值为9.2，按36μg/ml加入纯化的SEB抗体，搅拌20分钟，加10％BSA 5ml，搅拌20分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20分钟，3200rpm离心15分钟，吸出上清，10500rpm离心25分钟，弃上清，沉淀用四硼酸钠洗涤一次后用5ml四硼酸钠保存液收集沉淀，得到胶体金标探针。

所述调节pH值的K₂CO₃的浓度可为0.15-0.25M，优选为0.2M；所述调节pH值HCl的浓度可为0.08-0.12M，优选为0.1M。

本发明的免疫层析试纸采用双抗体夹心法，将抗B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体包被在硝酸纤维素膜上，用于捕捉标本中的B型金黄色葡萄球菌肠毒素抗原，然后用特异性抗体标记的免疫胶体金探针进行检测。

本发明的试纸可用于临床标本、污染物和环境中B型金黄色葡萄球菌肠毒素的检出，也可用于制备B型金黄色葡萄球菌肠毒素的鉴定。本发明的优势在于检测过程中标本处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，很适合突发事件现场和基层使用。

附图说明

图1为B型金黄色葡萄球菌肠毒素免疫层析试纸的结构示意图。免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。

图2SEB的FPLC纯化图谱，最高峰含SEB。

图3纯化的SEB SDS-PAGE分析。

图4SEB抗体FPLC纯化图谱，最高峰含SEB抗体。

具体实施方式

主要材料：氯金酸(HAuCl₄)(购自Sigma公司，1g/瓶包装)；硝酸纤维膜(NC膜)、样品垫和吸水滤纸(购自Millipore公司)。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(FRI 243)，为产SEB标准株，引自美国威斯康辛大学食品研究所，由军事医学科学院微生物流行病研究所保存。

福氏完全佐剂和不完全佐剂，为Sigma公司产品。

SP-Sepharose HP、rProteinA抗体亲合层析预装柱，为Amersham公司产品。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸的制备

1、B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体的制备

1)B型金黄色葡萄球菌肠毒素的制备

采用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)FRI 243进行产毒培养。SEB菌株在营养肉汤中37℃过夜活化，次日按1％接种量扩大培养，37℃培养48小时。4℃8000rpm离心15分钟，收集上清。上清中含有SEB，产毒量约为100-200μg/ml培养基。500ml上清用5mM PB pH7.0缓冲液稀释10倍后加入SP-Sepharose HP柱(该柱预先平衡至pH7.0)，上样流速5ml/min。穿透峰UV2800mAU，用5mM PB pH7.0缓冲液平衡至UV60mAU开始用洗脱液(0.04M PBpH7.4-0.5mNacl)洗脱，收集峰UV1600mAU，收集3ml/管，共收集14管，即为纯化的SEB。图2为SEB色谱层析纯化图谱，最高峰为SEB。纯化的SEB以BCA试剂盒(PIERCE产品)定量，1mg/瓶分装，冷冻干燥保存。SDS-PAGE检测纯化的SEB为一条带，为电泳纯(纯度95％以上，见图3)，分子量30kDa。Lane1～4为纯化毒素，Lane5为Amersham低分子量标准。

2)B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体的制备

选用体重2kg健康雌性新西兰家兔(购自中国人民解放军军事医学科学院动物中心)，用生理盐水配制上述纯化SEB，吸取所需用量与等量佐剂混合，首次免疫采用福氏完全佐剂，其他次数采用不完全佐剂。免疫方案见表2。每周耳静脉采血，分离血清，双相琼脂扩散法测定SEB抗体效价，至效价≥1∶32，收集全血，分离血清。

表2SEB免疫方案

注射次数	间隔(周)	剂量(mg/0.5ml)	注射途径
				1234567	111441周后试血	0.010.050.100.502.005.7010	皮下皮下肌肉肌肉肌肉肌肉肌肉

用蛋白A柱亲合层析纯化抗SEB抗体。取抗SEB兔免疫血清2ml，用5mM PB pH7.0缓冲液稀释100倍后上样，上样流速3ml/min，穿透峰UV200mAU，用5mM PB pH7.0缓冲液平衡至UV10mAU开始线性洗脱，洗脱液为0.1M柠檬酸和柠檬酸钠(pH3.0)，收集峰达UV2800mAU，分步收集3ml/管(每管加10％的1.5M pH8.8 Tris用于中和洗脱液)，共收集2管。最高峰为SEB抗体。图4为SEB抗体色谱层析纯化图谱，最高峰为SEB抗体。BCA法测定抗体蛋白为2mg/ml。

2、制备免疫胶体金探针

1)制备胶体金溶液：采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶液。冷却后用蒸馏水恢复至原体积，制成颗粒直径为25nm的胶体金颗粒。

2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度：用0.2 M K₂CO₃或0.1 M HCl调节胶体金溶液pH9.2，准备5支洁净试管，分别加入1ml胶体金溶液。将经纯化的抗B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体稀释为1mg/ml，分别向4支试管中加入10μl、15μl、25μl、35μl，另一支为对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定1ml胶体金所需抗体的最适浓度，以此为基础增加20％抗体量，即为胶体金偶联抗体饱和浓度。结果表明：维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为30μl，即30μg/ml。选择偶联抗体浓度为36μg/ml。

3)金标垫2的制备：按上述方法配制含有浓度为36μg/mL的抗SEB特异性抗体的免疫胶体金探针溶液50ml，搅拌20分钟，加10％BSA 5ml，搅拌20分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20分钟，3200rpm离心15分钟，吸出上清，10500rpm离心25分钟，弃上清，沉淀用四硼酸钠洗涤一次后用四硼酸钠保存液收集沉淀5ml。取金标探针5ml加入0.5g蔗糖，充分溶解均匀加在玻璃纤维膜上，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干，得到金标垫2。

3、B型金黄色葡萄球菌肠毒素快速检测试纸的制备

如图1所示，检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸由吸水垫4、硝酸纤维膜3、金标垫2和玻璃纤维膜样品垫1四部分组成；硝酸纤维膜3上包被有检测线5和质控线6。

1)NC膜3的包被：

用0.01M pH7.2 PB缓冲液(NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，去离子水1000ml)稀释抗B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体，浓度为2.5mg/ml，用于包被检测线。用0.01MpH 7.2的PBS(NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g，Na₂HPO₄ 1.07g，NaCl 8.5g，去离子水1000ml)稀释羊抗兔IgG，浓度为3mg/ml，用于包被质控线。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机分别喷于2.5mm厚硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线5和质控线6，37℃干燥2.5-4h。

2)B型金黄色葡萄球菌肠毒素快速检测试纸的制备

将吸水垫4用双面胶粘贴在包被的硝酸纤维膜3的一端，将包被的NC膜3用双面胶粘贴在步骤2中制备的金标垫2的一端；在金标垫2上用双面胶粘贴玻璃纤维膜样品垫1；再最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

4、检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试剂盒的制备

为了方便使用，将步骤3制备的B型金黄色葡萄球菌肠毒素快速检测的免疫层析试纸的下面再紧密连接一塑料背板，再将该带有背板的试纸装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于对照带和测试带的部位设有观测窗。

5、B型金黄色葡萄球菌肠毒素快速检测试纸的使用方法和原理

测定时将试纸条样品垫1浸入液体标本中，样品垫1即吸取液体向上端移动，流经金标垫2时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向硝酸纤维膜3渗移。若标本中有待测特异抗原，其可与免疫金复合物的抗体结合，此抗原抗体复合物流至检测线5即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控线6与固相羊抗兔IgG结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。

实施例2、B型金黄色葡萄球菌肠毒素的检测及与其它相关毒素的交叉试验

1、B型金黄色葡萄球菌肠毒素的敏感性检测

1)SEB(1mg/支)由军事医学科学院微生物流行病研究所制备，经生理盐水有限稀释后作为样品检测液。

2)经实施例1制备的包被SEB特异性抗体和羊抗兔IgG的免疫层析试纸检测，加入样品检测液3滴(约150μl)，2分钟后开始观察结果，15分钟终止观察。检测不同浓度SEB，10ng/ml以上均可检出(见表3)，与其它免疫学方法比较具有较高的敏感性。

表3敏感性测定结果

SEB样品浓度	5ng/ml	10ng/ml	20ng/ml	40ng/ml	80ng/ml	160ng/ml
							检测结果	-	+	+	+	+	+

2、其他相关毒素的交叉试验

1)葡萄球菌A型肠毒素(SEA、1mg/支)、葡萄球菌C型肠毒素(SEC、1mg/支)、A型肉毒毒素(BONTA，1ug/支)和产气荚膜梭菌α毒素(1μg/支)，均由军事医学科学院微生物流行病研究所制备，经生理盐水有限稀释后作为样品检测液。

2)经实施例1制备的包被SEB特异性抗体和羊抗兔IgG的免疫层析试纸检测，将SEA、SEC、BONTA和α毒素稀释成不同浓度，分别加入样品检测液3滴(约150μl)，2分钟后开始观察结果，15分钟终止观察。结果见表4。

表4特异性测定结果

样品名称	SEA			SEC			BONTA			α毒素
													浓度(μg/ml)	1	5	10	0.05	0.1	0.2	0.1	0.5	1	0.1	0.5	1
检测结果	-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-

从表4可以看出，SEB快速检测试剂与100ng/ml以上的葡萄球菌C型肠毒素发生交叉反应，与10μg/ml以下葡萄球菌A型肠毒素、1μg/ml以下A型肉毒毒素和1μg/ml以下产气荚膜梭菌α毒素等毒素不发生交叉反应。

SEB快速检测试剂与100ng/ml以上的葡萄球菌C型肠毒素发生交叉反应，与SEB和SEC有较高的同源性有关。

SEB快速检测试剂与μg水平的葡萄球菌A型肠毒素、A型肉毒毒素和产气荚膜梭菌α毒素等毒素不发生交叉反应，显示了较好的特异性

实施例3、SEB快速检测试剂对模拟环境标本中SEB的检出

1、模拟标本的制备

选用火腿肠、牛奶，人血清、普通肉汤培养基和土壤模拟环境现场标本，分别称取火腿肠2g，剪碎置容器中，加入5ml无菌生理盐水，充分搅拌混匀，静置沉淀；牛奶用生理盐水1∶4稀释；血清用生理盐水1∶10稀释；普通肉汤用原液；土壤称取1g，加入5ml无菌生理盐水，2000rpm离心10-15分钟。

每种样品一式多份，1份取上清用作阴性对照，其他样品加入已知浓度SEB纯品，使样品分别含有SEB 20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml和1600ng/ml，作为模拟阳性检测标本。

2、实验方法

取SEB快速检测试剂，分别于试剂样品垫上加入上述检测样本3滴(约0.2ml)，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果判定：检测线和质控线处出现2条红色沉淀线为阳性，即有SEB检出；质控线处出现1条红色沉淀线为阴性，即无SEB检出。

3、实验结果

表5为SEB快速检测试剂检测模拟标本的结果。

表5 SEB快速检测试剂(胶体金法)检测模拟标本

样品	取样(g)	生理盐水(ml)	阴性对照	A型肉毒毒素(ng/ml)				实际检出能力
										10	20	40	80	(ng/g)	(ng/ml)
				火腿肠	2	5	-	-	-							+	+	100

样品	取样(g)	生理盐水(ml)	阴性对照	A型肉毒毒素(ng/ml)				实际检出能力
										土壤	1	5	-	-	+	+	+	200
				牛奶		1∶4	-	-	-											+	+		160
血清		1∶10	-							-	-	+	+		400
				普通肉汤	原液		-	-	+							+	+		20

从表中可以看出，SEB快速检测试剂(胶体金法)的特异性不受标本来源的影响，用做阴性对照的样品检测结果全部为阴性；SEB快速检测试剂(胶体金法)检测不同样品的灵敏度，即检测不同样品中所含SEB的最低浓度(实际检出能力)为：火腿肠100ng/g，土壤200ng/g，牛奶160ng/ml，血清400ng/ml，普通肉汤20ng/ml。

Claims (5)

1.一种检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸，包括样品垫(1)、紧密连接于所述样品垫一端的含有B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体标记胶体金探针的金标垫(2)、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜(3)和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫(4)；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线(5)和质控线(6)，所述检测线为B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体，所述B型金黄色葡萄球菌肠毒素抗体为兔抗体；所述质控线为羊抗兔IgG。

2.根据权利要求1所述的检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸，其特征在于：所述样品垫、吸水垫、金标垫均由吸水材料制成；所述吸水垫的下面还紧密连接有背板。

3.一种制备检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体，将B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体喷到纤维膜上，包被NC膜的一个区域，得到检测线；将抗兔IgG的抗抗体溶液喷到纤维膜上，包被NC膜的另一区域，得到质控线；37℃干燥2.5-4小时，然后将其一端粘贴在吸水纸垫上；

2)制备胶体金标探针，将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸，搅动下加入1.6ml的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸10-15分钟，冷却后用水恢复至原体积，用K₂CO₃调pH值为9.2，按36ug/ml加入B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体，搅拌20分钟，然后加入10％BSA 5ml，搅拌20分钟，加1ml 10％PEG20000，搅拌20分钟，3200rpm离心15分钟，吸出上清，10500rpm离心25分钟，弃上清，沉淀用四硼酸钠保存液收集，得到胶体金标探针。

3)制备含有B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体标记免疫胶体金探针溶液；取5ml，加入0.5g蔗糖充分溶解，将玻璃纤维或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，-20℃～-50℃放置8-12小时，冻干机抽干即得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维膜的靠近所述检测线的一端；

4)在步骤2)中的金标垫上面再贴样品垫，得到检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述B型金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体的浓度为2.5mg/ml；抗兔IgG的浓度为3mg/ml；所述吸水垫的下面还粘贴有背板；所述调节pH值的K₂CO₃的浓度为0.2M。

5.含有权利要求1或2所述的检测B型金黄色葡萄球菌肠毒素的免疫层析试纸的试剂盒。

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