CN110244054A - 纳米抗体I22在重组人干扰素α2b检测中的应用 - Google Patents

纳米抗体I22在重组人干扰素α2b检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明纳米抗体I22在重组人干扰素α2b检测中的应用，通过一系列实验研究证明在重组人干扰素α2b检测中纳米抗体I22比商品化的单克隆抗体更灵敏，纳米抗体I22与胶体金标记技术相结合，检测重组人干扰素α2b的检测限可达到1μg/mL。首次开发的胶体金试纸条实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了对重组人干扰素α2b快速检测的初步应用。

Description

纳米抗体I22在重组人干扰素α2b检测中的应用
技术领域
本发明涉及纳米抗体对重组人干扰素α2b的检测，特别是实现纳米抗体对重组人干扰素α2b的快速检测应用。
背景技术
我国是肝炎频发大国。重组人干扰素是目前国际上公认的有效治疗肝炎的药物，对于基因重组药物来说，药品的质量控制是我们关注的焦点，其中药品的鉴别实验是药品定性检测的主要依据。
对于重组人干扰素来说，根据《中国药典》2015版三部，对重组人干扰素α2b制品进行鉴别实验，主要采用免疫学检测方法(免疫斑点或免疫印迹)。此方法周期长，成本高，抗体间有批次的差异且全过程需要低温运输与保存，不利于快速检测。中国专利“一种抗干扰素α-2b纳米抗体及其应用”(申请号201710965143.X，公布号CN107857816A，公布日2018.03.30)筛选出的纳米抗体I22，采用原核表达体系进行生产，降低了生产成本，全过程无需冷链运输，且稳定性高、特异性高、分子量小和可大规模生产，但是，目前尚缺乏对其在重组人干扰素α2b检测中的进一步研究，因此尚不具备临床应用。
发明内容
本发明通过一系列实验研究证明在重组人干扰素α2b检测中纳米抗体I22比商品化的单克隆抗体更灵敏。纳米抗体I22的产量约为45.7mg/L，经镍柱纯化得到纯度100％，降低了生产成本。本发明采用纳米抗体I22与胶体金试纸条结合方式对重组人干扰素α2b实现快速检测。首次开发出纳米抗体I22的胶体金标记胶体金试纸条，实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了纳米抗体I22在快速检测方面的初步应用。
构建的菌株pET28a-His-I22-His进行了诱导表达，得到了分子量符合预期的蛋白，且能与重组人干扰素α2b进行结合。产量约为45.7mg/L，纯度为100％。
经全柱成像毛细管测得纳米抗体I22的等电点约8.20，N端测序测得氨基酸数目与理论结果一致，质谱测得分子量为14226.80Da，与理论分子量14226.77Da一致。
证明纳米抗体I22与商品化的单克隆抗体对重组人干扰素α2b制品的生物活性没有影响，多克隆抗体对重组人干扰素α2b制品生物活性有影响。
纳米抗体I22应用于Western Blot实验中，且对重组人干扰素α2b制品有特异性，对重组人干扰素α2b制品中的辅料人血白蛋白没有结合作用。
将纳米抗体I22与商品化的单克隆抗体(抗重组人干扰素α2b)进行比较分析，证明纳米抗体I22的检测限约为31.25ng，同等实验条件下商品化的单克隆抗体的检测限约为125ng。
纳米抗体I22应用于半定量检测重组人干扰素α2b的含量，精确度高，实验结果准确。
本发明具有如下积极的技术效果：通过一系列实验研究证明在重组人干扰素α2b检测中纳米抗体I22比商品化的单克隆抗体更灵敏，纳米抗体I22与胶体金标记技术相结合，检测重组人干扰素α2b的检测限可达到1μg/mL。首次开发的胶体金试纸条实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了对重组人干扰素α2b快速检测的初步应用。
附图说明
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。
图1显示了构建的菌株pET28a-His-I22-His。
图2显示了纯化后的目的蛋白的跑胶电泳。
图3是显示1-10管纯化蛋白的纯度占比图。
图4是显示Bradford方法测纯化后目的蛋白的浓度。
图5是显示等电聚焦电泳Marker图谱，两个Marker，Marker的pI值分别为4.65和8.96。
图6显示了等电聚焦电泳sample图谱，只含有目的蛋白纳米抗体I22。
图7显示了等电聚焦电泳Marker和sample图谱，测目的蛋白的等电点。
图8显示了第二管的等电聚焦电泳Marker和sample图谱，重复测目的蛋白的等电点。
图9显示了质谱测得分子量为测定结果14226.80，与理论结果14226.77一致。
图10显示了抗干扰素α2b纳米抗体I22动力学曲线图，结合和解离阶段均正常，平衡解离常数KD＝2.06x10-9M。
图11显示了纳米抗体I22与多克隆抗体对干扰素生物活性的影响。
图12显示了不同浓度的纳米抗体I22对干扰素测活的影响。
图13显示了纳米抗体I22和单克隆抗体对细胞活性的影响。
图14显示了带His标签的纳米抗体I22对抗His标签抗体的特异性。
图15显示了纳米抗体I22对重组人干扰素α2b特异性验证性实验。
图16显示了纳米抗体I22检测灵敏度试验。
图17显示了abcam商品化单克隆抗体检测灵敏度TMB染色试验。
图18显示了纳米抗体I22检测灵敏度化学发光试验。
图19显示了abcam商品化单克隆抗体检测灵敏度化学发光试验。
图20显示了纳米抗体I22与rhIFN-α2b抗体依赖性曲线实验，通过ELISA预实验得出纳米抗体I22与干扰素α2b有依赖性，且有良好的线性关系，阴性对照(HSA)没有依赖性。
图21显示了标准曲线图谱，将重组人干扰素α2b标准品作为标准品，重组人干扰素α2b制品作为检测样品进行般半定量相关实验，绘制标准曲线R2＝0.999。
图22显示了三次测定结果统计数据分析，将半定量检测重组人干扰素α2b制品试验重复三次，重复性良好。检测浓度与标示剂量浓度大致相等。
图23显示了第一次胶体金试纸条的检测结果。
图24显示了第二次胶体金试纸条的检测结果。
图25显示了第三次胶体金试纸条的检测结果。
具体实施方式
通过下面的实施例对本发明作进一步解释和说明，但这并不限制本发明的保护范围。以下实施例中采用试剂的配制方法如下：
RPMI1640培养液：精确称量配置500mL的RPMI1640所需要的培养基粉末，加ddH2O170mL对其进行充分溶解，定容至500mL，依次加入链霉素5x104IU，青霉素5x104IU，称量NaHCO3 1.050g，溶解于上述溶液中，进行充分混匀，用滤膜进行过滤，4℃冰箱中备用。
完全培养基：取分装好的30mL的胎牛血清和上述配置的RPMI1640培养液中270mL，进行充分混合，4℃冰箱中备用。
测定培养基：取分装的7mL胎牛血清(贮存在-20℃冰箱中)，加入到上述配置的RPMI1640培养液中93mL中，4℃冰箱中备用。
攻毒培养基：取分装的6mL的胎牛血清，加入到上述配置好的RPMI1640培养液中194mL中，4℃冰箱中备用。
消化液：精确称量NaH2PO4·2H2O 0.749g，KH2PO4 0.100g，EDTA 0.100g，NaCl4.000g，KCl 0.100g，加90mL水溶解，后定容到500mL，121℃，25分钟，进行灭菌。
染色液：称取结晶紫25mg，加入分析纯无水乙醇10mL，用纯化水定容，至50mL。
脱色液：量取无水乙醇400mL，醋酸0.8mL，用纯化水定容，至800mL。
实施例1：表达体系的构建
将筛选出的目的蛋白抗重组人干扰素α2b纳米抗体I22基因序列构建到载体pET28a中，构建了N端，C端都带His标签的pET28a-His-I22-His。此株载体的酶切位点为NcoI/XHoI，如图1。
实施例2：诱导表达纯化
第一步，将纳米抗体I22表达载体pET28a-His-I22-His分别转化到BL21宿主菌中。
第二步，将细菌培养基放置在LB/Kan液体培养基中(含有1mM IPTG)，16℃，220rpm摇床中进行诱导表达。
第三步，13小时后，4℃，13000rpm条件下离心28分钟，收集菌液沉淀。用平衡缓冲液悬浮沉淀，超声破碎，4℃，13000rpm条件下离心26分钟，收集上清液。
第四步，采用镍柱纯化蛋白将原菌液作为阳性对照，在约15kDa处得到单一目的条带，即为目的蛋白，如图2。
第五步，对纯化后的目的蛋白进行纯度检测，分析纯化的质量，如图3。
结果所示，纯化后目的蛋白的产量进行测定，实验中采取Bradford的方法进行测定。用试剂盒中的BSA作为标准品，进行稀释，作标准曲线，将我们的纯化的目的蛋白原倍，两倍，4倍梯度稀释，酶标仪测得结果后，作标准曲线，如图4。样品OD值换算成浓度，得出1L大肠杆菌大约表达45.7mg目的蛋白。通过与商品化的抗体(abcam)的产量(约为25mg)进行比较，目的蛋白纳米抗体I22的产量高，经济成本低，表达时间短。未经镍柱纯化的蛋白计算灰度值比例。1L菌液离心沉淀后用30mL的平衡缓冲液对沉淀进行悬浮，纯化后的蛋白经Bradford的方法计算大约的产量。用实际的纯化量与未纯化的产量进行回收率计算，回收率大于80％，证明回收率良好。
实施例3：全柱成像等电聚焦毛细管电泳测纳米抗体I22蛋白的等电点
第一步，对溶液进行制备，制备好阳性电解液(85％磷酸溶液)和阴性电解液(50％NaOH溶液)，1％甲基纤维素溶液，8mol/L尿素溶液。
第二步，将样品测定溶液进行充分混合，取Marker pI＝4.65，pI＝8.96各2μL，1％methylcellulose(甲基纤维素)140μL，8M Urea溶液25μL，169μL总体积。
第三步，样品和标准品的制备，将蛋白样品浓缩至约4mg/mL，取5μL，与169μL测定液混合，用去离子水补齐到200μL。
第四步，样品脱气，对样品溶液进行离心3分钟，转速11000rpm，定量移至自动采样瓶中，再次离心30s。
第五步，操作流程，放置好自动采样瓶，在iCE3分析仪放置清洗瓶(装有1％methylcellulose)，平衡瓶(1％methylcellulose直到瓶颈)，清洗瓶(装有纯化水)，干燥瓶(空气)，样品瓶。
第六步上样，样品瓶1(只含Marker)，样品瓶2(只含simple)，样品瓶3(Marker+simple)，样品瓶4(Marker+simple)，方法参数，自动采样器温度为4℃，运行时间16min，聚焦期1(4min，1500V)，聚焦期2(12min，4000V)。
第七步，柱筒清洗与贮藏，分析结束后，用水冲洗毛细管10min，为了进行柱筒贮藏，用去离子水清洗筒，再进行风吹1min，再在室温下贮藏。
结果如下，经过两步空白对照如图5，阳性对照如图6的分析，进行Marker+sample混合后，进行等电聚焦。将纳米抗体I22I22(至终浓度为100μg/mL)，1％甲基纤维素，8M尿素溶液，两性电解质3-10，两个不同等电点的Marker，将上述试剂进行充分混合离心(避免产生气泡)，缓慢沿管壁加到检测瓶中，以免产生气泡，经低温离心除去气泡。两支检测管进行进样(加入试剂与样品等条件相同)。经全柱成像等电聚焦毛细管电泳分析结果。经数据分析，通过两个Marker的等电点，对蛋白的等电点进行数据分析。第一针的蛋白等电点为8.21，如图7。第二针的蛋白等电点为8.20，如图8。结果显示蛋白的等电点约为8.20。
实施例4：质谱分子量测定
第一步，称DTT 7.7g，用17mL纯化水溶解，溶解后定容至50mL，配置成浓度为1mol/L进行分装，储存于-20℃冰箱中，备用。
第二步，取100μL的抗体蛋白，稀释到1mg/mL的浓度，加入5μL 1mol/L的DTT溶液，金属浴56℃孵育1小时。
第三步，设定超高液相色谱参数。
第四步，设定质谱仪参数：采集MS模式数据。
第五步，测定分子量：用配置好校正溶液在扫描范围内对仪器进行校正，连接LC-MS，进行完整分子量测定。
结果如图9。用DTT对纳米抗体I22进行处理后，用配置好校正溶液在扫描范围内对仪器进行校正，连接LC-MS，进行完整分子量测定，且测定结果14226.80与理论结果14226.77一致。
实施例5：测定抗重组人干扰素α2b蛋白纳米抗体I22结合力
第一步，按照Octet仪器操作流程进行相关程序定。
第二步，进行分析数据。
结果如图10。Octet平台测量抗重组人干扰素α2b纳米抗体I22和重组人干扰素α2b蛋白之间的结合力。将抗原重组人干扰素α2b制品稀释到10μg/mL，纳米抗体I22分别稀释到40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL。按照操作程序进行上样分析，如图所示，结合和解离阶段均正常，平衡解离常数KD＝2.06x10-9M。证明了纳米抗体I22与重组人干扰素α2b亲和力较高。
实施例6：纳米抗体I22对干扰素生物活性测定的影响(抗病毒法)
第一步，取测定培养液作为稀释液，稀释国家标准品至活性单位1000IU/mL。
第二步，将重组人干扰素α2b制品稀释到0.2μg/mL(约等于1000IΜ/mL)，多克隆抗体与重组人干扰素α2b制品，单克隆抗体与重组人干扰素α2b制品，纳米抗体I22与重组人干扰素α2b制品，分别按照1：1，1：10，1：100的比例进行混合，37度孵箱中孵育一个半小时，4℃冰箱中孵育过夜。
第三步，加样槽中，然后加入3-5mL的胰酶消化一分钟(37度孵箱中)，看到培养瓶底有白色悬浮物，加入3mL的完全培养液中和胰酶，用枪进行吹打5次，吸到灭菌的离心管中，4℃，950rpm条件下离心，去上清，收集细胞，用测定培养液悬浮细胞，用计数板对细胞进行计数，观察细胞的生长状态，然后配制成每lmL含3.5×105个细胞的铺在96孔细胞培养板中，每孔100μL。
第四步，放于孵箱中继续培养,设置条件为37℃，5％二氧化碳，直到细胞在96孔板中完全贴壁生长(显微镜下进行观察)，大约需要4-5小时。
第五步，取无菌的96孔细胞培养板，每孔加入150μL的测定培养基，将1)步中孵育好的样品混合液在第一孔中加入50μL，用排枪混和6-7次，避免产生气泡，取50μL加入第二孔，用排枪混和6-7次，避免产生气泡，加入到下一个孔，依次稀释到第八个孔，标准品也做如上的稀释，全部稀释完毕后，用排枪每孔吸取100μL加入到4)步中的细胞培养板中，以上操作均在细胞操净台里操作。
第六步，放于孵箱中，设置条件为37℃，5％二氧化碳，注意观察，待细胞长满后，缓慢的拍去上清液，将-70℃冰箱中保存的水泡性口炎病毒(VSV，)稀释到预定的浓度，加入到细胞培养板中。
第七步，缓慢的拍去上清，加入染色液(50μL/孔)，室温下放置在摇床上摇30分钟后，用盆接满2/3的水，将培养板放在盆中把染色液洗干净，过夜晾干，第二天加脱色液100μL/孔，摇床中摇20分钟。
第八步，用酶标仪测定结果，处理数据。
结果所示，将纳米抗体I22与重组人干扰素α2b国家标准品(1:1)，多克隆抗体与重组人干扰素α2b国家标准品按照1:10的比例进行混合后，37度孵箱中孵育一个小时，4度冰箱过夜。进行重组人干扰素α2b制品生物活性检测实验，如图11(病毒抑制法结果)。纳米抗体I22与PBS缓冲液作为阴性对照，重组人干扰素α2b国家标准品作为阳性对照。重组人干扰素α2b国家标准品与多克隆抗体结合后影响了干扰素的生物活性。重组人干扰素α2b国家标准品与纳米抗体I22结合后不影响干扰素的生物活性。将重组人干扰素α2b国家标准品与纳米抗体I22按不同的比例(1:1，1:10，1:100)，多克隆抗体与重组人干扰素α2b国家标准品按照1:10的比例进行混合后，37度孵箱中孵育一个小时，4度冰箱过夜。重组人干扰素α2b国家标准品作为阳性对照。进行重组人干扰素α2b制品生物活性检测实验。结果如图12，重组人干扰素α2b国家标准品与纳米抗体I22不同比例的结合后，不影响重组人干扰素α2b的生物活性。多克隆抗体与重组人干扰素α2b国家标准品混合后影响重组人干扰素α2b的生物活性。重组人干扰素α2b制品与纳米抗体I22与商品化的单克隆抗体按照(1:1，1:10)比例进行孵育结合。结果如图13，即两种抗体不会影响重组人干扰素α2b生物活性。
实施例7：Western Blot试验检测抗His标签抗体对纳米抗体I22的特异性
第一步，样品处理：商品化的带His标签的蛋白作为阳性对照，白蛋白为阴性对照，抗体蛋白，重组人干扰素α2b，各19.5μL上样，分别加入7.5μL 4×Loading Buffer，3μLReducing Agent，总体积为20μL，混匀，金属浴70℃加热10min，5000rpm离心5min，用还原SDS-PAGE Bis-Tris Gel凝胶，每孔上样13μL，200V，80A，35min。
第二步，使用Invitrogen iBlot2蛋白半干式电转仪进行转膜，按照转膜仪程序转膜7min，然后取出PVDF膜，在正面做好标记(用剪刀剪开一个小口)。
第三步，取上述标记好的PVDF膜，放入到15mL的含有5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温下摇床上摇七十分钟。
第四步，进行抗体孵育，洗膜后，向平皿中加入PBST缓冲液15mL，加入HRP标记的抗HIS标签(鼠源)抗体10μL，马血清5滴，冰箱孵育13个小时，用洗脱液进行洗膜4次，每次6min。
第五步，显色：TMB溶液(保存在4度冰箱中)染色，出现明显条带时放在清水中终止显色。
结果如图14，将纳米抗体I22应用于WesternBlot试验。用带His标签的商品化蛋白(分子量约为14.5kD),纳米抗体I22,重组人干扰素α2b制品，人血白蛋白(Human serumalbumin,HSA)，主要是由于重组人干扰素α2b制品中辅料为HSA，验证得出HRP-anti-Hisantibody对带His标签的蛋白和纳米抗体I22有结合作用，对重组人干扰素α2b制品和重组人干扰素α2b制品中的辅料HSA都没有结合作用。证明HRP-anti-His antibody可以用于纳米抗体I22作为一抗的Western Blot实验，来检测重组人干扰素α2b制品。
实施例8：Western blot试验验证纳米抗体I22与重组人干扰素α2b蛋白的结合特异性
第一步，样品处理：重组人干扰素α2b标准品，重组人干扰素α2b制品，重组人干扰素α1b制品，重组人干扰素α2a制品，重组人干扰素α1a制品各取19.5μL，分别加入7.5μL的Loading Buffer，3μL的Reducing Agent，至总体积为20μL，充分混匀。金属浴75℃加热12min，3000rpm离心4min。
第二步，选用还原SDS-PAGE 4～12％NuPAGE Bis-Tris Gel凝胶，每孔加入上述溶液14μL，设置程序，200V，80A，35min。
第三步，使用Invitrogen iBlot2蛋白半干式电转仪进行转膜实验，按照转膜仪的程序转膜7min，然后取出PVDF膜，在正面做好相应标记。
第四步，将标记好的PVDF膜用清水洗净，分别放入含有5％脱脂奶粉的PBST缓冲液进行孵育，室温下摇床上摇六十分钟。
第五步，将纳米抗体I22溶于新鲜封闭液中作为一抗，4℃孵育12个小时。
第六步，进行洗膜，配制含有0.05％吐温20/80的PBST洗液进行洗脱(前一晚配好)，6min/次，洗膜4次。
第七步，洗膜后，向平皿中加入5％脱脂奶粉PBST缓冲液15mL，将Mouse HRP-anti-His antibody，按照1：1800比例进行稀释，加入7μL，混合均匀。
第八步，洗膜4次(用PBST缓冲液进行洗脱)，每次6min。
第九步，显色：用TMB溶液染色，出现明显条带时放在清水中终止显色。
结果如图15，将重组干扰素的几类制品和其它类制品作为抗原，纳米抗体I22作为一抗，做免疫鉴别实验，证明纳米抗体I22与干扰素α2b有特异性结合作用，与重组干扰素α2a制品，重组干扰素α1b制品，也能有反应。因为重组干扰素α2b制品与重组干扰素α2b制品都是有165个氨基酸组成，且两者只有第23位氨基酸的区别。重组干扰素α2b制品与重组干扰素α1b制品氨基酸数目分别是165个和166个，并且有30个氨基酸序列有所不同。结果证明纳米抗体I22不仅可以鉴别重组干扰素α2b制品，而且对重组干扰素α1b制品，重组干扰素α2a制品也有反应。
实施例9：TMB染色方法验证纳米抗体I22与单克隆抗体应用于western blot试验的灵敏度
第一步，样品处理：将rhIFNα2b制品浓度分别稀释从50μg/mL进行对倍稀释，各取19.5μL，分别加入7.5μL 4×Loading Buffer，3μL Reducing Agent，总体积为30μL，混匀。金属浴75℃加热15min，5000rpm离心5min。
第二步，用还原SDS-PAGE Bis-Tris Gel凝胶，每孔上样14μL，200V稳压，电泳40min。
第三步，使用Invitrogen iBlot2蛋白半干式电转仪进行转膜实验，按照转膜仪的程序转膜7min，然后取出两张PVDF膜，在正面做好相应标记(纳米抗体I22作为一抗的标记为1，普通抗体作为一抗的标记为2)。
第四步，将标记好的PVDF膜用清水洗净，分别放入含有5％脱脂奶粉的PBST缓冲液中，进行孵育,室温下摇床上摇六十分钟。
第五步，将商品化的传统单克隆抗体与纳米抗体I22分别溶于新鲜封闭液中作为一抗，4℃孵育12个小时。
第六步，进行洗膜，配制含有0.05％吐温20/80的PBST洗液进行洗脱(前一晚配好)，6min/次，洗膜4次。
第七步，进行二抗孵育：洗膜后，向平皿中加入5％脱脂奶粉PBS缓冲液15mL，标号1的加入HRP标记的Mouse HRP-anti-His antibody10μL，标号2的加入HRP-anti-Mouse IgGantibody 10μL，1.5个小时室温摇晃孵育。洗膜4次(用PBST缓冲液进行洗脱)，每次6min。
第八步，显色：用TMB溶液(冰箱中保存)染色，出现明显条带时放在清水中终止显色。
结果所示，将重组人干扰素α2b制品做梯度稀释，比较纳米抗体I22与商品化抗体之间的灵敏性，TMB染色，室温下放置的纳米抗体I22的检测限达到31.25ng，如图16。商品化的抗体检测限为125ng，如图17。证明纳米抗体I22比商品化的单克隆抗体亲和力更高，灵敏度更好。
实施例10：化学发光方法验证纳米抗体I22与单克隆抗体应用于western blot试验的灵敏度
第一步，样品处理，将rhIFNα2b制品浓度分别稀释至浓度为20μg/mL，进行对倍稀释，稀释8个梯度，各取19.5μL，分别加入7.5μL 4×Loading Buffer，3μL Reducing Agent，总体积为20μL，混匀。金属浴75℃加热15min，5000rpm离心5min。
第二步，用还原SDS-PAGE Bis-Tris Gel凝胶，每孔上样14μL，200V稳压，电泳40min。
第三步，使用湿转进行转膜实验，按照转膜仪进行两个半小时的转膜，然后取出NC膜，做好相应标记(纳米抗体I22作为一抗的标记为1，普通抗体作为一抗的标记为2)。
第四步，将转好的NC膜用清水洗净，分别放入含有5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，进行封闭，室温下摇床上摇六十分钟。
第五步，将商品化的单克隆抗体与纳米抗体I22溶于新鲜封闭液中分别作为一抗，冰箱中4℃孵育12个小时。
第六步，进行洗膜，配制含有0.05％吐温20的TBST洗液，8min/次(摇床中摇动)，洗膜5次。
第七步，向平皿中加入5％脱脂奶粉TBST缓冲液15mL，标号1的加入Mouse HRP-anti-His antibody 10μL，标号2的加入HRP-anti-Mouse IgG antibody10μL，九十分钟室温摇晃孵育。TBST缓冲液洗膜5次，每次8min。
第八步，显影，用Thermo fisher试剂盒化学发光染色，A、B各500μL进行充分混合，均匀点在NC膜上，静置3分钟，压片显影。
结果所示，将重组人干扰素α2b制品做梯度稀释，比较纳米抗体I22与商品化抗体之间的灵敏性，化学发光染色结果显示，室温下放置的纳米抗体I22的检测限达到50ng，如图18。商品化的抗体检测限为100ng，如图19。同样证明纳米抗体I22比商品化的单克隆抗体亲和力更高，灵敏度更好。
实施例11：纳米抗体I22应用于半定量检测重组人干扰素α2b的蛋白含量检测预实验
第一步，包被：将浓度为90μg/mL的重组人干扰素α2b铺在96孔板上，用一次性手套封闭好，4度冰箱中放置13个小时。
第二步，将纳米抗体I22和白蛋白的浓度分别稀释为0.0009μg/mL，0.009μg/mL，0.09μg/mL，0.9μg/mL，9μg/mL，99μg/mL，999μg/mL，每孔加入100μL。
第三步，37度孵箱中孵育一个半小时。
第四步，按照加纳米抗体I22与白蛋白的孔分别加入HRP-anti-His antibody和HRP标记的鼠源的抗白蛋白的抗体100μL，孵箱中放置六十分钟。
第五步，设定好洗板机程序，进行洗板，洗5次(洗脱液为用PBST溶液)。
第六步，每孔各加入TMB LIQΜID-1COMPENT 100μL，放置在抽屉中反应30分钟，加入3M H2SO4的终止液50μL，将反应终止。
第七步每孔加入50μL的3M H2SO4溶液终止反应。
第八步在450nm波长下检测各孔OD值。
结果如图20，结果通过ELISA预实验得出纳米抗体I22与干扰素α2b有依赖性，且有良好的线性关系，阴性对照(HSA)没有依赖性。预实验相关结果。
实施例12：半定量检测实验
第一步包被：将重组人干扰素α2b标准品起始浓度为125μg/mL对倍稀释，稀释到第七个孔，五种重组人干扰素α2b制品，浓度稀释至标准曲线范围内的浓度，加入到96孔板中，每空100μL，用一次性手套进行封闭，放置在4度冰箱十二个小时。
第二步，用配置好的5％BSA封闭液进行封闭，用排枪每孔加入100μL封闭液，37度孵箱中孵育1个小时。
第三步，设定好洗板机程序，进行洗板，洗5次(洗脱液为用PBST溶液)。
第四步，将纳米抗体I22稀释至到100μg/mL，每空加入100μL，37度孵箱中孵育七十分钟。
第五步，设定好洗板机程序，进行洗板，洗5次(洗脱液为用PBST溶液)。
第六步，将Anti-His-HRP(鼠源)的抗体按1：1600稀释，每孔100μL，37度孵箱中孵育七十分钟。
第七步，设定好洗板机程序，进行洗板，洗5次(洗脱液为用PBST溶液)。
第八步，每孔各加入TMB LIQΜID-1COMPENT 100μL，放置在抽屉中反应30分钟，加入3M H2SO4的终止液50μL，将反应终止。
第九步，设定450nm波长，检测各孔OD值。
结果如图21，22。将重组人干扰素α2b标准品作为标准品，重组人干扰素α2b制品作为检测样品进行半定量相关实验，绘制标准曲线R2＝0.999，如图21。将半定量检测重组人干扰素α2b制品试验重复三次，重复性良好，如图22。检测浓度与标示剂量浓度大致相等。
实施例13：第一次纳米抗体I22标记胶体金试纸条
第一步，进行标记蛋白，用10mM的磷酸钾缓冲液在低温下透析蛋白两个小时。
第二步，将1.5mL离心管用超纯水清洗两遍，吸取1mL胶体金缓慢加入管中，向管中加入10μL的0.2M碳酸钾后上下震荡混合，通过磁力搅拌，逐滴加入总量为20μg的纳米抗体I22，混匀后反应40min；
第三步，加入90μL的8％BSA，进行封闭反应40min；
第四步，在14000rpm/min转速下低温离心35min，去掉上清液，用含1％BSA的PBS液洗涤重复此步骤6-8次，保留沉淀；
第五步，用600μL金复溶液将沉淀复溶后铺在7mm×160mm的金垫上进行干燥；
第六步，用PBS稀释液稀释重组人干扰素α2b标准品至浓度为2mg/mL，包被10μL的量。将包被His标签的抗体用PBS稀释液稀释至浓度为1mg/mL，包被10μL的量；进行包被NC膜(设定好点膜仪相关程序)；
第七步，在室温低湿度条件下进行干燥；
第八步，从底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫、样品层析垫，用斩切机切成3.6mm宽的试纸条用以检测应用，对胶体金试纸条的应用进行测试。
结果如图23。纳米抗体I22与胶体金试纸条结合可以实现快速检测，20μg的纳米抗体I22与金标记，试纸条上包被重组人干扰素α2b制品(浓度为2mg/mL，10μL)和anti-Hisantibody(浓度为1mg/mL，10μL),把试纸条放入含有重组人干扰素α2b制品和样品稀释液(阴性对照)进行检测。1号试纸条插入到抗原稀释液中，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。2号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为50ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。3号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为100ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。4号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为500ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。5号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为1000ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)无红色条带，为阳性结果。得出胶体金试纸条的检测限为1μg/mL。目前市场上的重组人干扰素α2b制品的最低浓度为10μg/mL。能满足快速检测重组人干扰素α2b制品的要求。原本需要两天完成的免疫鉴别实验，用胶体金试纸条可以在几分钟就可以完成检测，且不受环境设备等的影响。
实施例14：第二次纳米抗体I22标记胶体金试纸条
步骤与第一次纳米抗体I22标记胶体金试纸条步骤相同。
结果如图24。1号试纸条插入到抗原稀释液中，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。2号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为100ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。3号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为500ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。4号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为1000ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)无红色条带，为阳性结果得出胶体金试纸条的检测限为1μg/mL。与上次实验结果相同。
实施例15：第三次纳米抗体I22标记胶体金试纸条
步骤与第一次纳米抗体I22标记胶体金试纸条步骤相同。
结果如图25。1号试纸条插入到抗原稀释液中，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。2号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为50ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。3号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为100ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。4号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为500ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)有条带，为阴性结果。5号试纸条插入到抗原检测液中，浓度为1000ng/mL，检测线(包被重组人干扰素α2b标准品区)无红色条带，为阳性结果得出胶体金试纸条的检测限为1μg/mL。结论与上两次结果实验相同。

Claims (3)

1.纳米抗体I22在重组人干扰素α2b检测中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：采用纳米抗体I22与胶体金试纸条结合方式对重组人干扰素α2b实现快速检测。
3.权利要求1或2所述应用的纳米抗体I22标记胶体金试纸条，其特征在于：由以下制备方法获得：
第一步，进行标记蛋白，用10mM的磷酸钾缓冲液在低温下透析蛋白两个小时；
第二步，将1.5mL离心管用超纯水清洗两遍，吸取1mL胶体金缓慢加入管中，向管中加入10μL的0.2M碳酸钾后上下震荡混合，通过磁力搅拌，逐滴加入总量为20μg的纳米抗体I22，混匀后反应40min；
第三步，加入90μL的8％BSA，进行封闭反应40min；
第四步，在14000rpm/min转速下低温离心35min，去掉上清液，用含1％BSA的PBS液洗涤重复此步骤6-8次，保留沉淀；
第五步，用600μL金复溶液将沉淀复溶后铺在7mm×160mm的金垫上进行干燥；
第六步，用PBS稀释液稀释重组人干扰素α2b标准品至浓度为2mg/mL，包被10μL的量；将包被His标签的抗体用PBS稀释液稀释至浓度为1mg/mL，包被10μL的量；进行包被NC膜；
第七步，在室温低湿度条件下进行干燥；
第八步，从底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫、样品层析垫，用斩切机切成3.6mm宽的试纸条用以检测使用；
第九部，对胶体金试纸条进行应用测试，得出胶体金试纸条的检测限为1μg/mL，能满足快速检测重组人干扰素α2b制品的要求。
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