CN114245747A - 医疗用途、方法和用途 - Google Patents
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Abstract
描述了抑制微小RNA‑144(miR‑144)的药剂,所述药剂用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状;用于鉴定患有所述肝脏疾病和/或肝脏病状或有患上所述肝脏疾病和/或肝脏病状风险的受试者的方法;预测患有所述肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者对抑制miR‑144的药剂的反应的方法;诊断所述肝脏疾病和/或肝脏病状的方法;药物组合物以及试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂,所述药剂用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状;用于鉴定患有所述肝脏疾病和/或肝脏病状或有患上所述肝脏疾病和/或肝脏病状风险的受试者的方法;预测患有所述肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者对抑制miR-144的药剂的反应的方法;诊断所述肝脏疾病和/或肝脏病状的方法;以及相关的药物组合物和试剂盒。
背景技术
肥胖症是世界范围内的一个主要健康问题,因为体重过重会显著增加多种代谢并发症的风险,包含非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和胰岛素抵抗以及2型糖尿病(T2D)。全世界NAFLD的估计患病率约为25%,但NAFLD和相关病症的实际患病率尚不清楚,这主要是因为缺乏可靠和适用的诊断测试。
肥胖症期间的脂质积聚与肝脏巨噬细胞的氧化应激和炎症活化有关。此外,肝脏中的氧化应激与脂肪肝向NASH、纤维化和肝细胞癌的进展有关。防止氧化应激的主要机制是核因子红细胞2相关因子2(NRF2)/ARE通路,其诱导抗氧化反应基因的表达。不适当的脂质积聚会导致氧化应激和活性氧(ROS)的过量产生。
氧化应激被认为是导致胰岛素抵抗和肥胖症中的NASH的重要驱动因素。NASH是一种全球性负担,预计将成为未来20年肝脏移植的主要原因(S.Furukawa等人,“肥胖症中的氧化应激增加及其对代谢综合征的影响(Increased oxidative stress in obesity andits impact on metabolic syndrome.)”《临床研究杂志(J Clin Invest)》114,1752-1761(2004))。NASH可在多达15%的患者中进展为肝硬化,并且目前尚无经证实对NASH有益的疗法。
以前使用具有抗氧化活性的药剂(如谷胱甘肽、泛素和尿酸或饮食的衍生物,如维生素C和E、类胡萝卜素、硫辛酸、硒)来降低氧化应激的方法通常都失败了。这些外源性抗氧化剂缺乏功效被认为是由于非特异性全身效应和内源性抗氧化反应的降低。
维生素E是一种具有抗氧化活性的亲脂性分子,其防止ROS对膜的损伤。已经在几种NAFLD实验小鼠模型中研究了维生素E的作用,其显示补充维生素E的小鼠中NASH的改善和氧化应激标志物、肝星状细胞活化和组织学纤维化的减少(Nan YM等人,“抗氧化剂维生素E和1-氨基苯并三唑可预防小鼠实验性非酒精性脂肪性肝炎(Antioxidants vitamin Eand 1-aminobenzotriazole prevent experimental non-alcoholic steatohepatitisin mice.)”《斯堪的纳维亚胃肠病学杂志(Scand J Gastroenterol.)》2009;44:1121–1131;Phung N等人,“促氧化剂介导的肝纤维化抗氧化剂干预对小鼠饮食性脂肪性肝炎的影响(Pro-oxidant-mediated hepatic fibrosis and effects of antioxidantintervention in murine dietary steatohepatitis.)”《国际分子医学杂志(Int J MolMed.)》2009;24:171-180;和Pacana T.等人,“维生素E和非酒精性脂肪性肝病(Vitamin Eand nonalcoholic fatty liver disease.)”《临床营养和代谢护理的最新观点(CurrOpin Clin Nutr Metab Care.)》2012;15:641-648)。
此外,维生素E或维生素E与其它药物的组合对经活检证实的NASH患者的肝损伤的影响已在一些小型研究中进行了调查,但观察到了相互矛盾的结果(Sanyal AJ等人,“用于非酒精性脂肪性肝炎的吡格列酮、维生素E或安慰剂(Pioglitazone,vitamin E,orplacebo for nonalcoholic steatohepatitis.)”《新英格兰医学杂志(N Engl J Med.)》2010;362:1675-1685;Harrison SA等人,“维生素E和维生素C治疗可改善非酒精性脂肪性肝炎患者的纤维化(Vitamin E and vitamin C treatment improves fibrosis inpatients with nonalcoholic steatohepatitis.)”《美国胃肠病学杂志(Am JGastroenterol.)》2003;98:2485-2490;和Dufour JF等人,“熊去氧胆酸与维生素E在非酒精性脂肪性肝炎中的随机安慰剂对照试验(Randomized placebo-controlled trial ofursodeoxycholic acid with vitamin E in nonalcoholic steatohepatitis.)”《临床胃肠病学与肝病学(Clin Gastroenterol Hepatol.)》2006;4:1537-1543)。
最近,两项大型多中心随机对照试验调查了维生素E在NAFLD受试者中的功效。在“PIVENS”试验中,在患有侵袭性NASH且没有糖尿病或肝硬化的成年患者中,与吡格列酮或安慰剂治疗组相比,高剂量维生素E补充剂(800UI q.d.)显著改善NASH组织学;然而,据报道,胰岛素抵抗和血浆甘油三酯水平增加(Sanyal AJ等人,2010)。相比之下,“TONIC”试验发现,在实现儿童NAFLD患者ALT水平持续降低的主要结果方面,维生素E和二甲双胍均不优于安慰剂(Lavine JE等人,“维生素E或二甲双胍治疗儿童和青少年非酒精性脂肪性肝病的效果:TONIC随机对照试验(Effect of vitamin E or metformin for treatment ofnonalcoholic fatty liver disease in children and adolescents:the TONICrandomized controlled trial.)”《美国医学协会杂志(JAMA.)》2011;305:1659-1668)。
因此,尽管有一些关于补充维生素E在NAFLD/NASH中的功效的报道,但对其安全性存在担忧。此外,在将抗氧化剂的作用解释为完全或甚至主要是由于化合物的抗氧化性质时,需要谨慎。一个相关的问题是即使是公认的抗氧化剂化合物的非标准剂量。如维生素E、维生素C和辅酶Q等药剂发挥作用,因为它们是单电子受体,但也可以充当具有高反应性的单电子供体。在高浓度下,维生素C和辅酶Q都可以成为促氧化剂,并有可能导致肝损伤(Abudu N等人,“人体动脉硬化中的维生素,重点强调维生素C和维生素E(Vitamins inhuman arteriosclerosis with emphasis on vitamin C and vitamin E.)”《临床化学学报(Clin Chim Acta.)》2004;339:11-25)。
缺乏有益影响,并且在一些情况下,观察到有害影响突出了新治疗方法的重要性。此外,目前的肝脏疾病诊断涉及侵入性技术,并且因此可以诊断氧化应激并鉴定易患胰岛素抵抗、2型糖尿病、NASH和肝细胞癌的患者的非侵入性技术将是有益的。
发明内容
在此背景下,发明人惊奇地发现,肝脏中特定的微小RNA(miRNA),即miR-144的沉默通过增加抗氧化反应来降低肝脏中的氧化应激。因此,发明人的发现鉴定了一种用于肝脏疾病和/或肝脏病状的新型疗法。靶向内源性抗氧化反应(而不是使用最终阻断内源性反应的外源性抗氧化剂)为肝脏胰岛素抵抗和NASH提供了一种有吸引力的疗法。
此外,发明人惊奇地发现,可以容易地测量这种miRNA,用于诊断易患肝脏疾病和/或肝脏病状(如NASH)的肝脏氧化应激。
因此,在第一方面,本发明提供了一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂,所述药剂用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状。
在第二方面,本发明提供了一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂在制备用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的药物中的用途。
在第三方面,本发明提供了一种用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的方法,其中所述方法包括向所述受试者施用抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂。
如本文所述,发明人惊奇地发现,肝脏中的核因子红细胞2相关因子2(NRF2)受由肝脏巨噬细胞并在肥胖胰岛素抵抗患者血液中高水平表达的miRNA(miR-144)调节。肥胖小鼠肝脏巨噬细胞中miR-144的特异性沉默增加了NRF2蛋白质水平,从而导致巨噬细胞和肝细胞释放的ROS减少,并且氧化应激和葡萄糖耐受性总体降低。
如所附实例所述,抗氧化防御在肥胖胰岛素抵抗患者的肝脏中无效,但在苗条或肥胖的胰岛素敏感个体中有效。这是由于与健康对照组相比,肥胖胰岛素抵抗人类和小鼠的肝脏中的核因子红细胞2相关因子2(NRF2)蛋白质水平显著降低。
核因子红细胞2相关因子2(NRF2;也被称为“NFE2L2”和“Nrf2”)是一种碱性亮氨酸拉链转录因子和氧化还原稳态的主要调节剂。在正常生理条件下,NRF2通过与Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)的结合而靶向蛋白酶体降解。相反,在氧化应激下,这种复合物解离,并且NRF2转移到细胞核,在所述细胞核处其与抗氧化反应元件(ARE)结合,从而驱动抗氧化反应。
miRNA是小的(通常为17个到27个核苷酸)非编码RNA,其通过影响mRNA的稳定性和翻译,参与多细胞生物中基因表达的转录后调节。miRNA各自由较长的前体RNA分子(“前体miRNA”)加工而成。前体miRNA是从非蛋白质编码基因转录而来的。前体可以具有至少50个、60个、66个、70个、75个、80个、85个、100个、150个、200个或更多个核苷酸的长度。前体miRNA有两个互补区域,所述两个互补区域可以形成茎环或折回样结构,所述结构在动物中被名为Dicer和Drosha的酶切割。Dicer和Drosha是核糖核酸酶Ill样核酸酶。加工后的miRNA通常是茎的一部分。
加工后的miRNA(也被称为“成熟的miRNA”)被整合到被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的大型复合物中,并且在动物中,基于miRNA的基因调节主要通过以下过程发生:成熟的miRNA通过部分碱基配对与mRNA靶位点结合,从而导致靶mRNA的翻译抑制或不稳定。
术语“微小RNA”或“miRNA”包含长度为至少约6个核苷酸的单链或双链非编码RNA,其可以通过降解靶mRNA或抑制其翻译来调节转录后水平的基因表达。
miR-144是一种由肝脏巨噬细胞并在肥胖胰岛素抵抗患者血液中高水平表达的miRNA。miR-144的生物学活性或生物学作用是指在体内(即在蛋白质的天然生理环境中)或体外(即在实验室条件下)测量或观察到的由天然存在的和/或野生型形式的miR-144表现或执行的任何功能。
miR-144的生物学活性包含但不限于降低其靶NRF2的蛋白质水平,并因此降低NRF2靶基因的表达(如表3(S9)中的那些)。
miR-144的生物学活性可以通过本领域已知的方法测量,包含但不限于通过蛋白质印迹和/或使用针对NRF2的抗体的ELISA测量NRF2蛋白质水平、通过实时PCR测量NRF2靶基因和/或通过检测如本文所公开的活性氧来测量氧化应激。
“抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂”包含抑制(例如,下调、拮抗、抑制、减少、预防、降低、阻断和/或逆转)miR-144的表达和/或生物学活性和/或作用的任何化合物的含义。更具体地说,抑制剂可以以这样的方式起作用,使得miR-144的生物学活性以与miR-144的天然、野生型作用拮抗(例如,对抗、逆转、相反)的方式降低。
在优选的实施例中,所述药剂是细胞可渗透的,不能快速排泄,在体内是稳定的,并且以高特异性和亲和力与miR-144结合。
在一个实施例中,所述药剂可以是选择性抑制miR-144的药剂。例如,所述药剂可以抑制和/或降低miR-144的表达和/或生物学活性,其程度大于其抑制无关miRNA(如miR-532)的程度。如所附实例所示,用安塔够妙(antagomiR)药剂沉默miR-144对miR-532没有影响。优选地,所述药剂抑制和/或降低miR-144的表达和/或生物学活性的程度是其抑制另一种无关miRNA的至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。更优选地,所述药剂抑制和/或降低miR-144的表达和/或生物学活性的程度是其抑制另一种无关miRNA的至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
“治疗(treating或treatment)”包含以改善或稳定受试者的疾病的方式施用疗法以逆转、减少、减轻、阻止或治愈特定病症、疾病、损伤或病状的症状、临床体征和/或潜在病理学。因此,治疗是指将药剂施用于有需要的患者,期望他们将获得治疗益处。
在受试者中“治疗(treating或treatment)”其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状包含改善以下一项或多项:肝细胞死亡、免疫细胞浸润和/或纤维化。在本发明的上下文中,治疗可以包含上调受试者肝脏中的抗氧化反应。因此,可以在不治愈特定疾病或病状而是优选地涵盖包含以下一项或多项的结果的情况下实现治疗益处:疾病或病状的减轻、与疾病或病状相关的症状的减少、疾病或病状的消除、由原发性疾病或病状的发生引起的继发性疾病或病状(例如,由NASH的进展引起的肝细胞癌)的预防或减轻,和/或疾病或病状的预防。治疗益处可以由本领域普通技术人员和/或由正在治疗受试者的受过训练的临床医生评估。
术语“预防”是本领域公认的,并且当关于如肝脏疾病和/或肝脏病状或任何其它医学病状等病状使用时,其包含施用一种药剂/组合物,相对于未接受所述分子/组合物的个体,所述药剂/组合物减少受试者中特定病症、疾病、损伤或医学病状的症状、临床体征和/或潜在病理学的频率或延迟其发作。术语“预防性”治疗是本领域公认的,并且可以与“预防(preventing和prevention)”互换使用。“预防性治疗”包含在不良病状(例如NASH)的临床表现之前施用分子/化合物(即,其保护个体免于发展出不良病状),而如果在不良病状的表现之后施用,则治疗是治疗性的(即,其旨在减少、改善或稳定现有的不良病状或相关的副作用)。
在本发明的上下文中,“预防”肝脏疾病和/或肝脏病状还可以包含防止一种形式的肝脏疾病和/或肝脏病状进展为更严重的肝脏疾病和/或病状。
在一个实施例中,以治疗有效量向患有或疑似患有或易患其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者(包含人)施用治疗有效量的药剂。
“治疗有效量”是指可以向患有或疑似患有或易患其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者(包含人)提供治疗性、姑息性或预防性缓解的量。应当理解,药剂的治疗有效量将是能够抑制受试者中微小RNA-144的表达和/或生物学活性的量。
术语“患有或疑似患有或易患”表明,相对于此类受试者的一般人群,受试者已被确定为或被怀疑为患如本文所定义的肝脏疾病和/或肝脏病状的风险增加。
例如,受试者可能具有个人和/或家族病史,包含频繁发生的特定疾病或病症,例如,肥胖症可能是如本文所定义的肝脏疾病和/或肝脏病状发展的促成因素。作为另一个实例,受试者可能具有通过本发明的方法确定的这种易感性,所述方法包含确定miR-144的表达和/或生物学活性。
“受试者”包含需要治疗和/或预防本文所述疾病或病状的患者或个体的含义。所述受试者可以是脊椎动物,如脊椎动物哺乳动物。
在一个实施例中,所述受试者选自包括以下的组:灵长类动物(例如,人;猴子;猿);啮齿动物(例如,小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、沙鼠、兔子);犬科动物(例如,狗);猫科动物(例如,猫);马(例如,马);牛(例如,母牛);和/或猪(例如,猪)。
最优选地,所述受试者是人类受试者。
如本文所使用的,术语“氧化应激”是对活性氧ROS(也被称为“自由基”)的产生与抗氧化防御之间平衡的干扰。氧化应激可以通过本领域已知的、如本文所述的以及如所附实例中所述的方法测量。
由于正常的细胞代谢和环境因素(如空气污染物或香烟烟雾),活生物体会产生活性氧(ROS)。ROS是高反应性分子,并且可以破坏如碳水化合物、核酸、脂质和蛋白质等细胞结构并改变其功能。氧化剂和抗氧化剂之间的平衡向有利于氧化剂的转变被称为“氧化应激”。还原和氧化(氧化还原)状态的调节对于细胞活力、活化、增殖和器官功能至关重要。好氧生物具有整合的抗氧化系统,所述系统包含酶和非酶抗氧化剂,它们通常能有效阻断ROS的有害影响。然而,在病理情况下,抗氧化系统可能会不堪重负(Birben E.,“氧化应激和抗氧化防御(Oxidative stress and antioxidant defense)”,《世界过敏器官杂志(WorldAllergy Organ Journal)》,2012,5(1):9-19)。
“其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状”包含其中至少部分病理学由氧化应激介导的任何肝脏生物学或医学病状或病症的含义。还包含了疾病的主要部位是肝脏。肝脏疾病和/或肝脏病状可能是由氧化应激引起的,或者可以简单地以氧化应激为特征。氧化应激可能通过产生引起病理学的产物(例如ROS)而直接起作用,和/或氧化应激可能通过改变抗氧化反应基因的表达以引起病理学而间接起作用。氧化应激导致DNA损伤、脂质过氧化,从而导致质膜双层破坏、蛋白质片段化和信号传导中断。所有这些影响都会导致肝脏细胞死亡、炎症和纤维化,这是如NASH和肝硬化等肝脏疾病的标志。因此,预期减少氧化应激将预防、改善或治疗如此表征的病状。
下面描述了特定肝脏疾病和/或肝脏病状的实例。
优选地,药剂降低肝脏细胞中的miR-144表达和/或活性。
“miR-144表达”包含miR-144的水平、数量、浓度或丰度。术语“表达”还可以指miR-144的量、浓度的变化率。表达可以例如通过miR-144的量或合成速率来表示。该术语可用于指代样品中miR-144的绝对量或miR-144的相对量,包含在稳态或非稳态条件下确定的量或浓度。表达也可以指与miR-144的量、浓度或变化率相关的测定信号。可以相对于对照样品中的miR-144水平确定miR-144的表达。
核苷酸序列的表达水平(或编码的miRNA分子,例如miR-144,的稳态水平)的降低优选地是,与对照(如健康受试者)中相应核苷酸序列的表达水平(或相应编码的miRNA分子或其等价物或来源的稳态水平)相比,使用如本文所述的方法可检测到的核苷酸表达水平(或编码的miRNA分子的稳态水平或miR-144的生物学活性的任何可检测的变化)的降低。
可以使用本领域已知的任何技术进行miR-144表达的检测。对miR-144的表达水平或存在的评估优选地使用合适的测定法进行,如实时(RT)定量PCR(RT-qPCR)、微阵列、珠阵列、原位杂交和/或Northern印迹分析。
优选地,肝脏细胞中miR-144表达的降低包含,与使用合适的方法在不存在抑制剂的情况下肝脏细胞中miR-144的表达相比,肝脏细胞中miR-144的表达降低至少10%。更优选地,肝脏细胞中miR-144表达的降低是指,与使用合适的方法在不存在抑制剂的情况下肝脏细胞中miR-144的表达相比,降低至少15%,甚至更优选,至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%。在这种情况下,肝脏细胞中没有可检测到的miR-144表达。
在一个实施例中,与使用合适的方法在不存在抑制剂的情况下肝脏细胞中miR-144的表达相比,所述药剂将肝脏细胞中miR-144的表达降低至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。更优选地,与使用合适的方法在不存在抑制剂的情况下肝脏细胞中miR-144的表达相比,所述药剂将肝脏细胞中miR-144的表达降低至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
“miR-144活性”包含miR-144的生物学活性或生物学作用,并且这是指在体内(即在蛋白质的天然生理环境中)或体外(即在实验室条件下)测量或观察到的由天然存在的和/或野生型形式的miR-144表现或执行的任何功能。
在一个实施例中,所述药剂可以是与在不存在抑制剂的情况下miR-144的生物学活性相比,将肝脏细胞中miR-144的生物学活性降低至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍的药剂。更优选地,与在不存在抑制剂的情况下肝脏细胞中miR-144的生物学活性相比,所述药剂将肝脏细胞中miR-144的生物学活性降低至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
在一个实施例中,使用针对miR-144活性的特异性测定法来量化miR-144活性的降低。优选的测定法是RT-qPCR。
在优选的实施例中,所述药剂是与miR-144结合以抑制miR-144的生物学活性的药剂。更优选地,所述药剂是与miR-144选择性结合的药剂。
“选择性结合”到miR-144的药剂包含以下含义:药剂与miR-144结合的亲和力高于与无关miRNA(如miR-532)结合的亲和力。优选地,药剂以比与无关miRNA结合的亲和力高至少5倍、或至少10倍或至少50倍的亲和力与miR-144结合。更优选地,药剂以比与无关miRNA结合的亲和力高至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍的亲和力与miR-144结合。这种结合可以通过本领域熟知的方法确定,包含RNA荧光原位杂交(FISH)、RNA荧光体内杂交(FIVH)、表面等离子体共振(SPR)、电泳迁移率变动分析以及交联、连接和杂交物测序(CLASH)。
应当理解,在药剂与miR-144结合之后对miR-144的抑制可以被称为“直接抑制”。直接抑制的实例是miRNA分子与反义RNA(即与miRNA分子具有反向互补序列的RNA)相互作用,从而形成双链体,所述双链体导致miRNA分子降解。
在一个实施例中,所述药剂不与miR-144结合以抑制miR-144的生物学活性。应当理解,这可以被称为“间接抑制”。间接抑制的实例是抑制参与miRNA分子的转录和/或加工从而导致其表达降低的蛋白质。
在一个实施例中,miR-144表达的下调优先发生在肝脏细胞中。
优选地,将药剂递送至肝脏细胞。
“递送至肝脏细胞”包含:药剂靶向肝脏细胞并将在肝脏细胞中具有活性。优选地,将药剂选择性地递送至肝脏细胞。例如,如果将药剂选择性地递送至肝脏细胞,则与不同器官(例如,脑或肾)的细胞相比,肝脏细胞将在更大程度上选择性地含有药剂。因此,在将药剂递送至肝脏细胞后,miR-144将在肝脏细胞中被抑制,而不影响miR-144在其它器官(如脑)的细胞中的表达和/或活性。
因此,优选地,药剂的递送是通过局部递送。“局部递送”包含将药剂直接递送至生物体内的靶标部位。例如,可以通过直接注射到肝脏中来局部递送化合物。
本发明的药剂包含但不限于安塔够妙、反义寡核苷酸、抑制性RNA分子或miR-144表达和/或活性的其它调节剂,其可以通过本领域技术人员已知的适合递送至肝脏的任何方法施用,如以下文献中所述的方法:Juliano R.L.,“治疗性寡核苷酸的递送(Thedelivery of therapeutic oligonucleotides)”,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,2016;44(14):6518-6548。
在一个实施例中,在施用后24小时、48小时、72小时和/或96小时可检测到药剂(如核酸药剂)在肝脏细胞中的存在。在一个实施例中,在施用后24小时、48小时、72小时和/或96小时可检测到miR-144表达的下调。
优选地,肝脏细胞是吞噬性肝脏细胞、肝细胞、内皮细胞和/或嗜中性粒细胞。
肝脏由多种细胞类型组成。
肝细胞呈多面体形状,直径大小从12到25μm不等,并且每个细胞中含有一个或有时含有两个不同的细胞核。肝细胞占所有肝脏细胞的60%–80%,并且它们执行肝脏的代谢、生物合成、解毒和胆汁分泌功能。
血窦由内皮细胞、吞噬性枯否细胞、星状细胞(Ito细胞)和凹坑细胞构成。
肝脏巨噬细胞或枯否细胞负责通过清除细菌和死细胞等病原体来为肝脏解毒。它们还有助于胆汁酸的形成(Jager J.,“肝脏先天免疫细胞和胰岛素抵抗:枯否细胞的多个方面(Liver innate immune cells and insulin resistance:the multiple facets ofKupffer cells.)”,《内科杂志(J Intern Med.)》2016年8月;280(2):209-20)。它们还可以直接调节肝细胞中的胰岛素信号传导(Morgantini C.,“肝脏巨噬细胞通过非炎症因子调节全身代谢(Liver macrophages regulate systemic metabolism through non-inflammatory factors)”,2019,《自然代谢(Nature Metabolism》1,445–459)
肝脏的内皮细胞包含肝窦内皮细胞(LSEC),它是肝脏中最丰富的非实质细胞。LSEC是高度专业化和独特的血管内皮细胞,因为它们缺乏基底膜,并且有大量的窗孔来调节大分子(包含脂质和脂蛋白)跨血窦的运输。
中性粒细胞(也被称为中性粒细胞)是大多数哺乳动物中最丰富的粒细胞类型和最丰富的(60%到70%)白细胞类型。它们构成先天免疫系统的重要组成部分。中性粒细胞是一种吞噬细胞并且通常在血流中发现。在炎症的开始(急性)阶段,中性粒细胞是炎症细胞向炎症部位迁移的第一应答者之一。它们在被称为趋化性的过程中通过血管迁移。已经表明,中性粒细胞不适当的活化和归巢到微脉管系统会导致多种肝脏疾病的病理学表现,如病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化和肝硬化。(Xu R等人,“中性粒细胞在肝脏疾病发展中的作用(The role of neutrophils in the development of liverdiseases)”,《细胞分子免疫学(Cell Mol Immunol.)》2014年5月;11(3):224–231)。
树突状细胞(DC)是哺乳动物免疫系统的抗原呈递细胞(也被称为辅助细胞)。它们的主要功能是处理抗原物质并将其在细胞表面呈递给免疫系统的T细胞。它们充当先天免疫系统和适应性免疫系统之间的信使。肝脏中的DC在监测门静脉循环方面具有独特的优势,它们对于调节对血源性病原体的反应、肝脏免疫耐受、肝脏稳态和纤维化至关重要。(Rahman A.,“树突状细胞和肝纤维化(Dendritic Cells and Liver Fibrosis)”,《生物化学与生物物理学学报(Biochim Biophys Acta.)》2013年7月;1832(7):998–1004)
在一个实施例中,吞噬性肝脏细胞是肝脏巨噬细胞(LM)。
在一个实施例中,将药剂递送至肝脏细胞导致肝脏细胞,例如吞噬细胞、肝细胞、内皮细胞和/或嗜中性粒细胞中的miR-144表达和/或活性降低。
从随附的实例中可以看出,使用葡聚糖封装的RNAi粒子(GeRP)技术,所述技术在LM中特异性递送siRNA并使基因沉默,而不影响肝脏或身体其它部位的其它细胞中的基因表达,发明人发现,选择性地使LM中的miR-144沉默足以通过拯救肥胖小鼠中的NRF2而减少LM和肝细胞的ROS释放,并最终减少在整个肝脏中积聚。后一种结果令人惊讶,因为GeRP无法被递送到非吞噬细胞(如肝细胞),但被认为是LM和肝细胞之间的串扰。从随附的实例中可以看出,LM中miR-144的选择性敲低导致肝细胞中miR-144转录的减少。
不受理论的束缚,发明人假设在所有肝脏细胞中靶向miR-144将是有益的。例如,在NASH中观察到的炎症的一个突出特征是中性粒细胞积聚,并且肝脏中性粒细胞功能障碍已被描述为与几种肝脏疾病有关,包含非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌(Xu R等人,《细胞分子免疫学)》2014年5月;11(3):224-31)。此外,内皮细胞已被证明有助于NAFLD/NASH中的氧化应激(Matsumoto M等人,《自由基生物学与医学(Free Radic Biol Med.)》2018年2月1日;115:412-420;和Peters KM等人,《脂质学最新观点(Curr Opin Lipidol.)》2018年10月;29(5):417-422)。
在一个实施例中,氧化应激是由肥胖症、酒精、环境污染物和/或如抗炎药、抗镇痛药、抗癌药和/或抗抑郁药等药物诱导的。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激是由肥胖症诱导的。应当理解,如果受试者的体重指数超过30,则将其归类为肥胖。脂肪肝是由于肥胖症相关的胰岛素抵抗中脂肪组织的脂肪储存能力较低而导致的过量脂质积聚的结果。肝脏无法处理这种脂肪超载会导致异常的脂质过氧化、活性氧(ROS)的过量产生和氧化应激。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激是由酒精诱导的。过量产生的自由基被认为在酒精引起的损伤的许多通路中起着核心作用。自由基可以导致氧化应激,其特征在于自由基产生和自由基清除之间的平衡受到干扰,包含修复受损分子。自由基是含有至少一个不成对电子的原子簇。因此,已知酒精会诱导氧化应激(Wu D.等人,《胃肠病学和肝病杂志(J Gastroenterol Hepatol.)》2006年10月;21增刊3:S26-9)。
在一个实施例中,氧化应激是由环境污染物诱导的。汞等环境污染物会增加细胞内活性氧的含量并诱导氧化应激,从而导致组织损伤效应,因为这种金属的毒性与超氧化物的产生和谷胱甘肽(GSH)的消耗有关(Bando I等人,《生物化学与分子毒理学杂志(JBiochem Mol Toxicol.)》2005;19(3):154-61)。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激是由包含抗炎药、抗镇痛药、抗癌药和/或抗抑郁药在内的药物诱导的。包含抗炎药、抗镇痛药、抗癌药和/或抗抑郁药在内的几种药物,如柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、唑来膦酸(Zoledronic acid)、扑热息痛(Paracetamol)、吗啡(Morphine)、多柔比星(Doxorubicin)、紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)、尼美舒利(Nimesulide)、氟西汀(Fluoxetine)/氯氮平(clozapine)和异烟肼(Isoniazid)均与诱导氧化应激有关(Linares V等人,《毒理学(Toxicology.)》2009年2月27日;256(3):152-6;Karabulut AB等人,《移植学会会报(Transplant Proc.)》2010年11月;42(9):3820-2;D等人,《食品和化学毒理学(Food Chem Toxicol.)》2009年4月;47(4):866-70;Samarghandian S等人,《国际临床与实验医学杂志(Int J Clin ExpMed.)》2014年5月15日;7(5):1449-53;A等人,《医学进展(Adv Med Sci.)》2013;58(1):104-11;Kale VM等人,《化学毒理学研究(Chem Res Toxicol.)》2010年5月17日;23(5):967-76;J等人,《欧洲药学杂志(Eur J Pharm Sci.)》2014年8月1日;59:20-30;Shuhendler AJ等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》2014年4月;32(4):373-80)。
优选地,氧化应激是肝脏细胞中的氧化应激。
优选的肝脏细胞包含上述那些,即吞噬细胞(如巨噬细胞)、肝细胞、内皮细胞和嗜中性粒细胞。
因此,在一个实施例中,肝脏细胞中的氧化应激是由肥胖症、酒精、环境污染物和/或如抗炎药、抗镇痛药、抗癌药和/或抗抑郁药等药物诱导的。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激的特征在于以下至少一项:
a)增加的脂质过氧化;
b)活性氧(ROS)增加和/或积聚;
c)降低的核因子红细胞2相关因子2(NRF2)活性和/或蛋白质水平;和/或
d)增加的miR-144的表达和/或活性。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激的特征在于增加的脂质过氧化。增加的脂质过氧化是氧化应激的常见标志物,其中例如。“脂质过氧化”包含这样一个过程,在所述过程中,如自由基等氧化剂攻击含有碳-碳双键的脂质,尤其是多不饱和脂肪酸。脂质过氧化可以通过本领域已知的并且如所附实例中所述的方法测量,例如通过测量丙二醛(MDA),一种在脂质过氧化过程中产生的反应性醛(参见例如来自Abcam的测定试剂盒;ab118970))。应当理解,如果与对照样品(如来自健康和/或苗条受试者)相比,测试样品(例如来自肥胖受试者)中的脂质过氧化增加,则这可能表明存在氧化应激。
在一个实施例中,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的脂质过氧化相比,脂质过氧化增加了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的脂质过氧化相比,脂质过氧化增加了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激的特征在于活性氧增加和/或积聚。“活性氧(ROS)”,也被称为“自由基”和“氧自由基”,包含一种不稳定的分子,其含有氧气并且很容易与细胞中的其它分子发生反应。细胞内ROS的积聚可能对DNA、RNA和蛋白质造成损害,并可能导致细胞死亡。ROS增加和/或积聚可以通过本领域已知的并且如所附实例中所述的方法测量,例如细胞内ROS可以通过OxiSelectTM体外ROS/RNS测定试剂盒(NordicBiosite;STA-347)测量并且细胞外ROS可以通过AmplexTM Red过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒(ThermoFisher;A22188)测量。应当理解,如果与对照样品(如来自健康和/或苗条受试者)相比,测试样品(例如来自肥胖受试者)中的ROS水平增加,则这可能表明存在氧化应激。
在一个实施例中,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的ROS相比,受试者中的ROS增加了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的ROS相比,ROS增加了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激的特征在于降低的核因子红细胞2相关因子2(NRF2)活性和/或蛋白质水平。如上所述,NRF2,也被称为“NFE2L2”和“Nrf2”,是一种碱性亮氨酸拉链转录因子,是氧化还原稳态的主要调节剂。在正常生理条件下,NRF2通过与Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)的结合而靶向蛋白酶体降解。相反,在氧化应激下,这种复合物解离,并且NRF2转移到细胞核,在所述细胞核处其与抗氧化反应元件(ARE)结合,从而驱动抗氧化反应。用于测量NRF2的蛋白质水平的方法包含本领域已知的并且如所附实例中所述的方法,例如使用NRF2抗体(Abcam;ab62352)通过蛋白质印迹,或使用针对NRF2的抗体使用染色质免疫沉淀(ChIP)检查其与特定抗氧化反应元件(ARE)DNA区域的结合。NRF2是一种转录因子,并且可以通过RTqPCR测量其靶基因(包含但不限于Nqo1、Hmox1、Ces2g和Gstp1)的表达来分析其活性。如果NRF2是活跃的,则其靶基因的表达就会增加。应当理解,如果与对照样品(如来自健康和/或苗条受试者)相比,测试样品(例如来自肥胖受试者)中的NRF2活性和/或表达降低,则这可能表明存在氧化应激。
用H2O2处理的健康细胞也可用作对照,其诱导氧化应激和抗氧化反应/NRF2活化。由于健康细胞具有正常的抗氧化反应,NRF2将在存在H2O2的情况下被活化(参见图4H-K,其显示用H2O2处理的人肝球体或人非实质细胞表现出NRF2靶基因的表达增加,如通过RTqPCR所测量的)。
从所附实例中可以看出,发明人在诱导型肥胖症模型中观察到肝脏巨噬细胞、肝细胞和整个肝脏中的NRF2蛋白质水平降低。然而,令人惊讶的是,NRF2 mRNA水平和转录在诱导型肥胖症模型中保持不变。
在一个实施例中,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的NRF2活性和/或蛋白质水平相比,受试者中的NRF2活性和/或蛋白质水平降低了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的NRF2活性和/或蛋白质水平相比,NRF2活性和/或蛋白质水平降低了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。“NRF2蛋白质水平”包含NRF2的表达、量、浓度或丰度。术语“水平”还可以指NRF2的量、浓度的变化率。表达可以例如通过NRF2蛋白质的量或合成速率来表示。该术语可用于指代样品中NRF2的绝对量或NRF2的相对量,包含在稳态或非稳态条件下确定的量或浓度。可以相对于对照样品中的NRF2水平确定NRF2蛋白质水平。
在一个实施例中,肝脏中的氧化应激的特征在于增加的miR-144表达和/或活性。术语“表达”如本文所定义。用于测量miR-144表达的方法包含本领域已知的并且如所附实例中所述的方法,例如通过使用RT-qPCR。用于测量miR-144活性的方法包含本文所述的方法。应当理解,如果与对照样品(如来自健康和/或苗条受试者)相比,测试样品(例如来自肥胖受试者)中的miR-144活性和/或表达增加,则这可能表明存在氧化应激。
在一个实施例中,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的miR-144表达和/或活性相比,受试者中的miR-144表达和/或活性增加了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与对照受试者(如苗条和/或健康受试者)中的ROS相比,miR-144表达和/或活性增加了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
如所附实例中所述,miR-144表达由GATA4介导。不受理论的束缚,发明人假设ROS作为辅助信使以将ERK和GATA4活化,从而导致miR-144的表达增加。因此,应当理解,测量ERK和GATA4的活化可能是miR-144表达增加的指示。GATA4和ERK活化可以通过本领域已知的方法测量,并且如实例中所述。
在一个实施例中,氧化应激的特征在于(b)-(d)中的任一个。
如所附实例中所述,当miR-144被诱导时,NRF2蛋白质水平降低,因为NRF2是miR-144的直接靶标。因此,应当理解,如果miR-144水平高且ROS水平增加,则不需要测量NRF2。此外,氧化应激会增加miR-144水平,例如通过过量的ROS积聚和/或产生,因此,miR-144的增加可以反映肝脏氧化应激。
在一个实施例中,其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状选自包括以下的组:非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、纤维化、肝硬化、肝细胞癌(HCC)和/或由酒精、环境污染物和/或如抗炎药、抗镇痛药、抗癌药和/或抗抑郁药等药物诱导的肝损伤。
在一个实施例中,受试者表现出胰岛素抵抗和肥胖症中的至少一种。
“胰岛素抵抗”包含胰岛素靶组织无法对胰岛素作出反应。在脂肪组织中,胰岛素不能诱导葡萄糖摄取和脂质储存,也不能阻止脂质释放;在肌肉中,胰岛素不能诱导葡萄糖摄取;在肝脏中,胰岛素不能阻止肝脏葡萄糖的产生。胰岛素敏感性可以通过本领域已知的方法来评估,如通过稳态模型评估(HOMA-IR),如实例中所述。一般来说,胰岛素抵抗也可以通过以下任何测量结果来诊断:
-使用HOMA-IR评估后超过2的值
-口服葡萄糖耐量测试期间2小时的葡萄糖值:140到199mg/dL
-HbA1c循环水平:5.7%到6.4%
所有这些测量结果的组合通常用于临床。
“非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)”包含以肝脏中脂肪堆积为特征的疾病状态,所述脂肪堆积通常在肥胖个体中观察到。包含了一种以肝脏脂肪炎症为特征的病状,所述肝脏脂肪炎症不是由于过度饮酒(例如,饮酒量超过20克/天)所致。在某些实施例中,NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征有关。
“非酒精性脂肪性肝炎(NASH)”包含以炎症和肝脏中脂肪和纤维组织的积聚为特征的病状,这不是由于过度饮酒所致。NASH是一种常见的肝脏疾病,其组织学特征为肝脏脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变;在多达15%的患者中,其会进展为肝硬化。目前还没有经证明对NASH有益的疗法。所述疾病与胰岛素抵抗和代谢综合征的特征密切相关,如肥胖症、高甘油三酯血症和2型糖尿病(Sanyal AJ等人,2010)。NASH是NAFLD的一种极端形式。
尽管脂质积聚失调发生在非酒精性脂肪性肝病光谱中,但肝细胞损伤的特征,肝细胞气球样变、细胞骨架变化(Mallory-Denk小体)和肝细胞凋亡,主要发生在NASH中,并将NASH与简单的脂肪变性区分开来。
“纤维化”包含细胞外基质蛋白(包含肝脏中的胶原蛋白)的过度积聚。
“肝硬化”包含肝脏瘢痕形成(纤维化)的晚期。
“肝细胞癌(HCC)”包含主要发生在患有潜在慢性肝病和肝硬化的患者中的肝脏原发性恶性肿瘤。HCC现在是全球癌症死亡的第三大原因,超过500,000人受到影响。大多数抗癌药物对HCC无效。用于诊断HCC的方法包含超声、成像(CT扫描和MRI),但最准确的是肝活检后的病理学。目前针对HCC的治疗选项包含肝脏移植、切除癌症的手术、化学疗法和/或放射疗法。
本领域技术人员可以诊断如NASH、NAFLD、纤维化和肝硬化等肝脏病状,并且可以包含回顾病史、体检和各种测试。可以查看病史以了解风险因素,如体重/肥胖症、胰岛素抵抗、高水平的甘油三酯或血液中异常水平的胆固醇、代谢综合征和/或2型糖尿病。身体症状,包含肝脏肿大、胰岛素抵抗迹象(如指关节、肘部和膝盖上的皮肤变黑斑)和/或肝硬化迹象(如黄疸,这种情况会导致您的皮肤和眼白变黄),可以提示肝脏疾病。用于诊断肝脏疾病的其它方法包含用于肝酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血液测试。用于诊断肝脏疾病的其它方法包含影像学检查,包含腹部超声、磁共振成像(MRI)、瞬时弹性成像、计算机断层扫描(CT)、超声弹性成像、MR弹性成像(MRE)。
以上都不是特别准确,并且非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的诊断是通过肝活检中特定组织学异常的存在和模式来定义的。病理学家观察脂肪、坏死性炎症和纤维化的组织学和评分。NASH(是或否)、纤维化(F0到F4,F0为单纯性脂肪堆积,F4为严重纤维化/肝硬化)。一种对非酒精性脂肪性肝病(NA)的特征进行评分的单独系统被称为NAFLD活性评分(NAS),其在本领域中是众所周知的,并且被开发为在治疗性试验期间测量NAFLD变化的工具。然而,一些研究使用NAS的阈值,特别是NAS≥5,作为NASH的组织学诊断的替代指标(即在没有肝活检的情况下)。
目前肝脏疾病的治疗因病因而异。医生通常会推荐旨在预防或延缓纤维化进展的治疗,如饮食改变、抗炎药物和胰岛素抵抗药物、胆固醇和糖尿病管理、运动和减肥和/或戒酒。
在本发明的上下文中,“预防”肝脏疾病和/或肝脏病状还可以包含防止NAFLD或NASH的进展(例如防止进展为纤维化和/或癌症)。在本发明的上下文中,预防还包含上调受试者肝脏中的抗氧化反应。预防还包含防止对治疗和/或疗法产生耐药性。例如,可以通过同时施用一种以上如本文所述的疗法/药物(组合疗法)来防止耐药性。
优选地,miR-144在肝脏细胞中介导以下至少一项:
i.NRF2活性和/或蛋白质水平;
ii.细胞外ROS的产生;
iii.GATA4磷酸化和/或活性;
iv.细胞内糖原的水平;以及
v.内源性抗氧化反应。
“介导”包含以下含义:miR-144表达和/或活性负责或调节NRF2活性和/或蛋白质水平;细胞外ROS的产生;GATA4磷酸化和/或活性;细胞内糖原的水平;和/或内源性抗氧化反应。
可以通过如在所附实例中描述的方法和通过本领域已知的方法测量GATA4磷酸化,包含但不限于蛋白质印迹和染色质免疫沉淀(ChIP),使用针对GATA4的抗体来测量其与DNA的结合。
可以通过本领域已知的方法测量细胞内糖原的水平,包含但不限于使用糖原测定试剂盒(Abcam;ab65620)。如所附实例中所述,发明人观察到用抑制miR-144的药剂处理的小鼠肝脏中储存的细胞内糖原水平增加(图5M)。与糖原储存增加一致,用抑制miR-144的药剂处理的小鼠的葡萄糖耐量测试显示,与对照小鼠相比,葡萄糖稳态得到改善(图5N)。
如本文所使用的,“内源性抗氧化反应”包含细胞在不添加(外源性)抗氧化剂的情况下对氧化应激的自然反应。NRF2驱动内源性反应,因为它由细胞本身产生,并诱导编码能够清除ROS的蛋白质的基因的表达。可以通过本领域已知的方法测量内源性抗氧化反应糖原,包含但不限于测量NRF2活性和蛋白质水平以及ROS水平。
优选地,miR-144表达和/或活性的降低在肝脏细胞中导致以下至少一项:
i.NRF2活性和/或蛋白质水平增加;
ii.细胞内ROS降低和/或ROS的释放降低;
iii.GATA4的磷酸化和/或活性降低;
iv.细胞内糖原的水平增加;以及
v.内源性抗氧化反应恢复和/或增加。
在一个实施例中,miR-144的表达和/或活性降低导致葡萄糖稳态改善。
可以在施用抑制miR-144的药剂后在受试者中测量上述参数中的每个参数。
“NRF2活性和/或蛋白质水平增加”包含:在施用抑制miR-144的药剂后,与患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)、未施用该药剂或施用了安慰剂的对照受试者相比,在患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)的受试者中,NRF2活性和/或蛋白质水平增加。在一个实施例中,安慰剂是加扰对照寡核苷酸,如实例中描述的那些。可替代地,对照可以是包括用诱导氧化应激的H2O2处理但未用抑制miR-144的药剂处理的健康细胞的对照样品。
在一个实施例中,与在不存在抑制剂的情况下NRF2活性和/或蛋白质水平相比,NRF2活性和/或蛋白质水平增加了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与在不存在抑制剂的情况下NRF2活性和/或蛋白质水平相比,NRF2活性和/或蛋白质水平增加了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
不受理论的束缚,因为已知miRNA调节转录和翻译,并且miR-144的表达在肥胖受试者的肝脏细胞中增加,这与NRF2蛋白质水平的降低相关,发明人假设miR-144靶向NRF2的翻译。因此,miR-144的沉默或下调导致NRF2活性和/或蛋白质水平的增加。
“细胞内ROS降低和/或ROS的释放降低”包含:在施用抑制miR-144的药剂后,与患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)、未施用该药剂或施用了安慰剂的对照受试者相比,在患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)的受试者中,细胞内ROS和/或ROS的释放减少。
在一个实施例中,与在不存在抑制剂的情况下细胞内ROS和/或ROS的释放相比,细胞内ROS和/或ROS的释放降低了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与在不存在抑制剂的情况下细胞内ROS和/或ROS的释放相比,细胞内ROS和/或ROS的释放降低了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
“GATA4的磷酸化和/或活性降低”包含:在施用抑制miR-144的药剂后,与患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)、未施用该药剂或施用了安慰剂的对照受试者相比,在患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)的受试者中,GATA4活性和/或磷酸化减少。从所附实例中可以看出,当LM中的miR-144沉默时,肝细胞中的GATA4磷酸化减少。
在一个实施例中,与在不存在抑制剂的情况下GATA4活性和/或磷酸化相比,GATA4活性和/或磷酸化降低了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与在不存在抑制剂的情况下GATA4活性和/或磷酸化水平相比,GATA4活性和/或磷酸化降低了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
“细胞内糖原的水平增加”包含:在施用抑制miR-144的药剂后,与患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)、未施用该药剂或施用了安慰剂的对照受试者相比,在患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)的受试者中,细胞内糖原的水平增加。
在一个实施例中,与在不存在抑制剂的情况下细胞内糖原的水平相比,细胞内糖原的水平增加了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与在不存在抑制剂的情况下细胞内糖原的水平相比,细胞内糖原的水平增加了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。
“内源性抗氧化反应恢复”包含:在施用抑制miR-144的药剂后,内源性抗氧化反应在患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)的受试者中恢复到与在未患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)并且未施用该药剂的对照受试者中观察到的水平基本相似的水平。
“内源性抗氧化反应增加”包含:在施用抑制miR-144的药剂后,与患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)、未施用该药剂或施用了安慰剂的对照受试者相比,在患有肝脏疾病和/或肝脏病状(其中氧化应激是促成因素)的受试者中,内源性抗氧化反应增加。
在一个实施例中,与在不存在抑制剂的情况下内源性抗氧化反应相比,内源性抗氧化反应增加了至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍。优选地,与在不存在抑制剂的情况下内源性抗氧化反应相比,内源性抗氧化反应增加了至少100倍、或至少1,000倍、或至少10,000倍。如上所述,可以通过本领域已知的方法测量内源性抗氧化反应,包含但不限于测量NRF2活性和蛋白质水平以及ROS水平。
在一个实施例中,NRF2活性和/或蛋白质水平增加、细胞内ROS减少和/或ROS的释放减少、GATA4的磷酸化和/或活性减少和/或内源性抗氧化反应恢复在肝细胞和/或肝脏巨噬细胞中发生。在一个实施例中,细胞内糖原的水平增加发生在肝细胞中。在一个实施例中,细胞内ROS减少和/或ROS的释放减少发生在内皮细胞和/或嗜中性粒细胞中。
优选地,所述药剂选自包括以下的组:核酸分子和小分子
“核酸”,也被称为“寡核苷酸”、“核酸序列”、“核酸分子”和“多核苷酸”,包含DNA序列或其类似物,或RNA序列或其类似物。核酸由核苷酸形成。“核苷酸”包含葡萄糖胺,所述葡萄糖胺包括核碱基和具有磷酸基团的糖,所述磷酸基团与糖共价连接。核苷酸可以用多种取代基中的任何一种进行修饰。
在一些实施例中,核酸药剂被修饰,例如,以进一步稳定以抵抗核酸降解。示例性修饰包含核苷酸碱基或糖部分的修饰。核酸药剂可以包含经修饰的接头药剂,如在核苷酸序列的5'或3'末端的至少第一、第二或第三核苷酸间键中的硫代磷酸酯。在一个实施例中,核酸药剂包含2'-修饰的核苷酸,例如,2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-0-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-0-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-0-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(T-0-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰胺基(2'-0-NMA)。在特别优选的实施例中,核酸药剂包含至少一个2'-O-甲基修饰的核苷酸,并且在一些实施例中,核酸药剂的所有核苷酸包含2'-O-甲基修饰。在一些实施例中,核酸的糖部分可以被替换为例如非糖部分,如PNA。
关于特定修饰寡核苷酸的合成的教导可以在以下文献中找到:Beaucage,SergeL.“经修饰的寡核苷酸和缀合物的合成(Synthesis of Modified Oligonucleotides andConjugates.)”《核酸化学实验室指南(Current Protocols in Nucleic AcidChemistry)》20(1):4.0.1-4.0.4.(2005)。
在一个实施例中,核酸药剂可以是适体。适体可以被认为是具有基于核苷酸的疗法的性质的化学抗体。适体是特异性结合到分子靶标(如蛋白质)的小核酸分子。与通过与另一个核酸靶标杂交起作用的核酸治疗剂不同,适体形成允许与酶、生长因子、受体、病毒蛋白和免疫球蛋白特异性结合的三维形状。核酸适体通常包含允许适体形成二级结构(例如,通过形成茎环结构)的一级核苷酸序列,所述二级结构允许适体结合其靶标。在本发明的上下文中,适体可以包含DNA、RNA、核酸类似物(例如,肽核酸)、锁核酸、经化学修饰的核酸或其组合。可以通过本领域已知的各种程序为给定的配体设计适体。适体也可用于递送本发明的药剂(Zhou J.,“适体靶向的细胞特异性RNA干扰(Aptamer-targeted cell-specific RNA interference)”,《Silenc》,2010,1:4)。
在一个实施例中,药剂是小分子,包含但不限于可以直接结合到miR-144的小的合成有机分子。它们的分子量通常小于800Da,并且具有以下性质,包含良好的溶解性、生物利用度、PK/PD、代谢等。可以设计小分子抑制剂以在至少三个不同阶段之一靶向miRNA;它们可以干扰一级RNA转录,它们可以通过DICER和RISC抑制pre-miRNA过程,或者它们可以抑制RISC和靶mRNA相互作用。关于特定修饰寡核苷酸的合成的教导可以在以下文献中找到:WenD.,“靶向微小RNA的小分子用于癌症疗法:前景和障碍(Small Molecules TargetingMicroRNA for Cancer Therapy:Promises and Obstacles)”《控释杂志(J ControlRelease.)》2015年12月10日;219:237–247。
术语“小分子”包含有机小分子、药物、前药和/或化合物。合适的小分子可以通过以下方法来鉴定:如筛选化合物大型文库(Beck-Sickinger和Weber(2001)“生物学和化学的组合策略(Combinational Strategies in Biology and Chemistry)”(约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons),奇切斯特,苏塞克斯);通过核磁共振的结构-活性关系(Shuker等人(1996)“发现蛋白质的高亲和力配体:NMR的SAR(Discovering high-affinity ligandsfor proteins:SAR by NMR.)”《科学(Science)》274:1531–1534);编码的自组装化学文库(Melkko等人(2004)“编码的自组装化学文库(Encoded self-assembling chemicallibraries.)”《自然生物技术》22:568–574);DNA模板化学(Gartner等人(2004)“DNA模板有机合成和大环文库的选择(DNA-templated organic synthesis and selection of alibrary of macrocycles.)”《科学》305:1601-1605);动态组合化学(Ramstrom和Lehn(2002)“通过动态组合文库发现药物(Drug discovery by dynamic combinatoriallibraries.)”《自然评论药物发现(Nature Rev.Drug Discov.)》1:26-36);拘束(tethering)(Arkin和Wells(2004)“蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂:朝着梦想前进(protein-protein interactions:progressing towards the dream.)”《自然评论药物发现》3:301-317);和速度筛选(Muckenschnabel等人(2004)“速度筛选:基于无标记液相色谱-质谱的高通量筛选,用于发现孤儿蛋白配体(SpeedScreen:label-free liquidchromatography-mass spectrometry-based high-throughput screening for thediscovery of orphan protein ligands.)”《分析生物化学(Anal.Biochem.)》324:241–249)。通常,有机小分子对于多肽的解离常数在纳摩尔范围内,具体地说,对于具有空腔的抗原。大多数有机小分子粘合剂的优点包含易于制造、缺乏免疫原性、组织分布性质、化学修饰策略和口服生物利用度。优选分子量小于5000道尔顿的小分子,例如小于400、3000、2000或1000道尔顿,或小于500道尔顿。
小分子还包含其前药的含义。例如,药剂可以作为前药施用,一旦进入受试者体内,所述前药就会被代谢或以其它方式转化为其活性形式。如本文所使用的,术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式,其与母体药物相比活性较低并且能够被酶促活化或转化为更具活性的母体形式(参见,例如,D.E.V.Wilman“癌症化疗前药(Prodrugs inCancer Chemotherapy)”《生化学会汇刊(Biochemical Society Transactions)》14,375-382(第615次会议,贝尔法斯特,1986)和V.J.Stella等人“前药:靶向药物递送的化学方法(Prodrugs:Chemical Approach to Targeted Drug Delivery)”《定向药物递送(DirectedDrug Delivery)》R.Borchardt等人(编辑)第247-267页(人类出版社(Humana Press),1985))。
优选地,所述药剂是选自包括以下的组的核酸分子:反义寡核苷酸和抑制性RNA分子。
“RNA”包含包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”包含在β-D-呋喃核糖部分的2'位置处具有羟基的核苷酸。所述术语涵盖双链RNA、单链RNA、具有双链和单链区域的RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及改变的RNA或类似物RNA(通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同)。此类改变可以包含添加非核苷酸材料,如添加到siRNA的末端或内部,例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本公开主题的RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸,如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称为天然存在的RNA的类似物或类似物。
反义寡核苷酸的实例包含但不限于安塔够妙、合成肽核酸(PNA)、LNA/DNA共聚物和缺口聚体(gapmer)。
可以通过施用靶向miR-144序列的反义寡核苷酸来实现miRNA功能的抑制。反义寡核苷酸通过沃森-克里克(Watson-Crick)结合形成miRNA-反义寡核苷酸双链体而发挥作用,从而通过抑制与靶mRNA的结合或通过募集RNase H进行降解而导致miRNA失活。对miR-144具有更高亲和力或比mRNA靶标具有更高丰度的反义寡核苷酸将防止miR-144的功能效应。
产生反义寡核苷酸的方法在本领域是众所周知的,并且可以容易地适应产生靶向任何多核苷酸序列的反义寡核苷酸,参见例如Joana Filipa Lima等人(2018)“抗miRNA寡核苷酸:设计综合指南(Anti-miRNA oligonucleotides:A comprehensive guide fordesign)”,《RNA生物学(RNA Biology)》,15:3,338-352。对给定靶标(即miR1-44)序列具有特异性的反义寡核苷酸序列的选择是基于对所选靶序列的分析和对二级结构、Tm、结合能和相对稳定性的确定。可以基于它们相对不能形成二聚体、发夹或其它二级结构来选择反义寡核苷酸,所述二级结构会减少或阻止与宿主细胞中的靶mRNA的特异性结合。mRNA的高度优选的靶区域包含在AUG翻译起始密码子处或附近的那些区域以及与mRNA的5'区域基本上互补的那些序列。例如,可以使用OLIGO引物分析软件(Molecular Biology Insights)的v.4和/或BLASTN2.0.5算法软件进行这些二级结构分析和靶标位点选择考虑(Altschul等人,《核酸研究》1997,25(17):3389-402)。
因此,在优选的实施例中,药剂是拮抗性反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中,反义分子可以是单链或双链序列。应当理解,单链反义寡核苷酸可用于拦截和降解成熟的miRNA。
磷酸骨架与硫代磷酸酯(PS)键的胆固醇缀合和修饰都已被用于增强反义寡核酸的体内递送。3'胆固醇-缀合的、2'-O-Me-修饰的安塔够妙已成为一种经过充分-验证的用于体内抑制miRNA的实验工具(van Rooij E等人《EMBO分子医学(EMBO Mol Med.)》2014年7月;6(7):851-64)。
优选地,反义寡核苷酸具有至少一种化学修饰。标准化学修饰是本领域技术人员已知的并且包含2'-O-甲基或甲氧基乙基核苷酸、2'-F核苷酸和硫代磷酸酯骨架修饰的寡核苷酸,所有这些都已显示成功地干扰miRNA效应。
示例性修饰包含核苷酸碱基或糖部分的修饰。反义寡核苷酸可以由一种或多种“锁核酸”组成。锁核酸(LNA),也被称为“不可接近的RNA”,是一种经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用连接2'和4'碳的额外桥进行修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内结构构象中,所述构象通常存在于DNA或RNA的A型中。LNA核苷酸可以在需要时与寡核苷酸中的DNA或RNA碱基混合。锁定的核糖构象增强了碱基堆叠和骨架预组织,从而显著提高了寡核苷酸的热稳定性(熔化温度)。LNA碱基可以包括在DNA骨架中,但它们也可以包括在LNA、2'-O-甲基RNA、2'-甲氧基乙基RNA或2'-氟RNA的骨架中。这些分子可以包括磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架。
反义寡核苷酸可以包括肽核酸(PNA),其含有基于肽的骨架而不是糖-磷酸骨架。肽核酸(PNA)是DNA的合成类似物,具有通过接头与嘌呤和嘧啶核碱基连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸肽骨架。在一些实施例中,核苷酸的糖部分可以被替换为例如非糖部分,如PNA。
反义寡核苷酸可能含有的其它化学修饰包含但不限于糖修饰,如T-O-烷基(例如2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基)、2'-氟和4'硫代修饰以及骨架修饰,如一种或多种硫代磷酸酯、二氨基磷酸酯吗啉代低聚物(PMO)或膦酰基羧酸酯键。本领域已知,2'-氧和4'-碳原子之间的亚甲基桥提供更高的结构刚性和增加的对RNA反向链的选择性亲和力。还应理解,硫代磷酸酯骨架修饰足以稳定寡核苷酸以防止降解,并导致与血浆蛋白的高度结合,这减少了快速消除。反义寡核苷酸可以在核苷酸序列的5'或3'末端的至少第一、第二或第三核苷酸间键中包含硫代磷酸酯。在一个实施例中,反义寡核苷酸在5'端包括2个硫代磷酸酯键并且在3'端包括4个硫代磷酸酯键,并且任选地在3'端包括胆固醇修饰。硫代磷酸酯几乎分布于所有器官和组织(大脑除外),但偏爱肝脏和肾脏。额外的2'-甲氧基或甲氧基乙烯修饰增加了稳定性并允许使用更低的剂量(Baumann,V.和Winkler,J.(2014).“基于miRNA的疗法:寡核苷酸和非寡核苷酸药剂的策略和递送平台(miRNA-based therapies:strategies anddelivery platforms for oligonucleotide and non-oligonucleotide agents.)”《未来医药化学(Future medicinal chemistry)》,6(17),1967–1984)。
增强稳定性和提高功效的反义寡核苷酸的其它修饰,如以下文献中所述的修饰:Urban E,“反义寡核苷酸的结构修饰(Structural modifications of antisenseoligonucleotides)”《Farmaco.》2003年3月;58(3):243-58(其通过引用整体并入本文),是本领域已知的并且适用于本发明的方法。
在一个实施例中,反义寡核苷酸是反义吗啉代。吗啉代(MO),也被称为吗啉代低聚物和磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO),是一种低聚物分子。其分子结构具有与DNA和RNA寡核苷酸相似的亚基,不同之处在于它们具有通过二氨基磷酸酯基团连接的亚甲基吗啉环骨架。此功能仍允许MO进行沃森-克里克碱基配对,但与常规寡核苷酸相比,其具有显著优势。MO不通过RNaseH机制发挥作用,而是专门结合其选定的靶标位点,以阻止细胞组分访问该靶标位点。该性质可用于阻断mRNA分子的翻译起始位点、干扰mRNA剪接、阻断miRNA或其靶标以及阻断核酶活性。
翻译阻断:通过空间阻断翻译起始复合物,吗啉代可以完全敲低许多靶序列的表达,以至于在等待现有蛋白质降解后,靶蛋白条带从蛋白质印迹中消失。吗啉代通常不会导致其RNA靶标的降解;相反,它们会阻断靶标RNA的生物学活性,直到该RNA自然降解,从而释放吗啉代。
剪接阻断:通过阻断参与剪接pre-mRNA的位点,吗啉代可用于修饰和控制正常的剪接事件。这种活性可以通过RT-PCR方便地测定,其中成功的剪接修饰表现为电泳凝胶上RT-PCR产物条带的变化。该条带可能会转移到一个新的质量,或者,如果剪接修饰触发了无义介导的转录物衰减,则野生剪接的条带将失去强度或消失。
在一些实施例中,反义寡核苷酸是安塔够妙(amiR)。“安塔够妙”是与miRNA序列至少部分互补的单链、经化学修饰的核糖核苷酸。与经典反义寡核苷酸的主要区别在于,安塔够妙旨在特异性靶向成熟miRNA的“种子”序列,从而阻断miRNA在Ago2上的加工,并因此抑制miRNA的功能。安塔够妙可以包括一种或多种经修饰的核苷酸,如2'-O-甲基-糖修饰。在一些实施例中,安塔够妙仅包括经修饰的核苷酸。安塔够妙还可以包括一个或多个硫代磷酸酯键,从而产生部分或完整的硫代磷酸酯骨架。安塔够妙可以在其3'端与胆固醇或其它部分连接,以促进体内递送和稳定性。已显示,胆固醇修饰的安塔够妙寡核苷酸在肝脏中积聚(Park J.K.,“miR-221沉默阻断肝细胞癌并促进存活(miR-221silencing blockshepatocellularcancer and promote Survival)”,2011,《癌症研究(Cancer Res.)》,71(24):7608-7616)。安塔够妙以一种尚未被完全了解的方式使miRNA沉默;据认为,miRNA/安塔够妙双链体诱导miRNA的降解和安塔够妙的再循环。
在一个实施例中,反义寡核苷酸是“缺口聚体”。缺口聚体利用细胞内酶RNase H,其降解RNA-DNA异源双链体中的RNA链。为了防止快速催化,这种反义寡核苷酸通常用硫代磷酸酯骨架合成。为了增加亲和力并保护寡核苷酸免受外切核酸酶的影响,已经在寡核苷酸的每一端插入了许多经化学修饰的核酸类似物,以产生所谓的缺口聚体。中间有六到八个未修饰的DNA核苷酸的缺口介导RNase H降解的有效诱导。在这个DNA缺口内只允许很少的碱基修饰,以免干扰催化。在一些实施例中,合适的反义分子是“缺口聚体”。在一个实施例中,缺口聚体是2'-O-甲氧基乙基缺口聚体,其在5'和3'末端均含有2'-O-甲氧基乙基修饰的核糖核苷酸,中心至少有十个脱氧核糖核苷酸。
优选地,反义寡核苷酸包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQID NO:4中存在的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。
表1:miR-144的序列。
“成熟miRNA”包含完全加工的miRNA链,或进入RISC的siRNA。在一些情况下,miRNA具有一条成熟的链,其长度可以在约17-28个核苷酸之间变化。在其它情况下,miRNA可以具有两条成熟的链,并且链的长度可以在约17个到28个核苷酸之间变化。
反义寡核苷酸可以包括与miR-144的前体miRNA序列(pre-miRNA)部分互补或基本上互补的核苷酸序列。反义寡核苷酸可以包括与miR-144的茎环miRNA序列部分互补或基本上互补的核苷酸序列。在一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与5'-GGCUGGGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGUUUGUGAUGAGACACUACAGUAUAGAUGAUGUACUAGUC-3'(SEQ ID NO:1)部分互补的序列的反义寡核苷酸。在一个实施例中,miR-144功能抑制剂是具有与miR-144的pre-miR-144序列(SEQ ID NO:1)基本上互补的序列的反义寡核苷酸。在一些实施例中,反义寡核苷酸包括与定位在pre-miR-144序列的茎环区之外的序列基本上互补的序列。
在某些实施例中,反义寡核苷酸和靶核酸彼此互补。在某些此类实施例中,反义化合物与靶核酸完全互补。在某些实施例中,反义化合物包含一个错配。在某些实施例中,反义化合物包含两个错配。在某些实施例中,反义化合物包含三个或更多个错配。
如本文所使用的,“互补的(complementary)”和“互补性(complementarity)”是可互换的,并且是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常通过反向平行的多核苷酸链或区域中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链或区域可以以沃森-克里克方式进行碱基配对(例如,A与T、A与U、C与G)。完全互补性或100%互补性是指其中一个多核苷酸链或区域的每个核苷酸都可以与第二个多核苷酸链或区域的每个核苷酸发生氢键合的情况。小于完全互补性是指其中两个链或两个区域的一些(但不是全部)核苷酸可以彼此发生氢键合的情况。
“部分互补”是指与靶miRNA序列至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%互补的序列。
“基本上互补”是指与靶miRNA序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同和互补的序列。还包含了与靶miRNA序列具有100%互补性的序列。包含了:如果两个序列基本上互补,则可以在它们之间形成双链体。双链体可能有一个或多个错配,但双链体形成的区域足以下调miRNA的表达。
用于确定寡核苷酸之间或寡核苷酸与靶核酸之间的适当数量的错配的方法,如通过确定解链温度(Tm)。Tm或Tn可以通过本领域已知的技术来计算,如在以下文献中描述的技术:Freier等人(《核酸研究》,1997,25,22:4429-4443)。
优选地,反义寡核苷酸包括与成熟miR-144序列中存在的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。
在一个实施例中,反义寡核苷酸靶向miR-144的成熟序列(例如SEQ ID NO:2和/或3)。
优选地,反义寡核苷酸包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID No:2和/或SEQ ID NO:3至少50%互补的核苷酸序列。
反义寡核苷酸可以包括与成熟miR-144序列至少部分互补的序列,例如,与成熟miR-144序列至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%互补的序列。
在一些实施例中,反义寡核苷酸可以与成熟miR-144序列基本上互补,即与成熟miR-144序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%互补。在一个实施例中,反义寡核苷酸包括与成熟miR-144序列100%互补的序列。在一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与5'-GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGU-3'(SEQ ID NO:2)和/或5'-UACAGUAUAGAUGAUGUACU-3'(SEQ ID NO:3)部分互补的序列的反义寡核苷酸。在一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与5'-GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGU-3'(SEQ ID NO:2)和/或5'-UACAGUAUAGAUGAUGUACU-3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的序列的反义寡核苷酸。
在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:1的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:1至少90%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:1的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:1至少95%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:1的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:1 100%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:2的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:2至少90%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:2的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:2至少95%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:2的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:2 100%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:3的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:3至少90%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:3的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:3至少95%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:3的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:3 100%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:4的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:4至少90%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:4的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:4至少95%互补。在某些此类实施例中,靶向SEQ ID NO:4的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:4 100%互补。
“成熟miR-144序列”包含完全加工的miRNA链,或进入RISC的siRNA。在一些情况下,miRNA具有一条成熟的链,其长度可以在约17-28个核苷酸之间变化。可替代地,miRNA可以具有两条成熟的链,并且链的长度可以在约17个到28个核苷酸之间变化。
优选地,与miR-144序列中存在的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列的长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、20个、21个、22个或23个核苷酸。
在一些实施例中,反义寡核苷酸是例如安塔够妙,其长度为约6个到约30个核苷酸、约10个到约30个核苷酸、约12个到约28个核苷酸。适用于抑制miRNA的反义寡核苷酸的长度可以为约15个到约50个核苷酸,更优选地长度为约18个到约30个核苷酸,更优选地长度为约19个到约30个核苷酸,并且最优选地长度为约19个到约25个核苷酸。在一些实施例中,反义寡核苷酸的长度为至少约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中,反义寡核苷酸的长度为至少19个核苷酸。
在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为8个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为9个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为10个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为11个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为12个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为13个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为14个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为15个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为16个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为17个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为18个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为19个核苷酸。在某些实施例中,反义寡核苷酸的长度为20个核苷酸。
在一些实施例中,反义寡核苷酸是安塔够妙,其长度为约6个到约30个核苷酸、约10个到约30个核苷酸、约12个到约28个核苷酸、约19个到约25个核苷酸。适用于抑制miRNA的安塔够妙的长度可以为约15个到约50个核苷酸,更优选地长度为约18个到约30个核苷酸,并且最优选地长度为约19个到约25个核苷酸。在一些实施例中,miRNA分子的安塔够妙的长度为至少约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个核苷酸。在一些实施例中,miRNA分子的安塔够妙的长度为至少19个核苷酸。
在一个实施例中,反义寡核苷酸基本上是单链的并且包括与成熟miR-144的核苷酸序列或pre-miR-144核苷酸序列的19个连续核苷酸基本上互补和/或与成熟miR-144的核苷酸序列或pre-miR-144核苷酸序列的种子序列中的6个连续核苷酸基本上互补的序列。优选地,反义寡核苷酸包括与pre-miR-144核苷酸序列相差不超过1个、2个、3个、4个或5个核苷酸的核苷酸序列。优选地,反义寡核苷酸包括与成熟miR-144核苷酸序列相差不超过1个、2个、3个、4个或5个核苷酸的核苷酸序列。
优选地,反义寡核苷酸包括与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%或100%互补的核苷酸序列。
在一个实施例中,反义寡核苷酸靶向miR-144的种子序列(例如SEQ ID NO:4)。种子区域是6-8个核苷酸长的序列,位于miRNA的5'末端(成熟miRNA的2-7位或2-8位核苷酸)。
反义寡核苷酸可以包括与miR-144序列至少部分互补的序列,例如,与miR-144序列的种子序列至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%互补的序列。在一些实施例中,反义寡核苷酸可以与miR-144序列的种子序列基本上互补,即与成熟miR-144序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%互补。在一个实施例中,反义寡核苷酸包括与miR-144序列的种子序列100%互补的序列。在一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与5'-GAUAUCA-3'(SEQ ID NO:4)部分互补的序列的反义寡核苷酸。在一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与5'-GAUAUCA-3'(SEQ ID NO:4)基本上互补的序列的反义寡核苷酸。
在一些实施例中,miR-144抑制剂是包括与成熟miR-144序列互补的序列的安塔够妙。在一个实施例中,miR-144抑制剂是具有与(SEQ ID NO:1)部分互补或基本上互补的序列的安塔够妙。在另一个实施例中,miR-144抑制剂是具有与(SEQ ID NO:2)部分互补或基本上互补的序列的安塔够妙。在另一个实施例中,miR-144抑制剂是具有与(SEQ ID NO:3)部分互补或基本上互补的序列的安塔够妙。在另一个实施例中,miR-144抑制剂是具有与(SEQ ID NO:4)部分互补或基本上互补的序列的安塔够妙。
如上文所讨论的,在一些实施例中,miR-144抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸。在一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与(SEQ ID NO:1)基本上互补的序列的经化学修饰的反义寡核苷酸。在另一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与(SEQ ID NO:2)基本上互补的序列的经化学修饰的反义寡核苷酸。在另一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与(SEQ ID NO:3)基本上互补的序列的经化学修饰的反义寡核苷酸。在另一个实施例中,miR-144抑制剂是包括与(SEQ ID NO:4)基本上互补的序列的经化学修饰的反义寡核苷酸。
在优选的实施例中,药剂是一种靶向miR-144的反义寡核苷酸,例如可从Dharmacon商购的miRIDIAN微小RNA mmu-miR-144-5p发夹抑制剂;IH-301058-02,或可从Dharmacon商购的miRIDIAN微小RNA hsa-miR-144-3p发夹抑制剂;IH-300612-06。
在某些实施例中,靶向miR-144的反义寡核苷酸包括选自表2中所示核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施例中,靶向SEQ ID NO:1-2和4中任一个的反义寡核苷酸包括选自表2中所示核苷酸序列的核苷酸序列。
表2中SEQ ID NO中示出的核苷酸序列独立于任何修饰。因此,由SEQ ID NO定义的反义寡核苷酸可以独立地包括如本文所述的一种或多种修饰。
表2展示了靶向miR-144的反义寡核苷酸的实例。
在一个实施例中,反义寡核苷酸包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13中存在的核苷酸序列的至少一部分相同的核苷酸序列。
靶标 | 序列(5'-3') | SEQ ID NO |
miR-144 | ACUACAGUAUAGA<u>UGAUGUC</u>U | 8 |
miR-144 | ACUACAGUAUAGA<u>UGAUAUC</u>U | 9 |
miR-144 | CUUACAGUAUAUGA<u>UGAUAUC</u> | 10 |
miR-144 | AGUACAUCAUCUAUACUGUA | 11 |
miR-144 | (X)<sub>n</sub>UGAUGUC(X)<sub>n</sub> | 12 |
miR-144 | (X)<sub>n</sub>UGAUAUC(X)<sub>n</sub> | 13 |
表2.靶向miR-144的反义寡核苷酸的实例
在一个实施例中,“X”是任何核苷酸并且“n”是1-10的整数。在一个实施例中,n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任一个。
在一个实施例中,表2中的序列可以包括如本文所讨论的一种或多种化学修饰。在一个实施例中,SEQ ID NO:10被如下修饰:5'-mC/ZEN/mU mUmAmC mAmGmU mAmUmA mUmGmAmUmGmA mUmAmU mC/3ZEN/-3',其中“m”代表2'-O-甲基修饰的寡核苷酸,“ZEN”代表N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基唑)-苯胺,用于提高结合亲和力并减少外切核酸酶降解。
在一个实施例中,SEQ ID NO:11被如下修饰:5'-ASGSUACAUCAUCUAUACUSGSUSAS-Chol-3',其中下标‘s’代表硫代磷酸酯键,并且‘Chol’代表连接的胆固醇。如上文所讨论的,一种或多种核苷酸可以是2'-O-甲基修饰的寡核苷酸。
反义寡核苷酸或其一部分可以与表2中公开的SEQ ID NO具有确定的同一性百分比。如本文所使用的,如果序列具有相同的核苷酸配对能力,则它与本文公开的序列相同。例如,含有尿嘧啶代替胸苷的RNA将被认为是相同的,因为它们都与腺嘌呤配对。这种同一性可以在寡聚化合物的整个长度上,或在反义寡核苷酸的一部分中(例如,可以将27聚体的核苷酸1-20与20聚体进行比较,以确定寡聚化合物与SEQ ID NO.的同一性百分比)。本领域技术人员理解,反义寡核苷酸不需要具有与本文所述的序列相同的序列,以便与本文所述的反义寡核苷酸具有相似的功能。
百分比同一性是根据具有相同碱基配对的碱基数计算的,所述碱基配对对应于与其比较的SEQ ID NO或反义寡核苷酸。不相同的碱基可以彼此相邻,分散在整个寡核苷酸中,或两者兼而有之。例如,与20聚体的核苷酸2-17具有相同序列的16聚体与20聚体具有80%的同一性。可替代地,含有与20聚体不同的四个核苷酸的20聚体也与20聚体具有80%的同一性。与18聚体的核苷酸1-14具有相同序列的14聚体与18聚体具有78%的同一性。这种计算是本领域技术人员已知的。
在另一个实例中,包括20个核苷酸靶序列的互补物的完整序列的30个核苷酸反义寡核苷酸将包括与20个核苷酸靶序列的互补物具有100%同一性的部分,同时进一步包括额外的10个核苷酸部分。在优选的实施例中,本文提供的寡核苷酸与本文公开的靶序列(即miR-144)的互补物的至少一部分具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性。
两个核酸分子之间的百分比序列同一性可以使用合适的计算机程序来确定,例如针(EMBOSS)比对工具(Madeira F等人,《核酸研究》,2019年4月12日)。
在某些实施例中,反义寡核苷酸可以包括与表2列出的任何序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性的序列。在一些实施例中,反义寡核苷酸可以与表2列出的任何序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
在本发明的其它实施例中,miR-144抑制剂可以是抑制性RNA分子,如核酶、miRNA海绵、siRNA或shRNA。
用于抑制miR-144功能的另一种方法是施用具有与成熟miR-144序列至少部分相同和部分互补的双链区的抑制性RNA分子。抑制性RNA分子可以是双链小干扰RNA(siRNA)或包括茎环结构的短发夹RNA分子(shRNA)。
术语“小干扰RNA”、“短干扰RNA”、“小发夹RNA”、“siRNA”和shRNA可互换使用,并且是指能够介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默的任何核酸分子。在一个实施例中,siRNA包括双链多核苷酸分子,所述双链多核苷酸分子包括互补的有义区和反义区,其中反义区包括与靶核酸分子(例如,编码BRCAA1的核酸分子)的区域互补的序列。在另一个实施例中,siRNA包括单链多核苷酸,所述单链多核苷酸具有自身互补的有义区和反义区,其中反义区包括与靶核酸分子的区域互补的序列。在另一个实施例中,siRNA包括具有一个或多个环结构的单链多核苷酸和包括自身互补的有义区和反义区的茎,其中反义区包括与靶核酸分子的区域互补的序列,并且其中多核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA。如本文所使用的,siRNA分子不必限于仅含有RNA的那些分子,而是进一步涵盖经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
优选地,抑制性RNA分子包括双链区,并且优选地,其中所述双链区包括与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4中存在的核苷酸序列的至少一部分基本上相同和基本上互补的核苷酸序列。
优选地,所述双链区包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID No:2和/或SEQ ID NO:3中存在的核苷酸序列的至少一部分至少50%互补的核苷酸序列。
优选地,所述双链区包括与成熟miR-144序列基本上相同和基本上互补的核苷酸序列。
抑制性RNA分子的双链区可以包括与成熟miRNA序列至少部分相同和部分互补(例如,约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%相同和互补)的序列。在一些实施例中,抑制性RNA的双链区包括与成熟miRNA序列至少基本上相同和基本上互补的序列。
“部分相同和部分互补”包含与靶多核苷酸序列至少约95%、96%、97%、98%或99%相同和互补的序列。
“基本上相同和基本上互补”包含与靶多核苷酸序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同和互补的序列。在其它实施例中,抑制性RNA分子的双链区可以含有与靶miRNA序列具有100%同一性和互补性的序列。如上文所讨论的,如果两个序列基本上互补,则可以在它们之间形成双链体。双链体可能有一个或多个错配,但双链体形成的区域足以下调miRNA的表达。
在一个实施例中,miR-144抑制剂是包括双链区的抑制性RNA分子,其中所述双链区包括与成熟miR-144序列(例如SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3)具有100%同一性和互补性的序列。在另一个实施例中,miR-144抑制剂是包括双链区的抑制性RNA分子,其中所述双链区包括与种子miR-144序列(例如SEQ ID NO:4)具有100%同一性和互补性的序列。在一些实施例中,miR-144功能抑制剂是包括双链区的抑制性RNA分子,其中所述双链区包括与成熟miR-144序列具有至少约50%、55%、60%、65%、705、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性和互补性的序列。
在一个实施例中,抑制性RNA分子是核酶。核酶或RNA酶是一种RNA分子,其具有特定的催化结构域,所述催化结构域具有核酸内切酶活性。DNAzyme或脱氧核酶是一种催化DNA,其可在位点特异性切割靶RNA。
目前,至少有六种基本的天然酶RNA是已知的。核酶通过与互补靶序列的沃森-克里克碱基配对而发挥作用,然后对底物进行位点特异性切割。在酶促核酸结合并切割其RNA靶标后,所述酶促核酸会从该RNA中释放出来以寻找另一个靶标,并可以反复结合和切割新的靶标。
本发明上下文中酶促核酸分子的重要特性是它们具有与至少部分miR-144互补的特异性底物结合位点,并且它们在底物结合位点内或周围具有核苷酸序列,这些核苷酸序列赋予分子RNA切割活性。
产生靶向任何多核苷酸序列的核酶的方法是本领域已知的。核酶可以按照以下文献中的描述进行设计:“小RNA世界:从核酶到siRNA和miRNA(World of small RNAs:fromribozymes to siRNA and miRNA.)”Kawasaki H,《分化(Differentiation.)》2004年3月;72(2-3):58-64。可以通过改变核酶结合臂的长度或化学合成具有修饰的核酶来优化核酶活性,所述修饰防止其被血清核糖核酸酶降解(参见例如,“小RNA世界:从核酶到siRNA和miRNA”Kawasaki H,《分化)》2004年3月;72(2-3):58-64。
在一个实施例中,抑制性RNA分子是miRNA海绵。合成miRNA海绵通常是质粒或病毒载体,其含有4-10个位点之间的串联排列的miRNA结合位点,用一个小的核苷酸间隔物隔开,并插入由RNA聚合酶II启动子驱动的报告基因的3'UTR中。一旦进入细胞,海绵就会被细胞的天然RNA聚合酶II扩增(参见MS,Sharp PA.“微小RNA海绵:进展和可能性(MicroRNAsponges:progress and possibilities.)”《RNA.》2010;16(11):2043-2050)。当递送到细胞中时,结合位点充当靶miRNA(即miR-144)的诱饵。在载体中包含可选择标志物或报告基因的开放阅读框允许选择或筛选、荧光活化的细胞分选,甚至激光捕获显微切割强烈表达海绵的细胞。应当理解,调节元件可以包含在海绵启动子中以使其对所选组织(即肝脏)具有药物诱导性或组织特异性。
优选地,所述双链区包括与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%或100%互补的核苷酸序列。
在一个实施例中,所述双链区包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13中存在的核苷酸序列的至少一部分相同的核苷酸序列。
抑制性RNA分子或其一部分可以与表2中公开的SEQ ID NO具有确定的同一性百分比。
在某些实施例中,抑制性RNA分子可以包括与表2列出的任何序列具有至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性的序列。在一些实施例中,反义寡核苷酸可以与表2列出的任何序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
用于将药剂递送至肝脏的合适方法包含可将核酸(例如,RNA、DNA,包含病毒和非病毒载体)引入细胞器、细胞、组织或生物体中的任何方法,如本文中描述的或本领域普通技术人员已知的。以下综述提供了几种调配RNA分子以优化其内化到细胞中的方法(Kim SS.等人,《分子医学的发展趋势(Trends Mol.Med.)》,2009,15:491-500)。
优选地,使用以下任一种将药剂递送至肝脏细胞:
-物理方法,如:肠胃外施用、直接注射或电穿孔;
-递送载体(vehicle),如:含葡聚糖的颗粒、含脂质的囊泡、含病毒的载体、含聚合物的载体、含肽的载体和外泌体。
在一个实施例中,递送载体包含多于一个组分。例如,其可以包含一种或多种脂质部分、一种或多种肽、一种或多种聚合物、一种或多种病毒载体或其组合。
例如,在本发明的某些实施例中,miR-144抑制剂可以通过物理方法施用,例如通过肠胃外施用,如静脉内注射或皮下注射,或通过直接注射到组织中(例如肝脏组织中)。在一些实施例中,可以通过口服、经皮、腹膜内、皮下、缓释、控释、延迟释放、栓剂或舌下施用途径施用miR-144抑制剂。在其它实施例中,miR-144的调节剂可以通过导管系统施用。
在优选的实施例中,miR-144抑制剂通过静脉内施用递送。
用于递送至肝脏的物理方法在本领域中是已知的并且包含通过针头注射、基因枪(弹道轰击)、电穿孔、超声介导的递送(声孔效应)和流体动力递送进行肝内递送(KamimuraK,Liu D.“用于将核酸递送至肝脏的物理方法(Physical approaches for nucleic aciddelivery to liver.)”《美国药剂学科学家协会杂志(AAPS J.)》2008;10(4):589-595)。
在本发明的某些实施例中,miR-144抑制剂可以通过含葡聚糖的颗粒来施用。如本文所使用的,“葡聚糖封装的”可以指为核酸药剂提供完全封装、部分封装或两者的调配物。在一些实施例中,核酸药剂完全封装在葡聚糖调配物中(例如,以形成核酸-葡聚糖颗粒)。
用于制备含葡聚糖颗粒的方法在本领域中是已知的,并且在实例中进行了描述,参见例如WO2014134509(通过引用并入),其公开了肽修饰的葡聚糖颗粒(PcGP)和/或胺修饰的葡聚糖颗粒(amGP),用于向细胞递送有效载荷分子,具体地说,核酸有效载荷分子。其中还公开了制备此类颗粒的方法和使用此类颗粒的方法,例如,用于介导体外和体内基因沉默。WO2009058913中公开了用于使用酵母细胞壁颗粒将药剂(例如,基因沉默剂,如核酸)和分子递送至细胞的方法和组合物,所述文献通过引用并入。
在一个实施例中,核酸药剂被封装在从酿酒酵母提取的并且主要由β-1,3-d-葡聚糖(凝集素-1受体和由巨噬细胞表达的其它受体的配体)构成的微米大小的葡聚糖壳(葡聚糖封装的siRNA颗粒,GeRP)中。
在本发明的某些实施例中,miR-144抑制剂可以通过含脂质的囊泡来施用。“含脂质的囊泡”或“脂质颗粒”包含可用于将药剂递送至受试者的任何脂质组合物,包含但不限于脂质纳米颗粒和脂质体,其中水性体积被两亲性脂质双层封装;或其中脂质包被包括大分子组分的内部,如包括干扰RNA序列的质粒,具有减少的水性内部;或脂质聚集体或胶束,其中封装的组分包含在相对无序的脂质混合物中。脂质颗粒被导向肝脏主要是因为它们的大小。
“脂质体”包含由排列成一个或多个球形双层的两亲性脂质构成的囊泡。
脂质体是具有水性内部和由亲脂性材料形成的膜的单层或多层囊泡。水性内部含有活性剂/药物。脂质体膜在结构上类似于生物膜,因此当脂质体被应用至组织时,脂质体开始与细胞膜合并,并且随着脂质体的合并和细胞进展,脂质体内容物被排空进入靶细胞,在所述靶细胞中活性剂可以起作用。因此,脂质体对于将活性成分转移以及递送至靶位点是有用的。
脂质体分为两个广泛的类别。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优势。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体,其与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电荷的DNA/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化于内体中。由于内体中的酸性pH,脂质体破裂,从而将其内容物释放到细胞质中。在一个实施例中,药剂与脂质(如阳离子脂质)复合。阳离子脂质可以是以下中的一种或多种:N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基1)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基1)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基1-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)及其混合物。
非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与细胞壁融合,但是被体内巨噬细胞摄取。对pH敏感的或带负电荷的脂质体包埋DNA而不是与其复合。由于DNA和脂质均带有类似的电荷,所以会出现排斥而非复合物形成。然而,一些DNA包埋于这些脂质体的水性内部。对pH敏感的脂质体已被用于将DNA递送至培养中的细胞单层。在一个实施例中,药剂与脂质(如非阳离子脂质)复合。非阳离子脂质可以是以下中的一种或多种:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇及其组合。
包括一种或多种糖脂的各种脂质体在本领域中是已知的,Kraft JC,“脂质体和脂质纳米颗粒药物递送系统的新兴研究和临床发展趋势(Emerging Research and ClinicalDevelopment Trends of Liposome and Lipid Nanoparticle Drug DeliverySystems.)”《药物科学杂志(Journal of pharmaceutical sciences.)》2014;103(1):29-52。包括用一种或多种亲水性聚合物衍生化的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。脂质体通常包含多种组分,如阳离子脂质(例如氨基脂质)、靶向部分、融合性脂质和/或聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
“融合性”包含脂质体或其它药物递送系统与细胞膜融合的能力。膜可以是质膜或围绕细胞器的膜,如内体。
含有脂质的囊泡及其制备方法公开于以下文献中:美国专利第5,705,385号;第5,981,501号;第5,976,567号;第6,586,410号;第6,534,484号;WO 96/40964;和WO 00/62813。
包括核酸的许多脂质体在本领域中是已知的,参见例如WO 96/40062,其公开了一种用于将高分子量核酸封装在脂质体中的方法,所述方法提供了高核酸包埋效率。所得组合物提供增强的体外和体内转染。WO 97/04787公开了包括长度为8个到50个核苷酸的寡核苷酸的组合物,所述寡核苷酸靶向编码人raf的mRNA并且能够抑制raf表达,包埋在空间稳定的脂质体中。
含有脂质的囊泡可以是脂质纳米颗粒(LNP)。LNP用于递送核酸的用途在本领域中是众所周知的(Zatsepin,Timofei S等人“用于靶向siRNA递送的脂质纳米颗粒–从实验室到临床(Lipid nanoparticles for targeted siRNA delivery-going from bench tobedside.)”《国际纳米医学杂志(International journal of nanomedicine)》第11卷3077-86.2016年7月5日)。示例性纳米粒子直径为300-200nm,具有适当的表面修饰,如通过PEG或维生素E D-α-生育酚PEG琥珀酸酯(TPGS)进行修饰。应当理解,聚乙二醇化磷脂用于许多基于脂质的药物载剂中,主要是因为它们增加了稳定性并增加了循环寿命。
脂质体和LNP相似,但在组成和功能上略有不同。两者都是脂质纳米调配物和药物递送载体,在保护性外层脂质内运输所关注的货物。然而,在应用中,LNP可以采取多种形式。传统的脂质体包含围绕水袋的一个或多个脂质双层环,但并非所有LNP都具有连续的双层,所述连续的双层将使它们有资格作为脂质囊泡或脂质体。一些LNP呈现胶束状结构,从而将药物分子封装在非水性核中。
在本发明的上下文中,含有脂质的囊泡的平均直径典型地为约30nm到约150nm,更典型地为约50nm到约140nm,更典型地为约60nm到约130nm,更典型地为约70nm到约110nm,最典型地为约70nm到约90nm,并且基本上无毒。
在一个实施例中,脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如,脂质与核酸的比率)将在约1:1到约50:1、约1:1到约25:1、约3:1到约15:1、约4:1到约10:1、约5:1到约9:1或约6:1到约9:1的范围内,或为约6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1或33:1。
在另一个实施例中,含脂质的囊泡包含亲和部分或靶向配体,其有效地特异性结合至疗法所针对的靶细胞。
例如,在本发明的某些实施例中,miR-144抑制剂可以通过含有聚合物的载体来施用。含有聚合物的囊泡在本领域中是已知的,参见例如Schmidt H.,“靶向肝脏疾病的治疗性寡核苷酸:TTR淀粉样变性(Therapeutic Oligonucleotides Targeting LiverDisease:TTR Amyloidosis)”,《分子(Molecules.)》2015,20(10):17944-17975。在一个实施例中,药剂与聚合物(如阳离子聚合物)复合以形成含有聚合物的载体。示例性阳离子聚合物包含聚(L)赖氨酸(PLL)和聚乙烯亚胺(PEI)。
在一个实施例中,递送载体是含有肽的载体,如内转运蛋白。Endo-Porter是一种弱-碱两亲性肽,其可通过内吞作用-介导的过程将反义寡聚体和其它非-离子物质递送到细胞的胞质/核区室中,所述过程避免损伤细胞的质膜。
例如,在本发明的某些实施例中,miR-144抑制剂可以通过外泌体来施用。用于靶向药物递送的外泌体的用途在本领域中是已知的,参见例如Antimisiaris SG,“用于靶向药物递送的外泌体和受外泌体启发的囊泡(Exosomes and Exosome-Inspired Vesiclesfor Targeted Drug Delivery.)”《药剂学(Pharmaceutics.)》2018年11月6日;10(4)
在一个实施例中,递送载体是含有病毒的载体,如表达载体。在一个实施例中,表达载体可用于将miR-144抑制剂递送至肝脏。RNA分子可以由包括在载体中的核酸分子编码。术语“载体”用于指一种载剂核酸分子,核酸序列可以被插入到所述载剂核酸分子中以引入细胞中,在所述细胞中可以复制核酸序列。病毒载体的实例包含但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。表达构建体可以在活细胞中复制,或者也可以合成。如本文所使用的,术语“表达构建体”、“表达载体”和“载体”可互换使用。
在一个实施例中,用于表达miR-144抑制剂的表达载体包括与编码反义寡核苷酸的多核苷酸可操作地连接的启动子,其中所表达的反义寡核苷酸的序列与成熟miR-144序列部分或完全互补。在替代实施例中,用于表达miR-144抑制剂的表达载体包括与编码shRNA或siRNA的多核苷酸可操作连接的一个或多个启动子,其中所表达的shRNA或siRNA包括与成熟miR-144部分或基本上相同和互补的双链区。
“可操作地连接”或“在转录控制下”包含:启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向,以控制通过RNA聚合酶进行的转录的启动和多核苷酸的表达。
“启动子”包含由细胞的合成机器(synthetic machinery)或引入的合成机器识别的、启动基因的特异性转录所需的DNA序列。病毒、哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子的用途在本领域中是众所周知的以实现所关注的编码序列的表达,并且包含人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)长末端重复、大鼠胰岛素启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶
可以通过多种方式将表达载体引入细胞。在本发明的某些实施例中,表达构建体包括病毒或源自病毒基因组的工程化构建体。某些病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并稳定且有效地表达病毒基因的能力已经使其成为用于将外源基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选者。体内递送的优选方法之一涉及使用腺病毒表达载体。
“腺病毒表达载体”包含那些含有足以(a)支持构建体的包装和(b)表达已在其中克隆的本文所述的核酸药剂的腺病毒序列的构建体。表达载体包括基因工程形式的腺病毒。本领域已知腺病毒适合用作基因转移载体,因为它的基因组大小中等、易于操作、滴度高、靶细胞范围广和传染性高。病毒载体可以直接注射到肝脏的传入血管(门静脉)或胆管中,而不是外周循环。
在另一个实施例中,可以使用被称为合成载体的合成化合物和通过去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)或转铁蛋白受体的靶向基因递送来实现肝脏特异性递送。
最近,通过直接缀合到三触角GalNAc糖,通过主要在肝细胞表面表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行受体介导的内吞作用,实现了核酸(siRNA)向肝脏细胞的靶向递送。ASGPR是一种C型凝集素受体,其促进去唾液酸化糖蛋白从血液中的清除。其在肝细胞表面以高拷贝数(每个细胞0.5-1百万)表达,并且每个肝细胞每小时可以内吞多达5百万个拷贝的ASGPR,从而为药物结合和摄取提供显著的过量受体可用性(Janas,Maja M等人“GalNAc缀合的RNAi疗法在亚急性研究中的非临床安全性概况(The Nonclinical SafetyProfile of GalNAc-conjugated RNAi Therapeutics in Subacute Studies.)”《毒理学病理学(Toxicologic pathology)》第46卷,第7期(2018):735-745)。
在一个实施例中,本发明的核酸药剂以治疗有效量以药学上可接受的载剂形式施用,其剂量范围为(约)0.01ug到(约)1gm;如(约)1mg到(约)100mg/kg体重,这取决于受试者的年龄和所治疗的病症或疾病状态的严重程度。在一个实施例中,反义寡核苷酸以2-5mg/Kg体重的剂量施用。在一个实施例中,反义寡核苷酸以3-4mg/Kg体重的剂量施用。
“药理学有效量”、“治疗有效量”或简言之的“有效量”包含有效产生预期的药理学、治疗性或预防性结果的药剂(如核酸药剂)的量。无不良副作用(如毒性、刺激或过敏反应)。例如,如果当与疾病或病症相关联的可测量的参数(例如,miR-144表达)减少至少25%时,给定的临床治疗被认为是有效的,那么用于该疾病或病症的治疗的药物的治疗的有效量是实现该参数至少减少25%所必需的量。尽管个体需要可能不同,但本领域技术人员可以容易地确定药剂有效量的最佳范围。应当理解,人的剂量可以从动物研究中推断出来。通常,提供有效量的药剂所需的剂量(可由本领域技术人员调整)将根据接受者的年龄、健康、身体状况、体重、疾病或病症的类型和程度、治疗频率、并行疗法的性质(如果有的话)以及期望效果的性质和范围而变化。
治疗后,监测受试者的病情变化和肝脏疾病和/或肝脏病状的症状的减轻。如果受试者对当前剂量水平没有显著反应,则可以增加药物的剂量,或者如果观察到病症或疾病状态的症状有所缓解,或者如果病症或疾病状态已经被减轻了,则可以减少剂量。
在一个实施例中,在施用药剂后,受试者的肝脏疾病和/或肝脏病状的一种或多种症状得到改善,例如肝细胞死亡、免疫细胞浸润和/或纤维化。
在肝细胞死亡过程中,细胞角蛋白18(CK18)的可溶性部分的细胞内容物是肝脏中的主要中间丝蛋白,其在细胞死亡过程中被释放到细胞外空间中。因此,可溶性全长和/或CK18片段的血液测量指示肝细胞死亡。这些测量可以使用本领域已知的技术(如ELISA)来进行。
肝脏中的炎性浸润可以通过本领域已知的技术来测量,如测量浸润的T细胞和/或巨噬细胞的肝活检上的免疫组织化学。
在一个实施例中,药剂与额外的疗法组合施用。
本发明的药剂可以与用于治疗肝脏疾病和/或病状的常规疗法的施用组合使用。
在一个实施例中,所述额外的疗法是降脂疗法,如HMG-CoA还原酶抑制剂。
“降脂”包含随着时间的推移受试者中一种或多种血清脂质的减少。
如本文所使用的,术语“降脂疗法”是指提供给受试者以减少受试者中的一种或多种脂质的治疗方案。在某些实施例中,提供降脂疗法以减少个体中的总胆固醇、ApoB、LDL-C、VLDL-C、IDL-C、非HDL-C、甘油三酯、小而致密的LDL颗粒和Lp(a)中的一种或多种。
HMG-CoA还原酶抑制剂,也被称为“他汀类药物”,是一类可降低患有心血管疾病或有患上心血管疾病风险的受试者的胆固醇水平的药物。它们通过抑制酶HMG-CoA还原酶来降低胆固醇,所述酶是胆固醇合成的甲羟戊酸通路的限速酶。抑制肝脏中的这种酶会导致胆固醇合成减少以及LDL受体合成增加,从而导致血流中低密度脂蛋白(LDL)的清除增加。他汀类药物的实例可以选自由以下组成的组:阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。他汀类药物治疗的具体指南可以在表A中找到(如《美国心脏协会指南(American Heart Association guidelines)》中所述):
缩写:LDL-C,低密度脂蛋白胆固醇。
粗体类型表示在随机对照试验和胆固醇治疗试验者的2010年荟萃分析中评估的特定他汀类药物和剂量。所有这些随机对照试验都证明了主要心血管事件的减少。非粗体类型表示已获得FDA批准但未在审查的RCT中测试的他汀类药物和剂量。
优选地,药剂的施用延迟和/或防止受试者从NASH进展为纤维化、肝硬化和/或肝细胞癌。
NAFLD向HCC的进展可以如下所示:NAFLD/脂肪肝到NASH,到轻度纤维化的NASH,到严重纤维化的NASH,到肝硬化,最后到HCC。
优选地,药剂被配制和/或适用于递送和/或被肝脏细胞摄取。
“配制和/或适用于被肝脏细胞摄取”包含:药剂处于某种形式,如包括在特定载体中,这导致其被肝脏细胞摄取的程度高于药剂被另一种器官类型(如大脑)的细胞摄取的程度。
“配制和/或适用于递送至肝脏细胞”包含:药剂处于某种形式,如包括在特定载体中,这导致其被递送至肝脏细胞的程度高于药剂被递送至另一种器官类型(如大脑)的细胞的程度。
在一个实施例中,肝脏细胞对药剂的摄取是受体介导的。受体介导的肝脏细胞摄取的实例包含通过主要在肝细胞表面表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行的受体介导的内吞作用和通过表达凝集素-1受体的巨噬细胞和树突状细胞进行的受体介导的吞噬作用。
如上文所讨论的,将药剂封装在从酿酒酵母中提取的并且主要由β-1,3-d-葡聚糖(凝集素-1受体和由巨噬细胞表达的其它受体的配体)构成的微米大小的葡聚糖中可以通过肝脏的巨噬细胞帮助受体介导的吞噬作用。
在一个实施例中,药剂是葡聚糖封装的。
在另一方面,本发明提供了一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂,所述药剂用于在受试者中抑制其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的进展。
在另一方面,本发明提供了一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂在制备用于在受试者中抑制其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的进展的药物中的用途。
在另一方面,本发明提供了一种用于在受试者中抑制其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的进展的方法,其中所述方法包括向所述受试者施用抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂。
此外,肝脏中的氧化应激与脂肪肝(NAFLD)向NASH、纤维化和肝细胞癌的进展有关。防止氧化应激的主要机制是核因子红细胞2相关因子2(NRF2)/ARE通路,其诱导抗氧化反应基因的表达。这种不适当的脂质积聚会导致氧化应激和活性氧(ROS)的过量产生。
“抑制进展”包含脂肪肝(NAFLD)进展为NASH、进展为轻度纤维化的NASH、进展为严重纤维化的NASH、进展为肝硬化、进展为HCC。
在另一方面,本发明提供了一种用于鉴定有患上其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状风险的受试者的方法,所述方法包括:
a)从受试者获得和/或提供测试样品;
b)确定所述测试样品中miR-144的表达和/或活性,
其中miR-144相对于对照的表达和/或活性表明受试者是否有患上其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的风险。
在特别优选的实施例中,确定miR-144的表达和/或活性相对于对照增加表明受试者处于患其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的风险。
在一个实施例中,与对照样品相比,测试样品中miR-144的表达和/或活性增加至少2倍。
优选地,用于鉴定有患上其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状风险的受试者的方法进一步包括向患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者施用有效量的疗法,例如其中所述方法包括施用抑制miR-144的药剂。
在一些实施例中,在向受试者施用抑制miRNA-144的药剂之后测量miR-144的表达和/或活性。在一些实施例中,miR-144的表达和/或活性被测量一次或两次。
在另一方面,本发明提供了一种用于鉴定患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者的方法,所述方法包括:
a)从受试者获得和/或提供测试样品;
b)确定所述测试样品中miR-144的表达和/或活性,
其中miR-144相对于对照样品的表达和/或活性表明受试者是否患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状。
在特别优选的实施例中,确定miR-144的表达和/或活性相对于对照增加表明受试者患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状。
在一个实施例中,与对照样品相比,测试样品中miR-144的表达和/或活性增加至少2倍。
优选地,用于鉴定患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者的方法进一步包括向患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者施用有效量的疗法,例如其中所述方法包括施用抑制miR-144的药剂。
在一些实施例中,在向受试者施用抑制miRNA-144的药剂之后测量miR-144的表达和/或活性。在一些实施例中,miR-144的表达和/或活性被测量一次或两次。
在另一方面,本发明提供了一种用于预测患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者对用抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂进行治疗的反应的方法,所述方法包括:
a)从受试者获得和/或提供测试样品;
b)确定所述测试样品中miR-144的表达和/或活性,
其中miR-144相对于对照样品的表达和/或活性表明受试者将对用所述药剂进行的治疗产生反应。
在特别优选的实施例中,确定miR-144的表达和/或活性相对于对照增加表明受试者将对用所述药剂进行的治疗产生反应。
在一个实施例中,与对照样品相比,测试样品中miR-144的表达和/或活性增加至少2倍。
优选地,用于预测患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者的反应的方法进一步包括向患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者施用有效量的疗法,例如其中所述方法包括施用抑制miR-144的药剂。
在一些实施例中,在向受试者施用抑制miRNA-144的药剂之后测量miR-144的表达和/或活性。在一些实施例中,miR-144的表达和/或活性被测量一次或两次。
用于确定miR-144的表达和/或活性的方法如本文所述。
可用于本发明的方法和用途的测试样品的实例包含但不限于肝活检、血浆和/或血清。“血清”包含血液凝固后剩余的血浆部分。
本发明的另一方面提供了一种miR-144的表达和/或活性在受试者中鉴定其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的用途,其中相对于对照样品,来自所述受试者的测试样品中增加的miR-144的表达和/或活性的存在表明所述受试者患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状。
在一个实施例中,所述用途是体外用途。
优选地,所述用途进一步包括向患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者施用有效量的疗法,例如施用抑制miR-144的药剂。
优选地,其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病症状如前述权利要求中任一项所定义。
在一个实施例中,所述用途包括确定来自受试者的测试样品和/或对照样品中的miR-144的表达和/或活性。
优选地,与对照样品相比,测试样品中miR-144的表达和/或活性增加至少2倍。
因此,本发明提供了一种用于在受试者中诊断其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供来自所述受试者的测试样品;
(b)测量miR-144的表达;
其中与对照样品相比,miR-144水平升高表明受试者患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状或有患上所述肝脏疾病和/或肝脏病状的风险。
从所附实例中可以看出,发明人观察到,miR-144表达在来自高脂肪饮食(HFD)小鼠的分离的肝脏巨噬细胞中(图2C)以及在HFD喂养和ob/ob小鼠的肝脏中与其各自的对照相比增加(图2D)。观察到的miR-144的增加是肝脏特异性的,因为它在从肥胖小鼠分离的脾脏、肺和内脏脂肪组织(VAT)中的表达保持不变(图8A-C(S2A-C))。
miR-144的表达水平可以通过微阵列分析、RT-PCR、Northern印迹或本文所述或本领域已知的其它合适的方法来确定。
在一个实施例中,测试样品包括一种或多种肝脏细胞。在替代实施例中,测试样品不包括肝脏细胞。
可用于本发明的方法和用途的测试样品的实例包含但不限于肝活检、血浆和/或血清。“血清”包含血液凝固后剩余的血浆部分。
在一个实施例中,对照样品包括其中不存在氧化应激的一种或多种肝脏细胞,例如来自肝脏中没有氧化应激的受试者的肝脏细胞。在替代实施例中,对照样品不包括肝脏细胞。
可用于本发明的方法和用途的对照样品的实例包含但不限于来自苗条且健康的受试者的肝脏、血浆和/或血清样品。
受试者的其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状如本文所定义。
在另一方面,本发明提供了一种药物组合物,其包括抑制miR-144的药剂,所述药剂被配制和/或适用于递送至肝脏的吞噬细胞。
优选地,药剂如本文所定义。
“药学上可接受的”包含调配物是无菌的且不含热原的。合适的药物载剂、稀释剂和赋形剂是药剂学领域众所周知的。在与抑制剂相容并且对其接受者无害的意义上,一种或多种载剂必须是“可接受的”。典型地,载体将会是将是无菌的且不含热原的水或盐水;然而,可以使用其它可接受的载剂。
在一个实施例中,本发明的药物组合物或调配物用于肠胃外施用,更具体地说,用于静脉内皮下施用。在优选的实施例中,所述药物组合物适于例如通过注射向患者静脉内施用。
适于肠胃外施用的调配物包含:水性和非水性无菌注射溶液,所述水性和非水性注射溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质;以及水性和非水性无菌混悬剂,所述水性和非水性无菌混悬剂可以包含悬浮剂和增稠剂。
在替代的优选实施例中,所述药物组合物适于向患者局部施用。
优选地,调配物可以是含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的活性成分的单位剂量。
所述药剂或活性成分可以以药学上可接受的剂型以包括活性成分的药物调配物的形式、任选地以无毒的有机或无机酸或碱加成盐的形式口服或通过任何肠胃外途径施用。取决于病症和待治疗的患者以及施用途径,组合物可以以不同剂量来施用。
在人疗法中,所述药剂或活性成分通常会与根据预期的施用途径和标准药学实践所选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载剂混合施用。
例如,所述药剂或活性成分可以以片剂、胶囊、珠粒剂(ovule)、酏剂、溶液或悬浮液的形式口服、经颊或舌下施用,其可以含有调味剂或着色剂,以用于速释、缓释或控释应用。所述活性成分也可以通过海绵体内注射施用。
合适的片剂可以含有:赋形剂,如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸;崩解剂,如淀粉(优选地,玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐;以及造粒结合剂,如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外,可以包含润滑剂,如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。
还可以采用类似类型的固体组合物作为明胶胶囊中的填充剂。在这方面,优选的赋形剂包含乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂,可以将本发明的化合物与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料、与乳化剂和/或悬浮剂以及与如水、乙醇、丙二醇和甘油以及其组合等稀释剂组合。
所述药剂或活性成分也可以肠胃外(例如,静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下)施用,或者它们可以通过输注技术施用。最好以无菌水溶液的形式使用所述药剂或活性成分,所述无菌水溶液可以含有其它物质(例如,足够的盐或葡萄糖)以使溶液与血液等渗。如有必要,应适当缓冲所述水溶液(优选地,缓冲到pH为3到9)。通过本领域的技术人员中众所周知的标准制药技术容易地实现在无菌条件下制备合适的肠胃外调配物。
所述调配物可以存在于单位剂量或多剂量容器(例如,密封的安瓿瓶和小瓶)中,并且可以在仅需要在使用前一刻添加无菌液体载剂(例如,注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
对于向人类患者口服和肠胃外施用,药剂、抗体或化合物的每日剂量水平通常会是每个成人1到1,000mg(即,约0.015到15mg/kg),以单个剂量或分次剂量施用。
因此,例如,所述药剂或活性成分的片剂或胶囊可以含有1mg到1,000mg的药剂或活性剂,以视情况在某个时间时一次或两次或更多次施用。在任何情况下,医生将确定最适合于任何个体患者的实际剂量,并且所述实际剂量将随着特定患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是一般情况的示例。当然,可以存在个别情况,其中更高或更低的剂量范围是理所当然的,并且此类剂量范围处于本发明的范围内。
所述药剂或活性成分还可以鼻内施用或通过吸入施用并且以干粉吸入器或气雾剂喷雾呈现的形式使用合适的推进剂(例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃(如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3))、二氧化碳或其它合适的气体)从加压容器、泵、喷雾器或雾化器方便地递送。在加压气雾剂的情况下,剂量单位可以通过提供阀门来递送计量的量来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性化合物(例如,使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂)的溶液或悬浮液,所述活性化合物可以另外含有润滑剂(例如,脱水山梨糖醇三油酸酯)。可以将用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如,由明胶构成)配置成含有活性成分和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。此类调配物对于治疗肺的实体瘤(例如,小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胸膜肺母细胞瘤或类癌瘤)可能特别有用。
优选地,气雾剂或干粉调配物被布置成使得每个计量的剂量或“粉扑”含有至少1mg的抑制剂以递送给患者。应当理解,气雾剂的每日总剂量将因患者而有所不同,并且可以一整天以单个剂量或更通常地以分次剂量施用。
可替代地,所述药剂或活性成分可以以栓剂或子宫托的形式施用,特别是用于治疗或靶向结肠肿瘤、直肠肿瘤或前列腺肿瘤。
所述药剂或活性成分也可以通过眼部途径施用。对于眼科使用,抑制剂可以在等渗的、经pH调整的无菌盐水中配制成微粒化悬浮液,或者优选地在等渗的、经pH调整的无菌盐水中配制成溶液,任选地与防腐剂(如苯扎氯铵)组合。可替代地,其可以配制成软膏,如矿脂。此类调配物对于治疗眼实体瘤可能特别有用,如视网膜母细胞瘤、髓上皮瘤、葡萄膜黑色素瘤、横纹肌肉瘤、眼内淋巴瘤或眼眶淋巴瘤。
药剂或活性成分可以以洗剂、溶液、乳膏、软膏或扑粉的形式局部施用,或者可以例如通过使用皮肤贴剂经皮施用。为了局部施用于皮肤,活性成分可以配制成合适的软膏,其含有悬浮或溶解在例如与以下一种或多种的混合物中的活性化合物:矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替代地,其可以配制成悬浮或溶解在例如与以下一种或多种的混合物中的合适洗剂或乳膏:矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。此类调配物对于治疗皮肤实体瘤可能特别有用,如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑色素瘤。
适于在口中局部施用的调配物包含:锭剂,其包括调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性成分;软锭剂,其包括惰性基质(如明胶和甘油,或蔗糖和阿拉伯胶)中的药剂或活性成分;以及漱口水,其包括合适的液体载剂中的活性成分。此类调配物对于治疗口腔和咽喉的实体瘤可能特别有用。
在一个实施例中,所述药剂或活性成分可以使用可注射的缓释药物递送系统来递送。这些是专门为减少注射频率而设计的。此种系统的实例是Nutropin Depot,其将重组人生长激素(rhGH)封装在可生物降解的微球中,一旦注射,所述可生物降解的微球就可以在持续的时段内缓慢释放rhGH。
所述药剂或活性成分可以通过将药物直接释放到所需部位(例如,到眼睛中以治疗眼肿瘤)的外科手术植入式装置来施用。向疾病部位的此种直接施用在没有显著的系统性副作用的情况下实现有效疗法。
用于递送药剂或活性成分的替代性方法是Regel可注射系统,其是热敏的。在体温以下,Regel是可注射液体,而在体温处,其立即形成缓慢侵蚀并且溶解成已知的、安全的、可生物降解的聚合物的凝胶储存库。随着生物聚合物溶解,活性药物随时间而递送。
多肽药物也可以口服递送。过程采用自然过程以口服摄取身体中的维生素B12以共同递送蛋白质和肽。通过利用维生素B12摄取系统,蛋白质或肽可以移动通过肠壁。复合物在维生素B12类似物与药物之间合成,所述复合物保留对复合物的维生素B12部分中的对因子(IF)的显著亲和力和复合物的药物部分的显著生物活性两者。
可以将多核苷酸作为如下文所描述的合适的基因构建体施用并且递送给表达其的患者。通常,基因构建体中的多核苷酸可操作地连接到可以在细胞中表达化合物的启动子。本发明的基因构建体可以使用本领域众所周知的方法(例如,在Sambrook等人(2001)中)来制备。
尽管用于递送多核苷酸的基因构建体可以是DNA或RNA,但是如果它们是DNA则是优选的。
优选地,基因构建体适于递送到人细胞。将基因构建体引入细胞中的手段和方法是本领域已知的并且包含使用免疫脂质体、脂质体、病毒载体(包含牛痘、经过修饰的牛痘、慢病毒、细小病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体)以及通过例如使用基因枪和电穿孔直接递送DNA。此外,将多核苷酸递送到患者的靶组织以进行治疗的方法也是本领域众所周知的。在替代性方法中,采用使用受体介导的内吞作用将DNA大分子携带到细胞中的高效核酸递送系统。这是通过将铁转运蛋白转铁蛋白与结合核酸的聚阳离子缀合来完成的。使用通过Cotten等人(1992)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》89,6094-6098的方法产生的有缺陷的或化学灭活的腺病毒颗粒的内体破坏活性对本发明的DNA构建体或其它基因构建体进行的高效的受体介导的递送也可以被使用。应当理解,“裸DNA”和与阳离子脂质和中性脂质复合的DNA也可以用于将本发明的DNA引入待治疗个体的细胞中。基因疗法的非病毒方法在Ledley(1995,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》6,1129-1144)中进行了描述。
尽管对于特定组织的癌症/肿瘤,在编码多核苷酸抑制剂的载体中使用组织特异性启动子可能是有用的,但是这并不是必需的,因为与对患有癌症/肿瘤的患者的治疗益处相比,预期活性成分在除癌症/肿瘤之外的位置处在身体中表达的风险是可容忍的。可能期望能够暂时调节多核苷酸抑制剂在细胞中的表达,尽管这也不是必需的。
在一个实施例中,药物组合物包括被封装用于受体介导的肝脏吞噬细胞摄取的药剂。
在一个实施例中,药物组合物被配制用于注射。
本发明的另一方面提供了如本文所述的药物组合物,其用于医药。
本发明的另一方面提供了一种部件试剂盒,其包括如本文所述的药物组合物和/或用于测量miR-144的表达水平的试剂。
在一些实施例中,所述试剂盒包括本文的一种或多种药剂和/或化合物。所述试剂盒还可以含有使用说明书。在一些实施例中,所述试剂盒可以含有对照样品(例如,对miR-144呈阳性和阴性的样品)和引物(对miR-144和作为内部对照的miRNA(例如RNAU6)具有特异性)以测量miR-144的表达水平以用于诊断。
在本发明的另一方面,提供了用于将本文的化合物施用给受试者的试剂盒。在这种情况下,除了包括至少一种如本文所述的药剂外,所述试剂盒可以进一步包括以下中的一种或多种:注射器、酒精棉签、棉球和/或纱布垫。在一些实施例中,抑制miR-144的药剂可以存在于预填充注射器中而不是小瓶中。多个预填充注射器,如10个,可以存在于例如分配包中。所述试剂盒还可以含有用于施用本文所述药剂的说明书。
在一个实施例中,药剂、用途、方法或组合物基本上参考所附描述、实例和附图如本文所示和所述。
本文引用的所有文件均通过引用整体并入本文。
本说明书中对显然在前公开的文件的列举或讨论不应必然地被视为是承认所述文件是现有技术的一部分或是公知常识。
附图说明
现在,将参考以下附图和实例来描述本发明。
现在,将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选的非限制性实例:
图1.LM中的氧化应激未能在肥胖症诱导的胰岛素抵抗中引发适当的抗氧化反应。(A)持续9周喂食HFD或ND的小鼠的肝油红O染色(比例尺,100μm);(B)持续9周喂食HFD或ND的小鼠的肝脏MDA含量(每组n=4);(C)来自持续9周喂食HFD或ND的小鼠的LM的培养基上的细胞外H2O2含量(每种情况n=4);(D-E)与wt相比,来自在9周和14周ob/ob小鼠的LM中差异表达的基因的基因本体论(GO)生物过程(D)和富集通路(E)的所选显著丰富术语(n=4wt,n=3ob/ob,持续9周;n=4,持续14周);(F-G)来自9周龄和14周龄的wt和ob/ob小鼠的RNA-seq(F)以及来自持续9周喂食HFD或ND的小鼠的GRO-seq(G)的Nrf2 mRNA表达数据(n=4wt,n=3ob/ob,ND,HFD,持续9周;n=4,持续14周);(H-I)在9周龄和14周龄ob/ob小鼠的RNA-seq(H)中与wt相比,以及在持续9周喂食HFD的小鼠的GRO-seq(I)中与ND相比,NRF2靶基因的百分比显著上调(“上调”)、下调(“下调”)或没有差异表达(“无变化”)(n=4wt,ND,HFD,n=3ob/ob,持续9周;n=4,持续14周);(J)对来自持续9周喂食HFD或ND的小鼠的LM上的NRF2的WB分析(每种情况n=3);(K)对来自持续9周喂食HFD或ND的小鼠的肝细胞上的NRF2的WB分析(每种情况n=3);(L)对来自持续9周喂食HFD或ND的小鼠和14周龄的ob/ob小鼠的整个肝脏上的NRF2的WB分析(每种情况n=3);(M-N)来自苗条、OIS和OIR人类个体的肝脏中的总细胞内ROS/RNS含量(M)和细胞内ROS水平(N)(每种情况n=5);(O)通过RT-qPCR在来自苗条、OIS和OIR人类个体的肝脏上测量的Nrf2 mRNA水平(每种情况n=5)。与苗条相比的倍数变化(F.C.)计算。(P)对来自苗条、OIS和OIR人类个体的肝脏上的NRF2的WB分析(每种情况n=5)。数据是平均值±SEM。所有WB量化都与b-肌动蛋白水平进行比较。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。另见表4和图7(S1)。
图2.miR-144的表达在肥胖的LM中增加并靶向NRF2的翻译。(A)KEAP1在来自苗条、OIS和OIR人类个体的肝脏上免疫沉淀后,NRF2和KEAP1的WB(每种情况n=3)。与KEAP-1水平相比的量化;(B-C)与wt相比,9周龄(B)和14周龄(C)ob/ob的LM中显著且普遍上调的miRNA的热图(n=4wt,n=3ob/ob,持续9周;每种情况n=4,持续14周;)(D)对来自持续9周喂食HFD或ND的小鼠的LM上的miR-的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=3);(E)对来自持续9周喂食HFD或ND的小鼠和14周龄的ob/ob小鼠的肝脏上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=3);(F)对来自苗条、OIS和OIR人类个体的肝脏上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=5)。数据是平均值±SEM。所有qPCR数据都是与ND喂养的小鼠或苗条个体相比的倍数变化(F.C.)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。RPM,每百万次读取的读数。另见图8(S2)。
图3.转录因子GATA4驱动miR-144在胰岛素抵抗患者肝脏中的表达。(A)对miR-144237启动子区域上的GATA4结合结构域的计算机预测分析(软件CISTER);(B)示出来自苗条、OIS和OIR人类个体的肝脏中的磷酸化GATA4和GATA4的WB分析(每种情况n=3)。与b-肌动蛋白水平相比的量化;(C-D)对来自苗条和OIR人类个体的肝脏的miR-144启动子上的GATA4和H3K4me3相对富集的ChIP-qPCR分析(每种情况n=3)。数据是与苗条相比的倍数变化(F.C.),并通过IgG归一化。(E)示出来自苗条、OIS和OIR人类个体的肝脏上的磷酸化ERK1/2和ERK1/2的WB分析(每种情况n=3)。p-ERK1/2/ERK1/2比率的量化;(F)对来自ob/+、ob/ob和ob/ob-Erk1-/-小鼠的肝脏上的p-GATA4、GATA4和ERK1/2的WB分析(每种情况n=7)。与b-肌动蛋白水平相比的量化;(G)对来自ob/+、ob/ob和ob/ob-Erk1-/-小鼠的肝脏上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=7)。数据是与ob/+相比的倍数变化(F.C.)。数据是平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。
图4.使肝脏巨噬细胞中的miR-144沉默会减少ROS释放并导致肝细胞中miR-144的表达降低。(A)GeRP-amiR-144处理的方案;(B-C)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的LM(B)和肝细胞(C)上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4);(D)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏、LM和肝细胞上的miR-532的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4);(E-F)来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的LM(E)和肝细胞(F)的培养基上的细胞外H2O2含量(每种情况n=4);(G)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝细胞上的p-GATA4和GATA4的WB分析(每种情况n=3)。p-GATA4/GATA4比率的量化;(H)对暴露于H2O2并用加扰和GeRP-amiR-144处理的人NPC上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=3);(I)对暴露于H2O2并用加扰和GeRP-amiR-144处理的人NPC上的GATA4的RT-qPCR分析(每种情况n=3);(J)对暴露于H2O2并用加扰和GeRP-amiR-144处理的人NPC上的NRF2靶基因NQO1、GSTP1和CES2G的RT-qPCR分析(每种情况n=3);(K)来自暴露于H2O2并用加扰和GeRP-amiR-144处理的人NPC的培养基上的细胞外H2O2含量(每种情况n=3);(L)对来自暴露于H2O2并用加扰和GeRP-amiR-144处理的人肝球体的肝细胞(Hep)上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(来自1个人类供体的合并肝脏器官);(M)肝球体细胞类型比例和处理的示意图;(N)对来自暴露于FFA并用加扰和amiR-144处理的人肝球体的肝细胞(Hep)和NPC上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(来自1个人类供体的合并肝球体);(O)对来自暴露于FFA并用加扰和amiR-144处理的人肝球体的肝细胞(Hep)上的NRF2靶基因NQO1、GSTP1和CES2G的RT-qPCR分析(来自1个人类供体的合并肝球体)。数据是平均值±SEM。所有qPCR数据都是与scr相比的倍数变化(F.C.)。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。另见图9(S3)。
图5.使LM中的miR-144沉默会减少氧化应激并改善胰岛素抵抗中的肝脏代谢。(A-C)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏(A)、LM(B)和肝细胞(C)上的NRF2的WB分析(每种情况n=4);(D-E)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的LM和肝细胞上的NRF2靶基因:Nqo1、Gstp1和Ces2G的RT-qPCR分析(每种情况n=4);(F)来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏中的总细胞内ROS/RNS含量(每种情况n=4);(G-H)来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝细胞上的细胞内ROS(G)和RNS(H)水平(每种情况n=4);(I)来自加扰和GeRP-amiR-144处理的ND喂养小鼠的常驻和募集巨噬细胞的百分比(每种情况n=4);(J)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的ND喂养小鼠的CD45+/F4/80+/Cd11b+/FITC+LM上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4);(K)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的ND喂养小鼠的CD45+/F4/80+/Cd11b+/FITC-LM上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4);(L)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的ND喂养小鼠的CD45-/FITC-NPC上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4);(M)对来自加扰和GeRP-amiR-144处理的ND喂养小鼠的肝细胞上的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4);(N)显示来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏中的线粒体数量增加的透射电子显微镜(每种情况n=2)。黑色箭头描绘线粒体(比例尺,500nm);(O)来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏中的每个切片的线粒体数量(每种情况n=20个切片);(P)显示来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏中储存的糖原增加的透射电子显微镜(每种情况n=2)。黑色箭头描绘糖原沉积物(比例尺,500nm);(Q)加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的IP-GTT(每种情况n=5)。数据是平均值±SEM。所有WB量化都与b-肌动蛋白水平进行比较。所有qPCR数据都是与scr相比的面积倍数变化(F.C.)。*p<0.05,****p<0.0001。另见图10(S4)。
图6.LM对肥胖症的氧化应激调节模型。肥胖症期间肝脏中过多的脂质积聚会导致氧化应激。LM在没有明显的促炎表型的情况下加剧了ROS的释放。ROS,作为辅助信使,活化ERK和GATA4,从而增加miR-144(一种靶向NRF2的miRNA)的表达。随后NRF2蛋白的下调防止这两种细胞类型参与适当的抗氧化反应。
图7(S1).LM中的氧化应激未能在肥胖症诱导的胰岛素抵抗中引发适当的抗氧化反应。(A)持续9周喂食HFD或ND的小鼠的体重(每种情况n=10);(B)持续9周喂食HFD或ND的小鼠的IP-GTT(每种情况n=10);(C)来自GRO-seq数据集的基因本体论(GO)分析,其将持续9周喂食HFD的小鼠与ND进行比较;(D)来自RNA-seq数据集的基因本体论(GO)分析,其将持续9周喂食HFD的小鼠与ND进行比较。(E)与wt相比,ob/ob小鼠中促炎细胞因子、抗炎细胞因子、巨噬细胞、M1和M2标志物靶标的表达热图(n=4wt,n=3ob/ob,持续9周;每种情况n=4,持续14周);数据是平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。FPKM,每千碱基百万个片段。与图1相关。
图8(S2).miR-144的表达在肥胖的LM中增加并靶向NRF2的翻译。(A)NRF2在从苗条、OIS和OIR人类个体分离的肝脏中免疫沉淀出后,泛素和NRF2的WB(每种情况n=3)。代表NRF2泛素化/NRF2水平比率的密度测定法。(B)在来自HFD和ND喂养小鼠的内脏脂肪组织(VAT)上执行的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=3)。数据表示为与ND喂养相比的倍数变化(F.C.);(C)在来自HFD和ND喂养小鼠的脾脏上执行的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=3)。数据表示为与ND喂养相比的倍数变化(F.C.);(D)在来自HFD和ND喂养小鼠的肺上执行的miR-144的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=3)。数据表示为与ND喂养相比的倍数变化(F.C.)。与图2相关。
图9(S3).使LM中的miR-144沉默会减少ROS释放并导致肝细胞中miR-144的表达降低。(A)在从加扰和GeRP-amiR-192处理的小鼠分离的LM上执行的miR-192的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4)。数据表示为与scr相比的倍数变化(F.C.);(B)在从加扰和GeRP-amiR-192处理的小鼠分离的肝细胞上执行的miR-192的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4)。数据表示为与scr相比的倍数变化(F.C.);(C)在从加扰和GeRP-mimic-miR-192处理的小鼠分离的LM上执行的miR-192的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4)。数据表示为与scr相比的倍数变化(F.C.);(D)在从加扰和GeRP-mimic-miR-192处理的小鼠分离的肝细胞上执行的miR-192的茎环RT-qPCR分析(每种情况n=4);(E)从LM的培养基中分离出的EV的浓度,所述LM分离自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠(每种情况n=4);(F)从LM收集的培养基中的EV含量,所述LM分离自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠(每种情况n=4);(G)对从LM的培养基中分离的EV上的miR-144的茎环RT-qPCR分析,所述LM分离自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠(每种情况n=4)。DCt-2值;(H)对从LM的培养基中分离的EV上的UNISP6的茎环RT-qPCR分析,所述LM分离自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠(每种情况n=4)。Ct值;(I)对从LM的培养基中分离的EV上的miR-126的茎环RT-qPCR分析,所述LM分离自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠(每种情况n=4)。DCt-2值。数据是平均值±SEM。**p<0.01。与图4相关。
图10(S4).使LM中的miR-144沉默会减少氧化应激并改善胰岛素抵抗中的肝脏代谢。(A)加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的体重(每种情况n=10)(B)加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏甘油三酯含量(每种情况n=4);(C)来自加扰和GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏的H&E染色(比例尺,100μm);(D)GeRP-amiR-192处理的小鼠中的IP-GTT。处理的第0天对比第7天。(每种情况n=4)。与图5相关。
图11.(A)在来自OIS、OIR和NASH人类个体的人血清上执行的miR-144表达的茎环RT-qPCR分析(n=6OIR、OIS;n=5NASH)(B)在持续12周喂食ND饮食的苗条和ob/ob小鼠或喂食高反式脂肪(40%)、果糖(22%)和胆固醇(2%)饮食(这会诱导NASH)的ob/ob小鼠中执行的miR-144表达的qPCR分析(对于苗条和ob/ob,n=3,并且对于患NASH的ob/ob,n=5)。(C)在从健康患者和受NASH影响的肥胖患者收集的肝活检中执行的miR-144表达的茎环RT-qPCR分析。NAS指数评分是NASH不同阶段的标志物。NAS指数由汉堡-埃彭多夫大学医院(Hamburg-Eppendorf)的病理学家评分。对于健康,n=5;对于NAS评分4,n=8;对于NAS评分5,n=4;并且对于NAS评分6,n=2。数据是平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图12.在来自患有或不患有NASH的人类个体的人血清中执行的miR-144表达的茎环RT-qPCR分析(对于不患有NASH,n=10;对于患有NASH,n=15)。数据是平均值±SEM。***p<0.001。
图13.对暴露于FFA并用加扰、amiR-144(Dharmacon;IH-300612-06)和amiR-144(SEQ ID NO10)处理的人NPC上的miR-144的茎环RT-qPCR分析。(每种情况n=3)。数据表示为与scr相比的倍数变化(F.C.)。数据是平均值±SEM。**p<0.01。
具体实施方式
实例1-肝脏巨噬细胞抑制与肥胖症相关的胰岛素抵抗中的内源性抗氧化反应
概述
肝脏巨噬细胞通过阻断内源性抗氧化反应加剧了由肥胖症中的肝脏脂肪变性诱导的氧化应激。
肥胖症和胰岛素抵抗是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的危险因素,所述NAFLD是全世界最常见的慢性肝病。由于目前没有获得批准的药物,也没有针对NAFLD的准确和非侵入性诊断,因此显然需要更好地了解肥胖症与NAFLD之间的联系。肥胖症期间的脂质积聚与肝脏巨噬细胞(LM)的氧化应激和炎症活化有关。然而,我们表明,虽然LM不会促炎,但它们会显示出氧化应激的迹象。在人类和小鼠的肝脏中,抗氧化核因子红细胞2相关因子2(NRF2)的水平随着肥胖症和胰岛素抵抗而下调,从而导致对脂质积聚的反应受损。在分子水平上,靶向NRF2的微小RNA(miR-144)在肥胖胰岛素抵抗人类和小鼠的肝脏中升高,并且LM中miR-144的特异性沉默足以拯救NRF2和抗氧化反应。这些结果突出了LM的病理学作用及其治疗潜力,其恢复与肥胖症相关的NAFLD中受损的内源性抗氧化反应。
介绍
肥胖症是世界范围内的一个主要健康问题,因为体重过重会显著增加多种代谢并发症的风险,包含非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、胰岛素抵抗以及2型糖尿病(T2D)(1、2)。鉴于其在营养物质代谢中的主要作用,肝脏在控制代谢稳态中发挥着核心作用(3)。
脂肪肝是由于肥胖症相关的胰岛素抵抗中脂肪组织的脂肪储存能力较低而导致的过量脂质积聚的结果(4)。肝脏无法处理这种脂肪超载会导致异常的脂质过氧化以及活性氧(ROS)/活性氮(RNS)的过量产生和氧化应激(5)。ROS和RNS被认为会触发肝脏巨噬细胞(LM)从抗炎(M2)到促炎活化状态(M1)的表型转换,从而导致胰岛素抵抗(6、7)。然而,我们最近发现,LM在肥胖症诱导的胰岛素抵抗中不会发炎(8)。我们还证明了,LM产生能够调节胰岛素敏感性的非炎症因子。然而,虽然LM没有发炎,但它们确实显示出氧化应激的迹象。事实上,转录组分析表明,与对照小鼠相比,参与ROS/RNS产生的几种代谢通路,如三羧酸循环(TCA)循环和氧化磷酸化(OXPHOS),在肥胖的LM中受到显著调节(8)。因此,我们假设,LM可以独立于其在肥胖诱导的胰岛素抵抗中的炎症状态来调节氧化应激。
核因子红细胞2相关因子2(NFE2L2/Nrf2),一种碱性亮氨酸拉链转录因子,是氧化还原稳态的主要调节剂(9)。在正常生理条件下,NRF2通过与Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)的结合而靶向蛋白酶体降解。相反,在氧化应激下,这种复合物解离,并且NRF2转移到细胞核,在所述细胞核处其与抗氧化反应元件(ARE)结合,从而驱动抗氧化反应。在肥胖症中,肝脏的抗氧化能力降低,尽管这种损害的分子机制仍然未知(10)。
在本文中,我们报告与健康对照组相比,肥胖胰岛素抵抗人类和小鼠的肝脏中的NRF2蛋白质水平显著降低。有趣的是,NRF2转录、NRF2-KEAP1相互作用和NRF2泛素化在胰岛素抵抗条件下均保持不变,这表明其它转录后机制可能会影响NRF2水平。我们将miR-144鉴定为肥胖症诱导的小鼠和人类胰岛素抵抗中NRF2蛋白质水平的有效调节剂。出乎意料的是,使用一种独特的方法在体内使LM中的基因特异性沉默(11、12),我们发现,使miR-144选择性沉默足以减少LM和肝细胞释放的ROS和RNS,并最终通过在肥胖小鼠中拯救NRF2来减少整个肝脏的积聚。总之,我们的数据表明,在肥胖症诱导的以肝脏脂质过度积聚为特征的胰岛素抵抗中,LM产生能够损害肝脏的抗氧化能力的miRNA,而这与促炎通路的活化无关。
结果
LM中的氧化应激未能在肥胖症诱导的胰岛素抵抗中引发适当的抗氧化反应
增加的脂质过氧化产物是氧化应激的常见标志物。为了证实高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖症与肝脏中脂质过氧化增加有关,我们测量了丙二醛(MDA)的水平,所述丙二醛是脂质过氧化过程中产生的一种活性醛。正如预期的那样,在持续9周喂食HFD的小鼠中,体重显著增加,并且葡萄糖处理受损(图7(S1)A-B),同时脂质积聚和肝脏中MDA水平显著增加(图1A-B)。此外,与对照相比,从喂食HFD的肥胖小鼠中分离出的LM在培养基中的ROS释放显著增加(图1C)。
为了研究肥胖症中LM的表型,我们分析了它们在两个不同年龄(9周龄和14周龄)的肥胖小鼠(ob/ob小鼠)中的转录组谱,并与它们的年龄匹配的野生型(wt)苗条对照进行了比较。基因本体论(GO)富集分析显示氧化应激是肥胖症中最失调的生物过程之一(图1D)。此外,通路分析显示,与苗条小鼠相比,肥胖小鼠中的脂质氧化和抗氧化反应通路显著受损(图1E)。在饮食诱导的肥胖症模型中也观察到了类似的情况,其中与喂食正常饮食的苗条对照相比,参与氧化应激的通路在持续9周喂食高脂肪饮食(HFD)的小鼠的LM中富集(图7(S1)C-D)。与我们之前的研究结果一致(8),转录组学分析未能揭示肥胖症中肝脏巨噬细胞的促炎表型转换(图7(S1)E)。
由于已知氧化应激在转录因子NRF2的控制下触发内源性抗氧化反应,我们测量了它在ob/ob小鼠的LM中的表达。我们观察到,与苗条小鼠相比,在肥胖小鼠的LM中,Nrf2的mRNA表达没有变化(图1F)。由于RNA-seq仅测量稳态转录水平,我们还进行了全局连续测序(GRO-seq),其允许测量新生转录本。这表明Nrf2转录在HFD中保持不变(图1G)。RNA-seq和GRO-seq分析表明,尽管LM中的ROS水平增加,但大多数NRF2靶基因在肥胖症中保持不变(图1H-I,表3(S9)中的完整列表)。
表3(S9).来自HFD小鼠对比ND小鼠的比较(RNA-seq)的差异表达基因富含炎症反应GO生物过程(GO:0006954)。基于FDR<0.05和|log2FoldChange|>1选择基因。
有趣的是,虽然Nrf2 mRNA水平和转录在诱导肥胖症时保持不变,但我们观察到与对照相比,在HFD喂养小鼠的LM中,NRF2蛋白质水平显著降低(图1J)。此外,与对照相比,在HFD喂养小鼠的肝细胞和整个肝脏中,NRF2蛋白质水平均降低(图1K-L)。与wt对照相比,在ob/ob小鼠的肝脏中也观察到NRF2蛋白质水平的这种降低(图1L)。因此,由NRF2驱动的抗氧化反应在来自HFD和遗传诱导的肥胖症的LM和肝细胞中均受损。
为了测试在小鼠肥胖肝脏中观察到的抗氧化反应受损是否也发生在人类中,我们测量了苗条、肥胖的胰岛素敏感(OIS)和肥胖的胰岛素抵抗(OIR)个体中的氧化应激以及NRF2 mRNA和蛋白质水平(表4)。首先,与苗条个体相比,在肥胖患者的肝脏中观察到显著更高的ROS和RNS积聚,这会因胰岛素抵抗而加剧,并证实了肝脏氧化应激、肥胖症和胰岛素抵抗之间的关联(图1M-N)。与小鼠相似,虽然NRF2 mRNA水平没有变化(图1O),但与OIS和苗条个体相比,OIR中的NRF2蛋白质水平显著降低(图1P)。
综上所述,这些结果表明,在小鼠和人类肝脏中,在与肥胖症相关的胰岛素抵抗期间,氧化应激未能诱导NRF2介导的抗氧化反应。
编码 | 性别 | 年龄 | BMI | HOMA-IR | HSI | |
6127 | M | 43 | 37,2 | 0,56 | 46,3 | OIS |
6006 | M | 43 | 40,8 | 1,1 | 51 | OIS |
6108 | M | 40 | 39,2 | 1,56 | 49,8 | OIS |
6141 | M | 54 | 35,8 | 1,69 | 50 | OIS |
6165 | M | 42 | 34,7 | 1,88 | 42,5 | OIS |
6168 | M | 25 | 40,3 | 6,18 | 53,5 | OIR |
6157 | M | 44 | 36,6 | 6,99 | 42,5 | OIR |
6027 | M | 38 | 39,8 | 10,65 | 55,6 | OIR |
5870 | M | 37 | 37,7 | 10,94 | 45,6 | OIR |
6029 | M | 64 | 39,6 | 13,28 | 47,2 | OIR |
表4.研究中选择的人类肥胖胰岛素敏感(OIS)和肥胖胰岛素抵抗(OIR)个体的参数。HOMA,稳态模型评估;通过HOMA-IR方法评估胰岛素敏感性。HIS:肝脂肪变性指数。
miR-144的表达在肥胖的LM中增加并靶向NRF2的翻译
然后,我们研究了NRF2蛋白质水平随着胰岛素抵抗而降低的机制。由于NRF2的转录不受肥胖症影响,并且KEAP1通过其泛素化和蛋白酶体降解作为NRF2的重要调节剂,我们研究了苗条肝脏、OIS肝脏和OIR肝脏中的KEAP1-NRF2相互作用。
令人惊讶的是,尽管OIS和OIR肝脏中的KEAP1蛋白质水平未改变,但与KEAP1相关的NRF2的水平在OIR条件下强烈降低(图2A)。此外,NRF2泛素化水平保持不变(图8(S2)A)。这些数据表明,NRF2的降低不仅是其泛素化的结果,而且可能是由于与KEAP1诱导的降解无关的替代转录后机制。鉴于NRF2在LM中被下调,并且已知miRNA调节转录和翻译两者,我们分析了肥胖动物中的LM miRNome。我们对9周龄和14周龄的ob/ob小鼠以及年龄匹配的wt对照的LM进行了小RNA测序。与匹配的对照相比,在ob/ob小鼠中,六种miRNA显著且通常随肥胖症上调(图2B-C)。使用计算机预测数据库(miRwalk2.0)(13),我们注意到,NRF2是miR-144的经过验证的靶标,所述miR-144是这些上调的miRNA之一。
因此,我们在两种肥胖症模型中进行了茎环RT-qPCR分析。我们发现miR-144的表达在HFD小鼠的分离的LM中(图2D)以及在HFD喂养和ob/ob小鼠的肝脏中与其各自的对照相比增加(图2E)。观察到的miR-144的增加是肝脏特异性的,因为它在肥胖小鼠的脾脏、肺和内脏脂肪组织(VAT)中的表达保持不变(图8(S2)B-D)。此外,与苗条或OIS个体相比,在OIR的肝脏中,miR-144的表达显著增加(图2F)。
总之,这些数据表明,在小鼠和人类肝脏中,miR-144可能均介导与肥胖症相关的胰岛素抵抗中NRF2蛋白质水平的降低。
转录因子GATA4驱动miR-144在胰岛素抵抗患者肝脏中的表达
为了研究触发miR-144在胰岛素抵抗中增加的机制,我们对其启动子区域进行了靶向计算机分析。顺式元素簇查找器(CISTER)软件在miR-144启动子和增强子区域上鉴定出高密度的GATA4结合结构域(图3A)。这一发现促使我们分析LM表达的同工型GATA4的总和/或磷酸化水平是否发生了改变。在来自OIR受试者的肝脏蛋白裂解物中,GATA4磷酸化和蛋白质水平均显著高于OIS和苗条个体(图3B)。为了检验GATA4在胰岛素抵抗中诱导miR-144表达的假设,我们进行了染色质免疫沉淀(ChIP)并分析了GATA4与miR-144启动子区域的特异性结合。ChIP分析证实,与苗条个体相比,GATA4在OIR中增加了与miR-144启动子的结合(图3C)。我们还在胰岛素抵抗条件下观察到更高水平的H3K4me3修饰,这是一种众所周知的活跃转录标志物(图3D),这表明miR-144基因座的活跃转录。
由于已知氧化应激会活化ERK通路,从而通过磷酸化使GATA4活化(14),我们接下来测量了我们人类队列中的ERK1/2活性。我们观察到,ERK1/2磷酸化随着肥胖症而增加,但在IR和IS个体中的程度相似(图3E)。然后,我们利用ob/ob-Erk1-/-小鼠模型(15)来验证ERK通路在调节肥胖症中GATA4活性方面的作用。WB分析显示,与ob/ob和ob/+胰岛素敏感对照小鼠相比,ob/ob-Erk1-/-条件下的磷酸化GATA4显著降低(图3F)。一致地,在ob/ob-Erk1-/-小鼠以及ob/+胰岛素敏感小鼠的肝脏中,miR-144转录水平也如预期的那样降低(图3G)。
这些数据强烈表明,miR-144表达受GATA4控制,所述GATA4在胰岛素抵抗小鼠和人类中被ERK活化。
使肝脏巨噬细胞中的miR-144沉默会减少ROS释放并导致肝细胞中miR-144的表达
降低
为了研究miR-144在体内NRF2调节中的作用,我们利用了葡聚糖封装的RNAi颗粒(GeRP)技术(11、12)。GeRP在LM中特异性地递送siRNA和沉默基因,而不影响肝脏或身体其它部位的其它细胞中的基因表达。持续7周给小鼠喂食HFD,然后用含有靶向miR-144的安塔够妙(amiR-144)或非靶向对照(scr)的GeRP处理(参见图4A中的方案)。分离LM和肝细胞,并通过RT-qPCR测量miR-144的表达。令人惊讶的是,我们观察到miR-144在LM和肝细胞中均显著敲低(图4B-C)。我们通过测量另一种miRNA(miR-532)的表达来解决GeRP介导的miR-144沉默的特异性,所述miR-532在用GeRP-amiR-144处理后保持不变(图4D)。
我们接下来讨论了在用GeRP-amiR-144处理后在肝细胞中观察到的miR-144的沉默是特异于所述特定miRNA的,还是影响所有miRNA的一般机制。因此,我们用装载有靶向另一种miRNA(miR-192)的安塔够妙的GeRP处理小鼠。用GeRP-amiR-192处理显著降低了LM中miR-192的表达,但对肝细胞没有影响(图9(S3)A-B)。此外,GeRP介导的miR-192模拟物的递送不影响肝细胞,而它增加了LM中的miR-192表达(图9(S3)C-D)。由于GeRP介导的肝细胞中miR-144的沉默似乎对这种miRNA具有特异性,我们假设miR144可以通过细胞外囊泡(EV)从LM递送到肝细胞。EV递送可能能够解释为什么使LM中的miR-144沉默会导致肝细胞中miR-144的表达降低。为了验证这一假设,我们从用安塔够妙-144沉默的LM的培养基中分离出EV,并测量了miR-144的水平。虽然对照miRNA(miR-126-3p和UNISP6)存在于来自LM培养基的EV中,但miR-144是检测不到的(图9(S3)E-I)。LM沉默后肝细胞中miR-144表达降低的另一种解释是细胞外ROS水平降低,这将不再诱导肝细胞中miR-144的转录。因此,我们测量了在使LM中的miR-144沉默后在LM和肝细胞的培养基中分泌的H2O2的水平。在LM和肝细胞中,H2O2的分泌均显著减少(图4E-F),这表明LM中miR-144的沉默可以减轻肝脏微环境中的氧化应激。然后,我们测量了在使LM中的miR-144沉默后肝细胞中GATA4的水平和磷酸化。在用GeRP-amiR-144处理后,肝细胞中的GATA4磷酸化降低(图4G),这证实了使LM中的miR-144沉默会导致肝细胞中的miR-144转录减少的观点。
为了进一步研究miR-144和ROS分泌的调节,我们将
286个人非实质细胞(NPC)暴露于H2O2和体外沉默的miR-144(amiR-144)。通过H2O2处理,我们观察到GATA4的表达增加,从而导致miR-144表达增加,所述miR-144表达被amiR-144显著减弱(图4H-I)。正如预期的那样,H2O2显著增加了NRF2抗氧化靶基因的表达,这随着miR-144的沉默而进一步增强(图4J)。在H2O2处理后,人NPC分泌显著更多的H2O2,而这被amiR-144减轻(图4K)。这表明细胞外ROS、细胞内ROS和miR-144/GATA4表达之间存在反馈回路。
使用人原代肝细胞(肝球体)的3D培养模型(16),我们发现,用细胞外H2O2处理足以显著诱导miR-144表达(图4L)。为了更接近地模拟体内肝脏环境,我们将NPC添加到肝球体中,并用游离脂肪酸(FFA)对其进行处理,以概括肥胖肝脏中的脂质超载。形成了三种类型的肝球体:(i)肝细胞和NPC中miR-144水平均正常,(ii)miR-144仅在NPC中沉默或(iii)仅在肝细胞中沉默(图4M)。正如预期的那样,用FFA处理提高了肝球体中miR-144的表达(图4N)。如在小鼠模型中所见,仅在NPC中使miR-144沉默会减少FFA驱动的miR-144诱导(图4N)。用安塔够妙-144处理肝细胞还降低了用FFA处理的球体中的miR-144(图4N)。此外,NPC或肝细胞中的miR-144沉默导致NRF2抗氧化靶基因的表达增加(图4O)。这些结果强调了LM和肝细胞表达的miR-144在调节内源性抗氧化反应中的重要性。考虑到肝脏中LM的百分比较低(6-10%)(8),这些结果支持LM在小鼠和人类中在肥胖症期间调节肝脏中的miR-144表达和ROS分泌的重要性。
使LM中的miR-144沉默会减少氧化应激并改善胰岛素抵抗中的肝脏代谢
在LM中特异性沉默miR-144通过减少GATA4磷酸化来降低肝细胞中miR-144的表达。由于GATA4磷酸化是由氧化应激触发的,我们假设LM中的miR-144沉默可以减少肥胖肝脏中的氧化应激。我们首先测量了用GeRP-amiR-144或GeRP-Scr处理的肥胖小鼠肝脏中的NRF2蛋白质以及ROS和RNS的水平。我们观察到在整个肝脏、LM和肝细胞中,NRF2蛋白质水平在用GeRP-amiR-144处理的小鼠的肝脏中显著增加(图5A-C),随后NRF2靶基因(Nqo1、Gstp1和Ces2G)的表达增加(图5D-E)。与对照相比,LM中miR的持续沉默减少了ROS,并且在较小程度上减少了经处理小鼠肝脏中的RNS(图5F-H)。该结果证实了这样的假设,即由于ROS的产生减少,使LM中的miR-144沉默会导致肝细胞中的miR-144水平降低。为了进一步研究这种机制,我们在产生生理水平的ROS的苗条健康小鼠中使miR-144沉默。用荧光素(FITC)标记的GeRP处理后,通过流式细胞术对含有GeRP的LM(CD45+/F4/80+/Cd11b+/FITC+)、空LM(CD45+/F4/80+/Cd11b+/FITC-)和空的非LM非实质细胞(NPC)(CD45-/FITC-)进行分类,而肝细胞则如方法部分所述进行分离。amiR-144处理并未影响常驻和募集巨噬细胞的百分比(图5I)。此外,虽然miR-144在FITC+LM中成功沉默,但我们观察到任何其它细胞部分中的miR-144水平不受影响(图5J-M)。这些数据进一步证实,使LM沉默后肝细胞中miR-144水平的降低是由于氧化应激减少导致miR-144通过GATA4的转录减少。
然后我们评估了NRF2的增加和肝脏氧化应激的减少是否对全身代谢有影响。在用GeRP-amiR-144处理后,我们并未观察到体重或肝脏中总TG含量的任何显著变化(图10(S4)A-C)。然而,透射电子显微镜(TEM)显示,miR-144沉默后线粒体数量增加,这表明了保护肝细胞免受氧化应激的适应性机制(图5N-O)。有趣的是,用GeRP-amiR-144处理的小鼠肝脏中储存的细胞内糖原水平增加(图5P)。因此,我们评估了使miR-144沉默是否会影响全身葡萄糖代谢。与糖原储存增加一致,用GeRP-amiR-144处理的小鼠的葡萄糖耐量测试显示,与对照小鼠相比,葡萄糖稳态得到改善(图5Q)。这种效应对miR-144是特异性的,因为在用GeRP-amiR-192处理后我们并未检测到任何差异(图10(S4)D)。这些数据表明,由LM和肝细胞表达的miR144可能有助于肥胖症中的肝脏氧化应激和葡萄糖稳态。所有这些结果表明,miR-144能够降低NRF2的水平,从而导致肥胖胰岛素抵抗小鼠和人类的肝脏中的抗氧化反应受损。
讨论
在这项研究中,我们研究了LM在调节肥胖胰岛素抵抗人类和小鼠的肝脏中的抗氧化反应方面的作用(图6)。我们首先证实了肥胖症在小鼠和人类肝脏中引发的氧化应激。先前的研究表明,氧化应激和相关损伤可能代表肥胖症与肝脏疾病之间的联系(17、18、19、20)。
LM对肝脏氧化应激的贡献一直存在争议,尽管有几篇关于LM活化导致肝脏疾病中不平衡和有害的ROS产生的报道(21),但LM在初始疾病状态期间调节氧化应激的直接作用还是未知数。事实上,研究将巨噬细胞(具体地说,LM)描述为ROS的主要来源(22),主要是指促炎活化的巨噬细胞(23)。然而,我们最近证明,LM在小鼠和人类中不会因肥胖症或胰岛素抵抗而发生促炎活化(8)。在本文中,我们发现,脂质氧化和抗氧化反应是两种肥胖症模型中最显著受损的通路之一。
防止氧化应激的主要机制是NRF2/ARE通路,其诱导抗氧化反应基因的表达(24)。我们发现,肥胖小鼠和人类个体中的NRF2蛋白质水平显著降低,这表明抗氧化反应受损。KEAP1已被广泛描述为转录后水平下的NRF2的主要调节剂。在没有氧化应激的情况下,NRF2与KEAP1之间的相互作用促进NRF2的蛋白酶体降解和快速周转(25、26)。相反,在氧化应激条件下,KEAP1半胱氨酸残基的修饰会导致其构象发生变化,从而释放NRF2,所述NRF2然后转移到与ARE结合的细胞核,随后活化抗氧化基因的转录(27)。巨噬细胞的炎症活化与在TCA循环中从柠檬酸盐中产生更高的衣康酸盐有关,所述衣康酸盐然后可以通过KEAP1的烷基化活化NRF2(28)。在这种情况下,衣康酸盐被描述为一种能够减少氧化应激的抗炎代谢物。
在这项研究中,我们发现,Nrf2 mRNA表达在肥胖症诱导的氧化应激下保持不变。此外,KEAP1的水平和NRF2的泛素化在肥胖症期间没有变化,这表明了独立于KEAP1调节NRF2蛋白质水平的不同转录后机制。考虑到LM在肥胖症期间不会发生炎症活化,不同的NRF2调节可能取决于刺激的类型和动力学。在Mills等人的研究中,使用了强效和急性炎症刺激物(脂多糖或IFN-β),而在我们的研究中,巨噬细胞暴露于慢性脂质超载,从而导致氧化应激,所述氧化应激不会诱导炎症活化并且可能需要比快速退化更可持续的调节机制。我们也不排除由于使用不同的巨噬细胞类型(血液和骨髓来源的巨噬细胞对比肝脏巨噬细胞)而导致的差异调节机制。
miRNA是长度约为21-23个核苷酸的短单链非编码RNA(29),它们在3'UTR区域与靶mRNA结合并通过mRNA降解或蛋白质翻译抑制作用发挥其功能(30)。我们假设NRF2可以被miRNA靶向,因此我们分析了来自肥胖和健康小鼠的LM的miRNome。在肥胖LM中检测到的上调的miRNA中,此前曾报道miR-144可降低癌症中的NRF2蛋白质水平(31)。有趣的是,肥胖小鼠和人类的整个肝脏中的miR-144水平也高度增加。更重要的是,胰岛素抵抗与人类中miR-144的显著增加有关。
为了研究miR-144受胰岛素抵抗调节的机制,我们首先进行了计算机预测分析,所述分析检测了miR-144的TSS附近的转录因子GATA4的结合位点。ChIP分析显示,GATA4确实结合了miR-144的启动子区域,从而随后诱导其转录。这与miR-144转录受心肌细胞中的转录因子GATA4调节的报道一致(32)。在小鼠中,通过ERK介导的心肌细胞磷酸化活化GATA4先前已被证明是由高血糖诱导的(14)。我们的调查证实了这些发现,因为我们观察到与苗条对照相比,肥胖患者中的ERK磷酸化增加。此外,肥胖Erk1-/-小鼠肝脏中的GATA4磷酸化显著降低,因此miR-144水平在肥胖症时保持不变。重要的是,虽然与OIS受试者相比,OIR中miR-144的水平有所增加,但ERK1/2磷酸化水平相当。然而,OIR中GATA-4蛋白质的水平较高,这表明OIR和OIS个体之间的miR-144的差异可能不仅是由于GATA4的活化,还与其蛋白质水平有关。
利用GeRP技术专门操纵LM中的基因表达,我们观察到LM中miR-144水平的降低,并且肝细胞中的miR-144水平也降低。后一种结果令人惊讶,因为GeRP无法被递送到非吞噬细胞,如肝细胞(33、8、34)。通过靶向仅在LM中沉默而不在肝细胞中沉默的另一种miRNA(miR-192),证实了GeRP的特定生物分布。基于这些发现,我们首先假设,LM可以通过EV将miR-144递送至肝细胞,因此使LM中的miR-144沉默可能导致LM和肝细胞中的miR-144降低。然而,LM产生的EV不含miR-144,其在miR-144沉默后仍然无法检测到。
另一种可能的解释是,使LM中的miR-144沉默可以减少肝脏中ROS的产生,从而降低肝细胞中miR-144的表达。与这一假设一致,LM中miR-144的敲低显著降低了肥胖小鼠整个肝脏中的氧化应激标志物,这表明LM和肝细胞之间存在串扰。我们的研究结果证实了这一假设,揭示了LM和肝细胞的ROS释放在LM中的miR-144特异性沉默后减少。然而,我们发现肝细胞也可能在miR-144的调节中发挥作用。事实上,在暴露于H2O2或FFA的人原代肝细胞3D培养物(16)中使miR-144沉默能够有效地触发抗氧化反应。因此,ROS可以充当辅助信使,其导致恶性循环,其中LM与肝细胞通讯以增加miR-144的表达,从而导致抗氧化反应受损。有趣的是,ROS释放主要在促炎性巨噬细胞中描述(26、35、36、37),而我们发现,ROS的产生可能与肥胖症中LM的炎症无关。此外,当LM中的miR-144沉默时,肝细胞中的GATA4磷酸化降低,从而证实了LM在调节氧化应激诱导的miR-144转录中的主要作用。由于NRF2蛋白质水平增加,观察到的LM中miR-144沉默后氧化应激的减少可以通过恢复的内源性抗氧化反应来解释。尽管需要额外的工作来研究其中NRF2恢复在亚细胞水平上驱动抗氧化反应的机制,但用安塔够妙-144处理的小鼠肝脏中线粒体数量的增加表明对线粒体生物发生有影响,如前所述(38、39)。
最后,使LM中的miR-144表达沉默显著改善了肥胖小鼠的葡萄糖耐量并增加了肝糖原的储存。与ERK1/2在GATA4活化和随后的miR-144增加中的作用一致,ob/ob-Erk1-/-小鼠在肥胖症时具有与沉默miR-144相似的表型(15)。虽然Erk1缺乏改善ob/ob小鼠代谢的分子机制尚未完全阐明,但我们的研究结果表明,更好的抗氧化反应可能解释了这些小鼠肝脏功能的改善。事实上,我们证明了在先前用H2O2处理的人NPC中使miR-144沉默会增强内源性抗氧化反应并影响GATA4表达,这表明GATA4和miR-144转录水平之间存在响应于ROS的反馈回路。
虽然几项研究强调了NRF2活化的有益影响(40、41),但长期NRF2刺激与肝纤维化(42)、减轻压力(43)和促进已存在的恶性肿瘤(44)有关。GeRP技术的主要优势在于它能够在LM中以瞬时和特异性方式操纵miRNA表达,同时不影响体内的其它细胞和巨噬细胞。这一点尤其重要,因为尝试使用外源性抗氧化剂(如维生素C、维生素E或β-胡萝卜素)来减少氧化应激没有任何有益或甚至有害的影响(45、46、47)。这些外源性抗氧化剂缺乏功效被认为是由于非特异性全身效应和内源性抗氧化反应的降低。这突出了有针对性的方法来增加内源性抗氧化反应以减少氧化应激的重要性。
总之,这项研究揭示了LM在调节肥胖症诱导的小鼠和人类胰岛素抵抗的全身代谢中的关键作用。具体地说,LM产生的miRNA能够响应于肥胖胰岛素抵抗中观察到的过度脂质积聚而损害肝脏的抗氧化能力。我们不能排除肝细胞在调节miR-144表达和肥胖症中的抗氧化反应中的重要性。然而,尽管肝脏中LM的百分比很低,但我们观察到mir-144特异性沉默在LM中具有显著的全局效应。因此,通过重新活化内源性抗氧化反应来特异性靶向LM以减轻肥胖症期间的氧化应激负担可能代表一种新的代谢疾病治疗方法。
材料和方法
人类受试者
肝脏样品获自总共15名个体,包含十名肥胖患者(体重指数(BMI)介于35和42kg/m2之间),他们在斯德哥尔摩的Danderyd医院或Ersta医院接受腹腔镜Roux-en-Y胃旁路手术。来自五名非肥胖患者的肝脏细胞获自肝脏供体,并由肝脏细胞实验室在卡罗林斯卡学院临床科学、干预和技术系(CLINTEC)移植手术单位进行分离。在研究前六个月内,所有参与者均无心血管疾病、糖尿病、胃肠道疾病、全身性疾病、酗酒、凝血障碍、慢性炎症性疾病、任何肝损伤临床症状或手术干预史。患者在手术前没有遵循任何特殊饮食。通过稳态模型评估(HOMA-IR)评估胰岛素敏感性。在肥胖患者中,五名Homa-IR<2的患者被定义为肥胖胰岛素敏感(OIS),而五名Homa-IR<4的患者被定义为胰岛素抵抗(OIR)。肝脂肪变性指数(HIS)的计算方法如(48)中所示。斯德哥尔摩的区域伦理委员会批准了这项研究,所有受试者在参与之前对所有程序都给出了书面知情同意书。来自非肥胖患者的肝脏细胞获自肝脏供体,并由肝脏细胞实验室在卡罗林斯卡学院临床科学、干预和技术系(CLINTEC)移植手术单位进行分离。
小鼠和饮食
四周龄的野生型C57BL/6J(WT)和五周龄的ob/ob雄性获自查尔斯河实验室国际公司(Charles River Laboratories International,Inc.),并保持12小时的明/暗循环。动物可以自由获取食物和水。C57BL/6J WT小鼠在五周龄时被喂食高脂肪饮食(HFD),其中60%卡路里来自脂肪、20%来自碳水化合物、20%来自蛋白质(Research Diets Inc.;D12492)。对照小鼠被喂食正常的食物。所有程序均按照斯德哥尔摩瑞典伦理委员会(Stockholms )批准的指南进行。
通过体内静脉注射(i.v.)施用GeRP
如前所述制备GeRP(12)。首先根据体重和葡萄糖耐量对持续8周喂食HFD的WT小鼠进行随机分组。然后用12.5mg/kg GeRP和内转运蛋白(2.27mg/kg)(scr)处理小鼠,所述GeRP载有miRIDIAN微小RNA mmu-miR-144-5p发夹抑制剂(GeRP-miR-144)(Dharmacon;IH-311182-01-0005)或miRIDIAN微小RNA发夹抑制剂阴性对照#1(Dharmacon;IN-001005-01-05)(247μg/kg)。小鼠在15天内通过静脉注射接受了六剂荧光标记的GeRP。
从小鼠中分离LM和肝细胞
如前所述分离LM和肝细胞(49)。简而言之,首先用无钙的汉克(Hank)平衡盐溶液(HBSS)灌注麻醉小鼠的肝脏,然后进行胶原酶消化。消化后,肝细胞通过瓣膜的机械解离而释放,并经历了以下几个步骤:用94含钙HBSS过滤,并在50g下离心3分钟。将所得肝细胞沉淀物洗涤两次并铺板。将含有非实质细胞的上清液加载到Percoll梯度(25%和50%)上,并在2300rpm和4℃下离心30分钟。收集富含LM的相间环(interphase ring)。然后将细胞铺板30分钟并洗涤两次,然后提取RNA或蛋白质进行后续分析。
从人体中分离NPC
将新鲜获得的肝活检切成小块,并立即在含有胶原酶II(0.25mg/ml,SigmaC6885)和DNase I(0.2mg/ml,Roche 1010415900)的RPMI培养基中于37℃下消化30分钟。通过细胞过滤器(75μm)过滤单细胞悬液,并以50g离心3分钟。将含有NPC的上清液加载到Percoll梯度上,并如上所述分离LM。
H2O2处理
将人NPC用500μM H2O2处理30分钟(随后在低葡萄糖/胰岛素培养基中维持20小时),并如上所述用scr或GeRP-amiR-144处理。24小时后收获细胞,并如下所列进行下游实验。
小鼠代谢分析
在最后一次GeRP注射当天并禁食6小时后进行葡萄糖耐量测试(IP-GTT)。腹腔内注射(i.p)1g/kg葡萄糖的剂量,并在规定的时间点从尾静脉使用血糖仪测量血糖水平。第二天处死小鼠,并收集组织用于后续分析。
RNA分离、微小RNA、实时定量PCR和RNA文库制备
按照制造商的方案,使用TRIzol试剂(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)-15596018)或miRNeasy迷你试剂盒(Qiagen;217004)进行总RNA和微小RNA提取和纯化。对于miRNA分析,按照制造商的方案,使用miScript-系统对100ng总RNA进行逆转录和扩增,所述系统包含miScript RT-试剂盒(Qiagen;218161)、miScript SYBR-绿色PCR-试剂盒和miScript引物测定miRBase v12(Qiagen;2i8076)。将hsa-miR-144(Qiagen;218300)、mmu-miR-144(Qiagen;MS00024213)、mmu-miR-532(Qiagen;MS00002611)和mmu-miR-192(Qiagen;MS00011354)的特异性引物用于茎环qPCR。对于内部对照,确定了小核RNARNU6B(Qiagen;MS00033740)的表达。对于实时qPCR,根据制造商的说明,使用iScript cDNA合成试剂盒(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad公司(Bio-Rad,Hercules,CA,USA))由0.5μg总RNA合成cDNA。在CFX96实时PCR系统(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad公司)上运行合成的cDNA正向和反向引物以及Sso Advanced Universal SYBR GreenSupermix。60S酸性核糖体蛋白P0(rplp0)或b-肌动蛋白被用作小鼠和人类的参考基因。用于qPCR的引物序列:
小鼠Nrf2 FW:5'-CGAGATATACGCAGGAGAGGTAAGA-3'(SEQ ID NO:12);
REV:5'-GCTCGACAATGTTCTCCAGCTT-3'(SEQ ID NO:13),
小鼠Gata4 FW:5'-CCCTACCCAGCCTACATGG-3'(SEQ ID NO:14);
REV:5'-ACATATCGAGATTGGGGTGTCT-3'(SEQ ID NO:15),
小鼠Nqo1 FW:5'-TTCTGTGGCTTCCAGGTCTT-3'(SEQ ID NO:16);
REV:5'-AGGCTGCTTGGAGCAAAATA-3'(SEQ ID NO:17),
小鼠Gstp1 FW:5'-TGTCACCCTCATCTACACCAAC-3'(SEQ ID NO:18);
REV:5'-CAGGGTCTCAAAAGGCTTCAG-3'(SEQ ID NO:19),
小鼠Ces2G FW:5'-TCTCTGAGGTGGTTTACCAAACG-3'(SEQ ID NO:20);
REV:5'-CCTCTCAGACAGCGCACCAG-3'(SEQ ID NO:21),
小鼠β-肌动蛋白 FW:5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3'(SEQ ID NO:22);
REV:5'-GTACATGGCTGGGGTGTTGAA-3'(SEQ ID NO:23),
人NRF2 FW:5'-CAGCGACGGAAAGAGTATGA-3'(SEQ ID NO:24);
REV:5'-TGGGCAACCTGGGAGTAG-3'(SEQ ID NO:25),
人NQO1 FW:5'-GGCAGAAGAGCACTGATCGTA-3'(SEQ ID NO:26);
REV:5'-TGATGGGATTGAAGTTCATGGC-3'(SEQ ID NO:27),
人 GSTP1FW:5'-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3'(SEQ ID NO:28);
REV:5'-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3'(SEQ ID NO:29),
人 CES2G FW:5'-TCTTCGCTTGTTGTGTCC-3'(SEQ ID NO:30);
REV:5'-CGAAGGAGAAAGGCAATGAC-3'(SEQ ID NO:31),
人 GATA4FW:5'-TTCCAGCAACTCCAGCAACG-3'(SEQ ID NO:32);
REV:5'-GCTGCTGTGCCCGTAGTGAG-3'(SEQ ID NO:25),
人RPLP0 FW:5'-CAGATTGGCTACCCAACTGTT-3'(SEQ ID NO:33);
REV:5'-GGGAAGGTGTAATCCGTCTCC-3'(SEQ ID NO:34)。
对于ChIP-qPCR,使用以下hChIPmiR144/451启动子引物:
FW:5'-CCTGGGCTGTGCCTGACCAC-3'(SEQ ID NO:35);
REV:5'-AGCACTGTGAGGGGCTGGGG-3'(SEQ ID NO:36)。
对于文库制备,使用安捷伦生物分析仪确定RNA完整性。使用TruSeq标准mRNA试剂盒(Illumina;RS-122-2201)制备小鼠RNA文库。使用TruSeq小RNA试剂盒(Illumina;RS-930-1012)制备用于小RNA测序的文库。使用通用Kapa文库定量试剂盒(KAPA Biosystems)通过RT-qPCR对索引文库的浓度进行量化。将最终文库在Illumina HiSeq 3000测序仪上进行归一化和测序。
肝球体
安塔够妙转染
在OptiMEM(Gibco;31985)中将冷冻保存的原代人肝细胞(Hep)(美国Bioreclamation IVT)与Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen;13778030)和amiR/抑制剂构建体的预孵育混合物(每300,000个细胞1nmol amiR/抑制剂)混合。在共培养转染的情况下,在OptiMEM中将冷冻保存的肝细胞和同基因非实质细胞(NPC)(美国BioreclamationIVT)用Lipofectamine RNAiMAX和amiR/抑制剂构建体的预孵育混合物(每300,000个细胞1nmol amiR/抑制剂)在悬浮液中分别转染。将细胞转染5小时,偶尔搅拌悬浮液。所有转染均使用低葡萄糖/胰岛素培养基(PAN-Biotech,Germany;P04-29050,补充有5.5mM D-葡萄糖、0.1nM胰岛素、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100μg/ml链霉素、5.5μg/ml转铁蛋白、6.7ng/ml亚硒酸钠、100nM地塞米松和10%FBS)进行。
球体形成
如图所示,球体由单独的肝细胞或由肝细胞和NPC的共培养物形成。在共培养的情况下,分别转染的肝细胞和NPC以3:1(Hep:NPC)的比率接种。如前所述,将细胞接种在超低附着96孔板(Corning;CLS3471)中(16),并在低葡萄糖/胰岛素培养基中培养。将板以180xg离心2分钟。如果细胞没有很好地聚集,则再次将板离心。6天后,当球体足够致密时,将50%的培养基更换为无血清培养基。
游离脂肪酸补充剂
将游离脂肪酸与10%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)以1:5的摩尔比在40℃下缀合2小时。将球体用240μM油酸(Sigma-Aldrich)和240μM棕榈酸(Sigma-Aldrich)在高葡萄糖/胰岛素培养基(Gibco;11965092,补充有11.1mM D-葡萄糖、1.7μM胰岛素、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100μg/ml链霉素、5.5μg/ml转铁蛋白、6.7ng/ml亚硒酸钠、100nM地塞米松和10%FBS)中处理5天。将未处理的球体保持在低葡萄糖/胰岛素培养基中。所有处理均在球状体接种后8天进行。
H2O2处理
将球体用500μM H2O2处理30分钟(然后在低
葡萄糖/胰岛素培养基中维持20小时)。所有处理均在球体接种后8天在低葡萄糖/胰岛素培养基中进行。
细胞外囊泡分离
如上所述分离LM,并在含有10%EV耗尽的FBS(赛默飞世尔科技;A25904DG)的RPMI(Sigma Aldrich;R0883)培养基中培养。如前所述分离细胞外囊泡(EV)(50)。简而言之,将细胞培养基以300g离心10分钟以沉淀细胞碎片。将上清液与磷酸盐缓冲盐水(PBS)(赛默飞世尔科技;AM9625)混合,转移至超速离心管(Polyallomer Quick-Seal超透明16mm×76mm管,Beckman Coulter)中并以120,000x g离心2小时以沉淀细胞外囊泡。分离的细胞外囊泡在100μL PBS中重新悬浮,并用于细胞外囊泡的表征,详情如下。
细胞外囊泡微小RNA分析
如上所述,在分离的EV上进行总RNA和微小RNA分离和茎环qPCR。RNU6B、mmu-miR-126-3p和mmu-miR-144的特异性引物(QIAGEN)用于qPCR。
细胞外囊泡大小、协同作用和ζ电位
使用ZetaView(德国Particle Metrix)平台通过动态光散射测定细胞外囊泡大小和协同作用。
GRO-seq的细胞核和文库制备
如前所述进行GRO-seq(51),对小鼠肝脏巨噬细胞样品进行少量修饰。使用低渗缓冲液从肝脏巨噬细胞(3-4只合并小鼠/组)中提取细胞核,并在DAPI染色显微镜下目测质量。使用Countess自动细胞计数器(Bio-Rad)确定细胞核总数。使用Br-UTP进行细胞核运行,然后用抗Br-UTP抗体进行富集、逆转录和文库制备。
蛋白质印迹、免疫沉淀和染色质免疫沉淀测定
使用预制的4-12%梯度凝胶(赛默飞世尔科技;NP0321BOX)通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离30μg蛋白质,将其转移到聚偏二氟乙烯膜(赛默飞世尔科技;LC2005)并用下文指出的1:1000稀释的一抗进行探测。随后与适当的HRP缀合的二抗(Abcam;ab6721或ab6789)一起孵育。最后,通过ECL检测试剂(BioRad;1705060)使结合的二抗可视化,并通过配备CCD相机(ChemiDoc,Bio-Rad)的成像系统获取图像。对1000μg蛋白质进行针对KEAP1(Santa Cruz Biotechnology,sc-514914)和NRF2(Abcam;ab137550)的免疫沉淀。将裂解物与琼脂糖蛋白G加混合物(Pierce;22851)一起孵育过夜,并将蛋白质复合物在Laemmli缓冲液中洗脱。然后,如上所述进行蛋白质印迹分析。根据制造商的说明,使用EpiQuik组织染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(EpiGentek;P-2003)进行染色质免疫沉淀。对于ChIP,将样品与GATA-4单克隆抗体(赛默飞世尔;MA5-15532)和抗组蛋白H3(三甲基K4)抗体-ChIP级(Abcam;ab8580)一起孵育过夜。使用了以下一抗:NRF2(Abcam;ab137550)、KEAP1(SantaCruz Biotechnology;sc-514914)、泛素(Abcam;ab7780);p44/42MAPK(Erk 1/2)(CellSignaling;4965S)、磷酸化p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling;4370S)、GATA4(磷酸化S105)抗体(Abcam;ab92585)、GATA4抗体(Abcam;ab227512)和b-肌动蛋白(Abcam;ab179467)。使用ImageJ软件评估信号的量化。
组织学
石蜡包埋的胰腺组织切片用于苏木精-伊红染色,肝脏冷冻切片用于油红O染色。用全景250载玻片扫描仪扫描载玻片。
小鼠生化参数
使用市售试剂(Roche;TG 12016648)使用比色技术测定总甘油三酯含量。
丙二醛和活性氧含量测量
使用脂质过氧化(MDA)测定试剂盒(比色法/荧光法)(Abcam;ab118970)测量丙二醛含量。根据制造商的说明,使用OxiSelectTM体外ROS/RNS测定试剂盒(绿色荧光)(NordicBiosite;STA-347)测定活性氧。使用DCFDA/H2DCFDA-细胞ROS测定试剂盒(Abcam;ab113851)测定细胞内ROS。使用Cell MeterTM荧光细胞内一氧化氮(NO)活性测定试剂盒*针对酶标仪优化的橙色荧光(AAT Bioquest;16350)评估细胞内RNS水平。使用AmplexTM Red过氧化氢/过氧化物酶测定试剂盒(Life Technologies;A22188)测量H2O2的细胞外释放。所有测定均按照制造商的说明进行。
透射电子显微镜(TEM)
根据公布的方案进行透射电子显微镜(TEM)的准备工作(52)。对于肝脏中线粒体的数值密度测量,在最终放大5000倍时随机拍摄肝脏细胞细胞质的数字图像。使用打印的数字图像,并使用ImageJ软件通过点计数计算线粒体的数量。每只小鼠分析了20个切片。
流式细胞术
用以下荧光团缀合的一抗和染料对非实质细胞进行染色:活力染料SYTOX蓝色(赛默飞世尔科技,S34857);F4/80-APC(BioRad,CI:A3-1;MCA497APC)、CD11b-PE-Cy7(BDBiosciences,MI/70;561098)、CD45-PECF594(BD Biosciences,30-F11;562420)。染色后,将细胞用FACS缓冲液(PBS中的1%BSA)洗涤两次,并使用BD FACSAria Fusion对样品进行分选。
生物信息学
检索原始测序数据
在序列运行期间,使用系统的实时分析(RTA)软件将信号强度转换为单个碱基调用。使用具有所有默认选项的Illumina的bcl2fastq软件执行样品解复用和转换为fastq文件。通道中每个样品的读数分布在合理的公差范围内。
HFD和ND小鼠的mRNA-seq比对和基因定量
使用具有所有默认选项的TopHat版本v2.0.13(53)将原始fastq文件(PRJNA483744)(8)与鼠基因组版本mm10进行比对。根据映射位置对含有比对结果的BAM文件进行分选。使用来自Subread软件包(54)的FeatureCounts对GRCm38-基因编码转录本数据库版本七(gencode.vM7.annotation.gtf)和GRCh38-基因编码转录本数据库版本24(gencode.v24.annotation.gtf)进行mRNA量化,以获得每个单独的Ensembl基因的读取计数。
HFD和ND小鼠的GRO-seq数据处理和基因定量
使用具有相同选项的BWA(51)将原始fastq文件(PRJNA483744)(8)与鼠基因组版本mm10进行比对。唯一映射的读数在5'到3'方向上扩展到150bp,并用于下游分析。使用GRO-seq读数测量基因的新生转录,该读数映射到基因符号注释基因体内10kb窗口(相对于转录起始位点(TSS)为+2kb到+12kb)中的基因有义链。使用较小的窗口大小(从+2kb到转录末端位点(TES))对长度介于2kb和12kb之间的较小基因进行量化。对于小于2kb的基因,使用整个基因体进行量化。使用带有相交选项的bedtools对每个基因量化窗口内的映射读数进行计数(55),并表示为每kb每百万读数的读数(RPKM)。转录水平大于0.3RPKM的基因被认为是主动转录的。在下游分析之前消除了在所有条件下都没有转录的基因。如果基因在任一条件下转录并且倍数变化大于1.5(向上或向下),则该基因被定义为给定条件对之间的“差异”。
分析来自ob/ob和wt小鼠的RNA测序数据
使用STAR比对器(56)将原始读数与小鼠基因组mm10(基因组构建GRCm38.p5)进行比对,然后使用Cufflinks管道(57)基于Gencode M14注释在基因水平上进行表达量化。Cuffdiff(58)用于鉴定ob/ob和wt小鼠之间差异表达的基因。进一步对条件之间的差异表达基因进行GO富集和通路过度表达分析(调整后的p值<0.05并且log2尺度倍数变化>1或<-1)。原始fastq文件和处理后的数据可在GEO存储库(GSE132801、GSE132800)中获得。
NRF2靶标
从WikiPathways(Pathway:WP2884)(59)下载NRF2靶基因(抗氧化剂,第1阶段和第2阶段)。使用Ensembl BioMart版本92将人类基因名称转换为小鼠直系同源物,用于下游分析。
分析小RNA测序数据
通过Cutadapt(60)从原始读数中去除衔接子后,使用ShortStack(61)将小RNA读数与GENCODE小鼠初级组装(释放M14,GRCm38.p5)进行比对,并进一步鉴定从头模式下的miRNA簇。ShortStack将基因座上最丰富的RNA(MajorRNA)的表达量化为每百万读数(RPM),但忽略了同一基因座上不太丰富的RNA(MinorRNA)的量化。这可能导致某些miRNA的假阴性发现,这些miRNA在样品中真正表达,但由于量化而未显示表达。在这里,通过从MinorRNA比对中检索出读数计数并将其转换为RPM,进行后处理,以量化不太丰富的RNA。然后通过使用BLAST(62)将序列与miRBase成熟miRNA序列数据库进行比对,将所有量化的miRNA注释到miRBase中。然后将从每个样品中量化的所有miRNA拉到一个表达矩阵中以进行下游分析。使用ANOVA鉴定基于调整后的p值<0.05的条件之间差异表达的miRNA,并且至少一个条件的中值RPM超过2。原始fastq文件和处理后的数据可在GEO存储库(GSE132795)中获得。
统计分析
使用GraphPad Prism软件分析数据。适当时使用ANOVA或学生t检验分析组间差异的统计显著性。数据表示为平均值±SEM。p值<0.05被认为具有统计学意义。每个实验的样品大小是根据之前的数据收集计算的,并且如Bernard Rosner的《生物统计学基础(Fundamental of Biostatistics)》(布鲁克斯/科尔圣智学习出版公司(Brooks/ColeCENGAGE Learning);第7版)中所述。对于动物实验,虽然我们总是以每组相同数量的动物开始每个实验,但如果任何个体动物表现出任何不适迹象或注射失败,我们必须根据我们的道德许可终止对该特定动物的研究和严谨的研究。
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实例2–患有NASH的人类受试者血清中的miR-144增加
引人注目的是,与不患有NASH的OIS和OIR患者相比,我们发现从NASH人类个体收集的血清中miR-144循环水平增加(图11A)。一致地,在NASH小鼠模型的肝脏中(图11B),以及在不同阶段从患有NASH的人类患者收集的肝活检中(图11C),也观察到了miR-144上调。
为了进一步证实miR-144循环水平与NASH疾病的进展相关,我们进行了另外的实验,所述实验分析了从患有NASH的患者与不患有NASH的个体收集的血清中的miR-144表达。
按照制造商的方案,使用miRNeasy迷你试剂盒(Qiagen)进行循环miRNA提取。简而言之,将700μl的QIAzol试剂添加到200μl血清中。将样品在试管中混合,并将2μl 0.5nM的“外加对照”cel-miR-39(Qiagen)添加到匀浆中,然后添加200μl氯仿。“外加对照”是一种外源性miRNA(从秀丽隐杆线虫(C.elegans)中分离,并且序列为:UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG),其在miRNA分离过程中被添加以将所关注的miR的量归一化,这是一种常见的方法,因为并非所有miRNA在血清中表达。
剧烈混合后,将样品在4-8℃下以12 000g离心15分钟。将上层水相小心地转移到新的收集管中,加入1.5体积的乙醇。然后将样品直接施加到柱子上并洗涤。将总RNA在30μl无核酸酶的H2O中洗脱。如应用程序中先前所述执行茎环RT-qPCR。在对加标的cel-miR-39进行归一化后计算miR-144的相对表达水平。
结果示出于图12中。茎环RT-qPCR实验证明了NASH人类个体血清中miR-144循环水平的上调。这些结果进一步表明,miR-144循环水平与NASH的发展相关,因此将miR-144鉴定为用于预测和评估NASH疾病的生物标志物。
实例3–评估不同安塔够妙对miR-144水平的影响。
我们评估了特定安塔够妙对miR-144(“amiR-144”)–具体地说,本申请中描述的amiR-144序列SEQ ID NO:10的影响。
将从人类个体中分离的NPC暴露于游离脂肪酸(“FFA”),持续24小时,以驱动miR-144表达,然后用以下任一种进行处理:amiR-144(SEQ ID NO:10);微小RNA hsa-miR-144-3p发夹抑制剂(来自Dharmacon的市售amiR-144;(IH-300612-06);和“加扰序列”对照序列(“scr”)。
SEQ ID NO:10在本申请的上文中有所描述。其具有以下序列和修饰:5'-mC/ZEN/mU mUmAmC mAmGmU mAmUmA mUmGmA mUmGmA mUmAmU mC/3ZEN/-3',其中“m”代表2'-O-甲基修饰的寡核苷酸,“ZEN”代表N,N-二乙基-4-(4-硝基萘-1-基唑)-苯胺,用于提高结合亲和力并减少外切核酸酶降解。
肝脏巨噬细胞(“LM”)从人体中分离出来,并按以下方式用安塔够妙处理。将新鲜获得的肝活检切成小块,并立即在含有胶原酶II(0.25mg/ml,Sigma)和DNase I(0.2mg/ml,Roche)的RPMI培养基中于37℃下消化30分钟。通过细胞过滤器(75μm)过滤单细胞悬液,并以50g离心3分钟。将含有NPC的上清液加载到Percoll梯度(25%和50%)上并离心以富集LM。然后将这些在存在游离脂肪酸(FFA)混合物(240μM油酸(Sigma-Aldrich)和240μM棕榈酸(Sigma-Aldrich)的混合物)的情况下铺板24小时以模拟肥胖状态。然后在OptiMEM培养基(Gibco;31985)中用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen;13778030)和amiR-144(Dharmacon)或amiR-144(SEQ ID NO:10)构建体或加扰对照(每300,000个细胞1nmolamiR/scr)的混合物转染NPC。
结果示出于图13中。qPCR强调,amiR-144(SEQ ID NO:10)和amiR-144(Dharmacon)能够以相似的速率显著降低miR-144表达水平,并且可以成功地用作调节miR-144表达水平的amiR-144。
Claims (52)
1.一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂,所述药剂用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状。
2.一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂在制备用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的药物中的用途。
3.一种用于在受试者中治疗或预防其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的方法,其中所述方法包括向所述受试者施用抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂。
4.根据权利要求1所述的供使用的药剂、根据权利要求2所述的用途或根据权利要求3所述的方法,其中所述药剂降低肝脏细胞中的miR-144表达和/或活性。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述药剂被递送至肝脏细胞。
6.根据权利要求4到5中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述肝脏细胞是吞噬性肝脏细胞、肝细胞、内皮细胞和/或嗜中性粒细胞。
7.根据权利要求6所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述吞噬性肝脏细胞是肝脏巨噬细胞。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中将所述药剂递送至肝脏细胞导致肝脏细胞,例如吞噬细胞、肝细胞、内皮细胞和/或嗜中性粒细胞中的miR-144表达和/或活性降低。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述氧化应激是由肥胖症、酒精、环境污染物和/或如抗炎药、抗镇痛药、抗癌药和/或抗抑郁药等药物诱导的。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述氧化应激是肝脏细胞中的氧化应激。
11.根据权利要求10所述的供使用的药剂、用途或方法,其中肝脏中的所述氧化应激的特征在于以下至少一项:
a)增加的脂质过氧化;
b)活性氧(ROS)增加和/或积聚;
c)降低的核因子红细胞2相关因子2(NRF2)活性和/或蛋白质水平;和/或
d)增加的miR-144的表达和/或活性。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状选自包括以下的组:非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、纤维化、肝硬化、肝细胞癌(HCC)和/或由酒精、环境污染物和/或如抗炎药、抗镇痛药、抗癌药和/或抗抑郁药等药物诱导的肝损伤。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中miR-144在肝脏细胞中介导以下至少一项:
i.NRF2活性和/或蛋白质水平;
ii.细胞外ROS的产生;
iii.GATA4磷酸化和/或活性;
iv.细胞内糖原的水平;以及
v.内源性抗氧化反应。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中miR-144表达和/或活性的降低在肝脏细胞中导致以下至少一项:
i.NRF2活性和/或蛋白质水平增加;
ii.细胞内ROS降低和/或ROS的释放降低;
iii.GATA4的磷酸化和/或活性降低;
iv.细胞内糖原的水平增加;以及
v.内源性抗氧化反应恢复和/或增加。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述药剂选自包括以下的组:核酸分子和小分子。
16.根据权利要求15所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述核酸分子选自包括以下的组:反义寡核苷酸和抑制性RNA分子。
17.根据权利要求16到17中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述反义寡核苷酸包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4中存在的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。
18.根据权利要求16到17中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述反义寡核苷酸包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3至少50%互补的核苷酸序列。
19.根据权利要求16到18中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中与miR-144序列中存在的核苷酸序列的至少一部分互补的所述核苷酸序列的长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、20个、21个、22个或23个核苷酸。
20.根据权利要求16到19中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述反义寡核苷酸包括与成熟miR-144序列中存在的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。
21.根据权利要求16到20中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述反义寡核苷酸包括与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%或100%互补的核苷酸序列。
22.根据权利要求16所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述抑制性RNA分子包括双链区,并且优选地,其中所述双链区包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4中存在的核苷酸序列的至少一部分基本上相同和基本上互补的核苷酸序列。
23.根据权利要求22所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述双链区包括与SEQ IDNO:1、SEQ ID No:2和/或SEQ ID NO:3中存在的核苷酸序列的至少一部分至少50%互补的核苷酸序列。
24.根据权利要求22所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述双链区包括与成熟miR-144序列基本上相同和基本上互补的核苷酸序列。
25.根据权利要求22到24中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述双链区包括与SEQ ID NO:4至少80%、85%、90%、95%或100%互补的核苷酸序列。
26.根据权利要求5到25中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中使用以下任一种将所述药剂递送至肝脏细胞:
-物理方法,如:肠胃外施用、直接注射或电穿孔;
-递送载体,如:含葡聚糖的颗粒、含脂质的载体、含病毒的载体、含聚合物的载体、含肽的载体和外泌体。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中在施用所述药剂后,所述受试者的所述肝脏疾病和/或肝脏病状的一种或多种症状得到改善,例如肝细胞死亡、免疫细胞浸润和/或纤维化。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述药剂与额外的疗法组合施用。
29.根据权利要求28所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述额外的疗法是降脂疗法,如HMG-CoA还原酶抑制剂。
30.根据权利要求12到29中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述药剂的施用延迟和/或防止所述受试者从NASH进展为纤维化、肝硬化和/或肝细胞癌。
31.根据权利要求1到30中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述药剂被配制和/或适用于递送和/或被肝脏细胞摄取。
32.根据权利要求1到31中任一项所述的供使用的药剂、用途或方法,其中所述药剂是葡聚糖封装的。
33.一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂,所述药剂用于在受试者中抑制其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的进展。
34.一种抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂在制备用于在受试者中抑制其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的进展的药物中的用途。
35.一种用于在受试者中抑制其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的进展的方法,其中所述方法包括向所述受试者施用抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂。
36.一种用于鉴定有患上其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状风险的受试者的方法,所述方法包括:
a)从受试者获得和/或提供测试样品;
b)确定所述测试样品中miR-144的表达和/或活性,
其中miR-144相对于对照的表达和/或活性表明受试者是否有患上其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的风险。
37.一种用于鉴定患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者的方法,所述方法包括:
a)从受试者获得和/或提供测试样品;
b)确定所述测试样品中miR-144的表达和/或活性,
其中miR-144相对于对照样品的表达和/或活性表明受试者是否患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状。
38.一种用于预测患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的受试者对用抑制微小RNA-144(miR-144)的药剂进行治疗的反应的方法,所述方法包括:
a)从受试者获得和/或提供测试样品;
b)确定所述测试样品中miR-144的表达和/或活性,
其中miR-144相对于对照样品的表达和/或活性表明受试者将对用所述药剂进行的治疗产生反应。
39.根据权利要求36到38中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括向患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的所述受试者施用有效量的疗法,例如其中所述方法包括施用抑制miR-144的药剂。
40.一种miR-144的表达和/或活性在受试者中鉴定其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的用途,其中相对于对照样品,来自所述受试者的测试样品中增加的miR-144的表达和/或活性的存在表明所述受试者患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状。
41.根据权利要求40所述的用途,其中所述用途进一步包括向患有其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状的所述受试者施用有效量的疗法,例如施用抑制miR-144的药剂。
42.根据权利要求36到39中任一项所述的方法,或根据权利要求40到41中任一项所述的用途,其中所述其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状根据前述权利要求中的任一项所定义。
43.根据权利要求40到42中任一项所述的用途,其中所述用途包括确定来自所述受试者的测试样品和/或对照样品中的miR-144的表达和/或活性。
44.根据权利要求40到43中任一项所述的用途,其中与所述对照样品相比,所述测试样品中miR-144的所述表达和/或活性增加至少2倍。
45.根据权利要求35到39和42中任一项所述的方法,或根据权利要求40到44中任一项所述的用途,其中受试者的所述其中氧化应激是促成因素的肝脏疾病和/或肝脏病状根据前述权利要求中的任一项所定义。
46.一种药物组合物,其包括抑制miR-144的药剂,所述药剂被配制和/或适用于递送至所述肝脏的吞噬细胞。
47.根据权利要求46所述的药物组合物,其中所述药剂被封装用于受体介导的肝脏吞噬细胞摄取。
48.根据权利要求46所述的药物组合物,其中所述药剂根据前述权利要求中的任一项所定义。
49.根据权利要求46到48中任一项所述的药物组合物,其中所述组合物被配制用于注射。
50.根据权利要求46到49中任一项所述的药物组合物,其用于医药。
51.一种部件试剂盒,其包括根据权利要求46到50中任一项所述的药物组合物和/或用于测量miR-144的表达水平的试剂。
52.一种药剂、用途、方法或组合物,其基本上参考所附描述、实例和附图如本文所示和所述。
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