CN114531876A - Rna编辑抑制剂及其用途 - Google Patents

Rna编辑抑制剂及其用途 Download PDF

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CN114531876A CN202080061907.2A CN202080061907A CN114531876A CN 114531876 A CN114531876 A CN 114531876A CN 202080061907 A CN202080061907 A CN 202080061907A CN 114531876 A CN114531876 A CN 114531876A
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Abstract

本发明提供了靶向AZIN1基因的核心编辑位点互补序列(ECS)的寡核苷酸，其中AZIN1基因的核心ESC包含序列5'‑GCTTTTCC‑3'，并且其中该寡核苷酸包含一个或多个具有糖修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷酸间键。另一方面，提供了包含本文公开的寡核苷酸的药物组合物。另一方面，提供了抑制细胞中AZIN1前mRNA编辑的方法，其中AZIN1前mRNA编辑是由作用于RNA‑1的腺苷脱氨酶(ADAR‑1)介导的，以及使用该寡核苷酸治疗与AZIN1前mRNA编辑相关的癌症的方法，包括肝癌。

Description

RNA编辑抑制剂及其用途
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年7月4日提交的第10201906239R号新加坡申请的优先权，其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学、细胞生物学和生物技术领域。具体而言，本发明涉及用于抑制RNA编辑的寡核苷酸、包含该寡核苷酸的组合物以及该寡核苷酸和组合物的用途。
背景技术
癌症通常是指一组涉及异常细胞生长的疾病，这些疾病有可能侵入或扩散到身体的其他部位。癌症在世界范围内的患病率很高，2015年估计高达9050万人。疾病控制中心(Centre for Disease Control,CDC)预计，在2010年至2020年，美国的新癌症病例数，在男性中可能会增加约 24％，每年超过100万例，在女性中增加约21％，每年超过900,000例。预计增加最多的癌症种类是：白人男性和女性的黑素瘤，男性的前列腺癌、肾癌、肝癌和膀胱癌，以及女性的肺癌、乳腺癌、子宫癌和甲状腺癌。
RNA编辑是在基因组编码的RNA序列中引入变化，从而导致“RNA 突变”的普遍过程。在过去的十年中，已经在许多癌症类型中发现了特定基因的异常RNA编辑及其与癌症进展的关联，包括但不限于肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)、食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)、非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC) 和结直肠癌(colorectal cancer,CRC)。
作用于RNA的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADAR)是一种在人体中由ADAR基因编码的酶。ADAR是一种RNA结合蛋白，它通过改变 RNA的核苷酸含量对mRNA转录物进行转录后修饰在RNA编辑中发挥作用。ADAR负责与双链RNA(dsRNA)结合并通过脱氨作用将腺苷(A)转化为肌苷(I)。肌苷在结构上类似于鸟嘌呤(G)，导致I与胞嘧啶(C)结合。肌苷通常在翻译过程中模仿鸟苷。因此，RNA中从A到I的转换破坏了正常的A:U配对，使RNA不稳定。密码子变化也可能由可以导致蛋白质编码序列及其功能变化的编辑引起。ADAR还以独立于编辑的方式影响转录组，可能以干扰其他RNA结合蛋白的方式。
在哺乳动物中，存在三种类型的ADAR，即ADAR1、ADAR2和 ADAR3。ADAR1和ADAR2存在于体内的许多组织中，而ADAR3仅存在于大脑中。研究表明，ADAR1和ADAR2在癌症中经常失调。有人认为，ADAR1是造成在各种癌症中观察到的A到I编辑模式中断的原因。 ADAR1表达的失调可能改变癌基因或抑癌基因的蛋白质编码区中A到I 转换的频率,导致癌基因或抑癌基因产物发生突变,从而推动癌症的发展。
由于ADAR蛋白具有数千个编辑底物，因此简单地调节ADAR的表达就可以导致相当大的脱靶效应。因此，需要特异性抑制ADAR靶向的癌基因或抑癌基因RNA编辑的ADAR抑制剂。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了靶向AZIN1基因的核心编辑位点互补序列(editing-site complementary sequence,ECS)的寡核苷酸，其中AZIN1 基因的核心ECS包含序列5'-GCTTTTCC-3'，并且其中寡核苷酸包含一个或多个具有糖修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷酸间键 (internucleotide linkage)。在另一方面，提供了包含本文公开的寡核苷酸的药物组合物。在另一方面，提供了抑制细胞中AZIN1前mRNA编辑的方法，该方法包括使细胞与本文公开的寡核苷酸或本文公开的药物组合物接触。在另一方面，提供了治疗有需要的个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的本文公开的寡核苷酸或本文公开的药物组合物，其中癌症与AZIN1前mRNA编辑相关。
附图简要说明
当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述会更好地理解本发明，其中：
图1显示AZIN1编辑需要外显子12的3'末端序列。图1A是通过将覆盖经编辑的外显子11以及侧翼外显子(外显子10和12)和内含子(内含子9、10、11和12)的5个不同片段(FA、FB、FC、FD或FE)插入到 pRK7或pcDNA3.1载体中生成的AZIN1小基因构建体的示意图。箭头表示编辑位点的相对位置。图1B和1C是测序色谱图，说明了在用所示 pRK7小基因和空载体(empty vector,EV)或ADAR1表达构建体(ADAR1)共转染的HEK293T细胞中，从基于pRK7的小基因构建体转录的内源性 AZIN1(图1B，左图)和外源性HTR2C(图1B，右图)或AZIN1(图1C)转录物的编辑。图1D显示的测序色谱图说明了，在用基于pcDNA3.1的小基因和EV或ADAR1共转染的HEK293T细胞中，内源性和外源性AZIN1 转录物的编辑。在图1B-1D中，将编辑百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。*表示未检测到编辑。黑色箭头表示编辑位点的位置。图1E显示了通过RNAfold预测的AZIN1的RNA二级结构。右侧小箭头所示的8-nt序列是潜在的核心ECS。编辑位点如左侧的实心箭头所示。显示了绘制编码碱基对概率的最小自由能(minimum free energy,MFE) 结构。碱基对概率如色谱所示。总之，图1显示，在所有AZIN1小基因 (使用基于pRK7或基于pcDNA3.1的小基因系统)中，只有转录自含有片段A(FA)的小基因的AZIN1转录物无法编辑，片段A在外显子12的3'末端缺乏90-bp序列。这表明，AZIN1的ECS位于外显子12的3'末端。
图2显示，外显子12的3'末端处的8-nt序列是核心ECS，并且是 AZIN1编辑必不可少的。图2A是FE-1、2和3小基因构建体的示意图。底部的小箭头表示引入FE-3小基因的突变。顶部的大箭头表示编辑位点的相对位置。图2B显示了通过RNAfold预测的从所示小基因转录的 AZIN1转录物的RNA二级结构。黑色箭头表示编辑位点。显示了绘制编码碱基对概率的MFE结构。碱基对概率如色谱所示。图2C显示的测序色谱图说明了，在用基于pRK7的小基因和EV或ADAR1共转染的 HEK293T细胞中，内源性和外源性AZIN1转录物的编辑。图2D显示了 AZIN1转录物的体外RNA编辑分析结果。图2D左图：来自所示小基因构建体的体外转录的HTR2C或AZIN1转录物与纯化的ADAR1蛋白一起孵育，然后使用Sanger测序进行RNA编辑分析。体外转录的HTR2C作为阳性对照。图2D右图：在条形图中将数据表示为代表性实验的三个技术重复的平均值±s.d。n.d.，无法检测到。在图2C和2D中，编辑的百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。*，未检测到编辑。黑色箭头表示编辑位点的位置。总之，图2显示，转录自FE-1(缺失外显子12的3'末端处的29-bp序列、FE-2(缺失外显子12的3'末端附近的8- bp序列)和FE-3(外显子12的3'末端附近的点突变)小基因的转录物在 ADAR1过表达时不能被编辑，这表明，外显子12的3'末端处的8-nt序列 (5'-GCUUUUCC-3')是AZIN1编辑的核心ECS。
图3显示了筛选可与AZIN1双链体结合并在体外抑制AZIN1编辑的有效反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)。图3A显示了ASO设计的图示。用短RNA双链体设计靶向编辑区或ECS区的ASO，短RNA 双链体含有具有经历脱氨作用的腺苷(编辑位点，实线下划线)的部分外显子11和含有具有核心8-nt ECS(ECS区，虚线下划线)的ECS的部分外显子12序列。ASP1、DSP1和DSP2是肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)，而ASO 1-7是使用2'-O-Me修饰的典范碱基的ASO。表3列出了每个寡核苷酸的序列及其特征。图3B显示了为检查每个ASO(2.5μM)与32P标记的AZIN1 RNA双链体(86-nt)的结合而进行的REMSA的结果。表2和图9A提供了双链体探针的序列和预测结构。媒介对照(vehicle control,VC) 意味着没有添加ASO。图3C显示了REMSA检测到的ASO1、3、5或7 在所示不同浓度下与32P标记的AZIN1 RNA双链体的结合。图3D显示了在与纯化的ADAR1蛋白和200nM所示ASO孵育后，从FE小基因转录的AZIN1转录物的体外RNA编辑分析。图3D顶部图：测序色谱图说明了所示样品中体外转录的AZIN1转录物的编辑。编辑百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。箭头表示编辑位点的位置。*，未检测到编辑。图3D底部图：在条形图中将数据表示为三个独立的实验的平均值±sd。每个条形顶部显示的值是平均值。n.d.，无法检测到。总之，图3表明，ASO1、ASO3、ASO5和ASO7可以以剂量依赖性方式与 AZIN1 dsRNA结合，ASO1、ASO3在体外可以完全抑制AZIN1编辑，而 ASO5在体外可以实质上抑制AZIN1编辑。
图4显示了ECS靶向ASO消除或抑制癌细胞中的AZIN1编辑。图 4A显示了ASO化学修饰的图示。完全2'-O-Me修饰的ASO1和ASO3进一步完全或部分被用星号表示(另见表3)的硫代磷酸酯(PS)键修饰。图4B 显示了用100nM每种所示ASO处理的KYSE510和H358细胞中AZIN1 转录物的半定量PCR分析结果。PCR扩增子的琼脂糖凝胶电泳显示了 AZIN1的两种异形体。快速移动的条带表明AZIN1的外显子11跳跃异形体。图10B显示了外显子10与外显子12之间连接点的Sanger测序色谱数据。图4B中的结果表明，靶向编辑区的7种ASO(ASO1、1.1、1.2、 1.3、5、6和7)导致外显子11跳过。图4C显示了通过SpliceAid231对 AZIN1前mRNA的编辑区上剪接因子结合位点进行计算机预测的结果。预测SRSF3、SRSF6和SRSF1会与编辑区结合。编辑位点加有下划线。图4D显示了用100nM每种所示ASO处理的KYSE510细胞中AZIN1表达的QPCR分析结果。将数据表示为代表性实验一式三份的平均值±sd。图4E显示了用100nM每种所示ASO处理的KYSE510细胞中AZIN1和 ADAR1蛋白表达的蛋白质印迹分析结果。包括从用AZIN1表达构建体转染的HEK293T细胞中提取的约20μg蛋白质裂解物，作为AZIN1蛋白质的阳性对照。GAPDH用作加载对照。图4F和4G是测序色谱图，显示了在用100nM每种所示ASO处理的KYSE510细胞中AZIN1转录物的编辑。编辑百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。箭头表示编辑位点的位置。*，未检测到编辑。在条形图中将数据(G)表示为代表性实验的三个技术重复的平均值±sd。每个条形顶部显示的值是平均值。n.d.，无法检测到。总之，图4D-4G表明，三种ECS靶向ASO中， ASO3.1和ASO3.2完全消除了AZIN1编辑，而ASO3.3显著抑制了编辑，但不会影响AZIN1在mRNA和蛋白质水平的剪接和表达。
图5示出ASO3.2特定抑制G1/S转换和癌细胞活力。图5A显示了在用不同浓度(1、10、25、50、100、150、200和250nM)的ASO3.1、 ASO3.2或ASO-ctl处理48小时后，
Figure GDA0003577466790000051
(CTG)测定测量的 KYSE510(K510)、H358或KYSE180(K180)细胞的细胞活力。显示了每个细胞系的相应半最大抑制浓度(IC50)值。数据表示为代表性实验的四个重复的平均值±sd。图5A中的结果表明，ASO3.1和ASO3.2均以低IC50 值显著抑制KYSE510和H358的细胞活力，而它们对KYSE180的细胞活力的抑制作用要小得多。图5B显示了在用50nMASO3.2或ASO-ctl处理48小时后，通过CTG测定测量的三种癌细胞系和正常肝细胞中每一种的细胞活力。ASO1和ASO3由于无法抑制AZIN1编辑可作为两个额外的阴性对照。图5C显示了在用所示浓度的ASO3.2或ASO-ctl处理48小时后，三种细胞系中每一种的病灶形成试验(foci formation assay)。细胞用结晶紫染色。图5B和5C中的结果表明，ASO3.2可以特异性抑制表达经编辑的AZIN1S367G的癌细胞的细胞活力。图5D左图：将细胞用50nM ASO3、ASO3.2或ASO-ctl处理48小时，然后进行PI染色，并通过流式细胞术进行细胞周期分析。使用BDFACSDiva软件分析原始FACS数据，该软件绘制了细胞计数与DNA含量的关系图。图5D右图：条形图显示了代表性实验的亚-G1、G1、S和G2/M期的细胞百分比。图5D中的结果表明，与用ASO-ctl或ASO3处理的细胞相比，在ASO3.2处理后，KYSE510和H358细胞表现出G1/S转换的明显衰减和亚G1期(凋亡细胞)百分比的显著增加。图5E显示了图5D中描述的KYSE510细胞中 CCND1和ODC蛋白表达的蛋白质印迹分析结果。GAPDH用作加载对照。图5E中的结果表明，在用ASO3.2处理的细胞中观察到CCND1和 ODC蛋白表达显著降低，从而支持图5D中所示的ASO3.2诱导的G1/S 停滞。
图6显示了ASO3.2在体内特异性地抑制肿瘤的发生和生长。图6A 显示了通过Kaplan-Meier方法估计的皮下注射了KYSE510细胞的NOD scidγ(NOD scid gamma,NSG)小鼠的累积肿瘤发生率曲线，KYSE510细胞用100nM ASO3.2或ASO-ctl预处理了48小时。将ASO3.2或ASO-ctl 预处理的细胞分别注射到小鼠的右侧或左侧背侧。图6A中的结果显示ASO3.2预处理组肿瘤发生率明显低于ASO-ctl预处理组。图6B显示了皮下注射后6周(n＝每组6只小鼠)源生自上述预处理KYSE510细胞的代表性肿瘤，以及源自每组预处理细胞的肿瘤在6周内的生长曲线。数据表示为平均值±sd。**P<0.01，***P<0.001，由未配对双尾斯氏t检验测定。图6B中的结果表明，在6周的观察期内，源自ASO-ctl预处理细胞的肿瘤的生长明显快于源自ASO3.2预处理细胞的肿瘤。图6C显示了用加载到CFSE标记的RBCEV中的ASO3.2处理的KYSE510细胞的代表性荧光显微镜图像。DAPI染色表明细胞核。比例尺，500μm。图6C中的结果表明，大多数ASO3.2-RBCEV可以进入细胞。图6D每4天接受 ASO3.2-RBCEV或ASO-ctl-RBCEV瘤内(i.t.)注射后，源自KYSE510细胞的代表性肿瘤(n＝每组6只小鼠)。对于每次注射，将总计1μg ASO加载到50μg RBCEV中，并重悬浮于20μL PBS中。显示了每组肿瘤在7周内的生长曲线。数据表示为平均值±sd。*P<0.05，**P<0.01，由未配对双尾斯氏t检验测定。黑色箭头表示每次注射。图6D中的结果表明，瘤内注射ASO3.2-RBCEV显著抑制了肿瘤生长。图6E显示了接受裸 ASO3.2或ASO-ctl多次i.t.注射后的代表性肿瘤。进行了与图6D所述相同的实验程序。图6E中的结果表明，在用裸ASO-ctl和ASO3.2处理的小鼠之间没有观察到明显的肿瘤生长差异。图6F显示的测序色谱图说明了在所示PDX行中AZIN1转录物的编辑。编辑百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。黑色箭头表示编辑位点的位置。*，未检测到编辑。图6F中的结果显示，四个PDX细胞(PDX-1；以及来自PDX-22 的不同部分(sector)的PDX-22-T1、T4和T5)具有超过20％的编辑的 AZIN1转录物。图6G显示了在用所示浓度的ASO3.2或ASO-ctl(由脂质转染胺递送)处理48小时后，通过CTG测定测量的PDX1(顶部图)或 PDX22-T3(底部图)的细胞活力。数据表示为代表性实验的四个重复的平均值±sd。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，由未配对双尾斯氏t检验侧定。总之，图6F和6G中的结果表明，ASO3.2处理可以显著降低 AZIN1编辑阳性细胞系的细胞活力，但不会降低非AZIN1编辑细胞系的细胞活力。
图7显示了用所示pRK7小基因和空载体(EV)或ADAR1表达构建体 (ADAR1)共转染的HEK293T细胞中ADAR1表达的定量实时PCR(QPCR) 分析结果。结果表明，在用ADAR1表达构建体共转染的所有样品中 ADAR1成功过表达。
图8显示了在用所示pRK7小基因和空载体(EV)或ADAR1表达构建体(ADAR1)共转染的HEK293T细胞中ADAR1表达的定量实时PCR (QPCR)分析结果。结果表明，在用ADAR1表达构建体共转染的所有样品中ADAR1成功过表达。
图9A显示了通过RNAFold预测的用于REMSA的86-nt AZIN1双链体探针的dsRNA二级结构。图9B所示的REMSA数据显示了ASP1、 DSP1或DSP2与截短的AZIN1双链体探针的结合。截短的RNA双链体为0.25μM。ASP1浓度从左到右分别为0、0.005、0.01、0.02、0.05、 0.1、0.2、0.4、0.7、1、1.5和2μM。ASP1显示不结合高达2μM。至于 DSP1和DSP2，截短的RNA双链体为1μM。DSP1和DSP2的浓度从左到右分别为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、1、2、4、10和20μM。DSP1和DSP2都显示出在μM浓度下与RNA双链体的结合。图9B 还显示了ASO和PNA的完整序列及其在AZIN1的外显子11和外显子12 上的编辑区和ECS区的短双链体上的位置。图9B中的结果表明，ASP1 不能与缩短的AZIN1 RNA双链体结合，而DSP1和DSP2可以通过PNA-dsRNA三链体形成以适度的结合亲和力结合。图9C显示了，在用纯化的 ADAR1蛋白和10μM(左)和200nM(右)的DSP1或DSP2孵育后，从FE 小基因转录的AZIN1转录物的体外RNA编辑分析的测序色谱图。编辑百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。箭头表示编辑位点的位置。*，未检测到编辑。图9C中的结果表明，DSP1和DSP2能够在10 μM的浓度下消除AZIN1编辑，但它们的编辑抑制作用在200nM时显著衰减。
图10A显示的测序色谱图说明了在所示HCC、ESCC和NSCLC细胞系中AZIN1转录物的编辑。编辑百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。箭头表示编辑位点的位置。*，未检测到编辑。图10A中的结果表明，在筛选的HCC、ESCC和NSCLC细胞系中，仅在ESCC系 KYSE510和NSCLC系H358中检测到AZIN1编辑。图10B显示的测序色谱图说明了在用100nMASO1.1处理48小时的KYSE510细胞中检测到的AZIN1转录物的外显子11跳跃。
定义
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷酸的寡聚化合物。如本文所用，术语“寡聚化合物”是指包含两个或更多个亚结构并且能够与核酸分子的区域杂交的聚合结构。在一些实例中，寡核苷酸可以以单链、双链、环状、分支或发夹的形式引入，并且可以含有诸如内部或末端凸起或环等结构元件。双链寡核苷酸可以由两条杂交在一起的寡核苷酸链或具有足以允许杂交并形成完全或部分双链化合物的自互补性的单条寡核苷酸链形成。
如本文所用，术语“核苷”是指包含核碱基和糖的糖基胺。核苷包括但不限于天然核苷、无碱基核苷、修饰的核苷和具有模拟碱基和/或糖基的核苷。如本文所用，术语“天然核苷”或“未修饰的核苷”是指包含天然核碱基和天然糖的核苷。天然核苷包括RNA和DNA核苷。如本文所用，术语“核碱基”是指核苷或核苷酸的碱基部分。核碱基可以包含能够与另一核酸的碱基形成氢键合的任何原子或原子团。如本文所用，术语“天然核碱基”是指未从RNA或DNA中的天然存在形式修饰的核碱基。“天然核碱基”的实例包括嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。除了“天然核碱基”之外，许多本领域技术人员已知的修饰的核碱基或核碱基模拟物适用于本文所述的化合物。术语“修饰的核碱基”和“核碱基模拟物”可以重叠，但通常“修饰的核碱基”是指在结构上与母核碱基非常相似的核碱基，例如7-脱氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G-钳，而“核碱基模拟物”会包括更复杂的结构，例如三环吩噁嗪核碱基模拟物。
如本文所用，术语“核苷酸”是指具有与糖共价连接的磷酸基团的核苷。核苷酸可以用多种取代基中的任何一种进行修饰。
本文所用，术语“靶向(targeting)”或“靶向(targeted to)”是指化合物与具体靶核酸分子或靶核酸分子内具体核苷酸区域的缔合。如果反义化合物与靶核酸充分互补以允许在生理条件下杂交，则该反义化合物靶向靶核酸。
如本文所用，术语“RNA编辑”是指，在基因组编码的RNA序列中引入变化，从而导致RNA突变的共转录或转录后修饰过程。双链RNA (dsRNA)中的腺苷编辑为肌苷(A-到-I)，由作用于RNA(ADAR)酶家族的腺苷脱氨酶催化，是哺乳动物中常见的RNA编辑类型。在脊椎动物中,先前已对三种ADAR蛋白ADAR1、ADAR2和ADAR3的家族进行了表征。ADAR1和ADAR2(ADAR)催化所有当前已知的A-到-I编辑位点。 ADAR3没有已知的脱氨酶活性。肌苷(I)模拟鸟苷(G)，因此ADAR蛋白在转录物中引入了虚拟的A到G取代。这种变化可以导致特定的氨基酸取代、可变剪接、微RNA介导的基因沉默或转录物定位和稳定性的变化。
如本文所用，术语“AZIN1基因”是指编码抗酶抑制剂1蛋白的基因。抗酶抑制剂1属于抗酶抑制剂家族，通过维持细胞内多胺稳态在细胞生长和增殖中起作用。抗酶抑制剂是已失去使鸟氨酸脱羧的能力、但保留了与抗酶结合的能力的鸟氨酸脱羧酶(ODC，多胺生物合成中的关键酶)的同系物。抗酶通过与ODC结合并靶向它以降解，以及通过抑制多胺摄取来负调节细胞内多胺水平。抗酶抑制剂通过螯合抗酶并中和其作用，起到多胺水平的正调节剂的作用。抗酶抑制剂1广泛表达并定位于细胞的细胞核和细胞质中。AZIN1基因的过表达与增殖、细胞转化和肿瘤发生的增加有关。在一具体实例中，AZIN1基因的序列为SEQ IDNO:3，编码SEQ ID NO:4的蛋白质。
“ADAR酶”是能够在具体核酸(例如，mRNA)处修饰多核苷酸的双链 RNA特异性腺苷脱氨酶。在一些实例中，ADAR酶例如通过将腺苷转化为肌苷进行mRNA序列的转录后修饰或“编辑”。由于肌苷模拟鸟苷的活性(例如，与胞嘧啶配对)，这可以有效地导致在转录的mRNA序列中形成单核苷酸多态性。在一些实例中，编辑可导致形成“隐蔽”剪接位点、重组基序或其他核酸元件。
本文所用术语“编辑位点互补序列”或简称“ECS”是指在被编辑基因的非翻译区(UTR)、外显子或内含子中能够形成双链RNA结构并且覆盖腺苷到肌苷编辑位点及其周围区域的序列。在一些实例中，ECS位于被编辑基因的内含子中。在一些实例中，ECS能够形成不完美的折回双链 RNA结构，同时外显子序列围绕着腺苷到肌苷的编辑侧。在一些实例中，AZIN1的用于ADAR1介导的前mRNA编辑的ECS包含位于AZIN1 外显子12的3'末端附近的29个核苷酸序列5'- AAGAAGACAGCUUUUCCGCUGAAGCUUAA-3'(SEQ ID NO:1)或由其组成。本文在“AZIN1的用于ADAR1介导的前mRNA编辑的核心ECS”的上下文中使用的术语“核心ECS”是指本申请的发明人发现对ADAR1介导的AZIN1前mRNA编辑至关重要(即核心ECS的缺失导致ADAR1介导的 AZIN1前mRNA编辑受到抑制)的ECS的特定部分。在一些实例中， AZIN1的用于ADAR1介导的前mRNA编辑的核心ECS包含位于AZIN1 外显子12的3'末端附近的8核苷酸序列5'-GCTTTTCC-3'或由其组成。
如本文所用，术语“编辑区”是指基因中例如AZIN1基因中由ADAR-1 识别和/或靶向以进行编辑的序列。在一些实例中，AZIN1的用于ADAR1 介导的前mRNA编辑的编辑区包含位于AZIN1外显子11中的序列5’- UGAGCUUGAUCAAAUUGUGGAAAGCUGUCUUCUUCCUGAGCU-3’(SEQ ID NO:2)(下划线“A”为腺苷到肌苷编辑位点)或由其组成。在一些实例中，序列5'-GGAAAGC-3'被认为是“含有编辑位点的序列或区域”。一般认为，在缺少腺苷到肌苷编辑位点的情况下，不会发生ADAR1介导的前mRNA编辑。
本文中可互换使用的术语“糖修饰”或“修饰的糖”是指不是天然存在的 RNA中发现的呋喃核糖基或天然存在的DNA中发现的脱氧呋喃核糖基的糖部分。修饰的糖部分可用于改变、通常增加反义化合物对其靶标的亲和力和/或增加核酸酶抗性。“修饰的糖”包括但不限于取代糖、双环或三环糖或糖替代物。如本文所用，“取代的糖部分”是指包含至少一个不同于天然存在的糖部分的取代基的呋喃糖基。取代的糖包括但不限于在2'- 位、3'-位、5'-位和/或4'-位包含取代基的呋喃糖基。如本文所用，“2'-取代的糖”是指在2'-位包含H或OH以外的取代基的呋喃糖基。除非另有说明，否则2'-取代的糖不是双环糖(即，2'-取代的糖部分的2'-取代基不与呋喃糖基环的另一个原子形成桥)。适用于2'-位的糖取代基的实例包括但不限于：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-氟。在一些实例中，2'位的糖取代基选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、O- C1-C10取代的烷基；O-C1-C10烷氧基；O-C1-C10取代的烷氧基、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2—O—N(Rm)(Rn)和O—CH2—C(═O)— N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn都独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。
本文所用“双环糖”是指包含4-7元环(包括但不限于呋喃糖基)的修饰糖，所述4-7元环包含连接4-7元环的两个原子以形成第二环的桥，从而导致双环结构。在一些实例中，4-7元环是糖环。在一些实例中，4-7元环是呋喃糖基。在一些这样的实例中，桥连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳。
如本文所用，术语“双环核苷”或“BNA”是指核苷，其中核苷的呋喃糖部分包括连接呋喃糖环上的两个原子的桥，从而形成双环系统。BNA包括但不限于α-L-LNA、β-D-LNA、ENA、氧氨基BNA(2'-O-N(CH3)-CH2- 4')和氨基氧基BNA(2'-N(CH3)-O-CH2-4')。
BNA的代表性结构包括但不限于：
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本文所用术语“4'至2'双环核苷”是指BNA，其中连接呋喃糖环的两个原子的桥桥接呋喃糖环的4'碳原子和2'碳原子，从而形成双环环系统。
如本文所用，“锁核酸”或“LNA”是指经修饰使得核糖基糖环的2'-羟基通过亚甲基连接至糖环的4'碳原子，从而形成2'-C,4'-C-甲醛键的核苷酸。LNA包括但不限于α-L-LNA和β-D-LNA。
如本文所用，术语“糖替代物”是指这样的结构，其不包含呋喃糖基和能够替代核苷的天然存在的糖，使得所得核苷能够(1)并入寡核苷酸和(2) 与互补核苷杂交。此类结构包括包含与呋喃糖基不同的原子数的环(例如，4、6或7元环)；用非氧原子(例如碳、硫或氮)替代呋喃糖基的氧；或者同时改变原子数和氧的替代。此类结构还可以包含对应于针对取代糖部分描述的那些取代的替代(例如，任选地包含其他取代基的6元碳环双环糖替代物)。糖替代物还包括更复杂的糖替代物(例如，肽核酸的非环系统)。糖替代物包括但不限于吗啉、修饰的吗啉、环己烯基和环己醇。
本文所用术语“肽核酸”或简称“PNA”是指在结构上类似于DNA或 RNA的人工合成聚合物。在一些实例中，PNA对RNAi或RNase H的切割具有抗性，和/或对核酸酶和蛋白酶的降解具有抗性。与可比较的寡核苷酸相比，PNA还可以具有增加的稳定性和更长的半衰期。在一些实例中，PNA对DNA和RNA具有高结合亲和力。在一些实例中，PNA包含通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元的骨架。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基桥(-CH2-)和羰基(-(C＝O)-)连接到骨架上。PNA通常被描述为肽，N端位于第一个(左侧)位置，C端位于最后(右侧)位置。在一些实例中，PNA在C末端具有伯酰胺以形成伯酰胺键。在一些实例中，PNA的N-末端包含赖氨酸氨基酸。在一些情况下，PNA具有两个C末端或两个N末端。在一些实例中，PNA的骨架不包含带电荷的磷酸基团。
如本文所用，“核苷酸间键”是指相邻核苷酸之间的共价键。
如本文所用，“天然核苷酸间键”是指3'至5'磷酸二酯键。
如本文所用，术语“修饰的核苷酸间键”是指核苷酸之间除天然存在的核苷酸间键之外的任何键。与天然磷酸二酯键相比，修饰的核苷酸间键可以用于改变、通常是增加反义化合物的核酸酶抗性。
如本文所用，术语“反义化合物”是指与所杂交的靶核酸分子至少部分互补的寡聚化合物。在一些实例中，反义化合物调节(增加或降低)靶核酸的表达。反义化合物包括但不限于为寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物和这些的嵌合组合的化合物。因此，虽然所有反义化合物都是寡聚化合物，但并非所有寡聚化合物都是反义化合物。
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”是指为寡核苷酸的反义化合物。
如本文所用，术语“互补”是指寡聚化合物通过核碱基互补性与另一寡聚化合物或核酸杂交的能力。在一些实例中，当每个分子中足够数量的相应位置被可以彼此键合以允许反义化合物与靶标之间的稳定结合的核碱基占据时，反义化合物与其靶彼此互补。本领域技术人员认识到，在不消除寡聚化合物保持结合的能力的情况下，包括错配是可能的。因此，本文公开的反义化合物可包含高达约20％错配的核苷酸(即，不是与靶标的相应核苷酸互补的核碱基)。优选，反义化合物含有不超过约 15％，更优选不超过约10％，最优选不超过5％的错配或没有错配。剩余的核苷酸是核碱基互补的或不会破坏杂交(例如，通用碱基)。本领域普通技术人员会认识到，本文提供的化合物与靶核酸是至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或100％核碱基互补的。
如本文所用，“杂交”是指互补寡聚化合物(例如反义化合物与其靶核酸)的配对。虽然不限于具体机制，但最常见的配对机制涉及互补核碱基之间的氢键合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。例如，天然碱基腺嘌呤是与通过形成氢键配对的天然核碱基胸苷和尿嘧啶互补的核碱基。天然碱基鸟嘌呤是与天然碱基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶互补的核碱基。杂交可以在不同情况下发生。
两条序列可以在中等严格或优选严格条件下互补并彼此杂交。可以通过本领域已知的方法在中等严格条件下或在严格条件下进行与所需序列的杂交。还可以根据已知方法改变杂交条件，这取决于感兴趣的序列。
如本文所用，术语“互补百分比”是指与另一寡聚化合物或核酸的相应核碱基具有核碱基互补性的寡聚化合物的核碱基数除以寡聚化合物的总长度(核碱基数)。
如本文所用，术语“同一性百分比”是指由匹配的相同核苷酸或氨基酸的数量除以报告同一性百分比的序列长度确定的值。氨基酸序列相似性百分比可以通过与用于确定氨基酸序列同一性百分比相同的计算来确定，但在计算中除了相同氨基酸之外还可以例如包括保守氨基酸取代。寡核苷酸比对算法，例如BLAST(GenBank；使用默认参数)可以用于计算序列同一性百分比。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指活性化合物的保留了所需生物活性并且不赋予不期望的毒理学作用的盐。反义寡核苷酸的钠盐是有用的，并且被广泛接受用于向人进行治疗性给药。
如本文所用，术语“前药”是指，以在体内或其细胞内通过内源性酶、化学物质和/或条件的作用转化为活性形式(即药物)的无活性或活性较低的形式制备的治疗剂。特别是，可以根据WO 93/24510或WO 94/26764公开的方法将寡核苷酸的前药形式制备为SATE((S-乙酰基-2-硫乙基)磷酸酯)衍生物。前药还可以包括反义化合物，其中一个或两个末端包含被切割(例如，通过在末端掺入磷酸二酯骨架键)以产生活性化合物的核碱基。
如本文所用，术语“治疗”是指施用本发明的组合物以实现疾病或疾病状况的改变或改善。预防、改善和/或治疗可能需要定期或在疾病或疾病状况发作之前施用多个剂量以改变疾病或疾病状况的进程。此外，对于病症或疾病状况的每次预防、改善和治疗，可以在单个个体中依次或同时使用单一药剂。
本文所用术语“药剂”是指当施用于个体时提供治疗益处的物质。
本文所用术语“治疗有效量”是指为动物提供治疗益处的药剂的量。
如本文所用，“施用”是指向动物提供药剂，包括但不限于由医学技术人员施用和自我施用。
如本文所用，术语“药物组合物”是指适合施用于个体的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含寡核苷酸和无菌水溶液。
如本文所用，术语“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和非人灵长类动物，包括但不限于猴子和黑猩猩。
发明详述
本申请的发明人已经发现，外显子12的3'末端序列是与在AZIN1的外显子11处被编辑的序列形成双链RNA(dsRNA)的AZIN1的编辑位点互补序列(ECS)。令人惊讶地发现，靶向该ECS的化合物，尤其是寡核苷酸，可以抑制ADAR1介导的AZIN1前mRNA编辑。抑制AZIN1的前 mRNA编辑可以在体外有效降低AZIN1前mRNA编辑相关癌细胞的活力，并在体内抑制与AZIN1前mRNA编辑相关的肿瘤/癌症的发生和生长。因此，由本申请的发明人鉴定的靶向ECS的化合物可充当与AZIN1 前mRNA编辑相关的肿瘤/癌症的有希望的治疗候选物。
因此，一方面，提供了靶向AZIN1基因的核心编辑位点互补序列 (ECS)的寡核苷酸，其中AZIN1基因的核心ECS包含序列5'-GCTTTTCC- 3'，并且其中该寡核苷酸包含一个或多个具有糖修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷酸间键。该寡核苷酸可以抑制ADAR1介导的AZIN1前 mRNA编辑。
如以下工作实施例所示，在一些实例中，AZIN1前mRNA包含编辑区(例如5’- UGAGCUUGAUCAAAUUGUGGAAAGCUGUCUUCUUCCUGAGCU-3’ (SEQ ID NO:2)，带有下划线的“A”是腺苷到肌苷编辑位点)，它被ADAR- 1识别和/或定位以进行编辑。在这些实例中，ADAR-1将序列5’- GGAAAGC-3’编辑为5’-GGAAIGC-3’，导致翻译的AZIN1蛋白发生突变。
在一些实例中，本文公开的反义寡核苷酸防止ADAR-1的识别和/或结合，从而抑制或阻断ADAR-1的活性。这可以通过例如防止在AZIN1 前mRNA链内形成dsRNA结构，或防止ADAR-1识别dsRNA结构来实现。
寡核苷酸可以包含核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。在一个具体实例中，寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在一些实例中，寡核苷酸不是肽核酸(PNA)。
在一些实例中，本文公开的寡核苷酸的长度为至少约8个核苷酸，例如但不限于约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100个或更多个核苷酸。此外，寡核苷酸的长度可以由如上提供的任何两个值或介于两者之间的任何两个值的范围限定。在一些具体实例中，寡核苷酸的长度为约20-30个核苷酸。在一个具体实例中，寡核苷酸的长度为至少约20个核苷酸。在一个具体实例中，寡核苷酸的长度为约20个核苷酸。
在一些实例中，寡核苷酸中至少约30％、35％、40％、45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的核苷酸被糖修饰修饰。此外，用糖修饰修饰的核苷酸的百分比可以由如上提供的任何两个值或介于两者之间的任何两个值的范围限定。在一个具体实例中，寡核苷酸中至少约50％的核苷酸被糖修饰修饰。在另一个具体实例中，寡核苷酸中至少约70％的核苷酸被糖修饰修饰。在又一具体实例中，寡核苷酸中的所有核苷酸均被糖修饰修饰。
在一些实例中，被糖修饰修饰的核苷酸位于寡核苷酸的5'末端处或附近。在一些其他实例中，被糖修饰修饰的核苷酸位于寡核苷酸的3'末端处或附近。在一些实例中，在寡核苷酸的5'末端处或附近的至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10个核苷酸被糖修饰修饰。在一些其他实例中，在寡核苷酸的3'末端处或附近的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸被糖修饰修饰。
在一些实例中，具有糖修饰的核苷酸为2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'- O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2',4'-桥接核酸修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)修饰的核苷酸或吗啉环修饰的核苷酸。在一具体实例中，具有糖修饰的核苷酸为2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一具体实例中，寡核苷酸中的所有核苷酸均被2'-O-甲基糖修饰修饰。
当寡核苷酸中有一个以上具有糖修饰的核苷酸时，这些核苷酸可以被相同的糖修饰或不同的糖修饰修饰。
在一些实例中，本文公开的寡核苷酸是反义寡核苷酸。在一些实例中，反义寡核苷酸是非降解反义寡核苷酸，即反义寡核苷酸不能通过 RNA酶H或RNA干扰(RNAi)机制实现靶标降解。在一些实例中，非降解反义寡核苷酸与其靶RNA结合，并在空间上阻止其他分子进入以与 RNA进行碱基配对。在一些具体实例中，此类空间阻断反义寡核苷酸在 2'糖位置是被完全修饰的，使得RNA酶H无法降解靶RNA。
在一些实例中，本文公开的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸间键。修饰的核苷酸间键的实例包括但不限于含磷的核苷间键，例如磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。在一些具体实例中，本文公开的寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯、氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯键。
在一些实例中，寡核苷酸中最多约2％、5％、10％、15％、20％、 25％、30％、35％、40％、45％或50％的核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。在一些其他实例中，寡核苷酸中至少约2％、5％、10％、15％、 20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。此外，寡核苷酸中修饰的核苷酸间键的百分比可由如上提供的任何两个值或介于两者之间的任何两个值的范围限定。在一个具体实例中，寡核苷酸中至少约10％的核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。在一个具体实例中，寡核苷酸中约25％的核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。在另一个具体实例中，寡核苷酸中的所有核苷酸间键都是修饰的核苷酸间键。在又一个具体实例中，寡核苷酸中至少约10％的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在又一个具体实例中，寡核苷酸中约25％的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在又一个具体实例中，寡核苷酸中的所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯键。
在一些实例中，修饰的核苷酸间键位于寡核苷酸的5'末端处或附近。在一些其他实例中，修饰的核苷酸间键位于寡核苷酸的3'末端处或附近。在一些实例中，在寡核苷酸的5'末端处或附近的至少1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10个核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。在一些其他实例中，在寡核苷酸的3'末端处或附近的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。
在一具体实例中，当具有糖修饰的核苷酸为吗啉环修饰的核苷酸，并且连接吗啉环修饰的核苷酸与相邻核苷酸的修饰的核苷酸间键为二氨基磷酸酯核苷酸间键时，形成二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(phosphorodiamidate morpholino oligomer,PMO)。
在一些实例中，寡核苷酸包含与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列或由其组成，使得寡核苷酸可以有效地靶向AZIN1基因的ECS。由于AZIN1基因的核心ECS包含序列5’-GCTTTTCC-3’，因此与AZIN1基因的核心ECS完全互补的反义序列为5’-GGAAAAGC-3’。本领域技术人员应当认识到，在不消除反义序列的互补活性的情况下包括错配是可能的。因此,在一些实例中,与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列可以含有高达1、2或3个不与AZIN1基因的核心ECS形成碱基配对的核苷酸。
在一些实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列位于靶向 AZIN1基因的ECS的寡核苷酸的3'末端或附近。例如，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列的3'末端可以距离寡核苷酸的3'末端最多0、 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列对于包含反义序列的寡核苷酸有效靶向AZIN1基因的ECS至关重要。因此，在一些实例中，与 AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少一些核苷酸被糖修饰修饰。这可以增加反义序列对AZIN1基因的ECS的亲和力，或增加反义序列的核酸酶抗性。在一些实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少5、6、7或8个核苷酸被糖修饰修饰。在一些具体实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少5、6、7或8个核苷酸为2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2',4'-桥接核酸修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)修饰的核苷酸或吗啉环修饰的核苷酸或其组合。在一个具体实例中，与AZIN1基因的核心 ECS互补的反义序列中的至少5、6、7或8个核苷酸是2'-O-甲基修饰的核苷酸。在另一个具体实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的所有核苷酸都是2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在一些其他实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少一些核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。这可以增加反义序列的核酸酶抗性。在一些实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少3、4、5、6或7个核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。在一些具体实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少3、4、5、6或 7个核苷酸间键是硫代磷酸酯、氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯键或其组合。在一个具体实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少 3、4、5、6或7个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在另一个具体实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的至少5个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在又一个具体实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯键。
在一些实例中，与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的核苷酸间键都不是修饰的核苷酸间键，即与AZIN1基因的核心ECS互补的反义序列中的所有核苷酸间键都是天然的3'到5'磷酸二酯键。在这样的实例中，寡核苷酸的其他部分(即与AZIN1基因的核心ECS不互补的部分)可以含有修饰的核苷酸间键，以增加寡核苷酸的核酸酶抗性。
在一些实例中，寡核苷酸完全被糖修饰和被核苷酸间键修饰修饰，即寡核苷酸中的每个核苷酸都被糖修饰修饰并通过修饰的核苷酸间键连接于相邻核苷酸。在一些具体实例中，寡核苷酸中的每个核苷酸都被2'- O-甲基糖修饰修饰并通过硫代磷酸酯键连接于相邻核苷酸。
在一些实例中，本文公开的寡核苷酸与序列5'- UUAAGCUUCAGCGGAAAAGC-3'(SEQID No:5)具有至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实例中，寡核苷酸包含序列5'-UUAAGCUUCAGCGGAAAAGC-3'(SEQ ID No:5)或由其组成。序列5'-UUAAGCUUCAGCGGAAAAGC-3'(SEQ ID No:5)含有一个或多个具有本申请所述糖修饰的核苷酸和任选的一个或多个本申请所述修饰的核苷酸间键。
在一些实例中，寡核苷酸与一条或多条下述序列具有至少70％、 75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性：5'- mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGmC-3' (SEQ ID No:6),5'- mU*mU*mA*mA*mG*mC*mU*mU*mC*mA*mG*mC*mG*mG*mA*mA* mA*mA*mG*mC-3'(SEQ ID No:7),5'- mU*mU*mA*mA*mG*mCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGm C-3'(SEQ ID No:8)和5'- mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmA*mA*mA*mA*mG*m C-3'(SEQ IDNo:9)，其中m表示2'-O-Me糖修饰，*表示硫代磷酸酯键。在一些实例中，寡核苷酸包含下述序列之一或由其组成：5'- mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGmC-3' (SEQ IDNo:6),5'- mU*mU*mA*mA*mG*mC*mU*mU*mC*mA*mG*mC*mG*mG*mA*mA* mA*mA*mG*mC-3'(SEQID No:7),5'- mU*mU*mA*mA*mG*mCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGm C-3'(SEQ ID No:8)和5'- mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmA*mA*mA*mA*mG*m C-3'(SEQ ID No:9)，其中m表示2'-O-Me糖修饰，*表示硫代磷酸酯键。
在一些实例中，可以通过本领域已知的适当部分，例如但不限于一种或多种荧光团、放射性基团、化学取代基、酶、抗体等，标记本文公开的寡核苷酸，以促进在杂交测定和其他测定或测试中进行鉴定。
本文提供的寡核苷酸可用于药物组合物，例如通过将有效量的寡核苷酸添加到合适的药学上可接受的稀释剂或载体中。因此，一方面，提供了包含本文公开的寡核苷酸的药物组合物。
可接受的载体和稀释剂是本领域技术人员众所周知的。稀释剂或载体的选择基于许多因素，包括但不限于寡核苷酸的溶解度和给药途径。本领域技术人员很好地理解这些考虑因素。
本文提供的寡核苷酸包含任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或任何其他在施用于包括人在内的动物时能够(直接或间接)提供生物活性代谢物或其残留物的功能性化学等效物。因此，例如，本公开还提供了寡核苷酸的前药和寡核苷酸的药学上可接受的盐、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物等效物。
本文公开的寡核苷酸还可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式结合。
可以多种方式施用药物组合物，这取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。
可以根据制药工业中众所周知的常规技术来制备可以方便地以单位剂型呈现的本文所述药物制剂。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体、细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，使产品成型(例如，形成用于递送的具体粒径)，来制备制剂。
“药物载体”可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或用于将一种或多种核酸递送至动物的任何其他药理学惰性媒介，并且是本领域已知的。当与给定药物组合物的核酸和其他成分组合时，载体可以是液体或固体，并在考虑计划的给药方式的情况下进行选择，以提供所需的体积、稠度等。液体载体可以是水性载体、非水性载体或两者，并且包括但不限于水性悬浮液、油乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位点特异性乳液、长效乳液(long-residence emulsion)、粘性乳液、微乳液和纳米乳液。固体载体可以是生物载体、化学载体或两者，包括但不限于允许寡核苷酸组合物持续释放的病毒载体系统、颗粒、微粒、纳米颗粒、微球、纳米球、微型泵、细菌细胞壁提取物和可生物降解或不可生物降解的天然或合成聚合物。
优选的水性载体包括但不限于水、盐水和药学上可接受的缓冲剂。优选的非水性载体包括但不限于矿物油或中性油，包括但不限于甘油二酯、甘油三酯、磷脂、脂质、油及其混合物，其中油含有多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的适当混合物。实例包括但不限于角鲨烯、大豆油、油菜籽油、棕榈油、橄榄油和myglyol，其中脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。任选地，不论药学上可接受的载体，可以包括赋形剂。这些赋形剂包括但不限于抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂，并且可以包括悬浮剂和增稠剂。
实施方案中可以通过常规制药技术制备本发明的组合物与例如一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂组合。此类技术包括使含有活性成分的组合物和药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体均匀且紧密地结合来制备制剂。
本文所公开的药物组合物的组成、形状和剂型类型通常会根据预期用途而变化。例如，与用于长期治疗相同疾病的剂型相比，用于该疾病或相关疾病的急性治疗的剂型可以含有量更大的一种或多种其包含的活性化合物。同样，与用于治疗相同疾病或病症的口服剂型相比，肠胃外剂型可以含有量较少的一种或多种其包含的活性化合物。本发明所涵盖的具体剂型彼此不同的这些和其他方式，对于本领域技术人员而言应该是显而易见的。剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊，例如软弹性明胶胶囊；扁囊剂；锭剂(troch)；锭剂(lozenge)；分散剂；栓剂；软膏剂；泥罨剂(泥敷剂)；糊剂；粉末剂；敷剂；乳膏剂；硬膏剂；溶液；贴剂；气雾剂(例如鼻腔喷雾剂或吸入器)；凝胶；适合于对患者进行口服或粘膜给药的液体剂型，包括悬浮剂(例如，水性或非水性液体悬浮剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；特别适合对患者进行肠胃外给药的液体剂型；和可以重构以提供适合对患者进行肠胃外给药的液体剂型的无菌固体(例如，结晶或无定形固体)。因此，在一个实例中，可以以选自但不限于以下的形式提供本文公开的药物组合物：片剂、囊片、胶囊、硬胶囊、软胶囊、软弹性明胶胶囊、硬明胶胶囊、扁囊剂、锭剂(troch)、锭剂(lozenge)、分散剂、栓剂、软膏剂、泥罨剂、泥敷剂、糊剂、粉末剂、敷剂、乳膏剂、硬膏药、溶液、注射液、贴剂、气雾剂、鼻腔喷雾剂、吸入剂、凝胶、悬浮剂、水性液体悬浮剂、非水性液体悬浮剂，水包油乳剂、油包水液体乳剂、溶液、无菌固体、结晶固体、无定形固体、用于重构的固体或其组合。
一方面，提供了抑制细胞中AZIN1前mRNA编辑的方法，该方法包括使细胞与本文公开的寡核苷酸或本文公开的药物组合物接触。这类方法可以是体内的、离体的或体外的。特别是，本文公开的寡核苷酸或药物组合物抑制的AZIN1前mRNA编辑是由作用于RNA-1的腺苷脱氨酶 (ADAR-1)介导的。
还考虑了使体液、器官或组织与有效量的一种或多种本文提供的寡核苷酸或药物组合物接触的方法。可以使体液、器官或组织与一种或多种寡核苷酸接触，从而调节体液、器官或组织细胞中的AZIN1前mRNA 编辑。可通过对本领域技术人员常规的方法监测寡核苷酸或药物组合物对AZIN1前mRNA编辑的调节作用来确定有效量。
AZIN1基因的前mRNA编辑与增殖、细胞转化和肿瘤发生的增加有关。因此，本文公开的能够抑制ADAR-1介导的AZIN1前mRNA编辑的寡核苷酸可有效治疗与ADAR-1介导的AZIN1前mRNA编辑相关的癌症。因此，一方面，提供了治疗有需要的个体的癌症的方法，包括向个体施用治疗有效量的本文公开的寡核苷酸或本文公开的药物组合物，其中癌症与AZIN1前mRNA编辑相关。
蛋白质重新编码类型的RNA编辑可以通过增强癌基因的活性或降低抑癌基因的活性来促进肿瘤发生。在一些实例中，AZIN1前mRNA可以被ADAR1蛋白编辑，导致在残基367处丝氨酸(S)到甘氨酸(G)的取代。在一些实例中，AZIN1S367G比野生型AZIN1更稳定，并且对抗酶具有更强的亲和力。抗酶通过结合和降解与细胞生长和增殖相关的蛋白质来调节生长，例如鸟氨酸脱羧酶(ODC)和细胞周期蛋白D1(CCND1)。 AZIN1S367G可以通过与野生型AZIN1竞争与抗酶的结合来抑制抗酶介导的ODC和CCND1降解，从而促进进入细胞周期并具有比野生型AZIN1 更强的致瘤能力。
与AZIN1前mRNA编辑、特别是与ADAR-1介导的AZIN1前mRNA 编辑相关的癌症的实例包括但不限于肝癌、食管癌、肺癌和结肠直肠癌。具体癌症类型包括但不限于肝细胞癌(HCC)、食管鳞状细胞癌 (ESCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌(CRC)。在一些实例中，AZIN1 RNA编辑水平升高是总生存期和无病生存期的预后因素，也是淋巴结和远端转移的独立危险因素。
在一些实例中，本文所述治疗癌症的方法包括施用多种治疗剂。在一些实例中，本文所述的任何寡核苷酸或药物组合物是第一治疗剂，并且该方法还包括施用第二治疗剂。可以在第一治疗剂之前、同时或之后施用第二治疗剂。在一些实例中，第二治疗剂是基于RNA的治疗剂或小分子药物。
应当理解，小分子药物可以指本领域已知的用于靶向癌症的药物。合适的药物包括：索拉非尼、吉非替尼、奥希替尼、克唑替尼、培美曲塞(Alimta)、紫杉醇、卡铂、吉西他滨、卡培他滨、艾日布林、5-FU(5-氟尿嘧啶)等。一些药物可与本文所述的寡核苷酸组合使用，以治疗具体疾病或疾病状况。例如，当治疗非小细胞肺癌(NSCLC)时，本文所述的寡核苷酸可以与吉非替尼、奥希替尼(对于EGFR突变体)、克唑替尼(对于 ALK突变体)或其组合组合。在一些实例中，本文公开的寡核苷酸可与化疗药物如培美曲塞(Alimta)组合，当肿瘤对靶向药物无反应时使用该化疗药物。在靶向乳腺癌的情况下，本文所述的寡核苷酸可以与紫杉醇、卡铂、吉西他滨、卡培他滨、艾日布林或其组合组合。在靶向结肠癌的情况下，本文所述的寡核苷酸可与5-FU(5-氟尿嘧啶)或卡培他滨组合。
本文提供的还包括本文公开的寡核苷酸或本文公开的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中癌症与AZIN1前mRNA编辑相关。本文提供的还包括本文公开的寡核苷酸或本文公开的药物组合物用于治疗、特别是用于治疗癌症，其中癌症与AZIN1前mRNA编辑相关。
在一些实例中，本文公开的寡核苷酸通过减少G1/S细胞周期转换来抑制细胞特别是癌细胞的生长、细胞活力和/或增殖。癌细胞可以理解为本文所述的任何癌细胞，或产生突变抗酶抑制剂的任何癌细胞。在一些实例中，减少G1/S细胞周期转换包括减少从经编辑的AZIN1 RNA转录物翻译的突变抗酶抑制剂的量。ADAR-1阻断dsRNA形成和/或异常AZIN1RNA转录物编辑会导致产生的突变抗酶抑制剂减少。
在一些实例中，为了确定患者的癌症是否与AZIN1前mRNA编辑相关并因此应当用本文公开的寡核苷酸或药物组合物治疗，从患者获得样品，以测量经编辑的AZIN1前mRNA的水平。因此，在一些实例中，本文公开的治疗方法还包括，在施用治疗有效量的本文公开的寡核苷酸或本文公开的药物组合物之前，测量获得自个体的样品中经编辑的AZIN1 前mRNA的水平。在一些实例中，测量经编辑的AZIN1前mRNA的水平包括AZIN1的RNA转录物的分离和测序。
在一些实例中，为了患者中的癌症被视为与AZIN1前mRNA编辑相关，获得自患者的样品中经编辑的AZIN1前mRNA的水平比获得自健康个体的样品中经编辑的AZIN1的水平高至少15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％或50％。在提供的实例中，经编辑的AZIN1前mRNA 的水平计算为“G”(表示由ADAR-1编辑)峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。
在一些实例中，还在治疗期间确定经编辑的AZIN1前mRNA的水平，以指示治疗的功效，和/或在治疗后检查以确定治疗是否有效。
本文使用的术语“样品”是指生物样品，或包含至少一些生物材料例如细胞、DNA或RNA的样品。生物样品的实例包括但不限于固体组织样品，例如骨髓，和液体样品，例如全血、血清、血浆、脑脊液、中枢脊髓液、淋巴液、囊液、痰液、粪便、胸腔积液、粘液、胸水、腹水、羊水、腹膜液、唾液、支气管冲洗液和尿液。在一些实例中，生物样品是血液样品。在一些其他实例中，生物样品是获得自肿瘤活检或手术切除的肿瘤的肿瘤样品。
可以从任何生物体获得本公开的生物样品，包括哺乳动物例如人、灵长类动物(例如猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)、猫、狗、兔子、农场动物(例如牛、马、山羊、绵羊、猪)和啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)。
应当理解，按照本文所述的与测试、鉴定或筛选相关的任何方法，该方法还可以包括针对一种或多种其他基因突变的其他测试或筛选、血液测试、血液酶测试、咨询、提供支持资源或根据此类测试和/或筛选的结果施用其他药剂。同样，还预期该方法可以在一个或多个步骤之后进行，一个或多个步骤例如但不限于选择患有癌症或被认为处于患有患癌症风险中的个体，或选择癌前期或疑似处于癌前期风险中的个体。
寡核苷酸可以通过理解为直接向身体给药的“裸递送”来递送，并被受体摄取到细胞中。寡核苷酸还可以与配体缀合，例如细胞穿透肽、新霉胺、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。寡核苷酸还可以通过合适的载体递送，例如纳米颗粒。也可以将寡核苷酸转染、脂质转染或电穿孔到细胞中。
施用本文所公开的寡核苷酸或药物组合物的方法包括但不限于以下：口服(例如颊或舌下)、肛门、直肠、作为栓剂、结肠内、局部、肠胃外、鼻、气雾剂、吸入、鞘内、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、皮内、真皮下(subdermal)、皮下(subcutaneous)、肌肉内、淋巴管内、子宫内、囊内(intravesicular)、阴道、内脏、进入体腔、在发炎组织例如脂肪组织的位置处外科给药、进入器官的腔或实质，进入骨髓和进入胃肠、生殖、泌尿和泌尿生殖系统的任何粘膜表面。应当理解，给药途径的选择应由治疗领域的普通技术人员来选择，从而实现RNA编辑水平的抑制或降低。
应注意，如本文所用，术语“生物体”、“个体(individual)”、“个体 (subject)”或“患者”用作同义词并且可互换。
定量给药(dosing)取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性，治疗过程持续数天至数月，或直至治愈或实现疾病状态的减轻。最佳定量给药方案可以由对患者体内药物积累或其代谢物的测量结果来计算。给药医生可以很容易地确定最佳剂量、定量给药方法和重复率。最佳剂量可以根据组合物的相对效力而变化，并且通常可以基于算术平均值来估计，例如基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50值，或基于本文所述的实施例。通常，本公开的药物组合物的剂量为约0.01μg至100 g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医师可以根据测量的停留时间和药物在体液或组织中的浓度来估计定量给药的重复率。在成功治疗之后，可能需要让个体接受维持治疗，以防止疾病状态的复发，其中以0.01μg至100g/kg体重的维持剂量、每天一次或多次至每2年一次施用组合物。
如上所述，本领域技术人员应当能够基于例如疾病严重程度确定达到所需临床效果所要求的所需剂量和剂量方案。以下为静脉注射的说明性实例，其可根据其他给药方式的需要进行修改。在一个实例中，本文所公开的方法向个体施用至少一次注射。在一个实例中，可以在任何给定时间向患者施用多于单次注射。在又一个实例中，本文公开的方法可能需要在指定的治疗时间范围或方案内多次向患者施用单次注射。在又一个实例中，本文所公开的方法可能需要在指定的治疗时间范围或方案内多次向患者施用超过两次或更多次的注射。这意味着，根据临床要求，可以给予个体注射形式的初始治疗，由此可以以例如3天、7天、每周、2周、每两周、1个月、每月、每季度、每半年、每年或更长时间的间隔进行进一步治疗，这取决于为个体设计的治疗。如果需要，本文公开的方法还可以用作与其他药物或药物组合物的联合治疗。
本文还描述了鉴定调节前mRNA编辑的RNA治疗剂的方法。本文描述的靶向AZIN1前mRNA编辑的方法可以不限于AZIN1，而是可以用于靶向AZIN1以外的基因。此类方法可以包括确定所需RNA转录物的编辑区和ECS，确定所需转录物的dsRNA结构，以及设计靶向和破坏dsRNA 组装或与dsRNA结构结合的RNA治疗剂。反义寡核苷酸经设计可以通过靶向dsRNA结构，例如通过靶向编辑区或ECS，来破坏前mRNA编辑。此类反义寡核苷酸可包含本文所述的任何化学修饰。所描述的任何步骤都可以使用本文所描述的方法来实现。例如，本文所述的小基因测定可用于确定所需靶序列的dsRNA结构。小基因是包括外显子和以与野生型基因片段相同的方式表达自身所需的控制区的最小基因片段。这是最基本意义上的小基因。可以构建含有多个外显子和内含子的更复杂的小基因。小基因为研究人员在体内和体外生化评估实验中评估剪接模式提供了有价值的工具。具体来说，小基因被用作剪接报告载体(也称为外显子捕获载体)，并充当探针来确定哪些因素对剪接结果重要。它们经构建可以测试顺式调节元件(RNA效应)和反式调节元件(相关蛋白质/剪接因子)影响基因表达的方式。
可以在不存在本文未具体公开的任何要素、一种限制或多种限制的情况下适当地实施本文说明性描述的本发明。因此，例如，术语“包含/包括(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应广泛地而不是限制地理解。此外，本文使用的术语和表达已被用作描述性而非限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物，而是应当认识到，在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以诉诸本文公开的本发明中体现的修改和变化，并且认为这类修改和变化在本发明的范围内。
本领域技术人员应当理解，可以使用本领域已知的多种方法和技术来实施本发明的某些实施方案。举例来说，可以使用本领域熟知的多种方法和技术来完成本文所述的任何致癌基因或抑癌基因中的突变和其他多态性或突变的检测。
在整个本公开，可以以范围格式公开某些实施方案。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应解释为不灵活地限制所公开范围的范围。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1-6等范围的描述应视为已经具体公开了诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围，以及该范围内的个体数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
本文已经广泛且上位地描述了本发明。落入上位公开内的每个较窄的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括带有附带条件或否定限制的本发明的上位描述，该附带条件或否定限制是从上位概念中去除任何主题，不管本文是否具体列举了所删除的材料。
其他实施方案落入所附权利要求和非限制性实例内。此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员应当认识到，还因此根据马库什组的任何个体成员或成员亚组描述了本发明。
实施例
以下实施例说明了可以实施本发明的方面或可以制备适合实施本发明某些实施方案的材料的方法。
材料和方法
细胞系
所有细胞系均维持在补充有10％FBS(Biowest)的Roswell Park MemorialInstitute(RPMI-1640)培养基(Biowest)中。本研究中使用的所有细胞系都定期通过形态学观察进行验证并测试支原体污染。将患者来源的异种移植物(patient-derivedxenograft,PDX)细胞系培养在DMEM/F12 (Biowest)中，并补充了不含维生素A的1:50B27补充剂(ThermoFisher)、 1:100胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(Gibco)、1.25mM N-乙酰基-L-半胱氨酸 (Sigma-Aldrich)、10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、10nM重组人(Leu15)-胃泌素I(Sigma-Aldrich)、25ng/mL重组人HGF(Abcam)、50ng/mL重组人 EGF(Abcam)、50ng/mL重组人bFGF(Abcam)、5μg/mL肝素(Sigma- Aldrich)、10-ng/mL重组人FGF-10(Abcam)。将所有癌细胞系和PDX细胞系在37℃孵育在含有5％CO2的加湿培养箱中。
正常人肝细胞
在用来自尸体的新鲜或冷冻的人肝脏/肝细胞对肝脏进行人源化后，从小鼠(小家鼠(Mus musculus))制备人肝细胞。从人源化
Figure GDA0003577466790000301
KO小鼠的灌注肝脏中分离HepaCurTM人肝细胞。保证新鲜分离的肝细胞是≥95％人类的，且活力≥70％。将分离的肝细胞培养在
Figure GDA0003577466790000302
FRS (BioLife Solutions,目录号：101373)中，这是一种优化的低温保存培养基。在铺板之前，根据制造商的方案，将
Figure GDA0003577466790000303
FRS更换为 HMM(HepaCurTM Maintenance Medium，目录号HMM500)。随后，将1.0 ×104个细胞铺板到96孔板的每个孔中，并在同一天用ASO处理。在 37℃，将细胞培养在含有5％CO2的加湿培养箱中。
RNA提取、cDNA合成、定量PCR(qPCR)和Sanger测序
根据制造商的方案，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取总RNA。使用AdvantageReverse Transcription Kit(Clontech Laboratories)按照制造商的方案进行cDNA合成。使用GoTaq DNA聚合酶(Promega)在 QuantStudio 5Real-Time PCR System(AppliedBiosystems)上进行实时定量 PCR(qPCR)。将AZIN1或ADAR1的相对表达(定义为“相对表达”)表示为 2-ΔCT(ΔCT＝CT(AZIN1/ADAR1)–CT(β-肌动蛋白))，并归一化为在相应对照细胞中检测到的定义为1.0的相对表达。使用FastStart Taq试剂盒(Roche)按照制造商的方案进行半定量PCR。通过Sanger测序鉴定纯化的 PCR扩增子。ImageJ用于计算A至I(G)编辑的百分比。编辑百分比计算为“G”峰的面积除以“A”和“G”峰的总面积。表1列出了引物的序列。
Figure GDA0003577466790000311
Figure GDA0003577466790000321
Figure GDA0003577466790000331
表1.使用的引物序列。
小基因构建体的生成
为了克隆用于pRK7或pcDNA3.1小基因构建的AZIN1序列，按照制造商的方案，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara)将胎盘DNA (Sigma-Aldrich)用于PCR。利用KAPA HiFiHotStart PCR Kit(KAPA Biosystems)引入内部缺失或点突变。表1列出了用于克隆的引物序列。
体外RNA编辑试验
首先，通过将FLAG-ADAR1质粒转染到HEK293T细胞中，强制过表达FLAG标记的ADAR1蛋白。转染后48小时收获细胞，并在裂解缓冲液中裂解，该裂解缓冲液含有50mMTris-HCl pH 7.5(Ambion)、150 mM NaCl(Ambion)、1mM EDTA(Ambion)、Triton-X100(Sigma-Aldrich) 和1×cOmpleteTM EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail(1×cOmpleteTM无 EDTA蛋白酶抑制剂混合物，Roche)。
Figure GDA0003577466790000332
M2Magnetic Beads (抗-
Figure GDA0003577466790000333
M2磁珠,Sigma-Aldrich)用于细胞裂解物的免疫沉淀，以获得 FLAG-ADAR1蛋白。通过将3×FLAG肽(Sigma)溶解在含有50mM Tris- HCl pH 7.4和150mM NaCl的Tris缓冲盐水(TBS)中，获得100μg/mL FLAG洗脱缓冲液。FLAG洗脱缓冲液用于从磁珠上洗脱蛋白质。将洗脱液储存在-80℃，直至进一步使用。使用RiboMAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-SP6(RiboMAXTM大规模RNA生产系统-SP6,Promega) 按照制造商的方案进行小基因构建体的体外转录。接下来，将5μL FLAG-ADAR1蛋白和从AZIN1 FE小基因转录的纯化RNA转录物在37℃孵育3小时，然后使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)进行RNA净化，并进行cDNA合成。为了在体外测试ASO的编辑抑制作用，在添加纯化的 ADAR1蛋白之前，将ASO与体外转录的RNA转录物一起孵育。然后进行PCR扩增，纯化的PCR产物送Sanger测序。表2列出了用于体外编辑分析的引物序列。
RNA电泳迁移率变动分析(REMSA)-每个寡核苷酸与AZIN1 RNA双链体探针的结合
首先使用RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7 (RiboMAXTM大规模RNA生产系统-T7,Promega)按照制造商的方案体外转录86-nt AZIN1 RNA双链体探针。接下来，将50pmol RNA探针与rSAP (NEB)在37℃孵育30min(分钟)，以使RNA去磷酸化。添加EDTA(0.8 μL，250mM)并在65℃孵育20min以加热灭活rSAP。然后将混合物与1 μL具有T4PNK(NEB)和ATP、[γ-32P](PerkinElmer)的100mM MgCl2在 37℃孵育30min。然后将混合物加热至95℃以使双链体变性，并使其缓慢退火至室温。之后，添加80μL蒸馏水并转移至Illustra MicroSpin G-25 柱(GE Healthcare)进行纯化。用LightShiftTMChemiluminescent RNA EMSA Kit(Thermo Scientific)10×REMSA Binding Buffer(100mM HEPES pH7.3,200mM KCl,10mM MgCl2,10mM DTT)孵育样品。将样品与1μL RNA双链体(终浓度为25nM)和相应的寡核苷酸混合并孵育30min。之后，在需要时添加FLAG-ADAR1蛋白并进一步孵育30min。在添加样品之前预运行TBE凝胶。将凝胶干燥，然后暴露于BioMaxLight Film (Carestream,Sigma-Aldrich)并显影；或BAS Storage Phosphor Screen(GEHealthcare)，用Typhoon Trio Variable Mode Imager(GE Healthcare)成像，并用ImageQuant TL(GE Healthcare)分析。
RNA电泳迁移率变动分析(REMSA)-每个PNA与截短的AZIN1 RNA双链体探针的结合
将两条链(ECS-s和ES-s)一起添加并从95℃缓慢冷却至室温，以形成截短的RNA双链体，然后将PNA在40℃退火10min。两个步骤均在 200mM NaCl、0.5mM EDTA和20mM HEPES(pH 7.5)的孵育缓冲液中进行。将PNA退火后，允许样品冷却至室温，然后在4℃孵育过夜。将凝胶在1x TBE、pH 8.3的运行缓冲液中以250V的恒定电压运行5小时。然后将凝胶在溴化乙锭中染色30min，然后使用Typhoon Trio Variable Mode Imager成像。表2列出了探针的序列。
Figure GDA0003577466790000351
表2.使用的探针序列。
ASO处理
所有ASO均购自Integrated DNA Technologies(IDT)。PNA(ASP1、DSP1和DSP2)是根据之前报道的方案合成和纯化的(Toh,D.K.,Patil,K. M.&Chen,G.Sequence-specificand Selective Recognition of Double- stranded RNAs over Single-stranded RNAsby Chemically Modified Peptide Nucleic Acids.J Vis Exp,doi:10.3791/56221(2017))。在处理前一天接种细胞以在处理当天达到80％汇合度。然后用在Opti-MEM中通过Lipofectamine 2000(脂质转染胺2000)稀释至所需浓度的ASO处理(转染) 细胞。在ASO处理后48小时进行随后的分析。进行了三个独立的实验，每个实验进行了三个技术重复。
细胞活力测定
用ASO处理细胞后，用
Figure GDA0003577466790000361
Luminescent Cell Viability (CTG)Assay(Promega)测量细胞活力。在添加CTG测定试剂之前，将细胞接种在96孔透明平底板(Corning)中并处理2天。将总共100μL的细胞裂解液转移到96孔白色平底板(Corning)中。用
Figure GDA0003577466790000362
Discover Microplate Reader(Promega)读取发光强度。
蛋白质印迹分析
用补充有1×cOmplete EDTA游离蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的 RIPA缓冲液(Sigma)制备蛋白质裂解物，并使用Bradford测定(Bio-Rad) 进行定量。然后通过8-10％SDS-PAGE分离蛋白质裂解物，然后在4℃与一抗(1:1000稀释)孵育过夜，并在室温与二抗(1:10,000稀释)孵育1小时。使用的一抗是抗ADAR1(Abcam,ab88574)、抗AZIN1(Proteintech, 11548-1-AP)、抗GAPDH(Santa Cruz Biotechnology,sc-59540)、抗ODC(Abcam,ab66067)和抗CCND1(Cell signalling technology(细胞信号技术)，2978)。
病灶形成试验
对于病灶形成试验，在ASO处理之前接种细胞以获得80％的汇合度。处理后48小时使用结晶紫(Sigma-Aldrich)对细胞进行染色。
通过PI染色和FACS进行细胞周期分析
在细胞周期分析之前，将细胞用ASO处理48小时。处理后，将细胞在-20℃用70％乙醇固定过夜。用磷酸盐缓冲盐水(PBS；10mM磷酸盐、 137mM NaCl和2.7mM KCl)洗涤后，将细胞重悬浮于1mL含有200μL 1mg/mL PI(Invitrogen)和20μL 10mg/mL RNA酶A(ThermoScientific)的染色溶液中，并在37℃孵育1小时。在LSRII(BD Biosciences)上分析染色细胞，并在FACSDiva Software(BD Biosciences)上分析结果。
将ASO加载到RBCEV中
血液样品是由中国香港红十字会(Hong Kong Red Cross,China)从健康供体获得的，EV是根据既定方案(Usman,W.M.et al.Efficient RNA drug delivery using redblood cell extracellular vesicles.Nat Commun 9,2359, doi:10.1038/s41467-018-04791-8(2018))由RBC产生的。根据制造商的方案，使用ExoFect转染试剂(SystemBioSciences)，将ASO以1:50的比例加载到源自红细胞的细胞外囊泡(EV)(RBCEV)中。在4℃将RBCEV用 PBS以21,000x g洗涤两次，持续30分钟，以去除游离ASO和转染试剂。
用CFSE标记RBCEV
将总共200μg ASO加载的RBCEV与400μL 10μM CFSE在37℃孵育2小时。将总共0.5ml CFSE标记的RBCEV加载到预装的qEV原始尺寸排阻色谱柱(Izon Science，新西兰)上，并用PBS洗脱为40级分(0.5ml/ 级分)。将级分7-11合并，并在4℃以21,000×g离心30min。去除上清液，将RBCEV沉淀用PBS洗涤两次，重悬并使用Nanodrop分光光度计(Thermo Fisher)定量。
荧光成像
将细胞在盖玻片上培养24小时，并用CFSE标记的ASO3.2-RBCEV 处理。在处理后48小时，将细胞用PBS洗涤，然后在室温下用甲醇固定 10min。将固定的细胞用PBS洗涤三次，每次5min。使用具有DAPI的 SlowFade Gold抗褪色封固剂(Thermo Fisher Scientific)将盖玻片封固在载玻片上，并在Zeiss Axio Imager M2显微镜下观察。
体内致瘤性测定
-预处理模型
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用100nM ASO3.2和ASO-ctl 将KYSE510细胞预处理48小时，然后将4×106预处理细胞皮下注射到4- 6周龄NOD scidγ(NSG)小鼠的左右背侧(n＝每组6只小鼠)。通过在指定时间点测量肿瘤长度(L)和宽度(W)来监测肿瘤生长。由公式V＝0.5×L×W2 计算肿瘤体积。所有动物实验均获得新加坡国立大学(NUS，新加坡)机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees ofNational University of Singapore(NUS,Singapore))批准，并按照其进行。
-瘤内注射模型
将总共2×106个KYSE510细胞皮下注射到4-6周NSG小鼠的右胁腹和左胁腹，用于肿瘤发展。当肿瘤可见(直径约1mm)时，将小鼠分为2 组(每组6只小鼠)，用于多次瘤内(i.t.)注射ASO加载的RBCEV(第1组：基于RBCEV的递送)或裸ASO(第1组：裸ASO)，每4天一次，持续7 周。对于每个肿瘤每次注射ASO加载的RECEV，将总共1μg ASO加载到50μg RBCEV中，并重悬浮于20μL PBS中。对于每个肿瘤每次注射裸ASO，将总共13.5μg ASO(ASO-ctl或ASO3.2)溶解在20μL PBS中。通过在指定时间点测量肿瘤长度(L)和宽度(W)来监测肿瘤生长。由公式 V＝0.5×L×W2计算肿瘤体积。所有动物实验均获得新加坡国立大学(NUS,Singapore)机构动物护理和使用委员会的批准，并按照其进行。
统计分析
未配对双尾斯氏t检验用于对照组与治疗组之间细胞活力和肿瘤生长速率的变化进行统计分析。对于所有数字：
Figure GDA0003577466790000381
P<0.05；
Figure GDA0003577466790000382
P< 0.01；
Figure GDA0003577466790000383
P<0.001。
结果
外显子12的3'末端处的8-nt序列是核心ECS，对于AZIN1编辑必不可少
揭示AZIN1转录物的ECS，将有助于破译对AZIN1编辑至关重要的精确的dsRNA结构。为此，通过将不同长度的片段插入到pRK7或 pcDNA3.1载体中来生成AZIN1小基因构建体，这些片段覆盖了经编辑的外显子11以及侧翼外显子和内含子(图1A)。将每个AZIN1小基因构建体与ADAR1表达构建体或空载体共转染到HEK293T细胞中，然后对内源性AZIN1和从AZIN1小基因转录的外源性转录物进行编辑分析。首先检查了ADAR1是否可以有效地作用于从基于pRK7的小基因系统转录的外源性转录物。使用HTR2C生成作为阳性对照的HTR2C小基因，HTR2C 是一种充分表征的编辑靶标，其dsRNA结构在许多研究中得到了很好的描绘。共转染HTR2C小基因和ADAR1后，在外源性HRT2C转录物中检测到三个已知的A到I编辑位点(图1B)，这支持了在本研究中使用pRK7 小基因系统的可行性。此外，约75.8％的内源性AZIN1被编辑，表明 ADAR1成功过表达(图1B和图7)。在所有AZIN1小基因中，只有从含有片段A(FA)的小基因转录的AZIN1转录物无法编辑，该片段A在外显子 12的3'末端缺少90bp序列(图1A、1C)。这一观察结果可以通过使用基于pcDNA3.1的小基因重现，从而排除pRK7小基因系统伪影的可能性(图 1D)。所有这些发现表明，AZIN1的ECS最有可能位于外显子12的3'末端。
为了精确定位ECS，通过RNAFold30，对对应于片段E(FE)的RNA 序列进行二级结构预测。正如预期的那样，外显子12的3'末端与经编辑的序列形成dsRNA(图1E)。通过在与编辑区直接相对的序列中使外显子 12(FE-1)的3'末端的29-bp序列缺失、引入8-bp内部缺失(FE-2)或点突变 (FE-3)(图2A)，用FE小基因来产生三个额外的小基因。二级结构预测表明，缺失和突变都可以显著改变二级结构(图2B)。使用相同的策略，观察到从FE-1、2和3小基因转录的转录物无法在ADAR1过表达时受到编辑(图2C和图8)。此外，进行了体外RNA编辑分析，发现在存在纯化的 ADAR1蛋白的情况下，来自FB或FE小基因而不是FA、FE-2和FE-3小基因的体外转录的AZIN1转录物在预期编辑位点受到编辑(图2D)。所有这些数据强烈表明，外显子12的3'末端的8-nt序列(5'-GCUUUUCC-3') 是核心ECS，并且对于dsRNA形成和AZIN1编辑是必不可少的。
鉴定具有明显体外编辑抑制作用的ASO
基于对AZIN1 dsRNA结构的阐明，设计、合成了可以与AZIN1 dsRNA形成三链体的七种完全2'-O-Me修饰的ASO(ASO1-ASO7)和三种 PNA(包括1种反义PNA(ASP1)和2种dsRNA结合PNA(DSP1和 DSP2))，并评估了它们与AZIN1 dsRNA的结合能力(表3和图3A)。对每个寡核苷酸都进行RNA电泳迁移率变动分析(REMSA)，以便检查它们与 32P标记的AZIN1 RNA双链体探针的结合能力(图9A)。在存在ASO1、 ASO3、ASO5和ASO7的情况下，观察到强烈的带移，而在添加ASO2、 ASO4、ASO6和所有三种PNA后检测到非常弱的带移或没有带移(图 3B)。值得注意的是，随着所添加的ASO1、ASO3、ASO5或ASO7的量增加，检测到AZIN1双链体结合的剂量依赖性增加，这进一步证实了这些ASO与AZIN1的结合能力(以亚微摩尔亲和力)(图3C)。由于PNA比 ASO短，使用缩短的AZIN1双链体的进一步测试证实，12-mer ASP1不能与缩短的AZIN1 RNA双链体结合，而DSP1和DSP2可以通过PNA- dsRNA三链体形成以适度的结合亲和力结合(微摩尔；图9B)。
Figure GDA0003577466790000401
Figure GDA0003577466790000411
Figure GDA0003577466790000421
m,2'-O-Me修饰的；*,PS修饰的表3.所用ASO和PNA的特性
接下来，为了检查每个寡核苷酸与AZIN1双链体的结合是否足以抑制AZIN1编辑，对ASO1、3、5和7进行了体外RNA编辑分析。随着 ASO3的加入，AZIN1编辑被完全消除。与ASO3相比，ASO1的效率略低，但明显将编辑从87.6％抑制至2.8％；而对于ASO5或ASO7，它们分别表现出对AZIN1编辑的低抑制或无抑制(图3D)。值得注意的是，ASO5 是在ASO1的5'末端添加了5个核苷酸(GCUUU)的25-mer ASO(图3A和表3)。虽然ASO5由于这种扩展可以靶向编辑位点，但未能改善或维持 ASO1的编辑抑制作用，这与ASO5与ASO1相比结合略弱的事实一致(图 3C)，可能是因为参与编辑的序列(AAAGC)的碱基对(可能是3个A-U和 2个G-C对)相对更稳定，难以被ASO侵入(图3A)。这也得到了如下观察结果的支持：即ASO6，其除了在3'末端比ASO5短5-nt，与ASO5共享相同的序列(图3A和表3)，在很大程度上不能与AZIN1双链体结合(图 3C)。此外，DSP1和DSP2能够在10μM的浓度消除AZIN1编辑，但它们的编辑抑制作用在200nM时显著衰减(图9C)，这表明，对于编辑抑制，PNA-dsRNA三链体的形成可能不像传统Watson-Crick碱基配对一样有效。所有这些数据表明，靶向位于编辑位点侧翼的编辑区的ASO1和靶向ECS的ASO3可以与AZIN1转录物结合，并在纳摩尔浓度下在体外消除或显著抑制AZIN1编辑。
ECS靶向ASO显著抑制癌细胞中的AZIN1编辑
目前，用于前mRNA结合和剪接调节的最广泛使用的化学物质是PS 骨架，在整个寡核苷酸长度上是2'-O-Me/2'-O-MOE/LNA或PMO完全修饰的。它们的稳定性、核酸酶抗性、靶亲和力和无法触发RNA酶 H/RNAi反应，使它们成为前mRNA结合、剪接和可能的RNA编辑的理想工具。因此，2'-O-Me修饰的ASO1和ASO3进一步完全或部分用PS 进行修饰(ASO1.1、1.2、1.3以及ASO3.1、3.2和3.3；图4A和表3)并包含在本研究中。筛选了AZIN1在9个HCC、3个ESCC和3个NSCLC细胞系中的基础编辑水平，发现仅在ESCC系KYSE510和NSCLC系H358 中检测到AZIN1编辑(图10A)。接下来用每种化学修饰的ASO处理 KYSE510和H358细胞。出乎意料的是，靶向编辑区的所有7种ASO (ASO1、1.1、1.2、1.3、5、6和7)都导致了外显子11跳跃(图4B和图 10B)，这可能是由于在SpliceAid231预测的编辑区存在剪接因子结合位点所致(图4C)。值得注意的是，在3种ECS靶向ASO中，ASO3.1和 ASO3.2完全消除了AZIN1编辑，ASO3.3显著抑制了编辑，而不影响 AZIN1在mRNA和蛋白质水平上的剪接和表达(图4D-G)。2'-O-Me修饰的ASO3中的其他PS修饰可能会增加化学稳定性，从而提高细胞中 ASO3.1、ASO3.2和ASO3.3的编辑抑制效果。上述发现表明，AZIN1转录物外显子11处的编辑区是不可靶向的，只有靶向ECS的ASO才能有效抑制癌细胞中的AZIN1编辑。
ASO3.2特异性抑制G1/S转换和癌细胞活力
接下来研究了最有效的ASO即ASO3.1和ASO3.2是否通过抑制 AZIN1编辑来特异性抑制癌细胞活力。为此，除了KYSE510和H358之外，研究中还包括了AZIN1编辑无效(null)ESCC细胞系KYSE180。通过Lipofectamine转染，用浓度增加的ASO3.1、ASO3.2或ASO-ctl处理三种细胞系，然后进行细胞活力分析。观察到ASO3.1和ASO3.2均以较低的IC50值(ASO3.1：K510：45.8nM和H358：37.6nM；ASO3.2：K510：62.3nM和H358：51.0nM)显著抑制KYSE510和H358的细胞活力；而它们对KYSE180细胞活力的抑制作用要小得多(ASO3.1：271 nM；ASO3.2：699nM)(图5A)。值得注意的是，KYSE180对ASO3.2的 IC50敏感性比对ASO3.1低约2.6倍，这意味着ASO3.2最有可能比 ASO3.1赋予更高的抑制编辑和癌细胞活力的特异性(图5A)。为了进一步证实ASO3.2的特异性抑制作用，在用低剂量ASO3.2处理后，对三种细胞系进行细胞活力和病灶形成试验。结果，ASO3.2仅抑制KYSE510和 H358的细胞活力，但不抑制KYSE180(图5B、C)。除了癌细胞之外，还用ASO3.2或ASO-ctl处理了从人源化小鼠的灌注肝脏中分离的正常人肝细胞(图5B)。发现正常肝细胞对ASO3.2处理不敏感。所有这些数据都支持ASO3.2可以特异性抑制表达编辑的AZIN1S367G的癌细胞的细胞活力。细胞周期分析表明，与用ASO-ctl或ASO3处理的细胞相比，ASO3.2处理后的KYSE510和H358细胞都表现出G1/S转换的明显衰减和亚G1期 (凋亡细胞)百分比的显著增加(图5D)。此外，CCND1和ODC蛋白表达的减少支持ASO3.2诱导的G1/S停滞(图5E)。总之，ASO3.2可以特异性抑制癌细胞中的AZIN1编辑，导致CCND1表达下降以及由此产生的G1/S 停滞和癌细胞活力降低。
ASO3.2在体内有效抑制肿瘤的发生和生长
使用2个异种移植肿瘤模型研究了ASO3.2在肿瘤发生和生长中的作用。使用lipofectamine转染，用ASO-ctl或ASO3.2预处理KYSE510细胞，然后皮下注射到小鼠的两个背侧，以比较它们的肿瘤发生率和生长率。ASO3.2预处理组的肿瘤发生率明显低于ASO-ctl预处理组(图6A)。此外，在6周的观察期内，源自ASO-ctl预处理细胞的肿瘤的生长速度明显快于源自ASO3.2预处理细胞的肿瘤(图6B)。除了预处理模型外，还通过瘤内注射研究了ASO3.2对肿瘤生长的影响。细胞外囊泡(EV)是从不同类型细胞释放的小膜囊泡，越来越多地被认为是天然RNA载体和新型药物递送载体。进入细胞后，货物会从EV中释放出来，ASO会被转运到细胞核。为了将ASO递送到肿瘤细胞中，将ASO3.2或ASO-ctl加载到源自人红细胞的EV(RBCEV)中，RBCEV是具有用于RNA药物递送的有前途的特性的EV的理想来源。为了测试ASO3.2-RBCEV的细胞摄取，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记ASO3.2-RBCEV，当CFSE被加载到 RBCEV或内化到细胞中时，只有在酯酶存在的情况下CFSE才会发出荧光。发现大多数ASO3.2-RBCEV可以进入细胞(图6C)。接下来，将 KYSE510细胞皮下注射到小鼠的两个背侧以促进肿瘤发展。当肿瘤可见 (直径约1mm)时，每4天将ASO-ctl-RBCEV或ASO3.2-RBCEV注射到瘤内。该实验还包括裸(未加载)ASO-ctl或裸ASO3.2，以检查基于RBCEV 的递送是否提高了ASO被摄取到肿瘤细胞中。正如预期的那样， ASO3.2-RBCEV的瘤内注射显著抑制了肿瘤生长(图6D)；而在用裸ASO- ctl和裸ASO3.2处理的小鼠之间没有观察到肿瘤生长的明显差异(图6E)。总之，ASO3.2可以有效抑制体内肿瘤的发生和生长。
ASO3.2特异性抑制源自HCC PDX的细胞的细胞活力
为了评估ASO3.2是否可以成为用于癌症治疗的有前途的RNA治疗剂，检查了ASO3.2在源自HCC PDX的细胞中的作用。由于HCC是一种高度异质性癌症，本研究还包括源自PDX的细胞，以研究ASO3.2是否特异靶向表达经编辑的AZIN1的肿瘤细胞群，PDX是由同一原发性HCC 肿瘤的不同区域(例如PDX22-T1和PDX22-T2)生成的。首先在所有PDX 细胞中检查了AZIN1的编辑水平。四种PDX细胞(PDX-1；以及来自 PDX-22中不同部分的PDX-22-T1、T4和T5)具有超过20％的经编辑的 AZIN1转录物(图6F)。由图6G可知，PDX1，其是AZIN1编辑阳性PDX 系，在ASO3.2处理后表现出显著降低的细胞活力；而在非AZIN1编辑阳性PDX系PDX22-T3中未观察到细胞活力的明显变化。这些数据表明 ASO3.2对离体细胞活力具有特异性抑制作用。
讨论
失调的A至I RNA编辑与多种人类疾病有关，包括癌症。失调的A 至I编辑是各种癌症发病机制的关键驱动因素，例如乳腺癌、神经胶质瘤、多发性骨髓瘤(MM)、慢性髓细胞性白血病、HCC、CRC、胃癌和 ESCC。AZIN1、Gli1(神经胶质瘤相关癌基因1)和DHFR(二氢叶酸还原酶)等由癌症组织中ADAR异常编辑的转录物显著促进了癌症的进展和转移。与DNA编辑不同，RNA编辑操纵的遗传信息是可逆的和可调的。由于ADAR1具有多种对正常发育至关重要的功能，例如造血和器官发育，因此简单地调节ADAR的表达可以导致相当大的脱靶效应。另一种策略是破坏在靶转录物的具体编辑位点的ADAR酶。
本研究发现，AZIN1外显子12的3'末端序列与编辑区形成dsRNA。因此，设计并合成了多种靶向编辑区或ECS的2'-O-Me/PS修饰的ASO和 PNA。观察到，1)ASO1或ASO3分别可以在体外充分抑制或完全消除 AZIN1编辑，2)ASO2、4和6不能与AZIN1双链体结合，3)虽然ASO7 可以与AZIN1结合，但仍然无法在体外抑制编辑。所有这些观察结果表明，编辑位点位置的5'和ECS的3'可有利于ASO与AZIN1的结合和 ADAR1反应的抑制，这可以为未来理解ADAR1底物结合和脱氨作用提供有用的模型。
此外，据报道，并入了诸如硫代假异胞嘧啶(L)和胍修饰的5-甲基胞嘧啶(Q)等修饰的核碱基的PNA相对于ssRNA和dsDNA可以以序列特异性方式选择性结合dsRNA。此外，PNA具有中性肽样骨架，化学性质稳定，对核酸酶具有抗性，并提供增强的RNA序列和结构识别的特异性。本研究还测试了PNA对AZIN1编辑的抑制作用。由于ASO4(20-mer)不能与AZIN1双链体结合，反义PNA ASP1(12-mer)也不能与AZIN1结合也就不足为奇了。尽管dsRNA结合PNADSP1和DSP2可以以适度亲和力与AZIN1结合，但它们无法以纳摩尔浓度抑制编辑，这可能归因于DSP1 (10-mer)或DSP2(8-mer)由于其长度相对较短导致对ADAR1-AZIN1 dsRNA相互作用的阻断不足。所有这些观察结果表明，相对长且化学稳定的ASO(例如，2'-O-Me糖环修饰与PS骨架修饰相结合)可能是抑制 RNA编辑的最佳化学物质。
尽管ASO1在体外表现出非常有希望的编辑抑制作用，但发现ASO1 和其他靶向42-nt编辑区的ASO导致了大量的外显子11跳跃，这可能是由于编辑区的剪接调节剂(例如SRSF1、SRSF3、SRSF6)的阻断所致，这表明编辑区是不可靶向的。此外，即使ECS靶向、2'-O-Me修饰的ASO3 可以在体外完全消除AZIN1编辑，但只有ASO3.1和ASO3.2(其与ASO3具有相同的序列且分别具有完全或部分PS修饰)可以有效地消除癌细胞中的AZIN1编辑。这可能归因于PS修饰的优点，例如对内切核酸酶和外切核酸酶消化的抵抗力强、血清稳定性增加、肾清除率降低。值得注意的是，与ASO3.1相比，ASO3.2通过抑制AZIN1编辑表现出更高的抑制癌细胞活力的特异性，这可能是因为PS修饰导致的与蛋白质和其他核苷酸序列的非特异性结合的不利后果。这一发现进一步得到了下述观察结果的支持，即观察到ASO3.2抑制表达AZIN1S367G的癌细胞和源自 HCC PDX的细胞的细胞活力，但不抑制AZIN1S367G-null癌细胞、PDX细胞系和正常肝细胞的细胞活力。此外，在预处理的异种移植肿瘤模型中，ASO3.2显著抑制了肿瘤的发生和生长。这一观察结果也得到了瘤内注射模型的支持，在该模型中使用基于RBCEV的递送方法，将ASO3.2 递送到肿瘤细胞中，这表明被加载到RBCEV中而不是裸(未加载)ASO3.2 的ASO3.2瘤内注射显著抑制肿瘤生长。
总而言之，数据表明ASO介导的AZIN1编辑的抑制有效地抑制了肿瘤的发生和生长，这支持了以下可能性，即大量癌症患者，特别是表现出高AZIN1编辑水平的HCC患者，可以受益于AZIN1靶向、基于ASO 的治疗策略。由于肝脏结构和快速内吞作用，肝细胞对ASO摄取的接受性高。三N半乳糖胺(tris Ngalactosamine，GalNAc)靶向结构域与ASO的缀合导致ASO活性的10倍增加，这显著改善了第二代ASO的化学性质并增加了ASO治疗剂治疗肝脏疾病(包括HCC)的潜力。在本研究中，这种基于ASO的RNA编辑抑制剂的发现为靶向癌症相关RNA编辑底物提供了有吸引力的方法。
序列表
<110> 新加坡国立大学
南洋理工大学
<120> RNA编辑抑制剂及其用途
<130> 10104SG1273
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
aagaagacag cuuuuccgcu gaagcuuaa 29
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
ugagcuugau caaauugugg aaagcugucu ucuuccugag cu 42
<210> 3
<211> 37899
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
ctaatataaa tactggcgtc gctggcgccg ccttctcaca ctttcaggct ctgatcgcgg 60
ccgcagtttt tccttttttc ttctgccgtc gccttctctg cctcttctca tcctttctcg 120
ctctgctgct ctgcagtgtg acgagtccga atcctcttcc cacccagccc gcgcctttct 180
tcttttgcct gcgctgttct atttctcctt cggccgccgc cgccactgct gcacacagct 240
ggtgtcggtg ccgcgctttt acccccaagt cgttcccgca gcctatggcc caggccgcct 300
tgggtatttc tgctcaaggt aaccacatcc ctctttaaaa attccgccga aaaagagaag 360
acgctttacc cgactctttg ggccgttatc tcacgtgagt accgagccga ggagcgcggg 420
aggggccagg acgcggggct ggccttgggg ggcggctggg gggctccggc tgggccccgc 480
cgcccttaag acgtccccgc agcgccccgc ggccggccgc ctcgaacatg gcggcggcgg 540
ctgtctgtgc ccccggcggc ggcggcggcg gcggggctgg gcggcgggcc gcgcctcagg 600
accttcgggc ggctgctgga cgcttggcgg agccggagcc gcagcagttg gggcgagggg 660
gcgtgtgcca gtgggggagc gcgcgggggt ctcgccgccg ggggtcgccg tcccctcctg 720
gcggcgtgcg gcccccaccc ctctcccgtg gtgcattgct gtttccgggg agggggcccg 780
gccgcagccc tgaggggccg gggtcccgca gcccctactc cgcggtgcgc cgccgccacc 840
tttgcctccc gaagcccggc gggcgggcgg cgctgtgggc tgcaacggct ggggtcctgg 900
ttatgaatgg agcggggcgg gccccgcgcc ggcctctggt gacagctgcg gaggaagtcg 960
gattcctggg gggcgcgggg agcgcggtcc ccctctggtg gaggaaagtt gacgccactt 1020
ggggcctggc ggcggggaag ccccggtgtc aggtagccag cgagaggctt ttggcccctt 1080
ctggaagcct cgaggctgct gctccgcccc tgcggcgctc ctgattgggt caagtcgcct 1140
tcactcaccc cagtcacctc ctggagcctg aggattagtc accatggctt cgtttttccg 1200
tccgcgccat ggttcctagg cagaaagagg gagattggta gacgggtggc ttatcaacta 1260
ctgtcttgac tgccaacagt tggtggtggt aacatgttct aacccttaca cggtatcctg 1320
aatgtgtgtt tcgtagacaa agctgctggt tcagaaaccc gaaacagtcg gggacacagt 1380
ttaccgcctc atgtttcagc acatttaact gaattttgtg gtggcatctt ggttatatta 1440
gttctgtgtc ccgtcgtgtt tctatcgtga attcccagac tgggtgggaa tctaaggact 1500
caaaggaggg ggaattgcct tgtgctcagc gaaggttgat gtagaggtgc atcaaagcac 1560
aaagtagaag tacatcaaag cacatcaaat acagcaaggg ttggcagaaa catggctcat 1620
gattgtctag aaaggccctc ataattcatt aatttctttt acatatacga gagcgtgcag 1680
atgctgatca tgattagaaa taagccccaa ggagtttagg aaagactcca aaagaaaatg 1740
attatcggtg gtgataagtg aggtcgagta gtcagtgcct ttctccccca aggttttatc 1800
acatacgttt tcaaacagaa ggtgaaaaag agttatactt ccacctagat tctgtaatta 1860
acattttacc ttatttgtcg atgcatttca aagtaaagtt ggagacccct ccaactttag 1920
tatgtgcata ttaaatagag ctcagtaccg cttactattt tttaaatctt agagggtaaa 1980
attcacatca gtataaaccc acaagtctta agtatgcaat ttgatgaacg ttgacaaaaa 2040
tacagctgtg taacctaaac cttttgtcaa gatgtagaac atcgccatca ccctcaaaag 2100
ttttttcttg tcctttcaaa tcgtcttcca gtcaccacag agccaaccac gatcttggtt 2160
tttttttttt ggagtctagc tctgtcgccc aggctggagt gcagtggcac aatctcggct 2220
tactgcaacc tccgcttccc aggttcaagc gattctcctt cctcagcctc ccgagcagct 2280
gggattacag gcgcccacca cgcccagcta atttttgtat ttttagtaga aaaggggttt 2340
cactgttggt caggctggtc tggaactcct gacctcatga tccgcccatc tcggcctccc 2400
agagtgctgg gattacaagc gtgagccact gcgcccggct gatcttgatt ttttttttta 2460
aacccataga ttattttcgt ctattccaga ctttccacat gaatggaatc atacagtatg 2520
cattctttgg tataaaaggc ttcttttaac tcagcacatt tttaatattc atccctgttg 2580
tctttatctg tagattatca gtagattatt tgtgttgctg agtagtagcc cattaggtga 2640
ctgtcccttg gttgtttttt ttaaaaataa actttattag gccgggcgcg gtggctcaag 2700
cctgtaatcc cagcactttg ggaggctgag gcgggtggat tgcctgaggt caggagacca 2760
gcctggctaa catgctgaaa ctccatctct actaaaaata caaaaattag ccgggcgtgg 2820
tggctggctc ctgtaatccc agctcctcgg gaggctgagt caggagaatc gcttgaactg 2880
gggaggcaga ggttgcagtg agccgagatc tcaccagggc actccagcct gggggacaag 2940
agcagcggga cttcatctca aaaaataata ataataatga aaaataaact ttattttgga 3000
gtatcttagt tgcgcagcaa agtcacaaag atacagtttc ttcatacttc ccacccagtt 3060
attagtaaca tcttacgtta ttacagtaca tttgttaaaa ctaagaaact gactttggca 3120
ctatgaaacg ttcgagactt ttatttggat ttcgccaatt tttctttaat gtctttttct 3180
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tttgtgacag tttctcagtc ttcctttgtt tttcattacc atcacagtct agaaaagtgc 3300
tgccagatat ctggtagaat actcccctcc cctaaacttg gggtttacct gatgtttttc 3360
tcatgattag actggggttt ggagttttta caaagaatac cacagaacga ttttaaaaat 3420
cattggtaaa ggcattgtgt tttcagagac gtactgataa ttttgagata ctaagtttgt 3480
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ccagcctggc caatatgatg aaaccccatc tctactaaaa atacaaaaaa attagccggg 3780
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acagagcgag actccgtctc aaaaaaataa aataaaataa attacataaa atgcttcttg 3960
tttcttactg accaaccgag ccctctctgt gctattctct aaggtgttag agaatttgca 4020
gtgtttacat acaccattct aagtgaaaat aatttatttt tttccatact gccttttctc 4080
cgcatttcca tttaacaagt ccttcttcat gcttttttat cctaactgtc cggataaaca 4140
ttctatctat cctgtatgta agtgcttata agaagtgctt atctatcctg tatgtgttta 4200
taagaagtgc ttatcctatg caccttttgg gtcttgctgt gttgcccagg ctggactcaa 4260
attcctgggc tcaagcagtc ctcctgcctt aacctcctca gtagttgaga ctataggtgc 4320
atactgtcac atctggctca ttttttcttt tcttttcttt ttttggagac aggttctccc 4380
tctgttgcct gggctggagt acagtggcac aatctcggct cactgcaacc tccgcctctt 4440
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ccatgcccag ctgatttttg tatttttagt agaagatggg atttcactgt gttgaccaga 4560
ctgatcttga actcctggcc tcaagtgatc cactggctca gagccactgc gcctagccct 4620
attttttgta tttaaataat gcctttcaaa ttctagagcc ttcattccct actagtatct 4680
ttttgttaaa tggaaatgtt gtagggttct cactgaggaa cattctggaa tgtctgacgt 4740
ttaatgtcca taatgtttca catcattgct cttgggttgc attaagcagc aaaatagctg 4800
tggatatatg tattgagaaa aagatgaata atgtcttacc tagggtatct gatcctattc 4860
cttaggataa ttgagaatga tctgtcccca gcatgactca actttttatt tatttagaaa 4920
attacgttgg tgttgaaaga atcagaatgt tatggagtag tacattattt ggaatctaat 4980
gtaagattat tatcatcatt gcatgtttgt aggagttctt tcctcatcat ccataaatgt 5040
cattcattga gcatgtgatc agcttctcct agatagatga aacattttgc ctccaccagg 5100
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caactcttga ctttataatt tctggttttc tggcttcctt cttaccaccc ctttctagca 5220
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gtatatcatt ttagcttaga agtgatgagt ggtaacaatg tctaaaactc acctaccatg 5340
ttgtatagtg tgctgtgcac ttatcacatt tatttgttcc tggtgataat agaatgaatt 5400
atgtccaaat aggttagata tgagaagata aatcttaaga gattagttgc ttaatattat 5460
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attagctaag tcataaaatc ttttggtatt gtggtggatt tttacattta aaatgtaaaa 5580
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gtacattatt catataaagt cttgtatata cactaggttg gtgagggtac ttggaatttt 5700
ttaaattctg gaccacttaa aaatgtggaa ttttagagga caaataaaag caaaaatgaa 5760
gttttcatct tcaaaaatga aggctggtaa ctcttgagta ggcagataaa acgacttggt 5820
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ataaagtact tggtactgtg gtaaaccctt tgaaaatatc acttgtgtaa tgtgacttta 5940
atgaaacatt gttataaaat gaacacgtat tctacagttc atgtttaagt cagcctaaac 6000
atttttttaa cataggacta tcttctgcta cttttatttc cttcttttag ggcgaacttt 6060
ctgaccaagt atacaactac ccagagggcc taggagaagt gctgtataga gagcagttcg 6120
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ttgtccatgt aagtatttgc acatttgttg gtggggagga ggtctttaaa atcgaaggaa 6240
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gtgactttta aatttctgaa atagagataa gacagttact ggttacagac ttgactgatt 6360
tagttgtgtg cattgtttac caatgactgg atcatttaaa actatcttgt atgcataact 6420
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accatttaac ttagtgaaat gatttttgct actcagctgg taggaacaac taactgattg 6540
tttttagagg acttgctgaa agatgataga gatagataga gatacatata tatatctcaa 6600
tttatatatg tatctaaata tgtatatggt attaaaatat atgtatggta ttaaaatata 6660
gatatttaac agattttcaa ggatagtttt tgactatact tggttttcta tgtgtgaatt 6720
ttactttaga attgagcccc tgtgcaaaat gtaattccac agtaaactga atttgggcta 6780
ctagatttgt gtgggttcat ttaaaaattt tgtggtatat agacttattg ttacggaaat 6840
tcagattttg ttattaaaat ttaagtgttt ttaagtttgg tcagagactt agaggtaagt 6900
tttcaggaaa gctgagggta tcagttttag tgtttcttta atctgatctt gttaaacaga 6960
tccctattcg ataaaagtgt ttgctctaag caaacatttg atgttaatac aaattagaat 7020
tttagactca ggtttttaag gctaaagaga aggaaacaca gtttaaatag taagatttct 7080
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tgtaaatttg agcaaatgtg aatcccagct ataacataat gttggactgg aacagttctt 7200
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ctcacccaaa cctgaatcag agtctatatc caggtggctt gtgtgcacat taaagagaag 7380
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tgtctcttgc tttaaagaaa agttaccttg cattatagtt aatatttcta ctggtgtttc 7680
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agtagtcttt agattaataa tgtaggattc agaaagtcta tagtgtctcc ctctttgtgg 7800
gtaggaggga atgggagcag atagaagcta aagataattt attctgcagg ttctggcagt 7860
cagaataact ggcttttaac tttattatgc ccgggtacaa tgcatattat gtcaaacaaa 7920
tataacttct ttaaatattc acatgtaatc ttctcatttt gcatgtctag tatttgatgc 7980
tttgctataa agctacaggt ccacaatccc tttttcatag aattctgaaa tccaaaaagt 8040
ctttaaaaaa atttttttat agcttccttg atgtgacctt aactgatttg ggaaaaaaaa 8100
aaaaaaacaa aaaaaacttg acctggatct gtgctgattt gaggctattt ttgtctttac 8160
ttatcccatt tagtgttaat attcctaaat tttgcttcag aaatattgtg gttgcagggt 8220
gctgactcat tctcctgaag aatattacat aacatatgta aagtatgtgt actacattat 8280
ggttcaaaat ctggagaatt ctgaattcac aaagatacct agtcccaaag gtttcttgac 8340
tagaatttgt aaaattggca agagaaaatt ccgcattcca gaaatgtgtt atccttacaa 8400
atcaataaga gtttgctcta ttggacaccg aaatcctggg gttaattttc tgtagatcaa 8460
caatattatt tgaaaaccat taaaaggagt taaaacagct tcatggaaat tatttggccc 8520
atagcattgc aaagcatgta gctatatgaa ctctgcttga actggtccac taggattccc 8580
gtgcaggtag tctgagatcc agaattggct tcagagttag gttttaaatc aaccacctga 8640
attttgatgg aataaactaa gtatctggaa attttggaag ttgcttacat aatccttttc 8700
tttcataatt tagaatgtgt gtatgatgta gtacgcaaac actgtaaaaa tgtcttaaca 8760
aaatatttta aggtcaatat caaagattaa tgggccccta attgtgaaaa agtttttgtg 8820
agccttttga gaaatcccct aggccaggtg aggtggctca cacctgtaat cccagcactt 8880
tgggaggcca aggcgggcgg attacatgag gtcaggagtt caagaccagc ttggccaaca 8940
tggtgaaacc ctgtctctac taaaaaaaaa tataaaatta gtcgagcgtc gtggcaggtg 9000
cctgtaatgc caactactcg tgggaggctg aggcaggaga atcacttgaa tctgggaggc 9060
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ctccgtctca aaaaaaaaga aatcccctag gtcttgatgc tggagtaaag gttttccagt 9180
gggctagttt tctatttatt ttggttgtag gtttaattat aattaatgaa ttagcctaat 9240
ggaaaatatt ttaaaactta aaaagctaag tttgcttctc atagtggatc cagtgatgtg 9300
gtcagattca ttatcacata ccctttaatg ttgtgcagta tggaaaaggg attcagttaa 9360
ttgatttgct taaatgggct cttaacaagt ttgctttaaa aagttttttt ttttacctgg 9420
ttgtcattag tcggctctat atattcatgt aggaacttca gaagaacatc agcattttaa 9480
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cctaattagg attattttaa ctagggaaaa aaaatatata tatatatata tatttttttt 9600
ttttttgaca gagtctcctc ctttcgccca ggctggagtg cagtggcaca atcttggctc 9660
actgcaacct ccgcctccct ggttcaactg attcttccgc ctcagcctcc caagtagttg 9720
ggattacagg cacccaccat tatgcccggc taaattttgt atttttgtgg agatgggttt 9780
caccatgtgg ccaggctggt cttgaactcc agacctcagg tgatccgccc cccttgcctc 9840
ccaaaatgct gggattatag gcgtgagcca ccgcgcctgg ctggaaagat gttctttacg 9900
aatttgctag tactccttcc tcatgtttca ctgtaagtta tcagtaggaa agggaggttg 9960
tccgctgggt gcggtgcctc acacctataa tcccagcact ttgggaggct gaggccggca 10020
gatcatctga agtcaggagt ttgagaccag cctggccaat atggtgaaac cttgtctcta 10080
ctaaaaatac aaaaataaat tagttgggca tggtggtgca cgcatgtaat cccagctact 10140
agggaggctg aggcctgctt gaacccggga ggcggaggtt gcagtgagcc aagatggtgc 10200
caccgcactg tagactagga gacagtgcaa gactgtctca agggaaaggg aggttgttga 10260
ccctgactgc agagaaaggg gaaaatttca gttttgatat ttggtacttt tttttctttt 10320
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gatatgagca aatgtaacag aacattcatt aatggcggtt gatactcttt gaccaaaaag 10440
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aatgtgaata ctagcatatt aatggataaa caaggtttta gagacatggt atttcttgct 10620
ttgagcaaat ttagcatttt ttttaggaag gtcaaaaaga ttggaaagca acgtagacca 10680
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agaccagttt ttaaacggga taaatggctt ttgcatttat tacagaggtt agtttagctg 11040
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ttgtttcaga gttttccagt ttgggtctcc ccatacccca ccccaggtaa accaatccct 11160
tttgcgatat ttaacttcca ttagaataaa tgagatattg catctatgaa aaaggcttgt 11220
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gccctgctaa tttttgtatt aaaaaatttt ttttttacta ttattttttt gagatggagt 11640
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tacaggcgtg agccaccatg cttggcagta tgagctttat gttgacttca gattactttt 11940
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aaacaagtat ggtatcttct tagctcatgt aggttcagca tgaacatgtt atatttggca 12060
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ttttttttta aagtcttcct gtgttgccca ggctggagtg gagtggcgca attatagctc 30360
actatagctt ccaactcctg ggctcaagcg atcctcctgc ttcaacctcc caagtagctg 30420
ggacttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaattg agtctttcta tattgcccag gctggtctcg 30480
gaactcctgg cctcaaatga tcctcctgtc cccaagtgat cctcctgccc cagcctccca 30540
aagttttggg gttacaggtg tgagccacca ctcccagcca actttagcat ttaggccaga 30600
tacacgtcac acctgtttct caccttcctg ctctgccctc cttccttctg tgatatctag 30660
aaactatgat ttgaaaattt tacttctgtt tttagtgatc aagtatagaa aaatgactta 30720
aaaaaaaaca aaaacaaata ccagtgggta tttgttatta gagctatttt taaaattaat 30780
gccattctga tagttacaaa ataaactgac ttgaaagcat gcctaattaa ttgcttggag 30840
ataactacaa agttgctaag gttcatgatc tgtgattgga actgcttcat tttcctagaa 30900
aattttgtta atatcaatct ctgaatattg cgaattatct aatccaatat tgaaaccata 30960
ctgtggcatt taaaatccat aggttaatca tgttatcagc cctctgttgg atatctactt 31020
tcctgaagga tctggtgtta agataatttc agaacccgga agctactatg tgtcttctgc 31080
atttacactc gcagttaata tcatagcaaa gaaagttgtt gaaaatgata aatttccctc 31140
tggaggtaag ttataaagtt tatagtttta tttttgttgg tagataattg cagttagtct 31200
ggaaatgagc agatggtcat gaagttgtag gtggttttca gcttttaaaa atcttaaaac 31260
tggccgggcg tggtggctca cgcctataat cccagcactt tgggaggcag agccaggtgg 31320
atcacaaggt caggagttcg agaccagcct ggccaatatg gtggaaaccc catctctact 31380
aaaaatataa aacttagctg gtcatggtgg cgcacacctg taatcccggc tactcgggag 31440
gctgaggcac aaaaatcgct tgaatccggg aggcagaggt tgcagtgagc caagattgtg 31500
ccactggact ccagcctggg tgacaagagt gagactccgt ctcaaaaaaa aaaaaaatct 31560
taaagccaag gtcccattcc gtaagacttc caaatccaac tttcttggta ctgatgttta 31620
gatacgtgtg ttttagataa atgtctagca gatgattaat tctcatccat tattcagaac 31680
tacttttatt gtgatctttt ctgttctcct tacctcacat gggtcagagg gaggctctgt 31740
tttcacactt tctcacataa gggccacaaa gagtccctgt aatctaactc aagtcaaacc 31800
aacaaaaagg cactagacag taccatcttg ttggctaata ttgtaggaaa tactgtttta 31860
cattaagaag actttttttt ttggctgtgg actaatccac agcccatagg aaagttgtcc 31920
atttccccaa tattgtcttt tttttacagc tttgtttttc cttgcttaga atccagtcca 31980
ggaccacatt gaattcgtca tttctccttg aatctagata aagtttctca gctcattact 32040
ttgtattttt taactttgac atttttgaag agtagaaatt tcatagctga tccttagttt 32100
gggtttgttg gatgattcct catgattaat tttttaggct atgcatttgg ggcatgaagt 32160
ccactaaagt gttactctgt tcttctcact tcatcatgtt aggaggcaca tgatagtggc 32220
caattctaat attgatgatg ctaggtgttt tttcttgttg ttttgtcgcc caggctggag 32280
tacagtggct ccatcagggc tcattgcagt ctccacctcc cggcttaagc agtcctccta 32340
ccttcaacct cttgcatagc tgggactaca ggcatatgcc accatgcctg gctaggtttt 32400
tttctatttt tattttgtag agggtttcgt cgtgtttctc aggctggtct caaactcctg 32460
agctcaagtg atccacctgc ctcagcctcc caaagtgctg ggattacaaa cttgagtcaa 32520
tacacctggc cttatgattt tttttttttt tttttttttg agactgtttt gctcttgttg 32580
cccaagctgg aatgcagtgg catgatctca gctcactgca acctccacct cccaggttca 32640
agcaattctc ctgcctcagc ctcccaagta gctgggatta caggtgcgtg ccaccacacc 32700
cggctagatt tttttttttt tttttaattt aaatgctagt tttgagcact tgtttaaggt 32760
tgtgtcaggc aggtttcttt ccattgtgaa gtggcaagtt taaattagag actctgtaaa 32820
ctacctgttt ttaaccagat tttcacccca ttagttttag catctattgt tgaatttcta 32880
acttcattat tgtttatatt agttggcctt tacttaaaga atatcttttc cttccctcct 32940
gtttatgagt ttagactcat agatctttat tcaataggtt tatataatct gttactctta 33000
tttttccctt gacatgtctc cattattctc agagcaattc gttatttttt ggtatatcaa 33060
gatgttccag gctcatttta accttttaaa tgagcctcag tcccgtaatc agttgtttct 33120
ccagggagcc ttggtttgtt ttcgtggaga gtgatatttt aaaaacctga aaattagtat 33180
tggttgtgct aagagtagag tagctgtgag tagaatgggc gttttcaaag gtttcaaagt 33240
gaggtgagag gatctattga tccctgaagc tcgaggctgc ggtgacctgt gatcacgcta 33300
ctgcactgta gcctgagtaa cagtgaggcc ctgtctctac acacacacac agattcccac 33360
tggcagtgta tacatgtgag ctctggttgc tcctcctgct ctctgatgtt ttgtagtgtc 33420
agtctttaag ttgatccagt cagtaggttg gtggtaatgg tagtccattg tggttttaat 33480
ttgcatttac ctgatgacta acgatgtaga gcactgtttt ctttttcttt ttcttttctt 33540
tttttttttt gtttttgaga cagggttttt gctctgttat ccaggctgga atgagtggca 33600
caatctcaac ttttattttt aattctacat tcaaacacat atttaactcc ttgtgcatat 33660
attgccttcc ccttgctgat ttgaaaagaa actaaaaagt gtttttcctt gctgcttcat 33720
ttcctctttt tttgaaacag caactatcag aaagtcttct agaatcttaa tacttttttc 33780
tttttttttt tttttttttg agacagggtc tcattctgtc acccaggctg gagtgcagta 33840
gcacagcctt ggctcactgt ctcactgtct tactgtaacc tccgcctccc ggattcaagg 33900
gattctagtg cctcagcctc ccaagtagct gtgattacag gcatgcacca ccacacctgg 33960
ctaatttttg tatttttagt agagatggag ttttgccatg ttgttcaggc tgatcttgaa 34020
ctcctgacct caagtgatcc tcccacctca gcctcacaaa gtgctaggat tacaggtatg 34080
agccaccgca tccagcccta gagcactctt ttcttgtgct cattggttat cttcctttgt 34140
gaaatgcgtg ctctatgtgt ctttttaagt ttaaatagtt tgagaaatgt gaaaattaca 34200
ttaatttgtt tcatatgagc cattttatta aaaattcatt ttcccctttc ctgttttatt 34260
ccagtagaaa aaaccggaag tgatgaacca gccttcatgt attatatgaa tgatggtgtt 34320
tatggttctt ttgcaagtaa actgtctgag gacttaaata ccattccaga ggttcacaag 34380
gcaagtttta tcagaaatat caaaacctat ttggcatttt ataagctgag ctgttatttt 34440
taagatgctt cccagttttt tgaaaaacat cttagaatgg ggaaaaatgt cctttttgag 34500
gatttgcgtt cttctggtgg agtccctttt ttagtttgtt gcctttacgt ggagttaatg 34560
gtaccatcga ggcttaagta gcaccctgcc cttggctcta ggcctttttt ccatgagcac 34620
attggatctg agacagtgaa aatacttatt tactcacaaa ttcaatacct gcgtaagtat 34680
gagtaaaaat taaattgtaa aacttttcct acagaaatac aaggaagatg agcctctgtt 34740
tacaagcagc ctttggggtc catcctgtga tgagcttgat caaattgtgg aaagctgtct 34800
tcttcctgag ctgaatgtgg gagattggct tatctttgat aacatgggag cagattcttt 34860
ccatgaacca tctgctttta atgattttca gaggccagcc atttattaca tgatgtcatt 34920
cagtgattgg taaggtgatt ttattttaag gcagatggga tatttgaact gtccttttag 34980
acttgctaat aagttttaat tctgtaatga atgctaaact tagaagtaca gtcatgtatt 35040
gcctatacag tgtagttact taatgatggg aatttgttct gacaaataca acattaggcg 35100
attgtatgat ggcataacct actacataat ctaggccatg tggtatattg atcctaggct 35160
acaaacctgt acagcatgtt actctgttta atactgttgg cagttgtaat gcagtggcgt 35220
ttgtgtatct taagttactt aaacatagaa aggataatac attgtgctat gacatgattg 35280
ctgcgatgta acgaggtgat aggacttttt aaacttcact gtaattttac ggtataccac 35340
agtcatatgt gtagtctttg accaaaacat cactctgcag tgcatgacta tcatagaaaa 35400
atgatgatct tttaaaggtt tttggaagac tagttataat cctgttttat tatccatttg 35460
ttatgtgatt acgtggtctt tgggcttaaa ctgagaattt agctgatttt ttttctacgt 35520
aggtatgaga tgcaagatgc tggaattact tcagactcaa tgatgaagaa cttcttcttt 35580
gtgccttctt gcattcagct gagccaagaa gacagctttt ccgctgaagc ttaaacaggc 35640
attaacgctt ctttagatct gaagttgcag gttaagcttg tctggtcaac attccagtgt 35700
ggaaaaataa tttaaacaat cttattctct taattctttt ggcaacaaaa actattagta 35760
atagctattt gggaccagac aaaatcagct ttcatctata attcattggg gataatggga 35820
gatttagata atgtatccag atttaaacct accagtttgt cctacccctt aagcgtttaa 35880
aataaaatat gcaacaaaat ggatgactta gtggagatgg aagcccatta attgggttcc 35940
ccattaaatc gtttacatac aagaacacag tttttatact aaggatttgt gtttaaagtc 36000
ttgtaaagtt catgtctttc acccagatat atcaaatgtt agaagaccag tgtgacttca 36060
ttagataacg tttagtgtat ttagaatgtg taaatttgtg ctttgaactg tagtttaata 36120
aatgtaaaat tgcatcatag tatttgttga cctaatgtaa cccttgtatg attgcaataa 36180
aattttgtgt agattttact gttttttcag gctaaaactt tgggaaaggg gctagctagc 36240
aaaggtagtt ttgaaataga tgtgtatatg gactgttttg aagggttttt ttctttatag 36300
cccagttaag ttttgtttgg ctcggtgcat ttttcattta tttaattagt aatttaagta 36360
aagtgtttgg taaatcattg tgaagttcag attcattatg gagagttgat gtgcagtaag 36420
catgatgttt aacaatttta acaccaaaaa tgttaatcct gcataaatca actgtaataa 36480
taaataggtg tttctgtata gatagaatgc atagagtacc ttagtaaatc tttgaatcac 36540
aatcttttgg ctgaaatgga agattctgtt aaatactttg aataaacttg gggggaggga 36600
aataaaattg cagaaaactg cagagcacta aaacttaaag aagggctaca tctttatcca 36660
gaaacctgtt gctcttttgc acggaatgtt taaattcaga gttgggatgg gggttggggt 36720
gaagcacact tattatcttc agttgcagtg atttcaaatt taggattttt tgttgttggt 36780
ttgaactgtc cccttagttt cttgttattt ccaatttgtt ctgcttagtc attactttta 36840
attcttttct tactaaaatt ttatggtggt tgggggaagg gagttagcat cactaacctg 36900
acagttgttg ccaggaattt gctttgttta ctgctagtat attagaaatc ctagatctca 36960
gaatcacaat agtaataaac aacaggggtc attttttcct aacttactct gtgttcaggt 37020
gtggaatttc tgtctcccaa gaggaaatgt gacttcactt tggtgccaat ggacagaaaa 37080
ttctacctgt gctacatagg agaagtttgg aatgcactta atagctggtt tttacacctt 37140
gatttcgagg tggaaagaaa ttgatcatga atctctaata aatttaaatc tcttaaacca 37200
gtaggtgctt aatatttttt gatttgatta atgcccattt aaatctcatg ggttctatta 37260
aaaatatata tatatagggc cccaatccat tgccatcaaa ttgcccttgg acttttccaa 37320
ggtatattat ggggttttat gcaaaattcc aagctaccat gtaacttttt ttaaccattt 37380
aacaaggagg gggaactgtt tcctaccttc tttacatgtt gtgcattgtt gtggtccaga 37440
aatgccaaac ctttttaaag atggtgcaac tttgagtcct tggcttgact atacaggcct 37500
tgaacttcat ggcatatcaa ctttgccata tctgcaggag agctgttcta taagaaatag 37560
ctcagagttg caaatatcac atgtgaatga tacggtaact tttaagaaat gtctgtattg 37620
tatttgaaga ctgtttgcca taaatctgaa atttgaacct atgtatttca atttggtatg 37680
ctaaaaagtt ctgaattaat gtaaagtttt ttgttataat attgtaatct cagttcaaaa 37740
gttaactgca aatataaaac ccaatgattt ctatatagta aattgaactg taaaggtaac 37800
ttgtgtgtga ttctgaatac atagataaat gtttttattc ctcatgtttt actttggctt 37860
ctatctgaaa tagaggtaaa attttacata tcagcttta 37899
<210> 4
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
Met Lys Gly Phe Ile Asp Asp Ala Asn Tyr Ser Val Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Glu Gly Thr Asn Leu Gly Asn Val Ile Asp Asn Tyr Val Tyr Glu His
20 25 30
Thr Leu Thr Gly Lys Asn Ala Phe Phe Val Gly Asp Leu Gly Lys Ile
35 40 45
Val Lys Lys His Ser Gln Trp Gln Asn Val Val Ala Gln Ile Lys Pro
50 55 60
Phe Tyr Thr Val Lys Cys Asn Ser Ala Pro Ala Val Leu Glu Ile Leu
65 70 75 80
Ala Ala Leu Gly Thr Gly Phe Ala Cys Ser Ser Lys Asn Glu Met Ala
85 90 95
Leu Val Gln Glu Leu Gly Val Pro Pro Glu Asn Ile Ile Tyr Ile Ser
100 105 110
Pro Cys Lys Gln Val Ser Gln Ile Lys Tyr Ala Ala Lys Val Gly Val
115 120 125
Asn Ile Leu Thr Cys Asp Asn Glu Ile Glu Leu Lys Lys Ile Ala Arg
130 135 140
Asn His Pro Asn Ala Lys Val Leu Leu His Ile Ala Thr Glu Asp Asn
145 150 155 160
Ile Gly Gly Glu Glu Gly Asn Met Lys Phe Gly Thr Thr Leu Lys Asn
165 170 175
Cys Arg His Leu Leu Glu Cys Ala Lys Glu Leu Asp Val Gln Ile Ile
180 185 190
Gly Val Lys Phe His Val Ser Ser Ala Cys Lys Glu Ser Gln Val Tyr
195 200 205
Val His Ala Leu Ser Asp Ala Arg Cys Val Phe Asp Met Ala Gly Glu
210 215 220
Ile Gly Phe Thr Met Asn Met Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Thr Gly
225 230 235 240
Thr Glu Phe Gln Leu Glu Glu Val Asn His Val Ile Ser Pro Leu Leu
245 250 255
Asp Ile Tyr Phe Pro Glu Gly Ser Gly Val Lys Ile Ile Ser Glu Pro
260 265 270
Gly Ser Tyr Tyr Val Ser Ser Ala Phe Thr Leu Ala Val Asn Ile Ile
275 280 285
Ala Lys Lys Val Val Glu Asn Asp Lys Phe Pro Ser Gly Val Glu Lys
290 295 300
Thr Gly Ser Asp Glu Pro Ala Phe Met Tyr Tyr Met Asn Asp Gly Val
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Glu Asp Leu Asn Thr Ile Pro
325 330 335
Glu Val His Lys Lys Tyr Lys Glu Asp Glu Pro Leu Phe Thr Ser Ser
340 345 350
Leu Trp Gly Pro Ser Cys Asp Glu Leu Asp Gln Ile Val Glu Ser Cys
355 360 365
Leu Leu Pro Glu Leu Asn Val Gly Asp Trp Leu Ile Phe Asp Asn Met
370 375 380
Gly Ala Asp Ser Phe His Glu Pro Ser Ala Phe Asn Asp Phe Gln Arg
385 390 395 400
Pro Ala Ile Tyr Tyr Met Met Ser Phe Ser Asp Trp Tyr Glu Met Gln
405 410 415
Asp Ala Gly Ile Thr Ser Asp Ser Met Met Lys Asn Phe Phe Phe Val
420 425 430
Pro Ser Cys Ile Gln Leu Ser Gln Glu Asp Ser Phe Ser Ala Glu Ala
435 440 445
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 5
uuaagcuuca gcggaaaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<400> 6
uuaagcuuca gcggaaaagc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 7
uuaagcuuca gcggaaaagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(6)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 8
uuaagcuuca gcggaaaagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<220>
<221> misc_binding
<222> (15)..(20)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 9
uuaagcuuca gcggaaaagc 20
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
cgggatccat tcattttccc ctttcctgtt ttattcc 37
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
cggaattctc cagcatcttg catctcatac c 31
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
cggaattcgc ttaaggggta ggacaaactg gt 32
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
cgggatccgc aagttttatc agaaatatca aaacctattt ggca 44
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
cgggatccaa atacaaggaa gatgagcctc tgtttacaa 39
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
cggaattctt aagcttcagc ggaaaagctg tc 32
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
ctgagccgaa ttcaatcgat ggccgccatg 30
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
gaattcggct cagctgaatg caagaaggca caaag 35
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
gaagacagct gaagcttaag aattcaatcg atggcc 36
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
ttcagctgtc ttcttggctc agctgaatgc aag 33
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
ctcattcagt gcagaagctt aagaattcaa tcgatggccg c 41
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
tgcactgaat gagtcttctt ggctcagctg aatgcaagaa 40
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
cgggatccat catgcacctc tgcgctatat cg 32
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
cggaattcag aacccgatca aacgcaaatg ttacc 35
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
gctgaagctg gaagcaagaa agtg 24
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
cagggccttc tttggacagg a 21
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
attgatgatg caaactactc cgttgg 26
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
ctggaggtac acccaactct tg 22
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
accctgaagt accccatcga 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
ctcaaacatg atctgggtca tct 23
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
gcatttacac tcgcagttaa tatcatagc 29
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
aatgcaagaa ggcacaaaga agaag 25
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
cggattcccc gtgccaagag tgac 24
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
ggccatggcg gccatcgatt 20
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 34
tacaaggaag atgagcctct gtttacaa 28
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
tccagcatct tgcatctcat acc 23
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
cctacagaaa tacaaggaag atgagcc 27
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 37
taaaatcacc ttaccaatca ctgaatgaca 30
<210> 38
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 38
ugagcuugau caaauugugg aaagcugucu ucuuccugag cuagcugagc caagaagaca 60
gcuuuuccgc ugaagcuuaa acaggc 86
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
caagaagaca gcuuuuccgc u 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
uguggaaagc ugucuucuuc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<400> 41
ccacaauuug aucaagcuca 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(20)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 42
ccacaauuug aucaagcuca 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<220>
<221> misc_binding
<222> (15)..(20)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 43
ccacaauuug aucaagcuca 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(6)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 44
ccacaauuug aucaagcuca 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<400> 45
gcugucuucu uggcucagcu 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<400> 46
cuucagcgga aaagcugucu 20
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<400> 47
gcuuuccaca auuugaucaa gcuca 25
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<400> 48
gcuuuccaca auuugaucaa 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<400> 49
cagcucagga agaagacagc 20
<210> 50
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> NH2-Lys修饰的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> m表示硫代假异胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> m表示硫代假异胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n表示胍修饰的 5-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> m表示硫代假异胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> CONH2修饰的
<400> 50
ttmttmtntm 10
<210> 51
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> NH2-Lys修饰的
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> CONH2修饰的
<400> 51
agcggaaaag ct 12
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 2'-O-Me糖修饰
<220>
<221> misc_binding
<222> (15)..(20)
<223> 硫代磷酸酯键
<400> 52
cguguguucu acgcucuggu 20

Claims (28)

1.一种靶向AZIN1基因的核心编辑互补序列(ECS)的寡核苷酸，其中所述AZIN1基因的核心ECS包含序列5'-GCTTTTCC-3'，并且其中所述寡核苷酸包含一个或多个具有糖修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷酸间键。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是核糖核酸(RNA)寡核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是反义寡核苷酸。
4.如权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是非降解反义寡核苷酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与5’-GCTTTTCC-3’互补的序列。
6.如权利要求5所述的寡核苷酸，其中所述与5'-GCTTTTCC-3'互补的序列位于所述寡核苷酸的3'末端附近。
7.如权利要求1-6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述具有糖修饰的核苷酸选自由2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2',4'-桥接核酸修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)修饰的核苷酸和吗啉环修饰的核苷酸组成的组。
8.如权利要求1-7中任一项所述的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷酸间键选自由硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二氨基磷酸酯组成的组。
9.如权利要求8所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)。
10.如权利要求5-9中任一项所述的寡核苷酸，其中所述与5’-GCTTTTCC-3’互补的序列中的至少五个核苷酸被糖修饰修饰。
11.如权利要求5-10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述与5’-GCTTTTCC-3’互补的序列中包含至少三个修饰的核苷酸间键。
12.如权利要求5-10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述与5’-GCTTTTCC-3’互补的序列中不包含任何修饰的核苷酸间键。
13.如权利要求1-12中任一项所述的寡核苷酸，其中至少50％的所述核苷酸被糖修饰修饰。
14.如权利要求1-13中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少10％的核苷酸间键是修饰的核苷酸间键。
15.如权利要求1-14中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中的每个核苷酸都被糖修饰修饰。
16.如权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中的每个核苷酸都被糖修饰修饰，并且通过修饰的核苷酸间键连接于相邻核苷酸。
17.如权利要求1-16中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与序列5'-UUAAGCUUCAGCGGAAAAGC-3'(SEQ ID NO:5)具有至少70％的同一性。
18.如权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含序列5'-UUAAGCUUCAGCGGAAAAGC-3'(SEQ ID NO:5)或由所述序列组成。
19.如权利要求1-18中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与以下序列具有至少70％的同一性：5'-mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGmC-3'(SEQ ID NO:6)、5'-mU*mU*mA*mA*mG*mC*mU*mU*mC*mA*mG*mC*mG*mG*mA*mA*mA*mA*mG*mC-3'(SEQ ID NO:7)、5'-mU*mU*mA*mA*mG*mCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGm C-3'(SEQ ID NO:8)或5'-mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmA*mA*mA*mA*mG*mC-3'(SEQ ID NO:9)，其中m表示2'-O-Me糖修饰，并且*表示硫代磷酸酯键。
20.如权利要求1-11中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自以下的序列或由其组成：5'-mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGmC-3'(SEQ ID NO:6)、5'-mU*mU*mA*mA*mG*mC*mU*mU*mC*mA*mG*mC*mG*mG*mA*mA*mA*mA*mG*mC-3'(SEQ ID NO:7)、5'-mU*mU*mA*mA*mG*mCmUmUmCmAmGmCmGmGmAmAmAmAmGm C-3'(SEQ ID NO:8)和5'-mUmUmAmAmGmCmUmUmCmAmGmCmGmGmA*mA*mA*mA*mG*mC-3'(SEQ ID NO:9)，其中m表示2'-O-Me糖修饰，并且*表示硫代磷酸酯键。
21.一种药物组合物，包含权利要求1-20任一项所述的寡核苷酸。
22.一种抑制细胞中AZIN1前mRNA编辑的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-20中任一项所述的寡核苷酸或权利要求21所述的药物组合物接触。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述AZIN1前mRNA编辑是由作用于RNA-1的腺苷脱氨酶(ADAR-1)介导的。
24.一种治疗有需要的个体的癌症的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的寡核苷酸或权利要求21所述的药物组合物，其中所述癌症与AZIN1前mRNA编辑相关。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症选自肝细胞癌(HCC)、食管鳞状细胞癌(ESCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌(CRC)。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症是肝癌。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括，在施用治疗有效量的权利要求1-19中任一项所述的寡核苷酸或权利要求20所述的药物组合物之前，测量获得自所述个体的样品中经编辑的AZIN1前mRNA的水平。
28.如权利要求27所述的方法，其中与从健康个体获得的样品中经编辑的AZIN1的水平相比，所述经编辑的AZIN1前mRNA的水平高至少15％。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549076B (zh) * 2021-07-23 2022-12-06 中国药科大学 一种多取代嘌呤类化合物及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060160762A1 (en) * 2004-12-13 2006-07-20 Children's Medical Center Corporation Methods for the treatment, diagnosis, and prognosis of cancer
WO2018080393A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 Agency For Science, Technology And Research Antisense oligonucleotides
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060160762A1 (en) * 2004-12-13 2006-07-20 Children's Medical Center Corporation Methods for the treatment, diagnosis, and prognosis of cancer
CN109477103A (zh) * 2016-06-22 2019-03-15 ProQR治疗上市公司Ⅱ 单链rna-编辑寡核苷酸
WO2018080393A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 Agency For Science, Technology And Research Antisense oligonucleotides

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEILEI CHEN等: "Recoding RNA editing of AZIN1 predisposes to hepatocellular carcinoma", 《NATURE MEDICINE》, vol. 19, no. 2, 6 January 2013 (2013-01-06), pages 209 - 216, XP055782878, DOI: 10.1038/nm.3043 *
RACHELLE R. OLSEN等: "Knockdown of antizyme inhibitor decreases prostate tumor growth in vivo", 《AMINO ACIDS》, vol. 42, 11 September 2011 (2011-09-11), pages 549 - 558, XP035008001, DOI: 10.1007/s00726-011-1032-x *
RENA A. MIZRAHI等: "Potent and Selective Inhibition of A‑to‑I RNA Editing with 2′‑O‑Methyl/Locked Nucleic Acid-Containing Antisense Oligoribonucleotides", 《ACS CHEM. BIOL.》, vol. 8, 11 February 2013 (2013-02-11), pages 833 *
TAY DARYL J.T.: "UNDERSTANDING THE DOUBLE-STRANDED RNA (dsRNA) STRUCTURE OF ANTIZYME-INHIBITOR 1 (AZIN1) TRANSCRIPT AND ITS THERAPEUTIC POTENTIALS", Retrieved from the Internet <URL:https://medicine.nus.edu.sg/ant/Archives/Seminars> *

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