KR20200120675A - 윌슨병을 위한 올리고뉴클레오티드 요법 - Google Patents
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Abstract
본 기재 내용은 ATP7B 엑손 6 또는 측접 인트론을 표적화함으로서, ATP7B 전구체-mRNA의 스플라이싱을 조절하여, 엑손 6을 갖는 ATP7B mRNA 분자의 수준을 증가시켜, 예를 들어, 윌슨병의 요법을 제공하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법을 제공한다. 본 기재 내용은 엑손 6, 5'-측접 인트론, 3'-측접 인트론, 또는 엑손 6과 5'-측접 또는 3'-측접 인트론의 조합 내의 ATP7B 표적 서열에 대해 적어도 70% 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
Description
본 발명은 올리고뉴클레오티드, 및 질병의 치료를 위한 이들의 사용의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 윌슨병의 치료에 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
윌슨병(Wilson disease)은 5 내지 35세의 환자들에게서 전형적으로 진단되는 치명적인 구리 항상성 기능부전으로, 자유 구리 축적에 기인한 간 및 신경계 증상을 유발한다. 윌슨병의 이환율(prevalence)은 30,000 개체당 한 명으로 추정된다. 구리의 손상된 간-담췌 분비는 간의 간세포 내에서 트랜스 골지 구리 전달자 ATP7B의 결함에 의해 유발될 수 있다. ATP7B는 세포질로부터 세포내막 구획으로의 구리의 전달에 필요하며, 이후 골지로부터의 소포성 전달을 통해 구리가 담즙으로 유출되고, 및/또는 혈류 전달을 위해 아포세룰로플라스민(apoceruloplasmin, CP)에 구리가 적재된다. 자유 구리 축적은 생체분자(DNA, 지질, 미토콘드리아)에 대한 직접적인 산화성 손상, 및 어팝토시스(apoptosis)를 촉발시키는 산화성 손상/손상을 유발한다.
윌슨병에 대한 현재의 치료 지침은, 자유 구리를 격리시키고 이의 분비를 유도하는 킬레이트제에 의한 초기 치료 후, 장 흡수를 차단하는 킬레이트제 또는 아연 염에 의한 유지 치료를 추천한다. 킬레이트제에 의한 초기 치료(2-12 개월)는 전형적으로 환자로부터 과다 구리를 제거하는데 필요하다. 간 상태의 악화는 죽은 간세포로부터 구리 유출의 증가를 유발할 수 있고, 따라서, 유지 치료는 안정한 간 상태가 달성될 때 단지 개시될 수 있다. 그러나, 아연 염에 의한 유지 치료는, 점착 곤란 및 위장관 부작용에 의해 합병증을 일으킨다. 킬레이션 요법에 기인한 역효과로 20-30% 환자가 추가로 중단(discontinuation)을 하게 된다. 킬레이션 요법은 면역 반응, 상처 치유 감소, 호중구감소증(neutropenia) 또는 혈소판감소증(thrombocytopenia), 림프절질환(lymphadenopathy), 단백뇨(proteinuria) 및 신장 독성(nephrotoxicity), 장-기간의 간 철 축적, 및 신경 손상을 생성하는 자유 구리의 급상승과 연관된다.
윌슨병과 관련된 ATP7B 돌연변이는 엑손 6에서 아데노신으로부터 시토신으로의 단일 염기쌍 변화인데, 이는 아미노산 645에서 메티오닌으로부터 아르기닌으로의 상응하는 변화를 유발한다(M645R): chr13:52535985:A:C [hg19/b37]; NCBI 참고 서열 NG_008806.1 (서열번호: 1):g.54646T>G; NM_0053.3(ATP7B):c.1934T>G (p.Met645Arg). M645R 돌연변이는 유전적 증거에 기초하여 부분적인 내지 완전한 기능-상실(loss-of-function)을 유발하는 것으로 추정되고, 절단 변이체를 갖는 복합 이형접합체(compound heterozygote)는 전형적으로 나이 4-15세 사이에서 윌슨병을 발생시킨다.
cDNA-암호화 플라스미드를 사용하여 발현된, M645R 돌연변이된 ATP7B 단백질에 대한 최근 분석은, 상기 돌연변이 단백질이 단지 돌연변이 단백질만을 발현하는 sf9 곤충 세포의 마이크로좀 분획에서 유사한 구리 흡수 능력을 갖지만, 반면 시험된 모든 다른 병원성 돌연변이는 능력의 감소를 나타낸다는 것을 지적하였다. 추가적인 연구에서는, M645R 돌연변이된 ATP7B 단백질이 다수의 세포 에세이들에서 생화학적 결함을 갖지 않는다는 유사한 결과가 발견되었다.
그러나, M645R 및 관련 돌연변이의 이전 분석은 스플라이싱에 대한 이러한 돌연변이의 영향을 고려하는데 실패했을 수 있다. 스플라이싱은 인간 세포 내에서 발생하는 자연적인 생물학적 메커니즘이다. 스플라이싱은 mRNA가 단백질로 번역되기 전에, 데옥시리보핵산(DNA)으로부터 전사된 1차 메신저 리보핵산(mRNA)를 가공하는데 사용될 수 있다. 스플라이싱은 mRNA의 하나 이상의 인접하는 단편(인트론)을 제거하여 나머지 단편들(엑손)을 결합시키는데 관여할 수 있는데, 5' 스플라이스 부위 및 3' 스플라이스 부위의 짝지음(pair)에 의해 범위가 정해진다. 대안적인 스플라이싱(alternative splicing)은, 상이한 조합의 엑손들을 함께 스플라이싱한 것일 수 있는데, 이는 단일 유전자로부터 다수의 mRNA 전사체를 생성할 수 있다.
(예를 들어, 유전적 변이, 예컨대 점 돌연변이에 의해 유발되는) 특정 인간 유전병은, 비정상(aberrant) 스플라이싱에 의해 유발될 수 있다. 또한, 비정상 스플라이싱에 의해 유발된 질병을 치료하기 위한 스플라이싱 매개자에 대한 필요성도 있다.
일반적으로, 본 발명은 ATP7B 엑손6, 측접 인트론, 또는 이들의 조합 내의 서열에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 엑손 6, 5'-측접 인트론, 3'-측접 인트론, 또는 엑손 6과 5'-측접 또는 3'-측접 인트론의 조합 내의 ATP7B 표적 서열에 대해 적어도 70% 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 5'-측접 또는 3'-측접 인트론 내의 인트론 스플라이싱 사일렌서(silencer)에 대한 스플라이싱 인자의 결합을 감소시킨다.
일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54672-54680 중에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54691-54701 중에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54492-54506 중에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54472-54516 중에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54522-54593 중에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54665-54718 중에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵염기 서열은 5'-측접 인트론 내의 서열에 대해 상보적이다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54517까지 중의 5'-측접 인트론 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 핵염기 서열은 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123 또는 124에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵염기 서열은 서열번호: 122에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54522 내지 54581 중의 5'-측접 인트론 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 핵염기 서열은 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 5'-측접 인트론과 엑손 6의 조합 내에 위치한다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54562 내지 54593 중에 5'-측접 인트론과 엑손 6의 조합 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 핵염기 서열은 서열번호: 11에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 엑손 6, 또는 3'-측접 인트론과 엑손 6의 조합 내에 위치한다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54631 내지 54677 중에 위치한다. 일부 구현예에서, 핵염기 서열은 서열번호: 22, 23, 24 또는 25에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 3'-측접 인트론 내에 위치한다. 일부 구현예에서, ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54655 내지 54738 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드는 서열번호: 1의 위치 54695 및 위치 54696 모두에 대해 상보적이지 않다. 일부 구현예에서, 핵염기 서열은 서열번호: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 또는 155에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵염기 서열은 서열번호: 39, 48, 49, 50, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 100, 103, 104, 121, 및 149에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 임의의 핵염기 서열의 서열 동일성은 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%, 예를 들어, 적어도 90%이다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 100%이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 핵염기를 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기(internucleoside linkage)를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 연결기는 입체화학적으로 풍부한(stereochemically enriched) 포스포로티오에이트 연결기이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드 간의 연결기의 적어도 50%는 독립적으로 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드 간의 연결기의 적어도 70%는 독립적으로 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드 간의 연결기는, 독립적으로 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 당 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 당 뉴클레오시드는 2'-변형된 당 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 2'-변형된 당 뉴클레오시드는 2'-플루오로, 2'-메톡시, 및 2'-메톡시에톡시로 이루어진 군으로부터 선택된 2'-변형(modification)를 포함한다. 일부 구현예에서, 2'-변형된 당 뉴클레오시드는 2'-메톡시에톡시 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드는 독립적으로 변형된 당 뉴클레오시드이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드 간의 연결기는 포스포로티오에이트 디에스테르 연결기이고, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드는 2'-메톡시에톡시 변형된 리보스 뉴클레오시드이다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 표적화 모이어티, 예컨대 N-아세틸갈락토사민 또는 이의 클러스터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 당 뉴클레오시드는 가교(bridged) 핵산이다. 일부 구현예에서, 가교 핵산은 고정된 핵산(locked nucleic acid, LNA), 에틸렌-가교 핵산(ENA), 또는 cEt 핵산이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 추가로 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 공유적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 공유적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 간의 연결기에 공유적으로 접합된다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 링커를 통해 공유적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커[예를 들어, -S-S-, -C(O)O-, -C(O)S-, -OC(O)-, -SC(O)-를 포함하는 링커]이다.
표적화 모이어티의 예는, N-아세틸갈락토사민, 글리시레틴산, 글리시리진, 락토비온산, 락토페린, IgA, 담즙산(예를 들어, 리토콜리타우린 또는 타우로콜산), 및 이들의 클러스터를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민 클러스터이다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 50개 이하의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 30개 이하의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 20개 이하의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 16 내지 20 개의 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 16 내지 19 개의 뉴클레오시드를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포와 접촉시킴으로서, 비정상 ATP7B 유전자를 발현하는 세포에서 엑손 6-함유 ATP7B mRNA 분자의 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체 내에 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 약학적 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로서, 비정상 ATP7B 유전자를 갖는 대상체에서 윌슨병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 투여 단계는 비경구적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 비정상 ATP7B 유전자는 서열번호: 1의 g.54646T>G 돌연변이를 갖는 ATP7B이다.
근본적인 유전적 변이로부터 발생하는 비정상 스플라이싱에 의해 유발될 수 있는 질병의 치료를 위한 조성물 및 방법의 필요성이 본원에서 인지되었다. 일부 경우에, 안티센스 핵산 분자, 예컨대 올리고뉴클레오티드는, 생산된 유전자 산물을 변형시키기 위하여, 유전병에서, 표적화된 유전자의 스플라이싱을 효과적으로 조절하는데 사용될 수 있다. 이 접근법은 유전병에 관여하는 유전자에 대한 발현 및 유전자 산물 조성을 선택적으로 조절하기 위한 치료에 응용될 수 있다.
본 기재 내용은 유리하게는 ATP7B를 암호화하는 핵산 분자를 표적화하여 이와 혼성화가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는, ATP7B의 하나 이상의 엑손 또는 인트론 내의 하나 이상의 스플라이싱 조절 요소를 표적화할 수 있다. 이들 스플라이싱 조절 요소는 ATP7B 리보핵산(RNA)의 스플라이싱을 조절한다.
일 양태에서, 본 기재 내용은 ATP7B의 엑손에 인접하는 하나 이상의 스플라이싱 조절 요소를 표적화하는 서열을 갖는 ATP7B RNA 스플라이스-조절 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, ATP7B의 유전적 변이는 M645R 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, M645R 돌연변이는 ATP7B chr13:52535985:A:C [hg19/b37](서열번호: 1의 g.54646T>G)로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스플라이싱 조절 요소는 엑손 스플라이싱 사일렌서 요소 또는 인트론 스플라이싱 사일렌서 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 표적화된다. 일부 구현예에서, 서열은 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접한 인트론에 표적화된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변이체 스플라이싱을 조절하여, 엑손 포함의 증가를 얻는다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 20 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 50 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
다른 양태에서, 본 기재 내용은 대상체의 세포, 조직 또는 장기에서 ATP7B RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 세포, 조직 또는 장기를, 비정상적으로 스플라이싱된 엑손의 하나 이상의 스플라이싱 조절 요소, 또는 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접한 인트론을 표적화하는 하나 이상의 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉하게 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, ATP7B의 유전적 변이는 M645R을 포함한다. 일부 구현예에서, M645R은 ATP7B chr13:52535985:A:C [hg19/b37](서열번호: 1의 g.54646T>G)로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 스플라이싱 조절 요소는 엑손 스플라이싱 사일렌서 요소, 또는 인트론 스플라이싱 사일렌서 요소이다. 일부 구현예에서, 서열은 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 표적화된다. 일부 구현예에서, 서열은 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접한 인트론에 표적화된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변이체 스플라이싱을 조절하여 엑손 포함의 증가를 얻는다(예를 들어, 엑손 6 포함은, 엑손 6-포함 ATP7B 전사체 대, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료의 부재시 엑손 6-스키핑(skipping) 돌연변이를 갖는 ATP7B 유전자를 포함하는 세포에서의 ATP7B 전사체 분자의 총 수의 비에 비해, 예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45% 또는 적어도 50%; 예를 들어, 최대 100%, 최대 90%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 최대 50% 증가한다). 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 20 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 50 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 예를 들어, 윌슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되며, 대상체는 세포, 조직 또는 장기가 조성물과 접촉하여 반응할 때의 질병의 진행 또는 퇴보에 대하여 모니터링된다.
다른 양태에서, 본 기재 내용은 대상체에서 윌슨병을 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 비정상적으로 스플라이싱된 엑손의 스플라이싱 조절 요소, 또는 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접된 인트론을 표적화하는 서열을 포함하는 치료 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ATP7B RNA의 스플라이싱을 조절한다. 일부 구현예에서, ATP7B의 유전적 변이는 M645R 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, M645R 돌연변이는 ATP7B chr13:52535985:A:C [hg19/b37](서열번호: 1의 g.54646T>G 돌연변이)로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 스플라이싱 조절 요소는 엑손 스플라이싱 사일렌서 요소, 또는 인트론 스플라이싱 사일렌서 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 ATP7B의 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 표적화된다. 일부 구현예에서, 서열은 ATP7B RNA의 변이체 스플라이싱을 조절하는 ATP7B의 유전적 변이의 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접하는 인트론에 표적화된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 스플라이싱을 조절하여, 엑손 포함의 증가를 발생시킨다(예를 들어, 엑손 6-포함 ATP7B 전사체 대, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료의 부재시 엑손 6-스키핑 돌연변이를 갖는 ATP7B 유전자를 포함하는 세포에서의 ATP7B 전사체 분자의 총수의 비율에 비해, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%; 예를 들어, 최대 100%, 최대 90%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 최대 50% 증가한다). 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 20 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 30 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 12 내지 50 개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 대상체에게 치료 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여할 때 반응한 윌슨병의 진행 또는 퇴보에 대해 모니터링된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대상체에서의 24-시간 소변내 구리 수준을, 대조군 대상체에 비해 예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%; 예를 들어, 최대 90%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 최대 50% 감소시킨다. 일부 구현예에서, 대조군 대상체는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 요법하기 전의 대상체이거나, 또는 윌슨병을 앓고 있으나 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 받지 않은 대상체이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대상체에서의 24-시간 소변내 구리 수준을 <100 ㎍/24 시간(<1.6 μmol/24 시간)까지[예를 들어, ≤40 ㎍/24 시간(≤0.6 μmol/24 시간)까지] 감소시킨다.
다른 양태에서, 본 기재 내용은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 윌슨병 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비정상적으로 스플라이싱된 엑손의 스플라이싱 조절 요소, 또는 상기 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접한 인트론을 표적화하는 서열을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ATP7B RNA의 스플라이싱을 조절한다. 일부 구현예에서, ATP7B의 유전적 변이는 M645R를 포함한다. 일부 구현예에서, M645R 돌연변이는 ATP7B chr13:52535985:A:C [hg19/b37](서열번호: 1의 g.54646T>G 돌연변이)로부터 생성된다.
정의
본 명세서 전체에서 사용된 다양한 용어는, 문맥상 달리 지정된 바 없는 경우, 이하와 같이 판독 및 이해될 수 있는데: 전반적으로 사용된 "또는(or)"은 포괄적이며, "및/또는"으로 사용되기도 하고; 전반적으로 사용된 단일 항목 및 대명사는 이들의 복수형을 포함하고, 그 반대이기도 하며; 유사하게, 성별을 반영하는 대명사는 이들의 상대(counterpart) 대명사를 포함하여, 대명사가 사용, 실행(implementation), 성과(performance) 등에 대해 본원에 기재된 임의의 것들을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단일 성별에 대해; "예시적인(exemplary)"은 "설명적인(illustrative)" 또는 "예를 드는(exemplifying)"으로 이해되어야 하며, 반드시 다른 구현예에 비해 "바람직한(preferred)" 것은 아니어야 한다. 용어에 대한 추가적인 정의는 본원에 제시될 수 있는데; 이들은 그 용어들의 이전 및 추후 사용에 적용될 수 있는데, 이는 본 명세서의 판독으로부터 이해될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "아실(acyl)"은, 화학식 -C(O)-R의 화학적 치환기를 나타내며, 여기에서 R은 알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴 알킬, 헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 알킬이다. 선택적으로 치환된 아실은 각각의 R 기에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 아실이다.
본원에서 사용된 용어 "아실옥시(acyloxy)"는, 화학식 -OR의 화학적 치환기를 나타내는데, 여기에서 R은 아실이다. 선택적으로 치환된 아실옥시는 아실에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 아실옥시이다.
본원에서 사용된 용어 "알칸-테트라일(alkane-tetrayl)"은, 달리 특정된 바 없는 경우, 1 내지 16 개의 탄소를 갖는 4가의 비환형, 직쇄 또는 분지쇄, 포화된 탄화수소 기를 나타낸다. 알칸-테트라일은 알킬에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알칸-트리일(alkane-triyl)"은, 달리 특정된 바 없는 경우, 1 내지 16 개의 탄소를 갖는 3가의 비환형, 직쇄 또는 분지쇄, 포화된 탄화수소 기를 나타낸다. 알칸-트리일은 알킬에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알카노일(alkanoyl)"은, 화학식 -C(O)-R의 화학적 치환기를 나타내고, 여기에서 R은 알킬이다. 선택적으로 치환된 알카노일은 알킬에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 알카노일이다.
본원에서 사용된 용어 "알콕시(alkoxy)"는, 달리 특정된 바 없는 경우, 화학식 -OR의 화학적 치환기를 나타내고, 여기에서 R은 C1-6 알킬기이다. 선택적으로 치환된 알콕시는 알킬에 대해 본원에서 정의된 바와 같이 선택적으로 치환된 알콕시 기이다.
본원에서 사용된 용어 "알킬(alkyl)"은, 달리 특정된 바 없는 경우, 비치환된 때, 1 내지 12 개의 탄소를 갖는 비환형의 직쇄 또는 분지쇄 포화된 탄화수소 기를 지칭한다. 특정 바람직한 구현예에서, 비치환된 알킬은 1 내지 6 개의 탄소를 갖는다. 알킬기는 메틸; 에틸; n- 및 이소-프로필; n-, sec-, 이소- 및 tert-부틸; 네오펜틸 등에 의해 예시되고, 알콕시; 아실옥시; 아미노; 아릴; 아릴옥시; 아지도; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 할로; 헤테로사이클릴; 헤테로아릴; 헤테로사이클릴알킬; 헤테로아릴알킬; 헤테로사이클릴옥시; 헤테로아릴옥시; 히드록시; 니트로; 티올; 실릴; 시아노; =O; =S; 및 =NR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘, 세 개, 또는 2개 이상의 탄소의 경우 4개 이상의 치환기로 원자가 허용시(valency permitting) 선택적으로 치환될 수 있고, 여기에서 R'는 H, 알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, 치환된 알킬은 2개의 치환기(옥소 및 히드록시, 또는 옥소 및 알콕시)를 포함하여 -L-CO-R 기를 형성하고, 여기에서 L은 결합이거나 또는 선택적으로 치환된 C1-11 알킬렌이고, R은 히드록실 또는 알콕시이다. 치환기의 각각은 그 자체로 비치환되거나, 또는 원자가 허용시 각각의 개별적인 기에 대해 본원에서 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알킬렌(alkylene)"은, 하나의 수소 원자가 하나의 원자가로 치환된 1가 알킬인 2가 치환기를 나타낸다. 선택적으로 치환된 알킬렌은 알킬에 대해 본원에서 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 알킬렌이다.
본원에서 사용된 용어 "아릴(aryl)"은, 하나 또는 두 개의 방향족 고리를 갖는 단환형(monocyclic)-, 이환형(bicyclic) 또는 다환형(multicyclic)의 탄소고리형 고리 시스템을 나타낸다. 아릴기는 6 내지 10 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 비치환된 탄소고리형 아릴기 내의 모든 원자는 탄소 원자이다. 탄소고리형 아릴기의 비-제한적인 예는, 페닐, 나프틸, 1,2-디히드로나프틸, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸, 플루오레닐, 인다닐, 인데닐 등을 포함한다. 아릴기는 비치환되거나, 또는 알킬; 알콕시; 아실옥시; 아미노; 아릴; 아릴옥시; 아지도; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 할로; 헤테로사이클릴; 헤테로아릴; 헤테로사이클릴알킬; 헤테로아릴알킬; 헤테로사이클릴옥시; 헤테로아릴옥시; 히드록시; 니트로; 티올; 실릴; 및 시아노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개의 치환기로 치환될 수 있다. 각각의 치환기는 그 자체로 비치환되거나, 또는 각각의 개별적인 기에 대해 본원에서 정의된 비치환된 치환기(들)에 의해 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아릴 알킬(aryl alkyl)"은, 아릴기로 치환된 알킬기를 나타낸다. 아릴 및 알킬 부분은 본원에 기재된 개별적인 기들로서 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아릴렌(arylene)"은, 하나의 수소 원자가 하나의 원자가로 치환된 아릴인 2가 치환기를 나타낸다. 선택적으로 치환된 아릴렌은 아릴에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 아릴렌이다.
본원에서 사용된 용어 "아릴옥시(aryloxy)"는 -OR 기를 나타내고, 여기에서 R은 아릴이다. 아릴옥시는 선택적으로 치환된 아릴옥시일 수 있다. 선택적으로 치환된 아릴옥시는 아릴에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 아릴옥시이다.
본원에서 사용된 용어 "ATP7B"은, 생체내에서 ATPase 구리 전달 베타 단백질로 번역되고, 게놈 DNA인 경우 먼저 전사되는 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 전구체-mRNA, 또는 mRNA)을 나타낸다. 인간 ATP7B 유전자를 포함하는 예시적인 게놈 DNA 서열은, 서열번호: 1(NCBI 참고 서열: NG_008806.1)로 주어진다. 서열번호: 1은 ATP7B(서열번호: 1의 위치 5001-83826) 및 근처의 다른 유전자의 게놈 DNA의 안티센스 가닥에 대한 서열을 제공한다. 당업계의 숙련자는 RNA 서열이 전형적으로 티미딘 대신 우리딘을 포함한다는 것을 인식할 것이다. 본원에서 사용된 용어 "ATP7B"는, 야생-형 및 돌연변이 버전을 나타낸다. 예시적인 돌연변이 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 전구체-mRNA, 또는 mRNA)은, 엑손 6이 결핍된 ATPase 구리 전달 베타 단백질을 생성한다.
본원에서 사용된 용어 "이환형 당 모이어티(bicyclic sugar moiety)"는, 2개의 융합된 고리를 포함하는 변형된 당 모이어티를 나타낸다. 특정 구현예에서, 이환형 당 모이어티는 퓨라노실 고리를 포함한다.
본원에서 사용된 표현 "Cx -y"는, (이의 명칭이 그 표현의 바로 뒤에 따라오는) 기가 비치환된 때, 총 x 내지 y 개의 탄소 원자를 함유한다는 것을 가리킨다. 그 기가 복합 기(예를 들어, 아릴 알킬)인 경우, Cx -y는 (이의 명칭이 그 표현의 바로 뒤에 따라오는) 부분이 비치환된 때, 총 x 내지 y 개의 탄소 원자를 함유한다는 것을 가리킨다. 예를 들어, (C6-10-아릴)-C1-6-알킬은, 아릴 부분이 비치환된 때 총 6 내지 10 개의 탄소 원자를 함유하고, 알킬 부분이 비치환된 때, 총 1 내지 6 개의 탄소 원자를 함유하는 기이다.
용어 "상보적인(complementary)"은, 본원에서 핵염기 서열에 대하여 사용될 때, 핵염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 다른 올리고뉴클레오티드 또는 핵산과 혼성화하여 생리적 상태 하에 이중체 구조를 형성하도록 허용하는, 인접한 핵염기들의 패턴을 갖는 핵염기 서열을 지칭한다. 상보적인 서열은 자연적 및/또는 변형된 핵염기로부터 형성된 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 포함한다. 상보적인 서열은 또한 비-왓슨-크릭 염기쌍, 예컨대 워블(wobble) 염기쌍(구아노신-우라실, 히폭산틴-우라실, 히폭산틴-아데닌, 및 히폭산틴-시토신) 및 후그스텐(Hoogsteen) 염기쌍도 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 맥락에서 본원에 사용된 용어 "인접하는(contiguous)"은, 서로에 대해 바로 인접한 뉴클레오시드들, 핵염기들, 당 모이어티들, 또는 뉴클레오시드 간의 연결기들을 지칭한다. 예를 들어, "인접하는 핵염기"는, 서열에서 서로 바로 인접한 핵염기들을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "사이클로알킬(cycloalkyl)"은, 달리 특정된 바 없는 경우, 3 내지 10 개의 탄소를 갖는 환형 알킬기(예를 들어, C3-C10 사이클로알킬)를 지칭한다. 사이클로알킬기는 일환형 또는 이환형일 수 있다. 이환형 사이클로알킬기는 비사이클로[p.q.0]알킬 유형일 수 있으며, 여기에서 p 및 q의 각각은 독립적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7이고, 단 p 및 q의 합은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 대안적으로, 이환형 사이클로알킬기는 가교 사이클로알킬 구조, 예를 들어, 비사이클로[p.q.r]알킬을 포함할 수 있고, 여기에서 r은 1, 2, 또는 3이고, p 및 q의 각각은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고, 단 p, q, 및 r의 합은 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다. 사이클로알킬기는 스피로고리형 기, 예를 들어, 스피로[p.q]알킬일 수 있고, 여기에서 p 및 q의 각각은 독립적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이고, 단 p 및 q의 합은 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이다. 사이클로알킬의 비-제한적인 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 1-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 2-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 5-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 7-비사이클로[2.2.1.]헵틸, 및 데칼리닐을 포함한다. 사이클로알킬기는 비치환되거나, 또는 알킬; 알콕시; 아실옥시; 아미노; 아릴; 아릴옥시; 아지도; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 할로; 헤테로사이클릴; 헤테로아릴; 헤테로사이클릴알킬; 헤테로아릴알킬; 헤테로사이클릴옥시; 헤테로아릴옥시; 히드록시; 니트로; 티올; 실릴; 시아노; =O; =S; =NR'로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 치환기로 치환될 수 있고(예를 들어, 선택적으로 치환된 사이클로알킬일 수 있고), 여기에서 R'은 H, 알킬, 아릴, 또는 헤테로사이클릴이다. 치환기의 각각은 그 자체로 비치환되거나, 또는 각각의 개별적인 기에 대해 본원에서 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "사이클로알킬렌(cycloalkylene)"은, 하나의 수소 원자가 하나의 원자가로 치환된 사이클로알킬인 2가 치환기를 나타낸다. 선택적으로 치환된 사이클로알킬렌은 사이클로알킬에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 사이클로알킬렌이다.
본원에서 사용된 용어 "사이클로알콕시(cycloalkoxy)"는, -OR 기를 나타내고, 여기에서 R은 사이클로알킬이다. 사이클로알콕시는 선택적으로 치환된 사이클로알콕시일 수 있다. 선택적으로 치환된 사이클로알콕시는 사이클로알킬에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 사이클로알콕시이다.
본원에서 사용된 용어 "이중체(duplex)"는, 상보적인 핵염기들의 혼성화를 통해 한 쌍을 이루는 2개의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "엑손 6(exon 6)"은, ATP7B 전구체-mRNA 또는 게놈 DNA의 엑손 6, 예를 들어, 서열번호: 2를 지칭하며, 이는 서열번호: 1의 위치 54582 내지 54658(hg19/b37 좌표 chr13:52535973-52536049), 또는 이의 돌연변이 버전(예를 들어, 서열번호: 1의 g.54646T>G)에 상응한다.
본원에서 사용된 용어 "측접 인트론(flanking intron)"은, 엑손 6 또는 이의 돌연변이의 5'- 또는 3'-말단부에 인접한 인트론을 지칭한다. 측접 인트론은 5'-측접 인트론 또는 3'-측접 인트론이다. 5'-측접 인트론은 엑손 6의 5'-말단부에 인접한 측접 인트론(예를 들어, 서열번호: 1에서 엑손 5과 엑손 6 사이의 인트론 위치)에 상응한다. 3'-측접 인트론은 엑손 6의 3'-말단부에 인접한 측접 인트론(예를 들어, 서열번호: 1에서 엑손 6과 엑손 7 사이의 인트론 위치)에 상응한다.
본원에서 사용된 용어 "유전적 변이(genetic aberration)"는, 일반적으로 유전자에서의 돌연변이 또는 변이체(variant)를 지칭한다. 유전적 변이의 예는, 점 돌연변이(단일 뉴클레오티드 변형 또는 단일 염기 치환), 삽입 또는 결실(indel), 염기전환(transversion), 전좌(translocation), 역위(inversion), 또는 절단(truncation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비정상 ATP7B 유전자는 전구체-mRNA의 스플라이싱이 엑손 6을 건너뛰게 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "할로(halo)"는, 브롬, 염소, 요오드 및 불소로부터 선택된 할로겐을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로알칸-테트라일(heteroalkane-tetrayl)"은, 하나의 헤테로원자에 의해 한 번; 매번 독립적으로, 하나의 헤테로원자에 의해 2번; 매번 독립적으로, 하나의 헤테로원자에 의해 3번; 또는 매번 독립적으로, 하나의 헤테로원자에 의해 4번 단절된(interrupted) 알칸-테트라일 기를 지칭한다. 각각의 헤테로원자는 독립적으로, O, N, 또는 S이다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 O 또는 N이다. 비치환된 CX -Y 헤테로알칸-테트라일은 X 내지 Y 개의 탄소 원자, 뿐만 아니라 본원에서 정의된 헤테로원자를 함유한다. 헤테로알칸-테트라일 기는 비치환되거나, 또는 헤테로알킬에 대해 기재된 바와 같이 치환될 수 있다(예를 들어, 선택적으로 치환된 헤테로알칸-테트라일일 수 있다).
본원에서 사용된 용어 "헤테로알칸-트리일(heteroalkane-triyl)"은, 하나의 헤테로원자에 의해 한번; 매번 독립적으로, 하나의 헤테로원자에 의해 두 번; 매번 독립적으로, 하나의 헤테로원자에 의해 3번; 또는 매번 독립적으로, 하나의 헤테로원자에 의해 4번 단절된 알칸-트리일 기를 지칭한다. 각각의 헤테로원자는 독립적으로, O, N, 또는 S이다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 O 또는 N이다. 비치환된 CX -Y 헤테로알칸-트리일은 X 내지 Y 개의 탄소 원자, 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 헤테로원자를 함유한다. 헤테로알칸-트리일 기는 비치환되거나, 또는 헤테로알킬에 대해 기재된 바와 같이 치환될 수 있다(예를 들어, 선택적으로 치환된 헤테로알칸-트리일).
본원에서 사용된 용어 "헤테로알킬(heteroalkyl)"은, 매번 하나 또는 두 개의 헤테로원자에 의해 1번 이상 단절된 알킬기를 지칭한다. 각각의 헤테로원자는 독립적으로 O, N, 또는 S이다. 헤테로알킬기는 2개의 인접하는 산소 원자를 포함하지 않는다. 헤테로알킬기는 비치환되거나, 또는 치환될 수 있다(예를 들어, 선택적으로 치환된 헤테로알킬일 수 있다). 헤테로알킬이 치환되고, 치환기가 헤테로원자에 결합된 때, 상기 치환기는 헤테로원자의 특성 및 원자가에 따라 선택된다. 따라서, 헤테로원자에 결합된 치환기는, 원자가 허용시, =O, -N(RN2)2, -SO2ORN3, -SO2RN2, -SORN3, -COORN3, N 보호기, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기에서 각각의 RN2는 독립적으로 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴이고, 각각의 RN3는 독립적으로 알킬, 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로사이클릴이다. 이들 치환기의 각각은 그 자체로 비치환되거나, 또는 각각의 개별적인 기에 대해 본원에서 정의된 비치환된 치환기(들)로 치환될 수 있다. 헤테로알킬이 치환되고, 치환기가 탄소에 결합될 때, 상기 치환기는 알킬에 대해 기재된 것들로부터 선택되고, 단 헤테로원자에 결합된 탄소 원자 상의 치환기는 Cl, Br, 또는 I가 아니다. 일부 구현예에서, 탄소 원자는 헤테로알킬기의 말단에서 발견된다. 일부 구현예에서, 헤테로알킬은 PEG이다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로알킬렌(heteroalkylene)"은, 하나의 수소 원자가 하나의 원자가로 치환된 헤테로알킬인 2가 치환기를 나타낸다. 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌은 헤테로알킬에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴(heteroaryl)"은, 일환형 5-, 6-, 7- 또는 8-원의 고리 시스템, 또는 융합된 또는 가교 이환형, 삼환형(tricyclic) 또는 사환형(tetracyclic)의 고리 시스템을 나타내고; 상기 고리 시스템은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 헤테로원자를 함유하고; 고리 중 적어도 하나는 방향족 고리이다. 헤테로아릴기의 비-제한적인 예는, 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨릴, 벤조티아졸릴, 벤조티에닐, 벤족사졸릴, 퓨릴, 이미다졸릴, 인돌릴, 이소인다졸릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 퓨리닐, 피롤릴, 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 티아디아졸릴(예를 들어, 1,3,4-티아디아졸), 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 디히드로인돌릴, 테트라히드로퀴놀릴, 테트라히드로이소퀴놀릴 등을 포함한다. 용어 이환형, 삼환형, 및 사환형 헤테로아릴은, 상기 기재된 적어도 하나의 헤테로원자를 갖는 적어도 하나의 고리, 및 적어도 하나의 방향족 고리를 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 헤테로원자를 갖는 고리는 하나, 둘 또는 세 개의 탄소고리형 고리, 예를 들어, 아릴 고리, 사이클로헥산 고리, 사이클로헥센 고리, 사이클로펜탄 고리, 사이클로펜텐 고리, 또는 다른 일환형 헤테로사이클 고리에 융합될 수 있다. 융합된 헤테로아릴의 예는 1,2,3,5,8,8a-헥사히드로인돌리진; 2,3-디히드로벤조퓨란; 2,3-디히드로인돌; 및 2,3-디히드로벤조티오펜을 포함한다. 헤테로아릴은 알킬; 알콕시; 아실옥시; 아릴옥시; 아미노; 아릴알콕시; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 할로겐; 헤테로사이클릴; 헤테로사이클릴 알킬; 헤테로아릴; 헤테로아릴 알킬; 헤테로사이클릴옥시; 헤테로아릴옥시; 히드록실; 니트로; 티올; 시아노; =O; -NR2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있고, 여기에서 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 아실, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로아릴; -COORA (여기에서 RA는 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로아릴임); 및 -CON(RB)2 (여기에서 각각의 RB는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로아릴임)이다. 각각의 치환기는 그 자체로 비치환되거나, 또는 각각의 개별적인 기에 대해 본원에서 정의된 비치환된 치환기(들)에 의해 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴렌(heteroarylene)"은, 하나의 수소 원자가 하나의 원자가로 치환된 헤테로아릴인 2가 치환기를 나타낸다. 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌은 헤테로아릴에 대해 본원에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌이다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로아릴옥시(heteroaryloxy)"는 구조 -OR를 지칭하는데, 여기에서 R은 헤테로아릴이다. 헤테로아릴옥시는 헤테로아릴에 대해 정의한 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로사이클릴(heterocyclyl)"은, 융합된 또는 가교 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 고리를 갖는 일환형, 이환형, 삼환형, 또는 사환형 고리 시스템을 나타내는데, 달리 특정된 바 없는 경우, 상기 고리 시스템은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 헤테로원자를 함유한다. 헤테로사이클릴은 방향족 또는 비-방향족일 수 있다. 방향족 헤테로사이클릴은 본원에 기재된 헤테로아릴이다. 비-방향족 5-원 헤테로사이클릴은 0 또는 1 개의 이중 결합을 갖고, 비-방향족 6- 및 7-원 헤테로사이클릴 기는 0 내지 2 개의 이중 결합을 갖고, 비-방향족 8-원 헤테로사이클릴 기는 0 내지 2 개의 이중 결합 및/또는 0 또는 1 개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는다. 헤테로사이클릴 기는, 달리 특정된 바 없는 경우, 1 내지 16 개 탄소의 탄소수(carbon count)를 갖는다. 특정 헤테로사이클릴 기는 최대 9개 탄소 원자의 탄소수를 가질 수 있다. 비-방향족 헤테로사이클릴 기는, 피롤리닐, 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 호모피페리디닐, 피페라지닐, 피리다지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디니일, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 티아졸리디닐, 테트라히드로퓨라닐, 디히드로퓨라닐, 테트라히드로티에닐, 디히드로티에닐, 피라닐, 디히드로피라닐, 디티아졸릴 등을 포함한다. 용어 "헤테로사이클릴"은 또한 가교 다환형 구조를 갖는 헤테로사이클 화합물을 나타내는데, 여기에서 하나 이상의 탄소 및/또는 헤테로원자는 일환형 고리, 예를 들어, 퀴누클리딘, 트로판, 또는 디아자-비사이클로[2.2.2]옥탄의 2개의 비-인접한 구성원들을 다리연결한다. 용어 "헤테로사이클릴"은 이환형, 삼환형 및 사환형 기를 포함하고, 여기에서 상기 헤테로사이클 고리 중 어느 것도 하나, 둘 또는 세 개의 탄소고리형 고리, 예를 들어, 사이클로헥산 고리, 사이클로헥센 고리, 사이클로펜탄 고리, 사이클로펜텐 고리 또는 다른 헤테로사이클 고리에 융합된다. 융합된 헤테로사이클릴의 예는 1,2,3,5,8,8a-헥사히드로인돌리진; 2,3-디히드로벤조퓨란; 2,3-디히드로인돌; 및 2,3-디히드로벤조티오펜을 포함한다. 헤테로사이클릴 기는 비치환되거나, 또는 알킬; 알콕시; 아실옥시; 아릴옥시; 아미노; 아릴알콕시; 사이클로알킬; 사이클로알콕시; 할로겐; 헤테로사이클릴; 헤테로사이클릴 알킬; 헤테로아릴; 헤테로아릴 알킬; 헤테로사이클릴옥시; 헤테로아릴옥시; 히드록실; 니트로; 티올; 시아노; =O; =S; -NR2 (여기에서, 각각의 R은 독립적으로 수소, 알킬, 아실, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로아릴임); -COORA (여기에서, RA는 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로아릴임); 및 -CON(RB)2 (여기에서, 각각의 RB는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로아릴임)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로사이클릴 알킬(heterocyclyl alkyl)"은, 헤테로사이클릴 기로 치환된 알킬기를 나타낸다. 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴 알킬의 헤테로사이클릴 및 알킬 부분은, 각각 헤테로사이클릴 및 알킬에 대해 기재한 바와 같이 선택적으로 치환된다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로사이클릴렌(heterocyclylene)"은, 하나의 수소 원자가 하나의 원자가로 치환된 헤테로사이클릴인 2가 치환기를 나타낸다. 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌은, 헤테로사이클릴에 대해 본원에서 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌이다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로사이클릴옥시(heterocyclyloxy)"는 구조 -OR을 지칭하는데, 여기에서 R은 헤테로사이클릴이다. 헤테로사이클릴옥시는 헤테로사이클릴에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "헤테로오르가닉(heteroorganic)"은, (i) 매번 하나 또는 두 개의 헤테로원자에 의해 한번 이상 단절된 비환형 탄화수소, 또는 (ⅱ) 하나 이상의(예를 들어, 한 개, 두 개, 세 개 또는 네 개의) 고리 내(endocyclic) 헤테로원자를 포함하는 환형 탄화수소를 지칭한다. 각각의 헤테로원자는 독립적으로 O, N, 또는 S이다. 헤테로오르가닉은 2개의 인접하는 산소 원자를 포함하지 않는다. 선택적으로 치환된 헤테로오르가닉 기는 알킬에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된 헤테로오르가닉 기이다.
본원에서 사용된 용어 "탄화수소(hydrocarbon)"는, 비환형, 분기형 또는 비환형, 선형 화합물 또는 기, 또는 일환형, 이환형, 삼환형 또는 사환형 화합물 또는 기를 지칭한다. 탄화수소는, 비치환된 때, 탄소 및 수소 원자로 이루어진다. 달리 특정된 바 없는 경우, 비치환된 탄화수소는 총 1 내지 60 개의 탄소 원자(예를 들어, 1 내지 16 개, 1 내지 12 개, 또는 1 내지 6 개의 탄소 원자)를 포함한다. 선택적으로 치환된 탄화수소는, 선택적으로 치환된 비환형 탄화수소 또는 및 선택적으로 치환된 환형 탄화수소이다. 선택적으로 치환된 비환형 탄화수소는, 알킬에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된다. 선택적으로 치환된 환형 탄화수소는, 선택적으로 치환된 방향족 탄화수소 또는 선택적으로 치환된 비-방향족 탄화수소이다. 선택적으로 치환된 방향족 탄화수소는, 아릴에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된다. 선택적으로 치환된 비-방향족 환형 탄화수소는, 사이클로알킬에 대해 기재된 바와 같이 선택적으로 치환된다. 일부 구현예에서, 비환형 탄화수소는 알킬, 알킬렌, 알칸-트리일, 또는 알칸-테트라일이다. 특정 구현예에서, 환형 탄화수소는 아릴 또는 아릴렌이다. 특정 구현예에서, 환형 탄화수소는 사이클로알킬 또는 사이클로알킬렌이다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "히드록실(hydroxyl)" 및 "히드록시(hydroxy)"는, -OH를 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "소수성 모이어티(hydrophobic moiety)"는, 올리고뉴클레오티드 골격에 공유적으로 연결된 1가의 기를 나타내는데, 여기에서 1가의 기는 담즙산(예를 들어, 콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 올레일 리토콜산, 또는 올레오일 콜렌산), 당지질, 인지질, 스핑고지질, 이소프레노이드, 비타민, 포화 지방산, 불포화 지방산, 지방산 에스테르, 트리글리세리드, 피렌, 포르피린, 텍사피린, 아다만틴, 아크리딘, 비오틴, 쿠마린, 플루오레신, 로다민, 텍사스-레드, 디곡시제닌, 디메톡시트리틸, t-부티디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 시아닌 염료(예를 들어, Cy3 또는 Cy5), 훽스트(Hoechst) 33258 염료, 소랄렌, 또는 이부프로펜이다. 1가 기의 비-제한적인 예는,에르고스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 푸코스테롤, 사링고스테롤, 아베나스테롤, 코프로스타놀, 콜레스테롤, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 카디오리핀, 및 카로테노이드를 포함한다. 1가의 기를 올리고뉴클레오티드에 연결시키는 링커는, 선택적으로 치환된 C1-60 탄화수소(예를 들어, 선택적으로 치환된 C1-60 알킬렌) 또는 선택적으로 치환된 C2-60 헤테로오르가닉(예를 들어, 선택적으로 치환된 C2-60 헤테로알킬렌)일 수 있고, 여기에서 상기 링커는 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 및 선택적으로 치환된 사이클로알킬렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 경우에 의해 선택적으로 단절될 수 있다. 링커는 예를 들어, 5'-말단 탄소 원자, 3'-말단 탄소 원자에 부착된 산소 원자, 5'-말단 포스페이트 또는 포스포로티오에이트, 3'-말단 포스페이트 또는 포스포로티오에이트, 또는 뉴클레오시드 간의 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오시드 간의 연결기(internucleoside linkage)"는, 올리고뉴클레오티드 내의 인접하는 뉴클레오시드들 간에 공유적인 연결기를 형성하는 2가 기 또는 공유 결합을 나타낸다. 뉴클레오시드 간의 연결기는 비변형된 뉴클레오시드 간의 연결기 또는 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기이다. "비변형된 뉴클레오시드 간의 연결기(unmodified internucleoside linkage)"는, 포스페이트 (-O-P(O)(OH)-O-) 뉴클레오시드 간의 연결기("포스페이트 포스포디에스테르")이다. "변형된 뉴클레오시드 간의 연결기(modified internucleoside linkage)"는, 포스페이트 포스포디에스테르가 아닌 뉴클레오시드 간의 연결기이다. 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기의 2개의 주요 부류는, 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 인-함유 뉴클레오시드 간의 연결기의 비-제한적인 예는, 포스포디에스테르 연결기, 포스포트리에스테르 연결기, 포스포로티오에이트 디에스테르 연결기, 포스포로티오에이트 트리에스테르 연결기, 포스포로디티오에이트 연결기, 보라노포스포네이트 연결기, 모르폴리노 뉴클레오시드 간의 연결기, 메틸포스포네이트, 및 포스포라미데이트를 포함한다. 비-인 뉴클레오시드 간의 연결기의 비-제한적인 예는, 메틸렌메틸이미노 (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르 (-O-C(O)-S-), 티오노카바메이트 (-O-C(O)(NH)-S-), 실록산 (-O-Si(H)2-O-), 및 N,N'-디메틸히드라진 (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)를 포함한다. 포스포로티오에이트 연결기는 포스포디에스테르 연결기 및 포스포트리에스테르 연결기이며, 여기에서 비-다리연결 산소 원자들 중 하나는 황 원자로 대체된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오시드 간의 연결기는 이하의 구조의 기이며:
여기에서
Z는 O, S, B, 또는 Se이고;
Y는 -X-L-R1이고;
각각의 X는 독립적으로 -O-, -S-, -N(-L-R1)-, 또는 L이고;
각각의 L은 독립적으로 공유 결합 또는 링커(예를 들어, 선택적으로 치환된 C1-60 탄화수소 링커 또는 선택적으로 치환된 C2-60 헤테로오르가닉 링커)이고;
각각의 R1은 독립적으로 수소, -S-S-R2, -O-CO-R2, -S-CO-R2, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴, 소수성 모이어티 또는 표적화 모이어티가고;
각각의 R2는 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-10 알킬, 선택적으로 치환된 C2-10 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴 C1-6 알킬이다.
L가 공유 결합이고, R1가 수소이고, Z가 산소이고, 모든 X 기가 -O-일 때, 뉴클레오시드 간의 기는 포스페이트 포스포디에스테르로 알려져 있다. L이 공유 결합이고, R1가 수소이고, Z가 황이고, 모든 X 기가 -O-일 때, 뉴클레오시드 간의 기는 포스포로티오에이트 디에스테르로 알려져 있다. Z가 산소이고, 모든 X 기가 -O-이고, (1) L가 링커이거나 또는 (2) R1가 수소가 아닐 때, 뉴클레오시드 간의 기는 포스포트리에스테르로 알려져 있다. Z가 황이고, 모든 X 기가 -O-이고, (1) L이 링커이거나 또는 (2) R1이 수소가 아닐 때, 뉴클레오시드 간의 기는 포스포로티오에이트 트리에스테르로 알려져 있다. 포스포로티오에이트 트리에스테르 연결기 및 포스포트리에스테르 연결기의 비-제한적인 예는, 본원에 그 내용이 참고로 포함된 US 2017/0037399에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드의 부류에 대해 본원에서 사용된 용어 "모르폴리노(morpholino)"는, 모르폴리노 뉴클레오시드 간의 연결기에 의해 상호연결된 적어도 10개의 모르폴리노 단량체 단위들의 올리고머를 나타낸다. 모르폴리노는 5' 기 및 3' 기를 포함한다. 예를 들어, 모르폴리노는 이하의 구조일 수 있다:
여기에서,
n은 적어도 10의 정수(예를 들어, 12 내지 50)이며, 이는 모르폴리노 단위의 수를 나타내고;
각각의 B는 독립적으로 핵염기이고;
R1은 5' 기이고;
R2는 3' 기이고;
L은 (i) 모르폴리노 뉴클레오시드 간 연결기이거나, 또는 (ⅱ) L이 R2에 부착된 경우 공유 결합이다. 모르폴리노의 5' 기는, 예를 들어 히드록실, 소수성 모이어티, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디포스포로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 세포 침투 펩티드, 엔도좀 탈출 모이어티, 또는 중성 유기 중합체일 수 있다. 모르폴리노의 3' 기는 예를 들어, 수소, 소수성 모이어티, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디스포로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 세포 침투 펩티드, 엔도좀 탈출 모이어티, 또는 중성 유기 중합체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "모르폴리노 뉴클레오시드 간의 연결기(morpholino internucleoside linkage)"는, 이하의 구조의 2가 기를 나타내는데:
여기에서,
Z는 O 또는 S이고;
X1은 결합, -CH2-, 또는 -O-이고;
X2는 결합, -CH2-O-, 또는 -O-이고;
Y는 -NR2이고, 여기에서 각각의 R은 독립적으로 C1-6 알킬(예를 들어, 메틸)이거나, 또는 R의 둘 다는 이들에 부착된 질소 원자와 함께 C2-9 헤테로사이클릴(예를 들어, N-피페라지닐)을 형성하고;
단, X1 및 X2은 둘 다 동시에 결합은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "핵염기(nucleobase)"는, 뉴클레오시드의 리보퓨라노스/2'-데옥시리보퓨라노스의 1' 위치에서 발견된 질소-함유 헤테로사이클 고리를 나타낸다. 핵염기는 비변형되거나 또는 변형된다. 본원에서 사용된 "비변형된(unmodified)" 또는 "자연적(natural)" 핵염기는, 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 그리고 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 알킬 또는 알키닐 치환된 피리미딘, 알킬 치환된 퓨린, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 뿐만 아니라 합성 및 자연적 핵염기, 예를 들어, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히폭산틴, 2-아미노아데닌, 6-알킬(예를 들어, 6-메틸) 아데닌 및 구아닌, 2-알킬(예를 들어, 2-프로필) 아데닌 및 구아닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 5-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 5-트리플루오로메틸 우라실, 5-트리플루오로메틸 시토신, 7-메틸 구아닌, 7-메틸 아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌을 포함한다. 특정 핵염기는 핵산, 예를 들어, 5-치환된 피리미딘; 6-아자피리미딘; N2-, N6-, 및/또는 O6-치환된 퓨린의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 핵산 이중체 안정성은, 예를 들어, 5-메틸시토신을 사용하여 개선될 수 있다. 핵염기의 비-제한적인 예는: 2-아미노프로필아데닌, 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히폭산틴, 2-아미노아데닌, 6-N-메틸구아닌, 6-N-메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3) 우라실, 5-프로피닐시토신, 6-아조우라실, 6-아조시토신, 6-아조티민, 5-리보실우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실, 8-아자 및 다른 8-치환된 퓨린, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 5-할로우라실, 및 5-할로시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 6-N-벤조일아데닌, 2-N-이소부티릴구아닌, 4-N-벤조일시토신, 4-N-벤조일우라실, 5-메틸 4-N-벤조일시토신, 5-메틸 4-N-벤조일우라실, 보편적인 염기, 소수성 염기, 잡다한(promiscuous) 염기, 크기-확장된 염기, 및 불소화 염기를 포함한다. 추가적인 변형된 핵염기는 삼환형 피리미딘, 예컨대 1,3-디아자페녹사진-2-온, 1,3-디아자페노티아진-2-온 및 9-(2-아미노에톡시)-1,3-디아자페녹사진-2-온(G-클램프)를 포함한다. 변형된 핵염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-데아자아데닌, 7- 데아자구아닌, 2-아미노피리딘, 또는 2-피리돈으로 대체된 것들도 포함할 수 있다. 추가적인 핵염기는 U.S. 특허 제3,687,808호; 문헌[The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch 외, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y. S., 챕터 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288]; 및 문헌[챕터 6 및 15, Antisense Drug Technology, Crooke S. T., Ed., CRC Press, 2008, 163-166 및 442-443]에 기재된 것들을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오시드(nucleoside)"는, 당업계에 알려진 당-핵염기 화합물 및 기(예를 들어, 당업계에 알려진 변형된 또는 비변형된 리보퓨라노스-핵염기 및 2'-데옥시리보퓨라노스-핵염기 화합물)를 나타낸다. 당은 리보퓨라노스일 수 있다. 당은 변형된 또는 비변형될 수 있다. 비변형된 당 뉴클레오시드는 핵염기에 결합된 아노머 탄소를 갖는 리보퓨라노스 또는 2'-데옥시리보퓨라노스이다. 비변형된 뉴클레오시드는 비변형된 핵염기에 결합된 아노머 탄소를 갖는 리보퓨라노스 또는 2'-데옥시리보퓨라노스이다. 비변형된 뉴클레오시드의 비-제한적인 예는, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시시티딘, 2'-데옥시구아노신, 및 티미딘을 포함한다. 변형된 화합물 및 기는, 본원에 기재된 핵염기 변형 및 당 변형로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다. 핵염기 변형은 비변형된 핵염기의 변형된 핵염기로의 대체이다. 당 변형은 예를 들어, 2'-치환, 고정(locking), 탄소고리화, 또는 열림(unlocking)일 수 있다. 2'-치환은, 리보퓨라노스의 2'-히드록실을, 2'-플루오로, 2'-메톡시 또는 2'-(2-메톡시)에톡시로 대체한 것이다. 고정 변형(locking modification)는 리보퓨라노스의 4'-탄소 원자와 2'-탄소 원자 사이에 다리를 포함한다. 고정 변형을 갖는 뉴클레오시드는 가교 핵산, 예를 들어, 고정된 핵산(LNA), 에틸렌-가교 핵산(ENA) 및 cEt 핵산으로 당업계에 알려져 있다. 가교 핵산은 전형적으로 친화도 증가 뉴클레오시드로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는, 뉴클레오시드 간의 연결기 또는 이하의 구조 -X1-P(X2)(R1)2의 1가의 기에 결합된 뉴클레오시드를 나타내는데, 여기에서 X1는 O, S, 또는 NH이고, X2는 부재하거나, =O이거나 또는 =S이고, 각각의 R1은 독립적으로 -OH, -N(R2)2, 또는 -O-CH2CH2CN이며, 여기에서 각각의 R2는 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬이거나, 또는 양쪽 R2 기는 이들에 부착된 질소 원자와 함께 결합하여, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴을 형성한다.
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는, 뉴클레오시드 간의 연결기에 의해 함께 공유적으로 결합된 10개 이상(예를 들어, 10 내지 50 개)의 인접하는 뉴클레오시드들을 함유하는 구조를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단부 및 3' 말단부를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단부는, 예를 들어, 히드록실, 표적화 모이어티, 소수성 모이어티, 5' 캡, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디포스프로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 세포 침투 펩티드, 엔도좀 탈출 모이어티, 또는 중성 유기 중합체일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 3' 말단부는, 예를 들어, 히드록실, 표적화 모이어티, 소수성 모이어티, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디스포로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 세포 침투 펩티드, 엔도좀 탈출 모이어티, 또는 중성 유기 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)일 수 있다. 5'-히드록실 또는 5'-포스페이트를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 비변형된 5' 말단을 갖는다. 5'-히드록실 또는 5'-포스페이트가 아닌 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드는, 변형된 5' 말단을 갖는다. 3'-히드록실 또는 3'-포스페이트를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 비변형된 3' 말단을 갖는다. 3'-히드록실 또는 3'-포스페이트가 아닌 3' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드는, 변형된 3' 말단을 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "옥소(oxo)"는, 2가 산소 원자를 나타낸다(예를 들어, 옥소의 구조는 =O로 나타낼 수 있다).
본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은, 과다한 독성, 자극, 알레르기 반응, 및 합리적인 이점/위험 비율에 비례하는 다른 문제적 합병증 없이, 개체(예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하기에 적합한 이들 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 제형을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "보호기(protecting group)"는, 작용기(예를 들어, 히드록실, 아미노, 또는 카보닐)가 화학 합성 동안 하나 이상의 원치않는 반응에 참여하는 것으로부터 보호하도록 의도된 기를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "O-보호기"는, 화학 합성 동안 산소 함유(예를 들어, 페놀, 히드록실 또는 카보닐) 기가 하나 이상의 원치않는 반응에 참여하는 것으로부터 보호하도록 의도된 기를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "N-보호기"는, 화학 합성 동안 질소 함유(예를 들어, 아미노 또는 히드라진) 기가 하나 이상의 원치않는 반응에 참여하는 것으로부터 보호하도록 의도된 기를 나타낸다. 통상적으로 사용된 O- 및 N-보호기는, 본원에 참고로 포함된 문헌[Wuts, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis" 4판(John Wiley & Sons, New York, 2006)]에 기재되어 있다. 예시적인 O- 및 N-보호기는, 알카노일, 아릴로일, 또는 카르바밀 기, 예컨대 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 피발로일, t-부틸아세틸, 2-클로로아세틸, 2-브로모아세틸, 트리플루오로아세틸, 트리클로로아세틸, 프탈릴, o-니트로페녹시아세틸, α-클로로부티릴, 벤조일, 4-클로로벤조일, 4-브로모벤조일, t-부틸디메틸실릴, 트리-이소-프로필실릴옥시메틸, 4,4'-디메톡시트리틸, 이소부티릴, 페녹시아세틸, 4-이소프로필페헤녹시아세틸, 디메틸포름아미디노, 및 4-니트로벤조일을 포함한다.
카보닐 함유 기를 보호하기 위한 예시적인 O-보호기는, 아세탈, 아실랄, 1,3-디티안, 1,3-디옥산, 1,3-디옥솔란, 및 1,3-디티올란을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 O-보호기는 치환된 알킬, 아릴 및 아릴알킬 에테르(예를 들어, 트리틸; 메틸티오메틸; 메톡시메틸; 벤질옥시메틸; 실록시메틸; 2,2,2,-트리클로로에톡시메틸; 테트라히드로피라닐; 테트라히드로퓨라닐; 에톡시에틸; 1-[2-(트리메틸실릴)에톡시]에틸; 2-트리메틸실릴에틸; t-부틸 에테르; p-클로로페닐, p-메톡시페닐, p-니트로페닐, 벤질, p-메톡시벤질, 및 니트로벤질); 실릴 에테르(예를 들어, 트리메틸실릴; 트리에틸실릴; 트리이소프로필실릴; 디메틸이소프로필실릴; t-부틸디메틸실릴; t-부틸디페닐실릴; 트리벤질실릴; 트리페닐실릴; 및 디페니메틸실릴); 카보네이트(예를 들어, 메틸, 메톡시메틸, 9-플루오레닐메틸; 에틸; 2,2,2-트리클로로에틸; 2-(트리메틸실릴)에틸; 비닐, 알릴, 니트로페닐; 벤질; 메톡시벤질; 3,4-디메톡시벤질; 및 니트로벤질)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 N-보호기는, 비대칭 보조제(chiral auxiliaries), 예컨대 보호 또는 비보호된 D, L 또는 D, L-아미노산, 예컨대 알라닌, 류신, 페닐알라닌 등; 설포닐-함유 기, 예컨대 벤젠설포닐, p-톨루엔설포닐 등; 카바메이트 형성 기, 예컨대 벤질옥시카보닐, p-클로로벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, 2-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, 3,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 3,5-디메톡시벤질 옥시카보닐, 2,4-디메톡시벤질옥시카보닐, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 2-니트로-4,5-디메톡시벤질옥시카보닐, 3,4,5-트리메톡시벤질옥시카보닐, 1-(p-비페닐릴)-1-메틸에톡시카보닐, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, 벤즈히드록시 카보닐, t-부틸옥시카보닐, 디이소프로필메톡시카보닐, 이소프로폭시카보닐, 에톡시카보닐, 메톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐, 페녹시카보닐, 4-니트로페녹시 카보닐, 플루오레닐-9-메톡시카보닐, 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐, 페닐티오카보닐 등, 아릴알킬기, 예컨대 벤질, 트리페닐메틸, 벤질옥시메틸 등, 및 실릴 기, 예컨대 트리메틸실릴 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
여기에서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 피리드-2-일 히드라존은 비치환될 수 있다(즉, 각각의 R'은 H임).
본원에서 사용된 용어 "스플라이스 부위(splice site)"는, 일반적으로 스플라이싱 과정에 관여할 수 있는 인트론의 말단부에 상응하는 게놈 내의 부위를 지칭한다. 스플라이스 부위는 5' 스플라이스 부위(예를 들어, 인트론의 5' 말단부) 또는 3' 스플라이스 부위(예를 들어, 인트론의 3' 말단부)일 수 있다. 주어진 5' 스플라이스 부위는 하나 이상의 후보 3' 스플라이스 부위와 연결될 수 있으며, 이들 각각은 스플라이싱 과정에서 이의 상응하는 5' 스플라이스 부위에 커플링될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "스플라이싱 인핸서(splicing enhancer)"는, 엑손 포함에 대해 긍정적인 효과(예를 들어, 증가 유발)를 갖는 모티프를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "스플라이싱 사일렌서(splicing silencer)"는, 엑손 포함에 대해 부정적인 효과(예를 들어, 감소 유발)를 갖는 모티프를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "입체화학적으로 풍부한"은, 동일한 기의 반대 거울상 이성질체에 비해, 나열된 기의 거울상 이성질체에 대한 국소적인 입체화학적 선호도를 지칭한다. 따라서, 입체화학적으로 풍부한 뉴클레오시드 간의 연결기를 함유하는 올리고뉴클레오티드는, 사전결정된 입체화학의 입체성 뉴클레오시드 간의 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트)가 사전결정된 입체화학과 반대인 입체화학의 입체성 뉴클레오시드 간의 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트)보다 우선하여 존재하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 선호도는 사전결정된 입체화학의 입체성 뉴클레오시드 간의 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트)에 대한 부분입체이성질체 비율을 사용하여 수치로 표현될 수 있다. 사전결정된 입체화학의 입체성 뉴클레오시드 간의 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트)에 대한 부분입체이성질체 비율은, 사전결정된 입체화학과 반대인 입체화학을 갖는 식별된 입체성 뉴클레오시드 간의 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트)를 갖는 부분입체이성질체에 대한, 사전결정된 입체화학을 갖는 식별된 입체성 뉴클레오시드 간의 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트)를 갖는 부분입체이성질체의 몰 비율이다. 사전결정된 입체화학의 포스포로티오에이트에 대한 부분입체이성질체 비율은, 1.1 이상(예를 들어, 4 이상, 9 이상, 19 이상, 또는 39 이상)일 수 있다.
본원에 사용된 "대상체(subject)"는, 대상체로부터의 샘플(들)의 당업계의 실험실 시험(들)에서 알려지거나 또는 그렇지 않은 경우에 자격을 갖춘 전문가(예를 들어, 의사 또는 임상 간호사)에 의해 결정될 때, 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있거나 또는 그러한 위험이 있는 인간 또는 비-인간 동물(예를 들어, 포유류)을 지칭한다. 질병, 장애 또는 질환의 비-제한적 예는, 윌슨병(예를 들어, 엑손 6 스키핑과 관련된 윌슨병)을 포함한다.
"당(sugar)" 또는 "당 모이어티(sugar moiety)"는, 뉴클레오시드의 퓨라노스 고리를 대체할 수 있는 퓨라노스 고리 또는 구조를 갖는 자연 발생적인 당을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오시드에 포함된 당은, 비-퓨라노스 (또는 4'-치환된 퓨라노스) 고리 또는 고리 시스템 또는 개방 시스템일 수 있다. 이러한 구조는 자연적인 퓨라노스 고리(예를 들어, 6-원 고리)에 비해 단순한 변화를 포함한다. 대안적인 당은 또한 퓨라노스 고리가 다른 고리 시스템, 예컨대, 모르폴리노 또는 헥시톨 고리 시스템으로 대체된 당 대용물을 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있는 유용한 당 모이어티의 비-제한적인 예는, β-D-리보스, β-D-2'-데옥시리보스, 치환된 당(예를 들어, 2', 5', 및 비스 치환된 당), 4'-S-당(예를 들어, 4'-S-리보스, 4'-S-2'-데옥시리보스, 및 4'-S-2'-치환된 리보스), 이환형 당 모이어티(예를 들어, 2'-O-CH2-4' 또는 2'-O-(CH2)2-4' 가교 리보스 유래의 이환형 당) 및 당 대용물 (리보스 고리가 모르폴리노 또는 헥시톨 고리 시스템으로 대체된 경우)를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "표적화 모이어티(targeting moiety)"는, 주어진 표적 세포 집단과 관련된 수용체 또는 다른 수용 모이어티에 특이적으로 결합하거나, 또는 반응적으로 연결되거나, 또는 이들과 복합체를 이루는 모이어티(예를 들어, N-아세틸갈락토사민 또는 이의 클러스터)를 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적화 모이어티를 함유할 수 있다. 표적화 모이어티를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 또한 본원에서 접합체(conjugate)로도 지칭된다. 표적화 모이어티는 하나 이상의 리간드(예를 들어, 1 내지 6 개의 리간드, 1 내지 3 개의 리간드, 또는 1개의 리간드)를 포함할 수 있다. 리간드는 항체, 또는 항원-결합 절편 또는 이들의 조작된 유도체(예를 들어, Fcab 또는 융합 단백질(예를 들어, scFv))일 수 있다. 대안적으로, 리간드는 작은 분자(예를 들어, N-아세틸갈락토사민)일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"은, 질병 또는 질환의 증상을 완화하거나, 치료하거나 또는 적어도 부분적으로 저지하는데(예를 들어, 엑손 6을 포함하는 ATP7B mRNA 분자의 수준을 증가시키는데) 필요한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 양을 나타낸다. 이 사용에 유효한 양은 예를 들어, 질병의 심각도, 대상체의 체중 및 전체적 상태에 따라 달라질 수 있다. 전형적으로, 시험관내에서 사용된 투여량은 약학적 조성물의 생체내 투여에 유용한 양에 대한 유용한 지침을 제공할 수 있고, 동물 모델은 특정 장애의 치료에 유효한 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 유효량의 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대상체에서 24-시간 소변내 구리 수준을 <100 ㎍/24 시간(<1.6 μmol/24 시간)까지(예를 들어, ≤40 ㎍/24 시간(≤0.6 μmol/24 시간)까지) 감소시킨다.
본원에서 사용된 용어 "티오카보닐(thiocarbonyl)"은, C(=S) 기를 나타낸다. "티오카보닐"을 함유하는 작용기의 비-제한적인 예는, 티오에스테르, 티오케톤, 티오알데히드, 티오무수물, 티오아실 클로라이드, 티오아미드, 티오카르복실산, 및 티오카르복실레이트를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "티오헤테로사이클릴렌(thioheterocyclylene)"은, 2가의 기 -S-R'-를 나타내는데, 여기에서 R'은 본원에서 정의된 헤테로사이클릴렌이다.
본원에서 사용된 용어 "티올(thiol)"은, -SH 기를 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "트리아졸로사이클로알케닐렌(triazolocycloalkenylene)"은, 8-원 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 고리를 함유하는 헤테로사이클릴렌을 지칭하고, 이의 고리 내 원자는 모두 탄소 원자이고, 브릿지헤드 원자는 sp2-혼성화된 탄소 원자이다. 트리아조사이클로알케닐렌은 헤테로사이클릴에 대해 정의된 방식으로 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "트리아졸로헤테로사이클릴렌(triazoloheterocyclylene)"은, 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 8-원 고리에 융합된 1,2,3-트리아졸 고리를 함유하는 헤테로사이클릴렌을 지칭한다. 트리아졸로헤테로사이클릴렌 내의 브릿지헤드 원자는 탄소 원자이다. 트리아졸로헤테로사이클릴렌은 헤테로사이클릴에 대해 기재된 방식으로 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 올리고뉴클레오티드 및 핵산 내의 위치의 열거는, 달리 특정된 바 없는 경우, 5'-말단 뉴클레오시드를 1로 하여 개시하고, 3'-방향으로 진행한다.
본원에 기재된 화합물은, 달리 기재된 바 없는 경우, 동위원소 풍부한 화합물(예를 들어, 중수소화 화합물), 토토머, 및 모든 입체이성질체 및 이형태체(예를 들어, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, E/Z 이성질체, 아트로프 이성질체 등), 뿐만 아니라 이들의 라세미체, 및 상이한 비율의 거울상이성질체들 또는 부분입체이성질체들의 혼합물, 또는 상기 형태들 중 임의의 것들의 혼합물, 뿐만 아니라 염(예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염)을 포괄한다.
본 기재 내용의 추가적인 양태 및 장점은, 이하의 상세한 설명으로부터 당업계의 숙련자들에게는 자명할 것이고, 여기에서는 본 기재 내용의 단지 예시적인 구현예만을 나타내고 설명하였다. 인지될 바와 같이, 본 기재 내용은 다른 상이한 구현예가 가능하며, 이의 몇몇 세부 사항은 다양하고 명백한 양태에서 본 기재 사항을 벗어나지 않고도 변형이 가능하다. 따라서, 도면 및 명세서는 완전히 설명적이며, 제한적인 것이 아니라고 간주될 것이다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 기재 내용과 모순되는 범위에서는, 본 명세서는 임의의 이러한 모순되는 물질을 대체하고 및/또는 이에 우선하는 것으로 의도된다.
도 1a 및 1b는, chr13:52535985:A:C [hg19/b37] 변이체가 ATP7B 미니유전자 내의 엑손 6 포함을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 1a은 ATP7B 미니유전자에 의해 형질감염된 HEK293T 세포의 RT-PCR 분석을 나타낸다. 엑손 포함(445 bp) 및 배제(368 bp)의 절편은, 야생형 미니유전자(WT) 및 chr13:52535985:A:C [hg19/b37](M645R) 변이체 미니유전자 모두에 대해 단색 검정색의 화살표 머리에 의해 표시된다. 100 bp DNA 래더(ladder)는 크기 참고용으로 나타내었다. 도 1b는 도 1a에서 관찰된 RT-PCR 절편의 정량화에 의해 계산된, ATP7B 미니유전자 내의 엑손 6 포함의 백분율을 나타낸다.
도 2a, 2b, 및 2c는 ATP7B 미니유전자의 콜스-틸링(coarse-tilling)에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적["핫스팟(hotspot)"] 식별을 나타낸다. 도 2a는 엑손 6 및 측접 인트론에 대해 콜스-틸링된 서열번호: 3-34에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 상대적 위치를 개략적으로 표현한 것이다. 도 2b는 ATP7B 야생형 및 M645R ATP7B 미니유전자 및 서열번호: 3-34에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염된 HEK293T 세포의 RT-PCR 산물에 대한 모세관 전기영동을 나타낸다. 100 bp DNA 래더는 445 bp에서의 엑손 6 포함 밴드, 및 368 bp에서의 배제 밴드에 대한 크기 참고를 위해 나타나있다. 도 2c는 도 2b에서 관찰된 RT-PCR 절편의 정량화에 의해 결정된, ATP7B 야생형과 서열번호 3-34에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 공동-형질감염된 M645R ATP7B 미니유전자 내의 엑손 6 포함의 백분율을 나타낸다. 포함 백분율은 절편 크기에 따라 정규화되었다(WT에 대해서는 n=4, M645R에 대해서는 n=5).
도 3은 ATP7B 전사체에 대한 역방향 상보체(즉, 안티센스) 내에 있는, ATP7B 유전자의 엑손 6을 둘러싼 인간 게놈의 정방향 가닥을 나타낸 것이다. (서열번호: 163 CCAGGTAGAGGAAGGGACTTAGATGAGAGCTGGAGTTTATCTTTTGTGTTCTACCTAC 및 서열번호: 164 CTTGTCATTAAAAAGAGAGGGGTGGGGAAAAAGGAGGAAGGTACTTGGTTAAAATATGCATTGGCAGAAAGCACTTTTCAGCTTTGGAAATTAGAAAG)(밑줄). 본 발명에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치 및 서열은, 또한 서열번호: 28-33, 47-51, 60, 61, 63-67, 76-81, 93-95, 120, 121, 130, 132-137, 147, 및 150, 그리고 내부 스플라이싱된 엑손 6의 퍼센트(dPSI)에 대한 이들의 상응하는 효과에 나타나 있다.
도 4a 및 4b는 서열 번호: 29에 제시된 서열을 갖는 스플라이스 조절 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료시의, 구리 허용성 및 ATP7B 단백질 수준의 회복을 나타낸다. 도 4a는 HepG2 야생-형(Wt) 및 2F3 세포 둘 다, 뿐만 아니라 상응하는 비-형질감염된(NT) 대조군을 사용한 구리 민감성 에세이의 결과를 나타낸다. 2F3 세포는 복합 이종접합체이며, 하나의 대립 형질은 M645R 돌연변이를 포함하고, 다른 대립 형질은 플라스미드 서열의 삽입에 의해 불활성화되어 있다. M645R 변이체(2F3)는 야생형 세포에 비해, 구리 농도 증가에 따라 더 낮은 세포 생존성을 갖는다. 이 표현형은 엑손 6의 포함을 증가시키는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 29)에 의한 형질감염에 의해 부분적으로 구제된다(에러 바는 3회 실시된 실험에 대한 표준 오차를 나타낸다). 도 4b는 HepG2 야생-형(Wt) 및 2F3 세포 둘 다, 뿐만 아니라 상응하는 비-형질감염된(NT) 대조군을 사용한 ATP7B에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 돌연변이(2F3)는 ATP7B 단백질 수준의 감소를 나타낸다. 이 표현형은 엑손 6의 포함을 증가시키는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 29)의 형질감염에 의해 부분적으로 구제된다.
도 2a, 2b, 및 2c는 ATP7B 미니유전자의 콜스-틸링(coarse-tilling)에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적["핫스팟(hotspot)"] 식별을 나타낸다. 도 2a는 엑손 6 및 측접 인트론에 대해 콜스-틸링된 서열번호: 3-34에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 상대적 위치를 개략적으로 표현한 것이다. 도 2b는 ATP7B 야생형 및 M645R ATP7B 미니유전자 및 서열번호: 3-34에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염된 HEK293T 세포의 RT-PCR 산물에 대한 모세관 전기영동을 나타낸다. 100 bp DNA 래더는 445 bp에서의 엑손 6 포함 밴드, 및 368 bp에서의 배제 밴드에 대한 크기 참고를 위해 나타나있다. 도 2c는 도 2b에서 관찰된 RT-PCR 절편의 정량화에 의해 결정된, ATP7B 야생형과 서열번호 3-34에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 공동-형질감염된 M645R ATP7B 미니유전자 내의 엑손 6 포함의 백분율을 나타낸다. 포함 백분율은 절편 크기에 따라 정규화되었다(WT에 대해서는 n=4, M645R에 대해서는 n=5).
도 3은 ATP7B 전사체에 대한 역방향 상보체(즉, 안티센스) 내에 있는, ATP7B 유전자의 엑손 6을 둘러싼 인간 게놈의 정방향 가닥을 나타낸 것이다. (서열번호: 163 CCAGGTAGAGGAAGGGACTTAGATGAGAGCTGGAGTTTATCTTTTGTGTTCTACCTAC 및 서열번호: 164 CTTGTCATTAAAAAGAGAGGGGTGGGGAAAAAGGAGGAAGGTACTTGGTTAAAATATGCATTGGCAGAAAGCACTTTTCAGCTTTGGAAATTAGAAAG)(밑줄). 본 발명에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치 및 서열은, 또한 서열번호: 28-33, 47-51, 60, 61, 63-67, 76-81, 93-95, 120, 121, 130, 132-137, 147, 및 150, 그리고 내부 스플라이싱된 엑손 6의 퍼센트(dPSI)에 대한 이들의 상응하는 효과에 나타나 있다.
도 4a 및 4b는 서열 번호: 29에 제시된 서열을 갖는 스플라이스 조절 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료시의, 구리 허용성 및 ATP7B 단백질 수준의 회복을 나타낸다. 도 4a는 HepG2 야생-형(Wt) 및 2F3 세포 둘 다, 뿐만 아니라 상응하는 비-형질감염된(NT) 대조군을 사용한 구리 민감성 에세이의 결과를 나타낸다. 2F3 세포는 복합 이종접합체이며, 하나의 대립 형질은 M645R 돌연변이를 포함하고, 다른 대립 형질은 플라스미드 서열의 삽입에 의해 불활성화되어 있다. M645R 변이체(2F3)는 야생형 세포에 비해, 구리 농도 증가에 따라 더 낮은 세포 생존성을 갖는다. 이 표현형은 엑손 6의 포함을 증가시키는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 29)에 의한 형질감염에 의해 부분적으로 구제된다(에러 바는 3회 실시된 실험에 대한 표준 오차를 나타낸다). 도 4b는 HepG2 야생-형(Wt) 및 2F3 세포 둘 다, 뿐만 아니라 상응하는 비-형질감염된(NT) 대조군을 사용한 ATP7B에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 돌연변이(2F3)는 ATP7B 단백질 수준의 감소를 나타낸다. 이 표현형은 엑손 6의 포함을 증가시키는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 29)의 형질감염에 의해 부분적으로 구제된다.
일반적으로, 본 발명은 ATP7B 엑손 6 또는 측접 인트론을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 조성물 및 방법을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 전사체 내에 엑손 6을 포함하도록 ATP7B 유전자 스플라이싱을 변형시키는 것이 윌슨병의 치료에 사용할 수 있고, 엑손 6을 포함하도록 ATP7B 유전자의 스플라이싱을 변형시키는데 안티센스 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손 6을 갖는 ATP7B mRNA 분자의 수준을 증가시키도록 ATP7B 전구체-mRNA의 스플라이싱을 조절할 수 있다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이에 대한 치료가 필요한 대상체에서 윌슨병을 치료하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손 6, 5'-측접 인트론, 3'-측접 인트론, 또는 엑손 6과 5'-측접 또는 3'-측접 인트론의 조합 내의 ATP7B 표적 서열에 대해 적어도 70% 상보적인 핵염기 서열을 포함한다.
유전적 변이체는 전사 및/또는 스플라이싱에서의 변화 또는 변형에 상응할 수 있다. RNA는 초기에 DNA로부터 전구체-mRNA로서 전사되며, 인트론에 의해 분리된 단백질-암호화 및 5'UTR/3'UTR 엑손을 갖는다. 스플라이싱은 일반적으로 인트론을 제거하고 엑손들을 연결할 수 있는 스플라이소좀 복합체에 의해 실시되는 분자 공정을 지칭하는데, 성숙한 mRNA 서열을 생성하여, 이후 리보솜에 의해 스캐닝되고 단백질로 번역된다. 스플라이소좀에 의해 촉매화되는 분자 반응은, (i) 분지 부위의 아데노신 2'OH가 인트론 공여체 디뉴클레오티드의 최외측 염기로 친핵성 공격을 하는 것(추후 최외측 엑손 공여체 염기 3'OH를 방출시킴); 및 (ⅱ) 엑손 공여체 3'OH가 최외측 엑손 수용체 염기로 친핵성 공격을 하는 것[인트론 올가미(lariat) 및 스플라이싱된 엑손을 추후 방출시킴]을 포함한다.
스플라이싱 서열 변화는 이하의 카테고리들을 포함할 수 있다: (a) 스플라이스 부위[표준(canonical) 스플라이스 부위라고 명명됨] 또는 유전자 산물의 적합한 조성을 위해 필요한 엑손 인식 서열의 변형, 및 (b) 부정확한 스플라이스 부위[숨겨진(cryptic) 스플라이스 부위로 명명됨]의 활성화 및 활용, 또는 인트론 서열의 엑손으로의 부정확한 인식(슈도 엑손으로 명명됨); 둘 다는 유전자 산물의 부적절한 조성을 생성할 수 있다. 스플라이스 부위 인식 신호는 스플라이소좀 조립에 필요할 수 있으며, 이하의 구조를 포함할 수 있다: (i) 엑손-인트론 경계에 바로 인접한, 고도로 보존된 인트론 디뉴클레오티드(AG, GT), 및 (ⅱ) 인트론 디뉴클레오티드를 둘러싼 공통 서열(종종 공여체 부위를 위해서는 3개의 엑손 및 6개의 인트론 뉴클레오티드, 수용체 부위를 위해서는 3개의 엑손 및 20개의 인트론 뉴클레오티드로 범위가 정해짐), 및 분지 부위(인트론 수용체 측 상의 가변적 위치); 둘 다는 더 낮은 보전성과 더 높은 및 서열 다양성을 갖는다.
스플라이스 부위 인식 외에, 엑손 인식 신호는 스플라이싱 인자 및 다른 RNA 결합 단백질에 의해 인식되는 모티프의 과잉(plethora)을 포함할 수 있는데, 이들 중 일부는 보편적으로 발현될 수 있고, 이들 중 일부는 조직 특이적일 수 있다. 이들 모티프는 엑손 바디 및 근접 인트론 서열에 분포할 수 있다. 용어 "스플라이싱 인핸서"는 엑손 포함에 대해 긍정적인 효과(예를 들어, 증가 유발)를 갖는 모티프를 지칭하며, 용어 "스플라이싱 사일렌서"는 엑손 포함에 대한 부정적인 효과(예를 들어, 감소 유발)를 갖는 모티프를 지칭한다. 엑손 인식 신호는 약한 공통 서열의 존재 하에서의 정확한 스플라이싱에서 특히 중요할 수 있다. 변이체가 스플라이스 부위 인식을 약화시킬 때, 엑손을 건너뛸 수 있고, 및/또는 이미 상당히 강한 근처의 숨겨진 스플라이스 부위가 사용될 수 있으며; 특히 짧은 인트론의 존재 하에서는, 전체 인트론 유지(retention)도 또한 가능한 결과이다. 특히, 인트론 디뉴클레오티드의 변형은 종종 스플라이싱 변형을 가져오는 반면, 공통 서열 변형은 평균적으로 충격이 덜하고, 더욱 상황(context)-의존적일 수 있다. 엑손 인식 신호가 약화할 때, 엑손 스키핑은 더욱 가능성 높은 결과일 수는 있지만, 숨겨진 스플라이스 부위 사용도 또한 매우 약한 공통 서열의 존재 하에서는 가능하다. 변이체는 또한 기준 스플라이스 부위에 근접한 약한 숨겨진 스플라이스 부위를 강화시키고, 이의 사용을 유의하게 증가시킬 수 있어서, [아미노산 삽입/결실, 프레임쉬프트, 및 종결-획득(stop-gain)을 포함하는 효과를 갖는] 부적절한 스플라이싱 및 부정확한 유전자 산물을 생성한다. 최종적으로, 기준 스플라이스 부위로부터 더 먼 변이체는 엑손 서열을 인트론으로 인식하도록 유도할 수 있고, 다시 부적절한 유전자 산물 조성을 생성하고; 구체적으로, 이들 변이체는 스플라이스 부위 또는 엑손 인식 신호의 강도를 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 (예를 들어, 유전자의 스플라이싱 조절 요소를 표적화함으로서) 유전자 스플라이싱을 조절하는데 사용될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 스플라이스-전환 올리고뉴클레오티드(SSO)를 포함할 수 있는데, 이는 (예를 들어, 엑손 6의 포함을 개선하기 위해) 입체적인 방해에 의해 스플라이싱을 조절하여, 스플라이소좀 조립 또는 스플라이싱 인자와 RNA 결합 단백질의 결합을 방지할 수 있다. 스플라이소좀 조립 단백질의 차단은 치료적으로 엑손 스키핑을 유발하는데 사용될 수 있다. 특이적인 스플라이싱 인자 또는 저해 효과를 갖는 RNA 결합 단백질의 저해성 결합은, 엑손 포함을 증가시키도록 사용될 수 있다. 특이적인 입체적 차단제 안티센스 올리고뉴클레오티드 화학은 당 변형(예를 들어, 2'-변형)를 갖는 포스포로티오에에트 골격(PS) 및 포스포로디아미데이트 모르폴리노(PMO)에 의해 변형된 RNA 화학을 포함할 수 있다. 예시적인 PS 골격 당 변형은 2'-O-메틸(2'OMe), 및 2'-O-메톡시에틸(2'MOE)(2'-메톡시에톡시로도 알려짐)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 대해, 또는 특정 염기를 위해 다른 뉴클레오티드 변형이 사용될 수도 있다. 올리고뉴클레오티드는 표적화 모이어티(예를 들어, GalNAc 클러스터), 또는 펩티드(예를 들어, 세포 침투 펩티드), 또는 올리고뉴클레오티드의 나머지와는 상이한 다른 분자 또는 다중분자성 기(예를 들어, 소수성 모이어티 또는 중성 중합체)에 공유적으로 접합될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 입체이성질체, 또는 입체이성질체들의 조합으로 사용될 수 있다.
ATP7B 유전자(ATPase 구리 전달 베타, OMIM: 606882)는 윌슨병(윌슨 질병으로도 알려짐)의 병원성에 중요한 역할을 할 수 있다. ATP7B는 세포내 트랜스-골지 구리 전달자를 암호화하는 유전자이다. 유전자는 간의 간세포에서 발현될 수 있고, 혈류로부터 담낭으로의 구리 분비, 및 세룰로플라스민 구리 적하(loading)에 필요할 수 있다. 결함이 있는 구리 분비 및/또는 세룰로플라스민 구리 적하는, 간 및 중추신경계에 독성 효과를 가져올 수 있다. ATP7B 동종접합체 또는 복합 이종접합체 기능-상실은, 상염색체 열성 윌슨병(OMIM: 277900)을 발생시킬 수 있다.
질병, 예컨대 윌슨병에 대해 효과적인 스플라이싱 조절 치료의 필요성을 인식하여, 본 기재 내용은 ATP7B의 비정상적으로 스플라이싱된 엑손의 스플라이싱 조절 요소, 또는 상기 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접하는 인트론을 표적화하는 서열을 포함하는 ATP7B 스플라이스-조절 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 기재 내용은 또한 세포, 조직 또는 장기를 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 접촉하게 함으로써, 대상체의 세포, 조직 또는 장기에서 ATP7B RNA의 스플라이싱을 조절하는 방법도 제공한다. ATP7B 스플라이스-조절 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비정상적으로 스플라이싱된 엑손의 스플라이싱 조절 요소, 또는 ATP7B의 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접한 인트론을 표적화하는 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 본 기재 내용은 대상체에 대해 치료 유효량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 투여함으로서, 대상체에서 윌슨병을 치료하는 방법을 제공한다. ATP7B 스플라이스-조절 안티센스 올리고뉴클레오티드는, ATP7B의 비정상적으로 스플라이싱된 엑손의 스플라이싱 조절 요소, 또는 상기 비정상적으로 스플라이싱된 엑손에 인접한 인트론을 표적화하는 서열을 포함할 수 있다.
스플라이싱 조절 요소는, 예를 들어, 엑손 스플라이싱 사일렌서 요소, 또는 인트론 스플라이싱 사일렌서 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ATP7B RNA의 변이체 스플라이싱을 조절하는, ATP7B의 엑손에 인접하는 엑손 또는 인트론을 표적화하는 서열을 포함할 수 있다. 스플라이싱의 조절은 엑손 포함을 증가시키도록 할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 8 내지 50 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 8 내지 16 개의 뉴클레오티드, 8 내지 20 개의 뉴클레오티드, 12 내지 20 개의 뉴클레오티드, 12 내지 30 개의 뉴클레오티드, 또는 12 내지 50 개의 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.
ATP7B 유전자의 유전적 변이는, 병원성에 중요한 역할을 할 수 있다. 특히, ATP7B M645R 유전적 변이인 ATP7B chr13:52535985:A:C [hg19/b37] (hg19 좌표)(서열번호: 1의 g.54646T>G 돌연변이)는, 엑손 6에서 NM_000053.3 cDNA 변화 1934T>G 및 단백질 서열 Met645Arg(M645R)를 생성할 수 있다. 게놈 좌표는 예를 들어, 인간 게놈 참고 hg19/b37와 비교하여 표현될 수 있다. 예를 들어, 이 변형은 윌슨병 환자에서 병원성을 갖는 것으로 보고되었다.
가상 환경에서 엑손 6 포함의 감소를 유발할 것으로 예측되고, 인간 유전자 돌연변이 데이터베이스(HGMD)에서 관찰되었던 다른 예시적인 유전적 변이는, chr13:52535964:T:C(서열번호: 1의 위치 54667; HMGD ID: CS076596) 및 chr13:52535994:T:C(서열번호: 1의 위치 54637; HMGD ID: CM164020)를 포함한다.
이들 예시적인 유전적 변이는 엑손 포함의 수준을 증가시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있으며, 스플라이싱 조절 요소 내의 다른 유사한 돌연변이는 유사한 경향으로 표적화될 수 있다.
상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 ATP7B의 엑손 6의 포함을 증가시키기 위해 조합될 수 있다. 2개의 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 조합, 예컨대 동일 또는 상이한 부위, 또는 핫스팟을 표적화하는 2개의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3개의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 4개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 5개의 상이한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 적합한 기술 및 방법에 의해 간접적으로 투여될 수 있다. 이는 예를 들어 개체, 또는 개체의 세포, 조직 또는 장기에 발현 벡터의 형태로 제공될 수 있는데, 여기에서 발현 벡터는 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 전사체를 암호화한다. 발현 벡터는 바람직하게는 유전자 전달 비히클을 통해 세포, 조직, 장기 또는 개체에 도입된다. 구현예에서, 본원에서 식별된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 발현 또는 전사를 유발하는 발현 카세트 또는 전사 카세트를 포함하는 바이러스 기반의 발현 벡터가 제공된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현하는 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 적합한 기술 및 방법을 사용하여, 예를 들어, 본원에 기재된 접합체를 사용하여 직접적으로 투여될 수 있다.
접합체
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 보조 모이어티, 예를 들어, 표적화 모이어티, 소수성 모이어티, 세포 침투 펩티드, 또는 중합체를 포함할 수 있다. 보조 모이어티는 (예를 들어, 5'-말단 뉴클레오시드에 공유적으로 결합된) 5' 말단 변형, (예를 들어, 3'-말단 뉴클레오시드에 공유적으로 결합된) 3' 말단 변형, 또는 (예를 들어, 뉴클레오시드 간의 연결기 내의 포스페이트 또는 포스포로티오에이트에 공유적으로 결합된) 뉴클레오시드 간의 연결기로서 존재할 수 있다.
표적화
모이어티
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다.
표적화 모이어티는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를, 선택된 표적화 모이어티에 대한 상응하는 결합 파트너(예를 들어, 상응하는 수용체 또는 리간드 중 하나)를 발현하는 원하는 또는 선택된 세포 집단으로 표적화시키는 이의 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 함유하는 표적화 모이어티를 선택함으로써 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R)를 발현하는 간세포로 표적화될 수도 있다.
표적화 모이어티는 하나 이상의 리간드(예를 들어, 1 내지 9 개의 리간드, 1 내지 6 개의 리간드, 1 내지 3 개의 리간드, 3개의 리간드, 또는 1개의 리간드)를 포함할 수 있다. 리간드는 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R), IgA 수용체, HDL 수용체, LDL 수용체, 또는 트랜스페린 수용체를 발현하는 세포를 표적화할 수 있다. 리간드의 비-제한적인 예는, N-아세틸갈락토사민, 글리시레틴산, 글리시리진, 락토비온산, 락토페린, IgA, 또는 담즙산(예를 들어, 리토콜리타우린 또는 타우로콜산)을 포함한다.
리간드는 작은 분자, 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R)를 발현하는 세포를 표적화하는 작은 분자일 수 있다. 아시알로당단백질 수용체를 표적화하는 작은 분자의 비-제한적인 예는, N-아세틸갈락토사민이다. 대안적으로, 리간드는 항체 또는 항원-결합 절편 또는 이들의 조작된 유도체(예를 들어, Fcab 또는 융합 단백질(예를 들어, scFv))일 수 있다.
표적화 모이어티는 -LinkA(-T)p일 수 있는데, 여기에서 LinkA는 다가의 링커이고, 각각의 T는 리간드[예를 들어, 아시알로당단백질 수용체-표적화 리간드(예를 들어, N-아세틸갈락토사민)]이고, p는 1 내지 9의 정수이다. 각각의 T가 N-아세틸갈락토사민인 때, 표적화 모이어티는 갈락토사민 클러스터로 지칭된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 사용될 수 있는 갈락토사민 클러스터는, 당업계에 알려져있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있는 갈락토사민 클러스터의 비-제한적인 예는, US 5,994,517; US 7,491,805; US 9,714,421; US 9,867,882; US 9,127,276; US 2018/0326070; US 2016/0257961; WO 2017/100461; 및 문헌[Sliedregt 외, J. Med . Chem ., 42:609-618, 1999]에 제공된다. GalNAc가 아닌 리간드는 또한 갈락토사민 클러스터에 대해 본원에서 기재된 바와 같이 클러스터에 사용될 수도 있다.
표적화 모이어티 -LinkA(-T)p는 화학식 (I)의 기일 수 있는데:
여기에서,
각각의 s는 독립적으로 0 내지 20의 정수(예를 들어, 0 내지 10)이고, 여기에서 반복 단위는 동일 또는 상이하고;
Q1는 접합 링커이고[예를 들어, [-Q3-Q4-Q5]s-QC-, 여기에서 QC는 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌(예를 들어, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-, -S(O)2-N(H)-, -N(H)-S(O)2-, 또는 -S-S-를 함유하는 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환된 C1-12 티오헤테로사이클릴렌(예를 들어, , , 또는 ), 선택적으로 치환된 C1-12 헤테로사이클릴렌(예를 들어, 1,2,3-트리아졸-1,4-디일 또는 ), 사이클로부트-3-엔-1,2-디온-3,4-디일, 피리드-2-일 히드라존, 선택적으로 치환된 C6-16 트리아졸로헤테로사이클릴렌(예를 들어, , , 또는 ), 선택적으로 치환된 C8-16 트리아졸로사이클로알케닐렌(예를 들어, ), 또는 디히드로피리다진 기(예를 들어, 트랜스-, 트랜스-, 또는 )임];
Q2는 선형 기이며(예를 들어, p가 1인 경우, [-Q3-Q4-Q5]s-)이거나, 또는 분기된 기(예를 들어, p가 2 내지 9의 정수인 경우, [-Q3-Q4-Q5]s-Q7([-Q3-Q4-Q5]s-(Q7)p1)p2, 여기에서 p1는 0, 1, 또는 2이고, p2는 0, 1, 2, 또는 3임);
각각의 Q3 및 각각의 Q6는, 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -OC(O)-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -NHCH2-, -CH2O-, 또는 -OCH2-이고;
각각의 Q4는, 독립적으로 부재하거나, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알케닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 알키닐렌, 선택적으로 치환된 C2-12 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴렌, 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로아릴렌, 또는 선택적으로 치환된 C1-9 헤테로사이클릴렌이고;
각각의 Q5는, 독립적으로 부재하거나, -CO-, -NH-, -O-, -S-, -SO2-, -CH2-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)NH-, -NH-C(O)-, -NH-CH(Ra)-C(O)-, -C(O)-CH(Ra)-NH-, -OP(O)(OH)O-, 또는 -OP(S)(OH)O-이고;
각각의 Q7는 독립적으로, 선택적으로 치환된 탄화수소 또는 선택적으로 치환된 헤테로오르가닉 (예를 들어, C1-6 알칸-트리일, 선택적으로 치환된 C1-6 알칸-테트라일, 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-트리일, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 헤테로알칸-테트라일)이고;
각각의 Ra는 독립적으로 H 또는 아미노산 측쇄이고;
단, Q3, Q4, 및 Q5 중 적어도 하나는 존재한다.
일부 경우에, [-Q3-Q4-Q5]s-의 각각의 경우에 대하여, Q3, Q4, 및 Q5 중 적어도 하나는 존재한다.
일부 경우에, Q7는 이하의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된 구조일 수 있다:
RA가 H 또는 올리고뉴클레오티드이고, X가 O 또는 S이고, Y가 O 또는 NH인 경우, 나머지 변수는 화학식 (I)로 기재된다.
-LinkA- 기는 폴리(알킬렌 옥사이드)[예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드, 폴리(트리메틸렌 옥사이드), 폴리부틸렌 옥사이드, 폴리(테트라메틸렌 옥사이드), 및 이들의 이원블록 또는 삼원블록 공-중합체]를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, -LinkA-는 폴리에틸렌 옥사이드[예를 들어, 1 kDa 미만의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 옥사이드)]를 포함한다.
소수성
모이어티
유리하게는, 소수성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드는, 소수성 모이어티가 결핍된 올리고뉴클레오티드에 비해 우월한 세포내 흡수를 나타낼 수 있다. 따라서, 소수성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 형질감염제를 실질적으로 포함하지 않는 조성물에 사용될 수 있다. 소수성 모이어티는 올리고뉴클레오티드 골격(예를 들어, 5'-말단)에 공유적으로 결합된 1가의 기[예를 들어, 담즙산(예를 들어, 콜산, 타우로콜산, 데옥시콜산, 올레일 리토콜산, 또는 올레오일 콜렌산), 당지질, 인지질, 스핑고지질, 이소프레노이드, 비타민, 포화된 지방산, 불포화된 지방산, 지방산 에스테르, 트리글리세리드, 피렌, 포르피린, 텍사피린, 아다만틴, 아크리딘, 비오틴, 쿠마린, 플루오레신, 로다민, 텍사스-레드, 디곡시제닌, 디메톡시트리틸, t-부티디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 시아닌 염료(예를 들어, Cy3 또는 Cy5), 훽스트 33258 염료, 소랄렌, 또는 이부프로펜]이다. 1가의 기의 비-제한적인 예는, 에르고스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 퓨코스테롤, 사린고스테롤, 아베나스테롤, 코프로스타놀, 콜레스테롤, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 카디오리핀, 및 카로테노이드를 포함한다. 1가의 기를 올리고뉴클레오티드에 연결시키는 링커는, 선택적으로 치환된 C1-60 탄화수소(예를 들어, 선택적으로 치환된 C1-60 알킬렌) 또는 선택적으로 치환된 C2-60 헤테로오르가닉(예를 들어, 선택적으로 치환된 C2-60 헤테로알킬렌)일 수 있고, 여기에서 링커는 선택적으로 치환된 아릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 및 선택적으로 치환된 사이클로알킬렌으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 경우에 의해 선택적으로 단절될 수 있다. 링커는 예를 들어, 5'-말단 탄소 원자, 3'-말단 탄소 원자, 5'-말단 포스페이트 또는 포스포로티오에이트, 3'-말단 포스페이트 또는 포스포로티오에이트, 또는 뉴클레오시드 간의 연결기에 부착된 산소 원자를 통해 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다.
세포 침투 펩티드
하나 이상의 세포 침투 펩티드(예를 들어, 1 내지 6 개, 또는 1 내지 3 개)는, 보조 모이어티로서 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. CPP는 본원에 기술된 바와 같이 디설파이드 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 따라서, 세포에 전달시, CPP는 예를 들어, 세포내 효소(예를 들어, 단백질 디설파이드 이소머라제, 티오레독신, 또는 티오에스테라제)에 의해 세포내에서 절단됨으로서, 폴리뉴클레오티드를 방출시킬 수 있다.
CPP는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, TAT 또는 Arg8)(Snyder and Dowdy, 2005, Expert Opin . Drug Deliv. 2, 43-51). 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드에 접합하기 위해 적합한 모이어티를 포함하는 CPP의 구체적인 예는, 예를 들어, 이들 CPP의 기재가 본원에 참고로 포함된 WO 2015/188197에서 제공된다.
CPP는 세포로의 생물학적 적재물(cargo)의 전달을 촉진시킬 수 있는 양전하성 펩티드이다. CPP의 양이온성 전하는 이들의 기능에 필수적이라고 여겨진다. 게다가, 이들 단백질의 변환은 세포 유형에 영향을 받는 것으로 보이지 않고, 이들 단백질은 명백한 독성 없이 배양체 내의 거의 모든 세포를 효과적으로 변환시킬 수 있다. CPP는 또한 전체-길이 단백질 외에, DNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 작은 분자, 및 심지어 무기 40nm 철 입자의 세포내 흡수를 유도하는데에도 성공적으로 사용되었는데, 이는 이 과정에서 입자 크기에 상당한 융통성이 있다는 것을 암시한다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 CPP는 실질적인 알파-나선성을 보이는 펩티드를 포함한다. 형질감염은 CPP가 유의한 알파-나선성을 나타낼 때 최대가 된다는 것이 발견되었다. 다른 구현예에서, CPP는 실질적으로 펩티드의 적어도 한 면을 따라 나열된 염기성 아미노산 잔기를 함유하는 서열을 포함한다. 본 발명에 유용한 CPP는 자연 발생적인 펩티드 또는 합성 펩티드일 수 있다.
중합체
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 공유적으로 부착된 중성 중합체-계 보조 모이어티를 포함할 수 있다. 중성 중합체는 폴리(C1-6 알킬렌 옥사이드), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(프로필렌 글리콜) 및 이들의 공중합체, 예를 들어, 이원- 및 삼원블록 공중합체를 포함한다. 중합체의 다른 예는 에스테르화 폴리(아크릴산), 에스테르화 폴리(글루탐산), 에스테르화 폴리(아스파르트산), 폴리(비닐 알콜), 폴리(에틸렌-코-비닐 알콜), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(에틸옥사졸린), 폴리(알킬아크릴레이트), 폴리(아크릴아미드), 폴리(N-알킬아크릴아미드), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(디옥사논), 폴리(카프로락톤), 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리우레탄, N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 및 폴리(N,N-디알킬아크릴아미드)를 포함한다. 예시적인 중합체 보조 모이어티는 100, 300, 500, 1000, 또는 5000 Da 미만(예를 들어, 100 Da 초과)의 분자량을 가질 수 있다. 다른 중합체는 당업계에 알려져 있다.
핵염기
변형
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 비변형된 핵염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 그리고 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 알킬 또는 알키닐 치환된 피리미딘, 알킬 치환된 퓨린, 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 뿐만 아니라 합성 및 자연적 핵염기, 예를 들어, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히폭산틴, 2-아미노아데닌, 6-알킬(예를 들어, 6-메틸) 아데닌 및 구아닌, 2-알킬(예를 들어, 2-프로필) 아데닌 및 구아닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 5-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 5-트리플루오로메틸 우라실, 5-트리플루오로메틸 시토신, 7-메틸 구아닌, 7-메틸 아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌을 포함한다. 특정 핵염기는 핵산, 예를 들어, 5-치환된 피리미딘; 6-아자피리미딘; N2-, N6-, 및/또는 O6-치환된 퓨린의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 핵산 이중체 안정성은 예를 들어, 5-메틸시토신을 사용하여 개선될 수 있다. 핵염기의 비-제한적인 예는: 2-아미노프로필아데닌, 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 히폭산틴, 2-아미노아데닌, 6-N-메틸구아닌, 6-N-메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3) 우라실, 5-프로피닐시토신, 6-아조우라실, 6-아조시토신, 6-아조티민, 5-리보실우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실, 8-아자 및 다른 8-치환된 퓨린, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 5-할로우라실, 및 5-할로시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 6-N-벤조일아데닌, 2-N-이소부티릴구아닌, 4-N-벤조일시토신, 4-N-벤조일우라실, 5-메틸 4-N-벤조일시토신, 5-메틸 4-N-벤조일우라실, 보편적인 염기, 소수성 염기, 잡다한 염기, 크기-확장된 염기, 및 불소화 염기를 포함한다. 추가적인 변형된 핵염기는, 삼환형 피리미딘, 예컨대 1,3-디아자페녹사진-2-온, 1,3-디아자페노티아진-2-온 및 9-(2-아미노에톡시)-1,3-디아자페녹사진-2-온(G-클램프)를 포함한다. 변형된 핵염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 대체된 것들, 예를 들어 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수 있다. 추가적인 핵염기는 문헌[Merigan 외]에 기술된 것들, U.S. 특허 제3,687,808호, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch 외, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y. S., 챕터 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288]에 기술된 것들; 및 문헌[챕터 6 및 15, Antisense Drug Technology, Crooke S. T., Ed., CRC Press, 2008, 163-166 및 442-443]에 기술된 것들을 포함한다.
시티딘을 5-메틸시티딘로 대체하면, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, CpG 단위를 갖는 올리고뉴클레오티드들의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
하나 이상의 구아노신을, 예를 들어, 7-데아자구아노신 또는 6-티오구아노신으로 대체하면, 안티센스 올리고뉴클레오티드 내에 G 사중체 형성을 감소시키는 안티센스 활성을 저해할 수 있다.
당 변형
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오시드에서 하나 이상의 당 변형을 포함할 수 있다. 비변형된 당을 갖는 뉴클레오시드는, 리보뉴클레오시드 및 2'-데옥시리보뉴클레오시드에서 발견된 바와 같은 퓨라노스 고리인 당 모이어티를 포함한다.
본 발명의 뉴클레오시드에 포함된 당은, 비-퓨라노스 (또는 4'-치환된 퓨라노스) 고리 또는 고리 시스템 또는 개방 시스템일 수 있다. 이러한 구조는 자연적 퓨라노스 고리(예를 들어, 6-원 고리)에 비해 단순한 변화를 포함할 수 있다. 대안적인 당은 또한 퓨라노스 고리가 다른 고리 시스템, 예컨대 모르폴리노 또는 헥시톨 고리 시스템으로 대체된 당 대용물을 포함할 수도 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있는 유용한 당 모이어티의 비-제한적인 예는, β-D-리보스, β-D-2'-데옥시리보스, 치환된 당(예를 들어, 2', 5', 및 비스 치환된 당), 4'-S-당(예를 들어, 4'-S-리보스, 4'-S-2'-데옥시리보스, 및 4'-S-2'-치환된 리보스), 가교 당(예를 들어, 2'-O-CH2-4' 또는 2'-O-(CH2)2-4' 가교 리보스 유래의 이환형 당) 및 당 대용물(리보스 고리가 모르폴리노 또는 헥시톨 고리 시스템으로 대체되었을 때)을 포함한다.
전형적으로, 당 변형은 예를 들어, 2'-치환, 고정, 탄소고리화, 또는 열림일 수 있다. 2'-치환은 리보퓨라노스 내의 2'-히드록실이 2'-플루오로, 2'-메톡시, 또는 2'-(2-메톡시)에톡시로 대체된 것이다. 고정 변형은 리보퓨라노스의 4'-탄소 원자와 2'-탄소 원자 사이의 가교 결합이다. 고정 변형을 포함하는 당을 갖는 뉴클레오시드는, 가교 핵산, 예를 들어, 고정된 핵산(LNA), 에틸렌-가교 핵산(ENA) 및 cEt 핵산로 당업계에 알려져 있다. 가교 핵산은 전형적으로 친화도 개선 뉴클레오시드로서 사용된다.
뉴클레오시드 간의
연결기
변형
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오시드 간의 연결기 변형을 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 간의 연결기의 2가지 주요 부류는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 인-함유 뉴클레오시드 간의 연결기의 비-제한적인 예는, 포스포디에스테르 연결기, 포스포트리에스테르 연결기, 포스포로티오에이트 디에스테르 연결기, 포스포로티오에이트 트리에스테르 연결기, 모르폴리노 뉴클레오시드 간의 연결기, 메틸포스포네이트, 및 포스포라미데이트를 포함한다. 비-인 뉴클레오시드 간의 연결기의 비-제한적인 예는, 메틸렌메틸이미노 (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르 (-O-C(O)-S-), 티오노카바메이트 (-O-C(O)(NH)-S-), 실록산 (-O-Si(H)2-O-), 및 N,N'-디메틸히드라진 (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)를 포함한다. 변형된 연결기는, 자연적 포스포디에스테르 연결기에 비해, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 저항성을 변형시키고, 전형적으로는 증가시키는데 사용될 수 있다. 인-함유 및 비-인-함유의 뉴클레오시드 간 연결기의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다.
뉴클레오시드 간의 연결기는 입체화학적으로 풍부할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트-계의 뉴클레오시드 간의 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트 디에스테르 또는 포스포로티오에이트 트리에스테르)는, 입체화학적으로 풍부할 수 있다. 입체성 인을 포함하는, 입체화학적으로 풍부한 뉴클레오시드 간의 연결기는, 전형적으로 인 원자의 절대적인 입체화학을 식별하기 위해 S P 또는 R P라고 지정된다. 올리고뉴클레오티드 내에서, S P 포스포로티오에이트는 이하의 구조를 나타낸다:
올리고뉴클레오티드 내에서, R P 포스포로티오에이트는 이하의 구조를 나타낸다:
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 중성 뉴클레오시드 간의 연결기를 포함할 수 있다. 중성 뉴클레오시드 간의 연결기의 비-제한적인 예는, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트 트리에스테르, 메틸포스포네이트, 메틸렌메틸이미노 (5'-CH2-N(CH3)-O-3'), 아미드-3 (5'-CH2-C(=O)-N(H)-3'), 아미드-4 (5'-CH2-N(H)-C(=O)-3'), 포름아세탈 (5'-O-CH2-O-3'), 및 티오포름아세탈 (5'-S-CH2-O-3')을 포함한다. 추가적인 중성 뉴클레오시드 간의 연결기는 실록산 (디알킬실록산), 카르복실레이트 에스테르, 카르복사미드, 설파이드, 설포네이트 에스테르, 및 아미드를 포함하는 비이온성 연결기를 포함한다(예를 들어 문헌[Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y. S. Sanghvi and P. D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; 챕터 3 및 4, 40-65]를 참고하라).
말단 변형
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 말단 변형, 예를 들어, 5'-말단 변형 또는 3'-말단 변형을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 5' 말단부는 예를 들어, 히드록실, 소수성 모이어티, 표적화 모이어티, 5' 캡, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디포스프로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 세포 침투 펩티드, 엔도좀 탈출 모이어티, 또는 중성 유기 중합체일 수 있다. 비변형된 5'-말단은 히드록실 또는 포스페이트이다. 5'-히드록실 또는 5'-포스페이트가 아닌 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드는 변형된 5' 말단을 갖는다.
올리고뉴클레오티드의 3' 말단부는, 예를 들어, 히드록실, 표적화 모이어티, 소수성 모이어티, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포로티오에이트, 디포스포로티오에이트, 트리포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 디스포로디티오에이트, 트리포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 세포 침투 펩티드, 엔도좀 탈출 모이어티, 또는 중성 유기 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)일 수 있다. 비변형된 3'-말단은 히드록실 또는 포스페이트이다. 3'-히드록실 또는 3'-포스페이트가 아닌 3' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드는 변형된 3' 말단을 갖는다.
말단 변형(예를 들어, 5'-말단 변형)은, 예를 들어, 본원에 기재된 표적화 모이어티일 수 있다.
말단 변형(예를 들어, 5'-말단 변형)은, 예를 들어, 본원에 기재된 소수성 모이어티일 수 있다.
상보성
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 걸쳐 ATP7B 표적 서열에 대해 상보적이다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 ATP7B 표적 서열에 대해 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 70% 상보적이다. 추가적인 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 전체 길이에 걸쳐 ATP7B 표적 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 90% 또는 적어도 95%) 상보적이며, ATP7B 표적 서열에 대해 완전히 상보적인 핵염기 서열을 포함한다. 완전히 상보적인 핵염기 서열은 예를 들어, 6 내지 20개, 10 내지 18개, 또는 18 내지 20 개 길이의 인접하는 핵염기일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 비해 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4 개의) 미스매치된 핵염기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적에 대한 스플라이스-전환 활성은 이러한 미스매치에 의해 감소하지만, 비-표적에 대한 활성은 더 큰 양으로 감소한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 표적-외(off-target) 선택성은 개선될 수 있다.
조성물을 제조하기 위한 방법
본 기재 내용은 본원에 제공된 조성물을 제조 또는 생성하는 방법을 제공한다. 표적화 서열을 포함하는 핵산 분자, 예컨대 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 다양한 핵산 합성 접근법들에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 스플라이스 부위에 표적화된 서열을 포함하는 핵산 분자는, 변형된 및/또는 비변형된 뉴클레오시드의 올리고머화에 의해 생성됨으로서, DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 고체상 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 고체상 합성은 예를 들어, Applied Biosystems 사(캘리포니아 포레스터 시티 소재)와 같은 판매사로부터 입수가능한 장비를 사용하여, 예를 들어 다중-웰 플레이트에서 실시될 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것이 잘 알려져 있다. 올리고뉴클레오티드는 당업계의 숙련자들에게 알려진 방법을 사용하여 정제 및/또는 분석될 수 있다. 예를 들어, 분석 방법은 모세관 전기영동 (CE) 및 전기분무-질량 분광분석법을 포함할 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 약학적 조성물 내에 포함될 수 있다. 약학적 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 예를 들어, 멸균 식염수 용액 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드을 포함할 수 있다(예를 들어, 이들로 이루어질 수 있다). 멸균 식염수는 전형적으로 약학적 등급의 식염수이다. 약학적 조성물은 예를 들어, 멸균수 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다(예를 들어, 이들로 이루어질 수 있다). 멸균수는 전형적으로 약학적 등급의 물이다. 약학적 조성물은 예를 들어, 포스페이트-완충 식염수(PBS) 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다(예를 들어, 이들로 이루어질 수 있다). 멸균 PBS는 전형적으로 약학적 등급의 PBS이다.
약학적 조성물은 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀라제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리크산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은, 올리고뉴클레오티드의 임의의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은, 대상체(예를 들어, 인간)에 투여시, 생물학적으로 활성인 대사산물 또는 이의 잔여물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 기재 내용은 또한 올리고뉴클레오티드의 약학적으로 허용가능한 염을 도시한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 염은, 나트륨 및 칼륨 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 전구약물은 올리고뉴클레오티드에 부착된 하나 이상의 접합체 기를 포함하며, 여기에서 접합체 기는 체내에서 내인성 효소에 의해 절단된다.
지질 모이어티는 다양한 방법에서 핵산 치료에 사용되어 왔다. 특정한 이러한 방법에서, 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오티드는 사전형성된 리포좀 또는 양이온성 지질과 중성 지질의 혼합물로 이루어진 리포플렉스(lipoplex)로 도입된다. 단일- 또는 다중-양이온성 지질을 갖는 DNA 복합체는, 예를 들어, 중성 지질의 존재 없이 형성될 수 있다. 지질 모이어티는 예를 들어, 특정 세포 또는 조직에 대한 약제의 분포를 증가시키도록 선택될 수 있다. 지질 모이어티는 예를 들어, 지방 조직에 대한 약제의 분포를 증가시키도록 선택될 수 있다. 지질 모이어티는 예를 들어, 근육 조직에 대한 약제의 분포를 증가시키도록 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 전달 시스템을 포함할 수 있다. 전달 시스템의 예는 리포좀 및 에멀젼을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 전달 시스템은 소수성 화합물을 포함하는 것들을 포함하는 특정 약학적 조성물의 제조에 유용하다. 특정 유기 용매, 예컨대 디메틸설폭시드가 사용될 수 있다.
약학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 약학적 제제를 특정 조직 또는 세포 유형에 전달하도록 고안된 하나 이상의 조직-특이적 전달 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 본원에 기재된 표적화 모이어티에 의해 코팅된 리포좀을 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 공-용매 시스템을 포함할 수 있다. 특정 공-용매 시스템은 예를 들어, 벤질 알콜, 비극성 계면활성제, 수-혼화성 유기 중합체, 및 수상을 포함한다. 이러한 공-용매 시스템은 예를 들어, 소수성 화합물에 대해 사용될 수 있다. 공-용매 시스템의 비-제한적인 예는, VPD 공-용매 시스템인데, 이는 3% w/v 벤질 알콜을 포함하는 절대 에탄올, 8% w/v의 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80™ 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. 이러한 공-용매 시스템의 비율은, 이들의 용해성 및 독성 특성을 유의하게 변형시키지 않고도 상당히 가변될 수 있다. 게다가, 공-용매 성분의 정체(identity)는 달라질 수 있는데: 예를 들어, 다른 계면활성제가 폴리소르베이트 80™ 대신에 사용될 수 있고; 폴리에틸렌 글리콜의 분획 크기는 달라질 수 있고; 다른 생체적합성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐 피롤리돈이 폴리에틸렌 글리콜을 대체할 수 있고; 및 다른 당 또는 다당류가 덱스트로스를 대신할 수 있다.
약학적 조성물은 주사 또는 투입 [예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내, 경막내, 뇌실내(intracerebroventricular) 등]에 의한 투여를 위해 제조될 수 있다. 약학적 조성물은 예를 들어, 담체를 포함할 수 있고, 예를 들어, 수용액, 예컨대, 물 또는 생리적으로 양립가능한 완충액, 예를 들어, 행크(Hank's) 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수 완충액 중에 제제화될 수 있다. 다른 성분(예를 들어, 용해성을 돕거나 또는 방부제로서 작용하는 성분)도 또한 포함될 수 있다. 주사용 현탁액은 예를 들어, 적절한 액체 담체, 현탁제 등을 사용하여 제조될 수 있다. 주사용 특정 약학적 조성물은 단위 제형으로, 예를 들어, 앰플 또는 다중-투여 용기 내에 주어진다. 주사용 특정 약학적 조성물은 예를 들어, 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼일 수 있고, 부형제(예를 들어, 현탁, 안정화 및/또는 분산 제제)를 함유할 수 있다. 주사용 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 특정 용매는, 친유성 용매 및 지방유, 예를 들어, 참기름, 합성 지방산 에스테르(예를 들어, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드), 및 리포좀을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법
본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 세포와 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 접촉시킴으로서, 비정상 ATP7B 유전자를 발현시키는 세포에서 엑손 6-함유 ATP7B mRNA 분자의 수준을 증가시키는 방법일 수 있다.
본 발명의 방법은 치료 유효량의 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로서, 비정상 ATP7B 유전자를 갖는 대상체에서 윌슨병을 치료하는 방법일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 약학적 조성물은, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 약학적 조성물은 비경구적으로(예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 비강내, 또는 폐내로) 대상체에 투여될 수 있다.
투여는 전형적으로 예를 들어, 치료될 질병 상태의 중증도 및 반응성을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다. 치료 코스는 예를 들어, 수 일 내지 수 개월간, 또는 치료가 효과를 보거나 또는 질병 상태의 약화가 달성될 때까지 지속될 수 있다. 최적 투여 일정은 환자의 체내 약물 축적을 측정함으로써 계산될 수 있다. 따라서, 필요할 때 최대 투여량, 투여 방법 및 반복율이 확립될 수 있다. 최적 투여량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있고, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 발견된 EC50에 기초하여 추정될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 kg당 0.01 ㎍ 내지 1g일 수 있고, 1일마다, 1주마다, 1개월마다, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다, 1년마다, 또는 2년마다 1회 이상 주어질 수 있다. 투여 빈도는 변형될 수 있다. 투여를 위한 반복율은 예를 들어, 체액 또는 조직 내의 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기초하여 확립될 수 있다. 성공적인 치료 후, 환자가 질병 상태의 재발을 예방하기 위한 유지 요법을 받는 것이 바람직할 수 있고, 여기에서 올리고뉴클레오티드는 체중 kg당 0.01㎍ 내지 1g 범위의 유지 투여량으로, 예를 들어, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 2일마다, 1주마다, 2주마다, 1개월마다, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다, 1년마다 또는 2년마다 투여된다.
이를 필요로 하는 대상체에서 윌슨병을 치료하는 방법은, 대상체에게 약학적으로 허용가능한 킬레이트제 또는 아연의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 아연의 약학적으로 허용가능한 염의 비-제한적인 예는, 아연 아세테이트, 아연 글루코네이트, 및 아연 설페이트를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 킬레이트제의 비-제한적인 예는, D-페니실라민, 트리엔틴, 소듐 머캅토숙시네이트, 디머캅토숙신산, 및 테트라티오몰리브데이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 아연의 약학적으로 허용가능한 염(예를 들어, 아연 아세테이트, 아연 글루코네이트, 또는 아연 설페이트)을 투여하는 단계를 포함한다. 일 예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 킬레이트제 또는 아연의 염은 동일한 약학적 조성물 내에서 함께 투여된다. 다른 예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 킬레이트제 또는 아연의 염은, 거의 동일한 시간 내에(예를 들어, 1분 이하로 떨어져서, 또는 5분 이하로 떨어져서) 별도로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 킬레이트제 또는 아연의 염은, 동일한 투여 경로(예를 들어, 정맥내 주사)를 통해 별도로 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 킬레이트제 또는 아연의 염은, 상이한 투여 경로(예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 정맥내 주사, 및 약학적으로 허용가능한 킬레이트제 또는 아연의 염의 경구 투여)를 통해 별도로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염에 앞서 투여된다. 추가적인 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 1시간 이내(예를 들어, 15분, 30분, 또는 1시간 전에)에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 12시간 이내(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 시간 전에)에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 24시간 이내(예를 들어, 12 또는 24 시간 전에)에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 1주 이내(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 일 전에)에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 1개월 이내(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4 주 전에)에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 이후에 투여된다. 추가적인 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 1시간 이내(예를 들어, 15분, 30분, 또는 1시간 후에)에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 12시간 이내(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 시간 후에)에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 24시간 이내(예를 들어, 12 또는 24 시간 후에)에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 1주 이내(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 일 후에)에 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 킬레이트제 또는 아연의 염 투여의 1개월 이내(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4 주 후에)에 투여된다.
실시예
이하의 물질, 방법, 예는 단지 설명을 위한 것이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
재료 및 방법
일반적으로, 본 발명의 실행은 달리 지시된 바 없는 경우, 화학, 분자생물학의 종래의 기술, 재조합 DNA 기술, 및 전기영동의 표준 기술을 이용한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 외, John Wiley & Sons (1992)]를 참고하라.
올리고뉴클레오티드. 사용된 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies Inc. 사(USA)에서 입수하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 염기는, 완전한 포스포로티오에이트 골격을 갖고 2'-O-메톡시에틸-변형되었다(MOE).
ATP7B 미니유전자의 제조. ATP7B 엑손 6을 위한 미니유전자 플라스미드는, 전체 인트론 서열을 포함하여, ATP7B 유전자의 게놈 좌위의 엑손 5 내지 7에 상응하는 절편들을 함유하도록 디자인되었다. 전사된 mRNA 절편의 비정상 스플라이싱을 최소화하기 위해, 엑손 5의 공통 스플라이스 수용체 서열은 엑손 5의 5' 말단부에서 9개의 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 제거되었고, 마찬가지로 엑손 7의 공통 스플라이스 공여체 서열은 엑손 7의 3' 말단부에서 40개의 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 제거되었다. 미니유전자는 KOD 핫 스타트(Hot Start) DNA 중합효소(Novagen)를 사용하여 HEK293T 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 절편의 DNA 조립에 의해 제조되었다. 야생-형 미니유전자를 위하여, 전체 절편은 프라이머 P461 (GATCCACCGGTCGCCACCATGACCTGCGCGTCCTGTGTC) (서열 번호: 165) 및 P463 (TCCTCGCCCTTGCTCACCATGGACAGTCCTGGAATGATGTTGTGG) (서열 번호: 166)에 의해 증폭되었다. 돌연변이 미니유전자를 위하여, NM_000053.3(ATP7B):c.1934T>G(p.Met645Arg) 변이체는, 프라이머 조합 P461 (서열 번호: 165)과 P465 (CTGCTTTATTTCCCTCTTGTGGTCCAAGTGATGAGC) (서열 번호: 167), 및 프라이머 조합 P464 (GACCACAAGAGGGAAATAAAGCAGTAGGTAGAACAC) (서열 번호: 168)과 P463 (서열 번호: 166)에 의해 각각 증폭된 2개의 겹치는 절편들을 부위-지향적 돌연변이 유발시킴으로써 도입되었다. 프라이머 P459 (ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA) (서열 번호: 169) 및 P460 (CATGGTGGCGACCGGTGGAT) (서열 번호: 170)에 의해 선형화된 PCR 절편은, 제조사의 지침에 따라서 NEBuilder HiFi DNA 조립 키트(New England Biolabs)를 사용하여 mClover2 플라스미드에 클로닝되었다. 플라스미드 DNA는 프레스토 미니(Presto Mini) 플라스미드 키트(Geneaid)를 사용하여 분리되었다.
HepG2 돌연변이 균주, 2F3. 이 균주는 통상 사용된 분자생물학 기술에 따라 CRISPR/Cas 9을 사용하여 M645R 변이체를 삽입함으로서 HepG2 세포로부터 제조되었다. 생성된 2F3 균주는 하나의 대립 형질에는 M645R 변이체를, 그리고 다른 쪽에는 큰 플라스미드 삽입부를 포함한다. 이러한 삽입은 그 대립 형질이 기능성 단백질을 생산할 수 없게 하여, 복합 이형접합체와 유사한 상황을 만든다고 추정되었고, 이는 윌슨병 환자에서 발견되는 것과 일관된다(Margarit 외, Clin Genet., 68:61-68, 2005).
세포 배양. HEK293T 세포는 10%(v/v) 코스믹(Cosmic) 송아지 혈청(HyClone), 2mM L-글루타민(Gibco) 및 1% 항생제(100-U/ml 페니실린 G 및 100-ug/ml 스트렙토마이신, Gibco)가 보충된 이스코브의 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(Gibco) 중에, 37℃의 5% CO2를 갖는 가습 배양기에서 생장하였다. 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 세포를 포스페이트-완충 식염수로 세척한 후 트립신(Gibco) 분리시키고, 10 내지 20-배 희석하여 플레이팅함으로서 계대하였다. HepG2 야생-형 및 돌연변이 2F3 세포는 37℃, 5% CO2의 가습 배양기에서, 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청(Gibco)가 보충된 둘배코 변형 이글 배지(Gibco) 중에서 생장하였다. 컨플루언시에 도달하면, 세포를 포스페이트-완충 식염수로 세척한 후, TrypLE(Gibco) 분리시키고, 배양 플라스크에서 2 내지 4-배 희석하여 플레이팅함으로서 계대하였다.
미니유전자 플라스미드에 의한 HEK293T 세포의 형질감염. 미니유전자 플라스미드에 의한 HEK293T 세포의 형질감염을 위하여, 300,000개의 세포를 12-웰 조직 배양 플레이트 내의 항생제를 포함하는 1 ml의 완전 배지에 플레이팅하고, 이를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 플라스미드 형질감염 혼합물은 50㎕ Opti-MEM 감소된 혈청 배지(Gibco) 중에 희석된 1,000 ng의 플라스미드 DNA(~ 5㎕)를, 3.0㎕의 X-tremeGENE HP DNA 형질감염 시약 용액(Roche)과 조합함으로써 제조되었다. 플라스미드 형질감염 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양한 후, HEK293T 세포에 첨가하고, 이는 이후 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 형질감염 24시간 후에, 배지를 2,000㎕의 완전 배지로 갈아주었다. 형질감염의 48시간 후에, RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 위해 세포를 용해시켰다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 미니유전자 플라스미드에 의한 HEK293T 세포의 공동-형질감염. 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 미니유전자 플라스미드를 96-웰 포맷 중의 HEK293T 세포에 공동-형질감염시켰다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 스톡 용액(100 μM)은 Opti-MEM 감소된 혈청 배지(Gibco) 중에서 5 μM로 희석되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 50,000개의 HEK293T 세포를 함유하는 웰당, 50 pmol의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 절대량으로 형질감염되었다. 이를 위해, 5 μM 안티센스 올리고뉴클레오티드 용액의 10-㎕ 분획을 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 9.7㎕의 Opti-MEM 및 0.3㎕의 리포펙타민 RNAiMAX (Invitrogen)을 함유하는 10㎕의 지질 형질감염 시약 용액을 상기 웰에 첨가하였다. 혼합물 중의 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 2회 피펫팅한 후 플레이트를 탭핑함으로서 가볍게 혼합된 후, 실온에서 20분 동안 배양함으로서 형성되었다. 다음으로, 항생제 없는 100㎕의 완전 배지 용액 중의 50,000개의 HEK293T 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체에 첨가하고, 이를 37℃ 및 5% CO2에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 미니유전자 플라스미드로 형질감염시켰다. 이를 위해, 플라스미드 형질감염 혼합물은 Opti-MEM 중에 희석된 200ng의 플라스미드를 함유하는 5㎕을, 0.6㎕의 X-tremeGENE 9 DNA 형질감염 시약 용액(Roche)와 합침으로서 제조하였다. 플라스미드 형질감염 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양한 후, HEK293T 세포에 첨가하고, 이를 이후 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 형질감염의 24시간 후, 배지를 200㎕의 완전 배지로 갈아주었다. 형질감염 48시간 후에, RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 위해 세포를 용해시켰다.
형질감염 HepG2 야생-형 및 돌연변이 2F3 세포. 모든 시약은 제조사의 권고를 따라서 사용되었다. 세포는 15-20 분 동안 TrypLE와 함께 배양함으로서 현탁시켰고, 10% 열 불활성화된 소태아 혈청을 갖는 둘배코 변형 이글 배지 중에 밀리리터당 250000-500000 개의 세포로 희석하였다. RNAiMAX(Invitrogen) 및 Opti-MEM (Gibco)를 함유하는, 형질감염 배지 중의 50 pmol의 올리고뉴클레오티드를, 상기 배양 현탁액으로부터의 25000-50000 개의 세포와 합쳤다. RNA는 달리 기재된 바 없는 경우 형질감염 48 시간 이후에 수집되었다.
RNA 제조. RNA는 제조사의 권고에 따라서 싱글샷(SingleShot) 세포 용해 키트(Bio-Rad) 또는 RNeasy 전체 RNA 키트(QIAGEN)를 사용하여 제조하였고, 대안적으로 모든 세척시 500㎕의 부피 대신 단지 300㎕만을 사용했고, 모든 rpm 속도는 900 rpm, 1050 rpm이 사용된 것을 제외하고는, Direct-zol TM-96 MagBead RNA(Zymo Research)를 제조사의 권고에 따라서 사용하였다.
RT-PCR 분석. 제1-가닥 cDNA의 합성은 ImProm-II 역전사 시스템(Promega)에 의해 제조사의 권고를 따라서 변형이 최소화되도록 실시되었다. 50-300 ng의 정제된 RNA는, 1㎕ 올리고-dT-VN 프라이머(100 μM, )를 포함하는 96-웰 PCR 플레이트 내에서 5분 동안 70℃에서 등온 처리한 후, 5분 동안 4℃로 신속히 냉각시켰다. 20 단위의 ImProm-II 역전사효소, 반응 완충액, 4 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP(FroggaBio) 및 40 단위의 RNAse 저해제(Bioshop)를 함유하는 14.5-㎕의 역전사효소 혼합물을 RNA-올리고-dT-VN 반응에 첨가하고, 25℃에서 5분 동안, 60분 동안 42℃에서 등온 처리하고, 최종적으로 12℃로 냉각하였다. 표적-특이적인 스플라이싱 절편은 PCR에 의해 증폭하였다. HepG2 야생-형 및 돌연변이 2F3 세포 실험을 위한 PCR 프라이머는, (서열번호: 156) 및 (서열번호: 157)였다. 미니유전자 실험을 위한 PCR 프라이머는 (서열번호: 158) 및 (서열번호: 159)였다. PCR 반응은 총 부피 25㎕ 중 5㎕의 제1-가닥 cDNA 산물, 0.4 μM의 정방향 프라이머, 0.4 μM의 역방향 프라이머, 300 μM의 각각의 dNTP, 25 mM 트리신, 7.0% 글리세롤(m/v), 1.6% DMSO(m/v), 2 mM MgCl2, 85 mM NH4-아세테이트(pH8.7), 및 1 단위의 Taq DNA 중합효소(FroggaBio)를 함유한다. 절편은 터치다운 PCR 프로그램[120초 동안 95℃; 20초 동안 95℃, 30초 동안 68℃(1 사이클당 1℃ 감소), 및 60초 동안 72℃의 10 사이클; 및 이후 20초 동안 95℃, 30초 동안 58℃, 및 60초 동안 72℃의 30 사이클; 180초 동안 72℃]에 의해 증폭되었다.
모세관 전기영동. 샘플은 DNA 1K Hi 민감성 LabChip 및 관련 시약(GE)을 제조사의 권고를 따라서 사용하는 LabChip GX 터치 핵산 분석기(GE)를 사용하여 분석되었다.
웨스턴 블로팅. 세포를 생장시켜서, 상기와 같이 형질감염하였다. 48시간 후에, 배지를 제거하고, 세포를 DPBS로 헹구었다. 세포를 TrypLE(Gibco)로 현탁시키고, 펠렛화하였다. TrypLE를 제거하고, 1×HALT 프로테아제 저해제(Pierce Biotechnology)를 포함하는 150㎕의 얼음 냉각된 RIPA 완충액(SIGMA)을 웰에 첨가하였다. 용액을 10분 동안 얼음 상에 둔 후, 4℃에서 15000 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 새 튜브에 넣고, 펠렛은 폐기하였다. 단백질 정량화 키트(Pierce)를 사용하여, 단백질 농도를 결정하였다. 20 내지 30 ㎍의 용해물 단백질을 70℃에서 뉴페이지(Nupage) 완충액(Novex)과 함께 가열하여, 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 로딩하였다. 겔은 200V에서 ~40분 동안 1×MOPS 완충액(Novex) 중에서 전개되었다. 겔을 제거하고, 이를 90분 동안 350mA 정전류에서 얼음 상의 PVDF 멤브레인(GE)에 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼한 후, 멤브레인을 60분 실온에서 TBST-5% 밀크 중에서 블로킹시켰다. 블로킹 후, GAPDH(Abcam) 및 ATP7B(Abcam)에 대한 1차 항체를 TBSB-1% 밀크에 첨가하고, 4℃에서 밤새 냉장보관하였다. 이후, 멤브레인을 5분 동안 TBST로 5회 헹구었다. 홀스래디쉬 퍼록시다제(Cell signalling technology)가 접합된 2차 항체를 60분 동안 실온에서 용액에 첨가하였다. 이어서, 멤브레인을 TBST로 5분 동안 5회 헹구었다. 이미지는 GE AI600RGB 장치에 의해 기록하였다.
구리 민감성 에세이. 세포를 생장시켜, 상기에 기재된 바와 같이 형질감염하였다. 세포는 이후 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질감염되거나, 또는 대조군을 위해 형질감염되지 않았다. 형질감염 48시간 이후, CuCl2(Sigma)를 탈이온수 중에서 0.5M의 농도로 제조하였다. 이것은 10% 소태아 혈청이 보충된 DMEM 중에서 0.2 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1.0 mM, 및 1.25 mM의 최종 농도로 희석되었다. 이후, 배지 + CuCl2를 사용하는 배지 변화가 세포에 대해 실시되었다. 48시간 이후, 세포 생존성은 CellTiter-Fluor™ 세포 생존성 에세이(Promega)를 사용하여 Neo2 장비(Biotek)에 의해 판독하였다. 데이터를 그룹 내의 구리-불포함 치료에 대해 정규화하였다.
실시예
1:
ATP7B
엑손 6의
스플라이싱은
chr13:52535985:A:C
[
hg19
/b37]
변이체에서
붕괴되고
,
안티센스
올리고뉴클레오티드의 사용을 통하여 부분적으로 구제될 수 있다.
chr13:52535985:A:C [hg19/b37] (M645R) 변이체에서 엑손 6 스키핑을 확인하기 위하여, 엑손 5-7 및 상응하는 인트론, 5 및 6을 함유하는 야생형 및 미니유전자 함유 변이체가 제조되었다. 이후 미니유전자를 HEK293T 세포로 형질감염하여, M645R 변이체의 스플라이싱에 대한 영향을 평가하였다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 야생형 미니유전자는 윗쪽 밴드에 의해 나타나는 엑손 6 포함, 및 배제를 모두 나타내었다. 그러나, M645R 돌연변이는 엑손 6 포함을 나타내지 않았고, 이는 chr13:52535985:A:C [hg19/b37] 돌연변이가 엑손 6 스키핑을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 1a의 실험 결과는 반복 및 정량화되었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, chr13:52535985:A:C [hg19/b37] 돌연변이에 기인하여, 엑손 6 포함이 확고하게(야생형 및 M645R 미니유전자에 대해 각각 5.7% 및 1.3%의 표준 오차) 감소하였다.
M645R 변이체에서 엑손 6 포함을 촉진시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 평가하기 위하여, 상기 미니유전자는 서열번호: 3-34에 제시된 서열(표 1 참고)을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 공동-형질감염되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손 6 및 주변 인트론을 따라 배치되었다(tiled). 도 2a는 엑손 6 및 주변 인트론에 비교한, 표적화된 ASO의 위치를 나타낸다. 도 2b는 모세관 전기영동에 의해 측정된 RT-PCR 샘플을 나타낸다. 100 bp DNA 래더는 445 bp에서의 엑손 6 포함 밴드, 및 368 bp에서의 배제 밴드에 대한 크기 참고를 위해 나타내었다. 이들 결과를 정량화하여, 도 2c에 나타내었다. 도 2b 및 2c를 모두 관찰하면, 엑손 6을 둘러싼 인트론 부위를 표적화하면 야생형 및 M645R 변이체 미니유전자 모두의 엑손 6 포함을 유도한다는 것이 명백하다. 이들 관찰은 이들 부위 또는 "핫스팟"(서열번호: 1의 위치 54522-54593 및 54665-54718; chr13:52536038-52536109 및 chr13:52535966-52535913)을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 암시하는데, 예를 들어, 핫스팟 1에 대해서는 서열번호: 3-12, 그리고 핫스팟 2에 대해서는 서열번호: 28-34의 핵염기 서열에 상보적인 것들이, 엑손 6 스키핑과 관련된 윌슨병(예를 들어, M645R 돌연변이에 의해 유발된 윌슨병)의 치료에 특히 유용할 수 있다.
실시예
2:
ATP7B
엑손 6의 포함을 증가시키기 위한 표적 부위(
핫스팟
)의 특성화
M645R 변이체를 갖는 윌슨병 환자의 치료로서의 스플라이스-전환 올리고뉴클레오티드의 가능한 사용을 분석하기 위하여, 이 돌연변이를 갖는 간 세포주 HepG2인 2F3을 얻었다. 2F3 세포주는 하나의 대립 형질에는 M645R 변이체를, 그리고 다른 쪽에는 큰 플라스미드 삽입부를 포함한다. 이 삽입은 그 대립 형질이 기능성 단백질을 생성하지 못하게 하여, 복합 이형접합체와 유사한 상황을 만든다고 추정되며, 이는 윌슨병 환자에서 발견되는 것과 일관된다.
표 2에 나열된 올리고뉴클레오티드를 2F3 세포에 형질감염하였고, RT-PCR 산물은 모세관 전기영동을 사용하여 분석하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 상기-식별된 핫스팟에 혼성화하고, 추가적인 핫스팟에 대한 연구를 확장시키기 위해 고안되었다. 이후 엑손 6에 대한 스플라이싱 퍼센트(Percent Spliced in, PSI), 뿐만 아니라 불활성화된 대조군 안티센스 올리고뉴클레오티드(dPSI)에 비교된 스플라이싱 퍼센트의 변화도 계산하였다(표 2). 표 2에 나타나는 바와 같이, 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드는 음의 dPSI를 갖는데, 이는 의도된 효과와 반대인 엑손 6 배제(예를 들어, 서열번호: 115-118)가 증가했다는 것을 나타낸다. 엑손 6의 어느 한 쪽 인트론 부위에 표적화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 효과적이며, 양의 dPSI를 나타낸다.
높은 dPSI를 갖는 특정 올리고뉴클레오티드를 기준 게놈 chr13: 52535914-52536146[hg19/b37] (서열번호: 28-33, 47-51, 60, 61, 63-67, 76-81, 93-95, 120, 121, 130, 132, 133-137, 147, 및 150)에 대해 정렬하였다. 도 3에 나타나는 바와 같이, ATP7B M645R 돌연변이 내에 엑손 6 포함을 유도하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 결합을 위한 제3의 핫스팟은, 서열번호: 3-12(게놈 안티센스: 서열번호: 1의 위치 54522-54593; chr13:52536038-52536109) 및 서열번호: 28-34(게놈 안티센스: 서열번호: 1의 위치 54665-54718; chr13:52535913-52535966)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드 외에도, 서열번호: 119-124(게놈 안티센스: 서열번호: 1의 위치 54472-54516; chr13:52536115-52536159)에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 커버되는 영역을 포함하는(spanning) 것으로 발견되었다. 3개의 예시적인 코어 서열도 또한 이들 영역에서 식별되었다: 서열번호: 160(게놈 센스: TTATCTTTT; 게놈 안티센스: 서열번호: 1의 위치 54672-54680), 서열번호: 161(게놈 센스: GACTTAGATGA; 게놈 안티센스: 서열번호: 1의 위치 54691-54701), 및 서열번호: 162(게놈 센스: TTTCAGCTTTGGAAA; 게놈 안티센스: 위치 54492-54506).
실시예
4:
안티센스
올리고뉴클레오티드를 조절하는
스플라이스에
의한 2F3 세포의 치료는 단백질 수준 및 구리 허용성을 증가시킨다.
윌슨병의 잠재적인 치료로서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 엑손 6 포함의 효율성을 모델링하기 위해, 시험관내 구리 민감성 에세이를 사용하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, M645R 돌연변이는 2F3 세포에서 구리 허용성을 감소시키는데, 이는 ATP7B 돌연변이의 결과 구리를 처리하지 못하는 윌슨병을 반영한다(mirroring). 서열 번호 29에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질감염은, 2F3 세포에서 구리 허용성을 증가시켰으며, 이는 구리 민감성 표현형이 본원에 나타난 올리고뉴클레오티드에 의한 형질감염에 의해 적어도 부분적으로 구제되어, 엑손 6의 포함을 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다. ATP7B 단백질에 대한 웨스턴 블롯은 이들 결과와 일관되며, 이는 2F3 세포가 야생-형 HepG2 세포보다 현저히 적게 ATP7B 단백질을 생성하기 때문이다(도 4b). 서열 번호 29에 제시된 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질감염은, 부분적으로 이 표현형을 구제하고, 2F3 세포에서 ATP7B 단백질 수준을 증가시킨다. ATP7B 단백질 수준 및 기능에서의 이러한 증가는, 엑손 6의 포함을 증가시킨다고 알려진 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료가 시험관내 모델에서 윌슨병 표현형을 부분적으로 구제시킨다는 것을 입증한다.
다른
구현예
기재된 발명의 다양한 변형 및 변형은 본 발명의 범주 및 사상을 벗어나지 않고도 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다. 비록 본 발명이 특정 실험과 관련하여 기재되기는 했지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 실험에 지나치게 제한되어서는 안된다고 이해해야 할 것이다. 사실, 당업계의 숙련자들에게 명백한 본 발명을 실시하기 위해 개시된 모델의 다양한 변형들은, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Deep Genomics Incorporated
<120> OLIGONUCLEOTIDE THERAPY FOR WILSON DISEASE
<130> 51359-003WO2
<150> US 62/630,565
<151> 2018-02-14
<160> 170
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 85826
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cacaaaacca ctttttcctc ctgggcctcc aggcctgcca tgagagaggc tgccatgaag 60
gtctccgaca ttgcctggag acattttccc ccatggtctt caggattaac attaggctcc 120
ttgctacttt tgaaaatttc tgcagccagc ttgaatttct cctaaaaaaa tgggtctttc 180
ttttctactg cattgtcagg ctgcaaattt tctgaacttt tatgctctgt tccgctttta 240
aaatggaatg cttttaagag cacccaagtc acttcttgaa ttctttgctg cttagaaatt 300
tcttacacca gataccctaa atcatctctt tcaagttcaa agttccacaa atctctaggg 360
caggggcaaa atgcctctag tacctttgct aaaacataag aggagtcacc tttctccagt 420
tcccaacaag ttcttcatct ccatctgaga ccacctcagc ctggatttcg ttgtccatat 480
cactatccgc attttgttca aagccattca acaagtctct aggatgttcc aaactttccc 540
acattttcct ggcttcttct gagccctcca aactgttcca gcctctgcct gttgcccagt 600
tccaaagtcg cttccacatt tttgggtatc tcttcagcag caccccactc tactggtact 660
aatttatggt accaagttca ttttcacgct gctgataaag acatactcga aactgggaac 720
aaaaataggt ttaattggat ttacagttcc acatggctat gaggcctcag aatcatggcg 780
ggaggcataa ggcacttctt acatggtggc agcaagagaa aaatcagaaa gaagcaaaag 840
cagaaacccc tgataaaccc catcagatct cgtgaactta ctcactatca cgagaatagc 900
atgggaaaga ttggccccca tgattcaatt acctccccct ggatccctcc cacaacatgt 960
gggcattctg ggagataaaa ttcaacttga ggtttgggtg gggtcacggc caaaccatat 1020
cacatagttt tcactgccca catgaaaaca tacaaattca tcagaaaagt aaattttgct 1080
ttttttagat acagggtctc actctgtcac ccaggctgaa gtgcagtggt gcaatcatag 1140
caatcactgc agccccaaac tccttggctc aagcgatcct cctgcctcag actcctgaga 1200
agctggaact acaggtgcat gccaccacac ccagctaatt aaaaaaatgt tttttgtaga 1260
aatagggttt tgctatgttg cccaggctgg tctcaaactc ttggcctcaa gtaatcctcc 1320
tgccttggcc ttccaaagca ttgagattac aggcatgagc tgctgcacct ggccagaagt 1380
aaatatttta ttgatattta gttttgacat aaagttctca tgtgggattt cctattgtga 1440
acaaatcctc atttgttcct attgtgaaca aatctcatgt gggatttcct actgtgtact 1500
tgaagaggta tttgactcta tttgaaatcc cacatgagca ctttatttca aagctgaaat 1560
aattggtcta aaataatttg gtctttatat tctttataca cctttatact cttaaaaatt 1620
ttactgagga tacaatagag cttttgttta catcagagtt tctcatcctt gacactactg 1680
acattttgga ccaaataatt atttgttgcg gaggttgtcc tatgtattat atttagtagc 1740
atctttggtc ttgacccact tagatgccag tagcaccctc ccaatcaaaa ttatcagttg 1800
ggcatggtgg ctcatgcctg taatcccaac attttgggag gctgaggtgg gaggattgct 1860
tgagcccagg agttcaaggc tgtagtaagc tatgatcatg ccactgcact ccagcctggg 1920
caacagagca agactcttat ctctaaaaaa aaaattaaaa aaaaaaagcc ctccagatat 1980
tgccaaatgc caaatgtctt gcgaagggca aaaatcaccc ctggttgaga accagtggtt 2040
tacactgctt atatctacca atatttagca tattagaaat gaaaactaaa gaactttaaa 2100
ctttttatga attcatttga aaataaaaat tctttcataa cacattaaca tatttttatt 2160
aaaaaactat cttttccaaa ccaaaaaaag aaatttagca agaagggtgc caatgattta 2220
cactttttgc aaatcttttt aatgtctggc ttaacgtgaa accagatagt ggctcctcct 2280
ttctgtttct gcattcaatc tagtgatatg ttgtttttgt tgaagtatat gaagaaaatt 2340
caggctaact tagacatgta gtaggaaaag ggagtatatt ttaatatata ttgatcttat 2400
gtttaaaata tatttaactt ttcagctagt tacagatatt cttctctgat gctagaccac 2460
atttgacaag ttatgcagtt tcttaatgtc agttgcaata cagactctga aaccctatca 2520
atgacctttt cacactgtta attaaaatcc actatcactt agttttatcc gctatcactt 2580
ttgcacttat caacatagta aaataggcaa atattacatt aatgttatta taaaaacaga 2640
tttgttgagg atccattgaa gggccttggg acctgcatgg tccatggagc acaatttgag 2700
aaccactgcc ttaaaggatg aacagagtct gacaaaagtg gtaagattta tcatttattt 2760
aacatttgga atatatgaat tcataaaagc aacactacag aggacagttt gctttctcag 2820
gacactcttt caaaagctta tttaaaatgc agctgaccca tataatgtaa aggtttttct 2880
ggcaattcct tcaaataatt taggtgggaa aattcatgtg acaagctttt caaactgaac 2940
tattaaacat ttaacttaaa agctgcataa taactaaagt taaacctgtc ctttaagtct 3000
ggttagtgag tttatttaaa cattataatg taaagcactg aggaatatta cgtatgacag 3060
ggaagaacca aaaggctctg ataacagact ttctcattca aaatgtttaa agtaatgatt 3120
acagaatttg aagtagagtg gacaaaaacg aagaagaaat gcctgaactt ttgaaagaat 3180
taggtatata ctgctattca ggaagctatg gtgttaatta taaattttca gcctgaacaa 3240
aaatatgtag gtggtaaaaa aactaggtag gtagaatata ctaggccttc tgttttatta 3300
gtggagggca aggcatttaa aatacagtag tactacaaca acaaaggtgg aaaaaagcct 3360
gggagttttt tcaccaaaat gttaacagtg gctatctccg gatggtagca ttcctggggt 3420
tttttccttt tacttatcta ttttctaatt tttctagaag aaacagcata tacacgtaat 3480
acaaataaaa taatatttta tgtaacttct tacatcataa aaattaaagt aacagattat 3540
caaaaagcag aggattcaac ataagcttta tatttaagtg acgtgttaac aatggcagtt 3600
ttggtgagtt taagagtaga aactaagatg agaaggaaga tccggtttct tctttaccga 3660
aaagagacat gatagattgg aaaatgtctc gtggctcaat cgtaaagaaa aataaggaat 3720
gaatatgaat aatttatgac agactaactg gagtgtgaaa gggaaaaaaa aagctgaagc 3780
agggaaggga actcgacccc tcggccaaca gtgaagcaga agaaaacgcg gtaaattgag 3840
tctttaagac ctagtctatt ccagtctata tagaagaccc ccaagaaaaa gaaagactgc 3900
tcattggcct gagaaattac cttagattca tgacaaggaa ggccatttgc ccgcaaaatt 3960
tagctacact ggacgggcaa gtacccctac agaagagaaa acgtctgtga gcccacacga 4020
ccggctgctc acctcaacaa cttgcacagg caccagctcc tttcgccggc cgccatcttc 4080
cgccgacccc cgaactcagg aaacgcttca ctttcctttt ccctattggc tcctgagaaa 4140
gcaagccgtg ctcgccccgc ccccacgggc caattgtgcg ttactattgg ttactggtag 4200
ccgcttccca cggccttcca gccaatagaa tatgccgagg cgtagactag tgttcggcgt 4260
ggcgcacacg gctcccgccc ccgtgggcgg gacagcagtg gggggttggg ctgaggaggg 4320
cgtggcctgt gattgacagc cgtcgctccc tccctcggcc acctccccca ctagaagccc 4380
ccgcctgggc gcctgcgccc ccgttcccgg cccaaagccc gccgcccgtt ggaggccatt 4440
ggctggcctt tgcgcacagc ggatcgattt tccaggtgcg gagttcactc ttgccgcggt 4500
tgcttccttt gggacccacg gcgtccggca gccaggcgca gagtccgagg agggggcagc 4560
gcagagcgga cccgacgcgg cgccgccggg caccttcccc gcaggcggtg ggtgagccct 4620
gggagctgag tctgcggccc ggctctgcgc agctcacctg ccctcccgct cccgcacacg 4680
cgtgagatcc cagtacagtg tcggagcgca ccagcgcgag gtggccgaga ccgcggagga 4740
ggacaggcct ccgccctgcg gcgccggcac ggcagaggac attgtggcac tggcacggca 4800
gagaacactg tggcaccggc ggggccggca gttccagggt gggcactccc agccacctgg 4860
ggagtgggcg agggtccgag gcccactctc ccctcacgct ctcatccccg tgcccccagg 4920
tcgggaggac ggcggcgcgc aactttgaat catccgtgtg aagagggctg cggcttcccc 4980
ggtcccaaat gaaggggcgg ttcccggacc cctgtttgct ttagagccga gccgcgccga 5040
tgccctcaca ctctgcgcct cctctcccgg gactttaaca ccccgctctc ctccaccgac 5100
caggtgacct tttgctctga gccagatcag agaagaattc ggtgtccgtg cgggacgatg 5160
cctgagcagg agagacagat cacagccaga gaaggggcca gtcggaaagt gagttttgtt 5220
cccccgcgtc cgcgcagcgt gctcactccc accaggagga ttttcctccc cgcgttcggc 5280
gcttactcgc ccccaggggg tgcgcaggga aggccgagcc agaccccagc tccagggatg 5340
tcttggcgtg ggagaaaagg accctttaga aaaagtgtgc cgtcaactga tgtttgggag 5400
caatggaaaa ccccgcacct caaaattcat ctttatgctt ttaaggggtc tgatgctgga 5460
gagataaagt gagcgtcgag ttgctgtgct agagccctaa tggctcaaaa cgatgaagtt 5520
agttacctgg agaagttact cagagcctgg tgcttggacc agatatggta tatcgaggtc 5580
ctggaacttt tataactgtt ttaaattcat tttaattgta caagtaatac attaagacag 5640
tcttttaaaa atggaaacag cacagaaata ttttgcacaa aaagcagatc tatttttcag 5700
tctttttcta ttcacgtaca tatgtcttca ttcggcaaat atttattgag aactttctat 5760
gtttcaggca cacagtgttg agttgataca gtggttaaca agacatgtat ctatatgtaa 5820
tatgcacaca ttcagagaaa tctttaggtt tcatttgtat gaggtgttaa aatttttgtt 5880
ttacctaaat gagatcactg tatgtgcatt ctcttttttc agtttaacga tatatcttag 5940
agattgtttc actaactgtc taattcagtg caacctctgc acagtttgga cgcatcatag 6000
tttattcatg gtttcctagt ggtggacgtt ctgtttgcta ctttttttct ctctctcttg 6060
caagtgaaca tctttgtaca tgatttttaa tgctgacact atttctttag gatagatact 6120
taggcctgga ttgctggaca gaacagtagg ctgtttcttt tccacagatt tctgaaacta 6180
attcactgac gttgctgggt gccctttagt agtgaattca tctaggctcc ggtgatacag 6240
aaatgaaaac taacggatta gtggacagac agagagaggc tggttagtag gtggtttgta 6300
gggtatgatg actatgcatt tgataggagt atgaagaaat gttgggaggg gtggcttgta 6360
cagaggagat ttcaacttcc tacagtgtcc ccacctagag aaagaaatca ttatccttcc 6420
aaatcaagct caagacctgc cacctccttg aaacgttctg taactgctcc tgcccatgtt 6480
gacctgtctt ctggaatcct ctgataatag cgttgaccag cgttattgag cttactgtgt 6540
gctgggcatt gtgttaggca ctcatatccc tctatgtgca ctctcgcgtt taatcctcac 6600
aaaaaccctt tgatgtaggt attatatctt gttatcaaca tttattcaac aaattttttt 6660
gtgtgtacta tgtgctcaaa cacatagtac tcaaagtttt agacactggg gatttaggta 6720
ggaccgagac cttgccctca tgaatttaca tcctagttgg agataggaaa aaaaaaggga 6780
taaacaaatg tatagcgtag gagttaaggg aaaacttttg tgccccgtga agcgtcactg 6840
aaaaatcaac tgacaaatgg cagattaata ggagagaagg catacacatt tactaacgtg 6900
ccgtgagagt cttacaacat aagatctcaa aggaaggcaa ggtggttgcc acaattatac 6960
tatcctgagg ttacagaaag tgtgggggct ctaagcttgg ccaaaaacag gttatggttg 7020
taaatcaggt tataggaggg agagaagagg agacctggct agcaaaggtg gtcttatgta 7080
gatgaaacct cacaggtagc agccctcagg gagaagaaat gtttcagacc ttgaaggtgc 7140
caaattcagc taatctcacc cagatccaga caaggaaggg ccctctgaga aaaactggct 7200
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taggccctct gaacggccat ctcaaaatat ttccaataag tctgttttga ggtgaaatgt 7320
tttagtttcc ttcaatagct ttatttcagg tactagtaag tactatgaag aaaataaagc 7380
agtttgggtc caggagttca agaccagcct ggcagcatat caagacatcg tttatacaaa 7440
aaaaaaagaa aaattagctg ggcataatgg tgtgtgcctg tcgaaccagc tactcgggag 7500
gctgaggcag gaggatggct tgagcccagg agtttgaggc tacagtgagt tgtgatccca 7560
ccactgcact tcagcctgag tgataaagca agatcctgtc tcaaaaaaaa agaaaagaaa 7620
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taagtaggtg gtcagggaat gatttctctt ggaaggtagg atttgagtag agacctgaat 7740
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cagtcatgtg ataagaagaa atatatactt ggtcttgtcc caagttcctg acatagagct 7860
tcttaaaccg ttgtaatttc ctgagagatg gtgataagag catcttttgt tattcataac 7920
aagtctcttt cacccctacc tgagtttctg ttaatgagag ggctcttgat aggcccctag 7980
atagcttcag gatggagact gattgccaga agaaccaacc atgtgattag gggattcgaa 8040
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atcagtgatg ccggcagaat agagctttct ttaaattttt atttatttag ttttttgaga 8160
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gcgcacgcca ccacacccag ctaatttttg tatttttagt ggagacgggg tttcaccatg 8340
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gactttaccc tacaggaaaa cagcgtaagt cactcctgca aggcagaggg tgaactgggc 9900
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ggtggctgaa aagcctgaaa aagaactgta agttgggtct tctaccctta ttctttatgg 10020
aattgtcttc tcagtagaga aactaggcta tccaaactca actgtcctga gtattagagg 10080
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acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggct gaggtgggtg gatcacctga ggtcgggagt 76260
tcgagaccag tctgaccaac atggagaaac cccgtctcta ctaaaaataa aaaaattagc 76320
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cttgtcatta aaaagagagg ggtggggaaa aaggaggaag gtacttggtt aaaatatgca 60
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Claims (61)
- 엑손 6, 5'-측접 인트론, 3'-측접 인트론, 또는 엑손 6과 5'-측접 또는 3'-측접 인트론의 조합 내의 ATP7B 표적 서열에 대해 적어도 70% 상보적인 핵염기 서열을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 5'-측접 또는 3'-측접 인트론 내의 인트론 스플라이싱 사일렌서에 대한 스플라이싱 인자의 결합을 감소시키는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54672-54680 중에 위치하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54691-54701 중에 위치하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54492-54506 중에 위치하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54472-54516, 54522-54593 및 54665-54718 중에 위치하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 5'-측접 인트론 내의 서열에 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54517까지 중의 5'-측접 인트론 내에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 서열번호: 119, 120, 121, 122, 123, 또는 124에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 서열번호: 122에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54522 내지 54581 중의 5'-측접 인트론 내에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 5'-측접 인트론과 엑손 6의 조합 내에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54562 내지 54593 중의 5'-측접 인트론과 엑손 6의 조합 내에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 서열번호: 11에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 엑손 6, 또는 3'-측접 인트론과 엑손 6의 조합 내에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54631 내지 54677 중에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 서열번호: 22, 23, 24, 또는 25에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 3'-측접 인트론 내에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 ATP7B 표적 서열은 서열번호: 1의 위치 54655 내지 54738 중에 위치하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제5항, 제6항, 제19항, 또는 제20항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 뉴클레오티드는 서열번호: 1의 위치 54695 및 위치 54696 모두에 대해 상보적이지 않은, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 서열번호: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 또는 155에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 서열번호: 39, 48, 49, 50, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 100, 103, 104, 121, 및 149에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제9항, 제10항, 제12항, 제15항, 제18항, 제22항, 또는 제23항에 있어서, 상기 서열 동일성은 적어도 90%인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제24항에 있어서, 상기 서열 동일성은 100%인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 핵염기를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기(internucleoside linkage)를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제27항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기는 포스포로티오에이트 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제28항에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 연결기는 입체화학적으로 풍부한 포스포로티오에이트 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드 간의 연결기의 적어도 50%는 독립적으로 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제30항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드 간의 연결기의 적어도 70%는 독립적으로 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제31항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드 간의 연결기는 독립적으로 변형된 뉴클레오시드 간의 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 당 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제33항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 당 뉴클레오시드는 2'-변형된 당 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제34항에 있어서, 상기 적어도 하나의 2'-변형된 당 뉴클레오시드는 2'-플루오로, 2'-메톡시, 및 2'-메톡시에톡시로 이루어지는 군으로부터 선택된 2'-변형을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제35항에 있어서, 상기 2'-변형된 당 뉴클레오시드는 2'-메톡시에톡시 변형을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 당 뉴클레오시드는 가교 핵산인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제37항에 있어서, 상기 가교 핵산은 고정된 핵산(locked nucleic acid, LNA), 에틸렌-가교 핵산(ENA), 또는 cEt 핵산인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드는 독립적으로 변형된 당 뉴클레오시드인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모르폴리노 올리고머인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티를 추가로 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제41항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 공유적으로 접합되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제41항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 공유적으로 접합되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제41항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 간의 연결기에 공유적으로 접합되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 링커를 통해 공유적으로 접합되는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제45항에 있어서, 상기 링커는 절단가능한 링커인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제47항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 N-아세틸갈락토사민 클러스터인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개의 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제49항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 16개의 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 50개 이하의 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 30개 이하의 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 20개 이하의 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 16 내지 20 개의 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 16 내지 19 개의 뉴클레오시드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
- 비정상 ATP7B 유전자를 발현하는 세포에서 엑손 6-함유 ATP7B mRNA 분자의 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 세포는 대상체 내에 있는, 방법.
- 비정상 ATP7B 유전자를 갖는 대상체에서 윌슨병을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 치료 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 제56항의 약학적 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 투여하는 단계는 비경구적으로 수행되는, 방법.
- 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비정상 ATP7B 유전자는 서열번호: 1의 g.54646T>G 돌연변이를 갖는 ATP7B인, 방법.
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