JP4986816B2 - ウイルムス腫瘍遺伝子(wt1)に対する発現阻害物質を含んで成る固形腫瘍治療剤 - Google Patents
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Description
化1のX及びYがO、Zが水素又は水酸基であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは市販のDNA合成装置(例えばApplied Biosystems社製など)によって容易に合成される。
Xがアルキル基であるアルキルホスホネート修飾体は、常法、例えばホスホアミダイトを用いて得ることができる(M.A.Dorman, et.al., Tetrahedron, 40, 95-102 (1984);K.L.Agarwal and F.Riftina, Nucleic Acids Res., 6, 3009-3024 (1979)) 。
X, YがともにSであるホスホロジチオエート修飾体は、例えばビスアミダイトをチオアミダイトに変換しイオウを作用させることにより固相合成法により得ることができる(W.K.-D.Brill, et.al., J.Am.Chem.Soc., 111, 2321-2322 (1989))。
本発明のWT1に対する発現阻害物質は、genomic DNA からmatureなmRNAに至るいかなる段階においても作用し、その発現を抑制することによって固形腫瘍細胞の増殖を阻害すると考えられる。従って、本願発明の発現阻害物質は固形腫瘍の治療のために有効であると期待される。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法に従って調製することができる。
以下本発明を実施例において詳しく説明する。
以下に使用するオリゴデオキシリボヌクレオチド(配列番号:1〜8)およびランダム配列(Rand)を、自動合成装置(Applied Biosystems) を用いて合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、エタノール沈澱を3回行い、そしてリン酸緩衝液に懸濁した。
合成したオリゴヌクレオチドは次の通りである。なお、ランダム配列(Rand)は、塩基18個の配列で理論上4の18乗種類の配列の混合物となっている。
配列番号:2 転写キャッピング部位のアンチセンス配列(AS1)
配列番号:3 転写キャッピング部位のセンス配列
配列番号:4 転写キャッピング部位のアンチセンス配列
配列番号:5 翻訳開始領域のセンス配列(SE2)
配列番号:6 翻訳開始領域のアンチセンス配列(AS2)
配列番号:7 エクソン6のセンス配列
配列番号:8 エクソン6のアンチセンス配列
WT1発現陽性の胃癌AZ521株の細胞を5×104 個/ml、100μl/ウエルの量で、平底96−ウエルプレート内の、ウシ胎児血清(FCS)を含有しないRPMI1640培地に接種した。オリゴヌクレオチドAS1又は対照SE1もしくはrandを、3連のウエルに、最終濃度が100μg/mlとなるように添加した。2時間のインキュベーションの後、各ウエルに最終濃度が10%となるようにFCSを添加した。24時間毎に、前記の量の半分のオリゴヌクレオチドを培養物に添加した。
この結果を図1に示す。この図から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドAS1は、対応するセンスオリゴヌクレオチドSE1に比べて強く細胞の増殖を阻害した。
実施例1と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドAS1もしくはAS2、又はrandを200μg/ml濃度で添加した。図2から明らかな通り、ランダム配列(rand)は胃癌細胞の増殖をほとんど阻害しなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチドAS1及びAS2は胃癌細胞の増殖を阻害した。
実施例1と同様の実験を行ったが、オリゴヌクレオチドAS1もしくはAS2、又はrandを400μg/mlの濃度で添加した。図3から明らかな通り、ランダム配列(rand)に比べて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドAS1又はAS2は胃癌細胞の増殖を阻害した。
なお、実施例1〜3の結果から明らかなごとく本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの胃癌細胞増殖阻害効果は濃度依存的であった。
実施例1と同様の実験を行ったが、固形腫瘍細胞として肺癌OS3株の細胞を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドAS1もしくはAS2、又は対照ランダム配列(rand)を200μg/mlの量で用いた。図4から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドAS1及びAS2は対照ランダム配列(rand)に比べて強い肺癌細胞増殖阻害効果を示した。
実施例5と同様の実験を行ったが、アンチセンスオリゴヌクレオチドAS1を400μg/ml、又は対照としてSE1もしくはrandを400μg/ml使用した。図5から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドAS1はその他の対照オリゴヌクレオチドに比べて、肺癌細胞増殖阻害効果を示した。
なお、実施例4及び5の比較から、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの肺癌細胞増殖阻害効果が濃度依存的であることが明らかである。
実施例1と同様の実験を行ったが、固形腫瘍細胞として、卵巣癌TYKnu株の細胞を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドAS1を400μg/ml、又は対照オリゴヌクレオチドSE1もしくはrandを400μg/ml用いた。図6から明らかな通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドAS1は、その他の対照オリゴヌクレオチドに比べて顕著な卵巣癌細胞増殖阻害効果を示した。
実施例と同様の実験を行ったが、被験細胞として、WT1発現陰性の肺アデノカルシノーマ細胞系WTAS PC14を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドAS1もしくはAS2を400μg/ml又は対照オリゴヌクレオチドrandを400μg/ml用いた。図7から明らかな通り、WT1発現陰性の細胞に対しては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは有意な増殖阻害効果を示さなかった。
表2記載の各種の腫瘍細胞株からRNAを抽出し、下記のRT-PCR法を用いてWT1mRNAの発現量を定量した。表2に白血病細胞株K562におけるWT1の発現量を1.0として各種腫瘍細胞株でのWT1の発現量を相対的に示した。
各細胞株より通常の方法〔例えば acid-guanidine-phenol-chloroform method:Anal. Biochem., 162, 156 (1987)〕に従い総RNAを抽出し、ジエチルピロカーボネート処理水に溶解して、吸光度260nmにて光学的に定量化した。
PCRは、DNAサーマルサイクラー(Perkin Elmer-Cetus)にて、94℃、1分の変性、64℃、1分(βアクチン:60℃、1分)のプライマーアニーリング(annealing )及び、72℃、2分の鎖延長(chain elongation)の条件で繰り返しサイクルを行ない、PCR産物(第1ラウンドPCR)を得た。
該PCR産物のデンシトメーター単位(後記)が500未満の場合には、第1ラウンドPCR産物の2.5μlを含む反応液にて、ネステッド内方プライマーによる第2ラウンドPCRを行なった。
即ち、20ngの総RNAからのPCR産物を、0.05μg/mlのエチジュームブロマイドを含む1.3%アガロースゲルに分離し、ポラロイド(登録商標)フィルム(Polaroid 665 film, Polaroid Corp. )にて撮影した。
ネガフィルムを、25℃、5分間にて現像し、デンシトメーター(CS-9000 :島津)にて検定して「デンシトメーター単位」として得た。
尚、上記においてRNA不含の場合のPCR産物を用いた結果を陰性コントロールとした。
また、上記において使用したプライマーは表1に示す通りである。
RT−PCRへのRNA使用量と各サンプルにおけるRNA分解の相違を標準化するために、WT1遺伝子の結果(デンシトメーター単位)をβアクチンのそれで除し、これをWT1遺伝子発現レベルとした。
結果を表2に示す。
以上の通り、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは固形腫瘍細胞の増殖の阻害のために有効であり、従って新規な固形腫瘍治療剤として期待される。
Claims (4)
- 下記一般式:
Xは、独立して酸素(O)、イオウ(S)、メチル基又はエチル基あるいは一級アミンまたは二級アミンであり;
Yは、独立して酸素(O)またはイオウ(S)であり;
Zは、水素または水酸基であり;
Bの配列は、
Zが水素のとき、5′-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3′(配列番号:2)又は5′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3′(配列番号:6)であり、
Zが水酸基のとき、前記配列番号:2又は配列番号:6において、T(チミン)がU(ウラシルにより置き換えられており;
Rは、独立して水素またはジメトキシトリチル基あるいはメチル基又はエチル基であり;そして
nは16である]
により表わされる、ウイルムス腫瘍遺伝子(WT1)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体を含んで成る、胃癌、肺癌又は卵巣癌の治療剤。 - 前記Bの配列が、5′-AGGGTCGAATGCGGTGGG-3′(配列番号:2)から成る、請求項1又は2に記載の治療剤。
- 前記Bの配列が、5′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3′(配列番号:6)から成る、請求項1又は2に記載の治療剤。
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