JPH11501509A - t(14:18)転座を有する腫瘍細胞に関連するアンチセンス転写産物とこの腫瘍細胞の診断及び治療に有用なオリゴデオキシヌクレオチド - Google Patents
t(14:18)転座を有する腫瘍細胞に関連するアンチセンス転写産物とこの腫瘍細胞の診断及び治療に有用なオリゴデオキシヌクレオチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
t(14:18)転座細胞中のハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブリッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物。前記アンチセンス転写産物のすべての領域と相補的であるODNと診断又は治療目的へのその使用。
Description
【発明の詳細な説明】
或る種の腫瘍細胞に関連するアンチセンス転写産物とこの腫瘍細胞の診断
及び治療に有用なオリゴデオキシヌクレオチド
本発明は、或る種の腫瘍細胞において発現するアンチセンス転写産物とこの腫
瘍細胞の診断及び治療に有用な合成オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)に関
する。
さらに詳述すると本発明は、BCL−2タンパク質の過発現(overexpression)
を促進し、これにより悪性形質転換を生じる染色体転座t(14:18)を有す
るハイブリッド遺伝子のプレmRNA(未熟RNA)を相補する内因性アンチセ
ンス転写産物に関する。また、本発明は、前記転写産物の作用を阻害するオリゴ
デオキシヌクレオチドに関する。
合成オリゴデオキシヌクレオチドが短い一本鎖DNAであることはよく知られ
ている。ヌクレオチド配列は反映様式(アンチセンス)で配列して、阻害される
べきmRNA内のヌクレオチド配列を相補する。当該モダリティーにより、これ
らは特定の方向に遺伝子発現を調節することができる。
オリゴデオキシヌクレオチドは、標的mRNAを最適にハイブリッド形成する
のに適する長さを有することが重要である。一般的に、最小の長さは10塩基の
長さであり、最大の長さは約100塩基の長さである。好ましくは、この長さは
15〜30塩基の長さであり、さらに好ましくは18塩基の長さである。その理
由は、この長さを有する配列はすべてヒトゲノム内で独特であることが、統計的
分析により教示されているからである。
オリゴデオキシヌクレオチドは、mRNA代謝経路の種々の段階で、核レベル
又は細胞質レベルのいずれかで作用することができる。さらに、オリゴデオキシ
ヌクレオチドは、核とミトコンドリアとの双方中で、リボソームレベル又は直接
DNAレベルで作用する傾向がある。オリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチ
ド長さは、細胞膜の効率に関する当業者の基礎的知識の観点から選択できる(Loc
ke S.L.等:Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of
specific receptors? Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3474,1989、Yakubov L
.A.等:Characterization of oligonucleotide transport into living cells
.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6454,1989)。
また、特定の遺伝子内の別個の領域を両方向に転写できることも知られている
。さらに一般的に、二本鎖からの一本鎖(陽性)をmRNAに転写し、次にタン
パク質に翻訳する。しかし、若干の状況においては、陰性の鎖もまた転写し(内
因性アンチセンスRNA)、これが通常の転写の作用において調節作用を有する
ことがありうる。アンチセンス転写産物はメッセンジャーRNAの合成、成熟、
安定性及び翻訳を調節することができる(Green P.J.等:The role of antisen
se RNA in gene regulation.Ann.Rev.Biochem.55:569,1990、Krystal G.W
.等:N-myc mRNA forms RNA-RNA duplex with endogenous antisense transcrip
ts.Mol.Cell.Biol.10:4180,1990、Taylor E.R.等:Identification of a
ntisense transcripts of the chicken insuli-like growth factor-II gene.J
.Mol.Endocrinol.7: 145,1991)。
最後に、ほとんどの小胞状B細胞リンパ腫、t(14〜18)転座についての
陽性において、初期の事象により染色体18のbcl−2遺伝子の3’末端が短
縮され、これが染色体14のIgH遺伝子座の短縮された5’末端に接合され、
これによりBCL−2過発現の原因となるキメラ遺伝子bcl−2/IgHが発
生することもまた知られている(Nunez G.等:Deregulated bcl-2 gene express
ion selectively prolongs survival of growth facor-deprived haemopoietic
cell lines.J Immunol 144:3602,1990、Cleary M.L. 等:Cloning and stru
ctural analysis of cDNAs for Bcl-2 and a hybrid Bcl-2/immunoglobulin tra
nscript resulting from the t(14;18)translocation.Cell 47: 19,1986)。タ
ンパク質BCL−2は、若干の状況では計画された細胞死を阻害し、これにより
細胞生存の利点が提供されることが示されている。
bcl−2配列は知られている(Cleary M.L.等:Cloning and structural a
nalysis of cDNAs for Bcl-2 and a hybrid Bcl-2/immunoglobulin transcript
resulting from the t(14;18)translocation.Cell 47: 19,1986)。また、その
切断点(breakpoint)が主に3’UTRにあることも知られている。さらに特に
、染色体18の切断点の約60%がヌクレオチド2890とヌクレオチド320
0との間に生じており(主要切断点又はmbr; M.Kneba 等:Cancer Research 51
,3243-50,1991)、20%はmbr,mcrの約20Kb下流に位置する領域に
生じている(次位切断点領域)。
次に、IgH遺伝子座の配列もまた記載されており、その切断点は配列が知ら
れているJ領域の1つの内部に位置することが知られている(Ravetch J.V. 等
:Structure of the human immunoglobulin locus: Characterization of embry
onic and rearranged J and D genes.Cell 27: 583,1981)。
例えば、DOHH2細胞において、bcl−2遺伝子はヌクレオチド3110
において切断され、免疫グロブリンのリアレンジ遺伝子のセグメントJ6と接合
される(Kluin Nelemans H.C.等:A new non-Hodgkin's B-cell line(DOHH2)
with a chromosomal translocation t(14;18)(q32;q21).Leukemia 5: 221,199
1)。この転座に関連して、bcl−2の3’とDOHH2の独特であり特異的な
ヌクレオチド配列を示すセグメントJ6との間に、15個のヌクレオチド(領域
N)が挿入される(Nunez G.等:Deregulated bcl-2 gene expression selectiv
ely prolongs survival of growth factor-deprived haemopoietic cell lines.
J Immunol 144:3602,1990、Kluin Nelemans H.C.等:A new non-Hodgkin's B
-cell line(DOHH2)with a chromosomal translocation t(14;18)(q32;q21).L
eukemia 5: 221,1991)。
DOHH2−2のt(14〜18)転座の図式を図1に示す。図中、
A)はt(14〜18)に含まれる遺伝子の式であり、切断点を点線で示し、
B)はbcl−2/IgHハイブリッド遺伝子であり、
C)はN領域のヌクレオチド配列(CCC TGG TTC CCC GA)
である。
さらに、図1において、Eはエンハンサー領域を示す。この配列はEMBL Data
Library Accession 番号X54,712 中に蓄積されており、Sun Z 等により出版され
た("Sequencing of selected regions of the human immunoglobulin heavy-cha
in gene locus that completes the sequence from Jh through the delta cons
tant region.DNA sequence J DNA sequencing and mapping 1: 347,1991)。
DHL−4細胞系列では(Cleary M.L.等:Detection of a second t(14;18)
breakpoint cluster region in human follicular lymphomas.J Exp Med 164:3
15,1986、Cleary M.L.等:Nucleotide sequence of a t(14;18)chromosomalbr
eakpoint in follicular lymphoma amd demonstration of a breakpoint cluste
r region near a transcriptionally active locus on chromosome 18.Proc Na
tl Acad Sci USA 82:7439,1985)、bcl−2遺伝子はヌクレオチド2694で
切断され、免疫グロブリンのリアレンジ遺伝子のセグメントJ4に接合される。
転座に続いて、6個のヌクレオチド(領域N)がbcl−2の3’末端とJ4と
の間に挿入され、これらはDHL−4細胞系列のみに特異的な独特の配列を示す
。
図1にDHL−4のt(14〜18)転座の図式を示す。図中、
A)はt(14〜18)転座に含まれる遺伝子の式であり、切断点を点線で示
し、
B)はハイブリッドbcl−2/IgH遺伝子であり、
C)はN領域のヌクレオチド配列(CCG AGC)を有するDHL−4細胞
系列中のハイブリッドbcl−2/IgH遺伝子の式である。
K422の場合には(Dyer M.J.等:A new human B-cell non Hodgkin's lym
phoma cell line(Karpas 422)exhibiting both t(14;18)and t(4;11)chromoso
mal translocation.Blood 75: 709,1990)、bcl−2遺伝子はmbr内で切
断され、リアレンジIgHのセグメントJに接合される。
小胞状リンパ腫JNLにおいては(Cleary M.L.等:PNS 82: 7439,1985)、
bcl−2遺伝子はヌクレオチド3059において切断され、IgHのセグメン
トJ4に接合される。
DHL−6においては(Cleary M.L.等:Cell 41: 899,1985)、bcl−2
遺伝子はヌクレオチド3139において切断され、IgHリアレンジ中にセグメ
ントJ6に接合される。
t(14:18)陽性細胞系列の他の例は、Tsujimoto Y.,Science 229: 1390
,1985に記載されている。特に
FL 1032においてはbcl−2遺伝子はヌクレオチド3107において
切断され、18個のヌクレオチド(N領域、GTG CGT GGT TGA
TGG GGA)がbcl−2の3’末端とJ4(FL 1032に完全に特異
的な非反復配列)との間に挿入されてIgHのセグメントJ4に接合される。
FL 966においてはbcl−2遺伝子はヌクレオチド3110において切
断され、1個のヌクレオチド(N領域、C)がbcl−2の3’末端とJ4との
間に挿入されてIgHのセグメントJ4に接合される。
FL 1144においてはbcl−2遺伝子はヌクレオチド3157において
切断され、11個のヌクレオチド(N領域、CCC GAG TGA AG)が
bcl−2の3’末端とJ6(FL 1144に完全に特異的な非反復配列)と
の間に挿入されてIgHのセグメントJ6に接合される。
FL 1003においてはbcl−2遺伝子はヌクレオチド3046において
切断され、3個のヌクレオチド(N領域、CGA)がbcl−2の3’末端とJ6
(FL 1003に完全に特異的な非反復配列)との間に挿入されてIgHの
セグメントJ6に接合される。
ここで、本発明者等は、t(14:18)細胞系列中にハイブリッドbcl−
2/IgHアンチセンス転写産物を見出した。アンチセンスRNAはIgHのエ
ンハンサー領域中に発生し、t(14:18)融合部位を包含し、bcl−2R
NAの3’領域全体に亘り延在する。
転写されるが翻訳されないbcl−2遺伝子の3’末端領域は、不安定化因子
(ヌクレアーゼ)の部位に結合する配列AU及びAUUUAを多く含む(Caput D
.等:Identification of a common nucleotide sequence in the 3’untranslat
ed region of mRNA molecules specifying inflammatory mediators.Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 83: 1670,1986)。
キメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物をこの領域とハイブリッド形
成させるには、AUを多く含む要素を不安定化因子に対して遮蔽し、これにより
mRNAのレベルを上昇させる。
これによりBCL−2タンパク質発現のアップ・レギュレーションが発生し、
この結果、計画された細胞死(アポトーシス)を防止することにより悪性形質転
換が発生する。
実際に、ミトコンドリアの内膜中及び小胞体中に位置するBCL−2タンパク
質は、計画された細胞死を防止し、細胞生存の利点とその後の不死化/形質転換
を提供する(Zutter M.等:Immunolocalization of the Bcl-2 protein within h
ematopoietic neoplasms.Blood 78: 1062,1991、Jacobson M.D.等:Bcl-2blo
cks apoptosis in cells lacking mitochondria DNA.Nature 361: 365,1993)
。アポトーシスは、正常又は病気の双方の状態において極めて重要な役割を有し
、これには免疫系及び神経系の発達及び分化が含まれる(Cohen J.J.等:Apopto
sis and programmed cell death in immunity.Ann.Rev.Immunol.10: 267, 1
992、Garcia I.等:Prevention of programmed cell death of sympathetic n
eurons by the Bcl-2 proto-oncogene.Science 258: 302,1992)。近年の研究
により、BCL−2タンパク質を過剰生成する悪性細胞は抗腫瘍化合物に対する
耐性が比較的高いことが示された(Miyashita T.等:Bcl-2 oncoprotein blocks
chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line.Blood 81:
151,1993、Walton M.I.等:Constitutive expression of human Bcl-2 modula
tes nitrogen mustard and camptothecin induced apoptosis.Cancer Res 53:1
853,1993)。
本発明者によるt(14:18)陽性細胞により発現する未熟ハイブリッドm
RNAを相補する内因性アンチセンスbcl−2/IgH転写産物の発見は、こ
の配列が対応する未熟mRNAの配列から容易に導き出せるので、極めて重要で
ある。
次に、アンチセンスキメラ転写産物bcl−2/IgHの配列に関する知識に
より、当業者によく知られている従来の手法に従って、アンチセンス転写産物と
ハイブリッド形成することができ、これを不安定化することができ、これにより
BCL−2タンパク質の生成を阻害し、細胞死を発生させることができるODN
を設計し、合成することができる。
従って、本発明の第1の目的は、t(14:18)転座細胞中のハイブリッド
遺伝子のプレmRNAとハイブリッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチ
センス転写産物を提供することにある。
前述のアンチセンス転写産物の構造は、次式
3’A−N−B5’(図2)
(式中で
Aはハイブリッドbcl−2/IgHプレmRNA内のbcl−2の3’領域に
相補的なヌクレオチド配列であり、
Bは5’ハイブリッドプレmRNA bcl−2/IgHのJ及びE(エンハン
サー)領域に相補的なヌクレオチド配列であり、
Nはハイブリッドbcl−2/IgHプレmRNAのN領域に相補的なヌクレオ
チド配列である)
で表される。
本発明の第2の目的は、前述のキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産
物のすべての領域に相補的とするため、インビボでの活性を高めるように場合に
よっては変性させ、これによりその作用を阻害するセンス配向ODNを提供する
ことにある。
これらのODNは、各々の個別の細胞系列の特異なN領域に相補させることが
できる。
この場合、生成したセンス配向ODNは、各々の個別の細胞系列に特異なキメ
ラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物とのみハイブリッド形成する。
さらに、これらのODNは、キメラbcl−2/IgH RNAのJ領域又は
エンハンサー領域のいずれかに相補的であることができる。
DOHH2のN領域に配向するODNの代表例には、次の配列
が含まれる。
免疫グロブリン遺伝子座のJ6領域に配向するODNの代表例には、次の配列
が含まれる。
勿論、後者のODNの活性は、DOHH2細胞の未熟mRNAに限定されず、
すべての(14:18)転座細胞系列の未熟mRNAに作用する。
J6とエンハンサーとの間の領域(J6/E)と相補的なODNの代表例には、
次の配列
が含まれる。
これらのODNはDOHH−2細胞の未熟mRNAに作用するのみならず、す
べての(14:18)転座細胞系列の未熟mRNAにも作用する。
bcl−2の3’末端に配向するODNの代表例には、次の配列
が含まれる。
これらのODNはDOHH−2のキメラアンチセンス転写産物bcl−2/I
gHに作用するのみならず、bcl−2領域が前述のヌクレオチドを含むすべて
のt(14:18)陽性細胞系列のプレmRNA bcl−2/IgHにも作用
する。
DHL−4細胞の特異な融合領域(N領域)に配向するODNの代表例には、
次の配列
が含まれる。
本明細書及び本明細書に添付した請求の範囲において、「インビボ活性を高め
るために変性させる」は、細胞膜の交差(cross)を増大させ、及び/又はエンド
ヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼの攻撃に対するODN安定性を標的化合物
のハイブリッド形成能力に悪影響を与えることなく改善するための当業者に知ら
れている化学的変性を意味する(Uhlmann E.等:Antisense oligonucleotides:
a new therapeutic principle.Chemical Rev 90: 544,1990)。
ヌクレアーゼに対する安定性を高めることができる構造的変性の代表例には、
ホスフェート基に対して実施するものがある。例えば、メチルホスホネート、ホ
スホロアミデート、ホスホロトリエステル、ホスホロチオエート及びホスホロジ
チオエートがある。
膜交差を増大させる化学的変性の代表例には、通常メチレン架橋基により(5
’末端又は3’末端又はこれらの双方に)共有結合する親油性化合物、好ましく
はコレステロールを用いて実施するものがある。
本発明のODNは、当業者によく知られている方法、例えばNarang A.により
報告された方法(Tetrahedron 39: 3,1983)、Itakura K.により報告された方法
(Synthesis and use of synthetic oligonucleotides.Ann.Rev Biochem 53:
323,1984)又は“Oligonucleotides Synthesis; A Practical Approach",Gait
M.J.編、英国オックスフォード IRL Press,発行、1984)中に報告された方法
により、固相で容易に製造することができる。
所要に応じて、このようにして製造したODNを、例えば変性条件下でのポリ
アクリルアミド電気泳動(PAGE)、逆相又はイオン交換カラムでの高速液体
クロマトグラフィー(HPLC)及び毛細管クロマトグラフィー等の従来の手法
により精製することができる。
本発明のODNは、ヒトには、病気の激烈さ、体重、使用する特定のODN等
に依存する当業者によく知られているパラメータに従って選定される投与経路及
び投与量で施与する。
特に、本発明のODNは、顕著な有毒影響を伴わずに極めて特徴的な療法を可
能にし、これにより真に重要な目的、即ち関心のあるゲノム変化を伴わない細胞
に悪影響を与えずに十分明確な種類の癌を特定的に治療すると云う目的を達成す
ることができる。
然し、選定したODN次第では、アンチセンス転写産物の非個別的領域(N領
域外)に相補的なODNを用い、これにより1つのみ又は限定された数のODN
をすべてのt(14:18)腫瘍の治療に用いることができる。
本発明のODNは、現在の方法よりもはるかに良好な極めて鋭敏であり正確な
診断を可能にする診断目的に用いることもできる。
さらに、本発明のODNにより、進行中の治療処置の正確な監視が可能になる
。
以下に例を記載して本発明をさらに詳細に例示するが、これらの例はいかなる
場合でも本発明を限定するものではない。
例1 t(14:18)ヒト小胞状B細胞リンパ腫のアンチセンス転写産物同定
DOHH−2細胞から抽出した全RNAを2つの瓶に分割し、瓶Aについては
アンチセンス配向のプライマー(プライマーA:5’−GGT GAC CGT
GGT CCC TTG CCC CCA−3’、JH6のヌクレオチド297
3〜ヌクレオチド2998)を用いて、瓶Bについてはセンス配向のプライマー
(プライマーB:5’−GAC CTT GTT TCT TGA AGG T
TT CCT CGT CCC−3’、bcl−2 cDNAのヌクレオチド2
832〜ヌクレオチド2862)を用いて逆転写した。
t(14:18)陰性B細胞リンパ腫RajiとT細胞白血病JURKATを同一の手順
により処理した。
cDNAの製造は、プライマーBをプライマーAで逆転写した瓶Aに加えるこ
とにより、また、プライマーAを逆転写をプライマーBで行った瓶Bに加えるこ
とにより増幅された。
この増幅生成物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。
図3に示すように、DOHH2はゲル中で2つのバンドにより特徴がある。第
1のバンドは長さが約340bpであり(ライン4)、通常のbcl−2/Ig
Hセンス転写産物(プライマーA)に相当し、第2のバンドは長さが約250b
pであり(ライン7)、ハイブリッドアンチセンス転写産物(プライマーB)に
相当する。
Raji細胞(ライン5〜6)及びJurkat細胞(ライン6〜9)からは増幅生成物
は得られず、このことはt(14:18)陰性細胞系列が種々の染色体で関連す
るヌクレオチド配列を有していることを示す。
センス及びアンチセンス信号が汚染ゲノムDNAから得られなかったことを考
慮しないように、各RNA調製物のアリコートを逆転写前にRNA分解酵素で消
化した(ライン1〜3)。他のRNAのアリコートを無秩序6量体(RH)で逆
転写し、切断点の上流のbcl−2 mRNAに相補的なプライマーB及びC(
プライマーC:5’−GCA CCA CTG CAT TTC AGG AA
G ACC CTG AAG−3’、bcl−2 cDNAのヌクレオチド30
81〜ヌクレオチド3110)で増幅した(ライン10〜12)。
他の対照物として、β−アクチンRNAを3つの細胞系列から増幅した(プラ
イマーD:5’−GCG GGA AAT CGT CGG TGA CAT
T−3’、β−アクチンcDNAのヌクレオチド2104〜ヌクレオチド212
4とプライマーE:5’−GAT GGA GTT GAA GGT AGG
GGT TTC GTG−3’、β−アクチンcDNAのヌクレオチド2409
〜ヌクレオチド2435)(ライン13〜15)。
同一の実験手順を、共にbcl−2の3’UTR中に位置する2種のプライマ
ー(5’−GAC CTT GTT TCT TGA AGG TTT CCT
CGT CCC−3’、ヌクレオチド2832〜ヌクレオチド2862と5’
−GCA CCA CTG CAT TTC AGG AAG ACC CTG
AAG−3’、ヌクレオチド3081〜ヌクレオチド3110)を用いて繰り
返して、アンチセンス転写産物の発現がt(14:18)陽性細胞系列に限定さ
れることを確認した。
例2 ODNの製造
β−シアノエチルホスホロアミデートを固相で用いる化学的方法で、パーキン
−エルマーABI 392合成装置を用いて、ODNを製造した。
樹脂からの除去の直後に、オリゴデオキシヌクレオチドを30%アンモニアで
12時間、55℃で脱保護した。
ファーマシア バイオテク(Pharmacia Biotech)から入手したクロマトグラフ
ィーカラムNAP 25(セファデックスG25)を用いて精製した。
カラムNAP 25を4×5ミリリットルの20%エタノール緩衝液で平衡に
し、粗製ODNを20%エタノール緩衝液で溶出した。
溶出したフラクションを捕集し、濃厚液の分光蛍光測定(260nm及び28
0nm)の後に乾燥した。
この手順で、本発明の次のODN
次のプライマー
及び次の対照ODN
を製造した。
例3 t(14:18)ヒト小胞状B細胞リンパ腫に対するODNインビトロ活性
A)DOHH2A1)ODN生物活性
DOHH2を、10%FCS(胎児子牛血清)、抗生物質(ペニシリン及びス
トレプトマイシン)及びグルタミンを加えたRPMI中で培養維持し、95%の
湿度のCO2の湿潤雰囲気の下で37℃でインキュベートした。ODNでの処理
の前に、この細胞系列をHBSSで2回洗浄してFCSを完全に除去し、次に6
5℃にスコンプレメントした(scomplemented)FCSを含む完全なRPMI中で
再懸濁させて、ODNを劣化させるヌクレアーゼを除去した。細胞をウェル(9
6マイクロウェル平坦底)あたり104接種し、0日において10μM又は1μ
M、1日及び2日において半分の用量の次に記す本発明のODNで処理した。
第1群(DOHH2 bcl−2/IgH mRNAのN領域に相補的なODN
)
第2群(IgH mRNAのJ6又はJ6/E領域に相補的なODN)
第3群(bcl−2 mRNAの3’末端に相補的なODN)
さらに、DOHH2細胞を次の対照ODNで処理した。
BCL−2タンパク質合成の阻害を評価するのに、本発明のODNで処理した
細胞の形態と対照ODNで処理した細胞の形態とを顕微鏡で比較観察し(アポト
ーシス細胞は比較的小さい細胞容積と細胞質膜の典型的なバブリング(babbling)
を示した)、生細胞をトリパンブルー排除アッセイにより計数し、次に3H−チ
ミジン混合(3H−チミジン1mC/ミリリットル)を計数した。
未処理細胞と第1群、第2群及び第3群のODNで処理した細胞のセンス又は
アンチセンス配向の細胞計数及び3H−チミジン混合アッセイを表1に示す。こ
のアッセイを3回1組で実施し、データを5回の実験から標準化した。
これらのデータは、本発明のODNが細胞数又は細胞核中に含まれた放射能の
量を大幅に低下させることを示す。
本発明の同一のODNを、t(14;18)陰性細胞系列(K562,Jurkat,LCL
,Raji)及びN領域中に固有のヌクレオチド配列を示すt(14;18)陽性細
胞系列(DHL-4及びK422)に加えた。
本発明のODNはいずれも、t(14;18)陰性細胞系列において生物活性
を示さなかった。反対に、第2群及び第3群のODNは生物活性を示した。さら
に、DOHH2のN領域に相補的な第1群のODNは完全に不活性であった。A2)bcl−2 mRNAの決定
細胞を第1群、第2群及び第3群ODN並びに対照ODNに3日間10μM及
び1μMで曝して、細胞中に発現したハイブリッドbcl−2/IgH mRN
Aレベルを、Horikoshi T.等(Quantitation of Thymidylate Synthase,Dihydro
folate reductase and DT-diaphorAse gene expression in human tumors using
polymerase chain reaction.Cancer Res 52: 108,1992)により記載された方
法に従って、半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)により定
量した。
その後、全細胞RNAをRNAzol B方法(CINNA BIOTECX; 米国テキサス
州ヒューストン)により抽出し、DNA分解酵素及びプロテイナーゼKで処理し
、次にMo−MLV逆転写酵素(PROMEGA, 米国ウィスコンシン州マジソン)及
び無秩序6量体(RX)を用いてcDNAに逆転写した。このcDNAをPCR
により放射性ATP、アンプリタック ポリメラーゼ(AmpliTaq polymerase)(PE
RKIN-ELMER,米国コネクティカット州ノーウォーク)の存在下で、増大させた量
のcDNA及びGENOSIS、英国ケンブリッジから入手した次のプライマーβ2mA
、5’−AAC CCC ACT GAA AAA GAT GA−3’、β2
m遺伝子のヌクレオチド1544〜ヌクレオチド1563、β2mB、5’−A
TC TTC AAA CCT CCA TGA TG−3’、β2m遺伝子の
ヌクレオチド2253〜ヌクレオチド2262[Noonan K.E.等:Quantitative
analysis of MDRI(multidrug resistance)gene expression in human tumors b
y polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,87: 7160,1990]、
bcl−2/JH6A、5’−GGT GAC CGT GGT CCC TTG
CCC CCA G−3’、JH6のヌクレオチド2973〜ヌクレオチド29
97(Cleary M.L.等:Cloning and structural analysis of cDNAs for Bcl-2
and a hybrid Bcl-2/immuno globulin transcript resulting from the t(14;1
8)translocation.Cell 47: 19,1986)、
bcl−2/JH6B、5’−GCA ATT CCG CAT TTA ATT
CAT GGT ATT CAG GAT−3’、bcl−2遺伝子のヌクレ
オチド2866〜ヌクレオチド2898を用いて増幅させた。
30サイクルのPCRの後、増幅産物を定量するのに、非変性条件下で6%P
AGEから切り出し、シンチレーション液体に溶解したバンド中の放射能を測定
した。
また、試料を、1.5%アガロースゲル電気泳動により分析し、デンシトメト
リー(densitometry)により定量した。
ハイブリッドbcl−2/IgH RNAの量を計算するのに、内部標準β−
アクチン及びβ2ミクログロブリンと比較した。
かくて未処理対照の百分率として計算して得られたデータは、本発明のODN
が10μM及び1μMの双方の用量で、キメラmRNA含量を用量依存様式で低
下させたことを示す。対照ODNで処理した細胞は、ハイブリッドmRNAの含
量を変化させなかった。
さらに、bcl−2 mRNAを第3群のODNで処理した後、融合部位中の
固有のヌクレオチド配列を発現する他のt(14;18)陽性細胞系列(DOH
H−2、DHL−4及びK422)中で、且つt(14;18)に対して陰性の
K562細胞系列を用いて定量した。
3つのt(14:18)陽性細胞系列中で、mRNA量の顕著な低下が観察さ
れた。対照的に、K562細胞においてはmRNA量の変化は観察されなかった
。A3)タンパク質BCL−2測定
BCL−2タンパク質の量を、第1群、第2群及び第3群のODN並びに対照
ODNで処理した細胞試料について同様に評価した。
細胞中のBCL−2タンパク質を、フローサイトメトリー(Aiello A.等:Flow
cytometric detection of the mitochondrial BCL-2 protein in normal and n
eoplastic hunam lymphoid cells.Cytometry 13: 502,1992)により測定した。
特に、2%パラホルムアルデヒド中に固定したペレット化細胞を抗BCL−2
MoAb(Pezzella.F.等:Expression of the Bcl-2 oncogenic protein is
not specific for the t(14;18)chromosomal translocation.Am J Pathol 137
: 225,1990)で処理し負の対照物として正常マウス血清を用いて、自己蛍光発光
(autofluorescence)を検出した。細胞を、数回洗浄した後、アルゴンイオンレー
ザーを備えたEPICS−C装置(クールター エレクトロニクス、米国フロ
リダ州ハイアレア)を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
第1群、第2群及び第3群のODNで処理した細胞は、未処理細胞又は対照O
DNで処理した細胞の蛍光強度と比較してBCL−2タンパク質レベルが低下し
た。
本発明のODN又は対照ODNで処理したt(14;18)陰性腫瘍細胞系列
は、BCL−2タンパク質レベルが変化しなかった。
本発明のODNは、IgH遺伝子座中に発生しt(14;18)融合部位を含
み少なくともbcl−2 mRNAの完全な3’UTR領域に亘るアンチセンス
転写産物とハイブリッド形成し、これによりBCL−2タンパク質のアンチセン
ス転写産物過発現を阻害することができる。従って、bcl−2遺伝子の3’末
端の不安定化領域を陰性調節要素に曝すことができ、mRNAの不安定化により
BCL−2タンパク質のレベルを低下させる。
B)DHL−4B1)ODNの生物活性
第2群及び第3群の前述のODN、対応する対照ODN、DHL−4細胞系列
のN領域(図4)に相補的な次のODN
及び次の対照ODN
を用いた。
実験を例3のA1に記載したようにして実施した。
実験結果は、核レベルで作用する第2群のODNがDHL−4のキメラプレm
RNA中に存在するセグメントJ6とハイブリッド形成し、DHL−4の成長を
阻害することを示す。キメラmRNA内のbcl−2 mRNAセグメントの3
’末端を標的とする第3群のODNは、同様のDHL−4成長阻害を発生する。
第2群及び第3群のODNは、融合領域の特異なヌクレオチド配列とは無関係
なt(14;18)陽性細胞系列すべてに対して活性である、といえる。B2)タンパク質BCL−2測定
前述の例3のA3と同様の操作により、細胞中で発現したBCL−2タンパク
質の量の低下を生じた本発明のODNを、例3のA3と同様にして実施した。
従って、これらはすべてのt(14:18)陽性細胞系列のアンチセンス転写
産物領域すべてにおいて作用するので、本発明のODNはBCL−2タンパク質
の細胞内量を低下させ、アポトーシス細胞死を誘発する。
例4
アポトーシス測定
細胞DNA断片化は、細胞形態変化と共にアポトーシスの特異性である。
DOHH2、DHL−4及びK422細胞系列を前述の第2群及び第3群のO
DN並びに相応する対照ODNに曝した後、核DNA断片化をサイトフルオリメ
トリー(cytofluorimetry)(Delia D.等:N-(4-Hydroxyphenyl)retinamide induc
es apoptosis of malignant haemopoetic cell lines including those unres p
onsive to retinoic acid.Cancer Res.53:6036,1993)により評価した。
この方法は、蛍光化したデオキシウリジンをDNA断片化により生じた3’−
OH末端に結合させることに基づいている。この反応は酵素TdT(末端デスオ
キシトランスフェラーゼ(Terminal desoxytransferase))(Gavrieli Y. 等:Id
entification of programmed cell death in situ via specific labeling of n
uclear DNA fragmentation.J Cell Biol 119:493,1992)により触媒される。蛍
光化したヌクレオチドの混入は、フローサイトメトリーにより定量する。
処理済か又は未処理の細胞を、2%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し
、0.1Mトリス(pH7.2)で2回洗浄し、再びアセトン中で1分間固定し
、再び洗浄し、酵素TdT(BOERINGHER Mannheim)及び蛍光化UTPと共に1時
間37℃でインキュベートした。2回洗浄した後、細胞をフローサイトメーター
で分析した。
未処理又は対照ODNで処理した同一の細胞系列と比較して、すべてのt(1
4:18)陽性細胞系列で蛍光が強まったことが見出された。
従って、アンチセンス転写産物のすべての領域に相補的な本発明のODNは、
アンチセンス転写産物の作用を阻害することができ、t(14:18)陽性細胞
系列の死を誘発することができる。
例5 t(14:18)ヒト小胞状B細胞リンパ腫に対するODNのインビボ活性
まず、免疫不全マウス(SCID)におけるDOHH2リンパ腫の成長を研究
した。免疫不全は、染色体16における常染色体自然劣性突然変異であり、T及
びBリンパ球の双方のVDJ遺伝子座の正確なリアレンジを制御する組み替えシ
ステムの変化の原因となる。SCIDマウスはB及びT機能を失ったが、ナチュ
ラルキラー活性はアシアル糖タンパク質(asyal-glicoprotein)に対する抗体によ
り不活性化された。従って、これらのマウス系統ではヒト腫瘍の移植は成功した
。
これらのマウスにインビボ注入したDOHH2小胞状リンパ腫の取り込みを確
認した。次に、本発明のセンス配向ODN(ODN72)の治療活性を評価する
試験を開始した。
前述のリンパ腫を有する4匹のマウスを1日目から15日目まで、1mg/日
の前述のODNで処理した。
同一のリンパ腫を有する4匹の対照群を同様にして、相応するアンチセンス配
向ODN(ODN76)で処理した。
同一のリンパ腫を有する別の4匹の群を、生理的溶液で処理した(未処理対照
)。
前述のODN及び生理的溶液での処理は、各マウスの皮下に挿入し評価用化合
物を含む浸透圧マイクロポンプ(ALZET,Charles River)により実施した。このポ
ンプは1mg/日を全体又は15mg/マウスの量で放出した。
ODN72で処理したマウスの群では、平均生存時間の延長が達成された。
【手続補正書】
【提出日】1997年9月9日
【補正内容】
1.明細書第7頁第9〜11行「前述の〜作用を阻害する」を「請求の範囲3〜
9記載の、インビボでの活性を高めるように場合によっては変性させた」に補正
し、
同頁第13〜16行を削除し、
同頁第17行「さらに、」を削除する。
請求の範囲
1.t(14:18)転座細胞中のハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブ
リッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物。
2.次式
3’A−N−B5’
(式中で
Aはハイブリッドbcl−2/IgHプレmRNA内のbcl−2の3’領域
に相補的なヌクレオチド配列であり、
Bは5’ハイブリッドプレmRNA bcl−2/IgHのJ及びE(エンハ
ンサー)領域に相補的なヌクレオチド配列であり、
Nはハイブリッドbcl−2/IgHプレmRNAのN領域に相補的なヌクレ
オチド配列である)
で表される請求の範囲1記載のキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産
物。
3.ODNがアンチセンス転写産物のN領域と相補的でない場合には、t(14
:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブリッド形成す
るキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物のすべての領域に相補的とす
るため、インビボでの活性を高めるように、場合によっては変性させ、これによ
りその作用を阻害するODN。4
.前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6領域と相補的である請
求の範囲3記載のODN。5
.次の配列
を含む請求の範囲3又は4記載のODN。6
.前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6/E領域と相補的であ
る請求の範囲3記載のODN。7
.次の配列
を含む請求の範囲3又は6記載のODN。8
.前記アンチセンス転写産物内のbcl−2の3’末端と相補的である請求の
範囲3記載のODN。9
.次の配列
を含む請求の範囲3又は8記載のODN。10
.t(14:18)腫瘍を治療する薬理組成物において、
前記組成物が(a)ODNがアンチセンス転写産物のN領域と相補的でない 場合には、
インビボ活性を改善するため場合によっては変性することがあり、t
(14:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブリッド
形成し、これによりその作用を阻害するキメラbcl−2/IgHアンチセンス
転写産物のすべての領域と相補的な治療的に有効な用量のODNと、(b)少な
くとも薬理学的に受け入れられる担体とを含むことを特徴とする薬理組成物。11
.前記ODNが前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6領域と
相補的である請求の範囲10記載の薬理組成物。12
.前記ODNが次の配列
を含む請求の範囲10又は11記載の薬理組成物。13
.前記ODNが前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6/E領
域と相補的である請求の範囲10記載の薬理組成物。14
.前記ODNが次の配列
を含む請求の範囲10又は13記載の薬理組成物。15
.前記ODNが前記アンチセンス転写産物内のbcl−2の3’末端と相補
的である請求の範囲10記載の薬理組成物。16
.前記ODNが次の配列
を含む請求の範囲10又は15記載の薬理組成物。17
.t(14:18)転座に関連する腫瘍を従来方法により診断するのに用い
るための、ODNがアンチセンス転写産物のN領域と相補的でない場合にはt(
14:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブリッド形
成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物のすべての領域と相補的
なODN。18
.t(14:18)転座に関連する病状の治療処置の進行を従来技術により
監視するための、ODNがアンチセンス転写産物のN領域と相補的でない場合に は
t(14:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブリ
ッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物のすべての領域と
相補的なODNの使用。
【手続補正書】
【提出日】1998年1月20日
【補正内容】
1.明細書第1頁第2行〜第3行を「t(14:18)転座を有する腫瘍細胞に
関連するアンチセンス転写産物とこの腫瘍細胞の診断及び治療に有用なオリゴデ
オキシヌクレオチド」に補正する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AU,BB,BG,BR
,CA,CN,CZ,EE,GE,HU,IS,JP,
KP,KR,LK,LR,LT,LV,MG,MK,M
N,MX,NO,NZ,PL,RO,SG,SI,SK
,TR,TT,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 ニコリン アンジェロ
イタリア国 20123 ミラノ ヴィア ア
ンスペート 7
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.t(14:18)転座細胞中のハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブ リッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物。 2.次式 3’A−N−B5’ (式中で Aはハイブリッドbcl−2/IgHプレmRNA内のbcl−2の3’領域 に相補的なヌクレオチド配列であり、 Bは5’ハイブリッドプレmRNA bcl−2/IgHのJ及びE(エンハ ンサー)領域に相補的なヌクレオチド配列であり、 Nはハイブリッドbcl−2/IgHプレmRNAのN領域に相補的なヌクレ オチド配列である) で表される請求の範囲1記載のキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産 物。 3.t(14:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmRNAとハイブ リッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物のすべての領域 に相補的とするため、インビボでの活性を高めるように、場合によっては変性さ せ、これによりその作用を阻害するODN。 4.前記アンチセンス転写産物のN領域内の配列と相補的である請求の範囲3記 載のODN。 5.DOHH2の場合には、次の配列 が含まれ、DHL−4の場合には、次の配列 が含まれる請求の範囲3又は4記載のODN。 6.前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6領域と相補的である請 求の範囲3記載のODN。 7.次の配列 を含む請求の範囲3又は6記載のODN。 8.前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6/E領域と相補的であ る請求の範囲3記載のODN。 9.次の配列 を含む請求の範囲3又は8記載のODN。 10.前記アンチセンス転写産物内のbcl−2の3’末端と相補的である請求 の範囲3記載のODN。 11.次の配列 を含む請求の範囲3又は10記載のODN。 12.t(14:18)腫瘍を治療する薬理組成物において、 前記組成物が(a)インビボ活性を改善するため場合によっては変性するこ とがあり、t(14:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmRNAと ハイブリッド形成し、これによりその作用を阻害するキメラbcl−2/IgH アンチセンス転写産物のすべての領域と相補的な治療的に有効な用量のODNと 、少なくとも薬理学的に受け入れられる担体とを含むことを特徴とする薬理組成 物。 13.前記アンチセンス転写産物のN領域内の配列と相補的なODNを含む請求 の範囲12記載の薬理組成物。 14.DOHH2の場合には、次の配列 が含まれ、DHL−4の場合には、次の配列 が含まれる請求の範囲12又は13記載の薬理組成物。 15.前記ODNが前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6領域と 相補的である請求の範囲12記載の薬理組成物。 16.前記ODNが次の配列 を含む請求の範囲12又は15記載の薬理組成物。 17.前記ODNが前記アンチセンス転写産物内の免疫グロブリンのJ6/E領 域と相補的である請求の範囲12記載の薬理組成物。 18.前記ODNが次の配列 を含む請求の範囲12又は17記載の薬理組成物。 19.前記ODNが前記アンチセンス転写産物内のbcl−2の3’末端と相補 的である請求の範囲12記載の薬理組成物。 20.前記ODNが次の配列 を含む請求の範囲12又は19記載の薬理組成物。 21.t(14:18)転座に関連する腫瘍を従来方法により診断するのに用い るための、t(14:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmRNAと ハイブリッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物のすべて の領域と相補的なODN。 22.t(14:18)転座に関連する病状の治療処置の進行を従来技術により 監視するための、t(14:18)転座を有するハイブリッド遺伝子のプレmR NAとハイブリッド形成するキメラbcl−2/IgHアンチセンス転写産物の すべての領域と相補的なODNの使用。
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IT95MI000420A IT1275862B1 (it) | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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A762 | Written abandonment of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A762 Effective date: 20031117 |