KR20090065880A - 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 siRNA 구조 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 19~21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스 (antisense); 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15~19nt의 센스(sense);로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5'방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3'말단에 돌출부(overhang)를 갖는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 siRNA 분자 및 이를 이용한 목적 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 siRNA의 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과의 발생이나 외부 또는 내부 유래의 타 RNAi기작을 저해함 없이 우수한 목적 유전자 발현 억제 효율을 제공하는 새로운 구조의 siRNA 분자를 제공함으로써, 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 유전자 치료 등 siRNA를 기반으로 하는 유전자 발현 억제 기법에 널리 사용될 수 있다.
siRNA, RNAi, 유전자 발현 억제, RNAi 기구의 포화, 오프-타겟 효과

Description

오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지 않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도{Novel siRNA Structure for Minimizing Off-target Effects and Relaxing Saturation of RNAi Machinery and the Use Thereof}
본 발명은 신규한 siRNA 구조 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우수한 목적 유전자 발현 억제 효율을 보이면서, RNAi 기구를 포화시키지 않으며 siRNA의 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과를 최소화한 새로운 구조의 siRNA 분자 및 이를 이용한 목적 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interferance, 이하 「RNAi」라 칭한다)은 목적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스로 구성되는 이중가닥 RNA(이하, 「dsRNA」라 칭한다)를 세포 등에 도입하는 것에 의하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도하고 목적유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 이와 같이 RNAi는 목적유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 지루하고 비효율적인 상동재조합에 의한 유전자 파괴방법을 대신하는 간단한 유전자 넉다 운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다. 상기 RNAi는 처음에 선충(nematode)에서 발견되었지만 (Fire, A. et al ., Nature, 391:806, 1998), 현재는 식물, 선형동물, 초파리(Drosophila) 및 원생동물 등의 각종 생물에서도 관찰되고 있다 (Fire, A., Trends Genet ., 15:358, 1999; Sharp, P.A., Genes Dev ., 15:485, 2001; Hammond, S.M. et al ., Nature Rev . Genet., 2:110, 2001; Zamore, P.D., Nat . Struct . Biol ., 8:746, 2001). 이들 생물에서는 실제로 외래의 이중가닥 RNA(dsRNA)를 도입함으로써 목적유전자의 발현이 억제되는 것이 확인되었고, 나아가 이 기술은 넉다운 개체를 생산하는 방법으로 이용되고 있다.
한편, 포유동물 세포에서는 다른 생물과 비슷하게, 외래 dsRNA를 도입함으로써 RNAi의 유도가 시도되고 있다. 그러나, 이 경우, 도입된 dsRNA에 의하여 숙주가 가지고 있는 바이러스 감염 등에 대한 방어기작이 작동하여 단백질 합성이 저해되고 RNAi가 관찰되지 않았다. 그러나, Tuschl 등에 의하여 다른 생물에서 사용되는 긴 이중사슬 RNA 대신 단일사슬의 2 혹은 3 뉴클레오티드(nt)를 가지는 3′돌출(overhang) 말단을 갖는 전장 21 혹은 22 염기쌍(base pair, bp)의 짧은 dsRNA를 포유동물 세포에 도입함으로써 포유동물 세포에서도 RNAi를 유도할 수 있음이 보고되었다 (Elbashir, S.M. et al ., Nature, 411:494, 2001; Caplen, N.J. et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 98:9742, 2001).
또한, Tuschl 등은 안티센스 및 센스 가닥의 3'부에 2-nt의 돌출부를 가지며, 이중결합부위는 19 bp인 siRNA 분자의 구조를 RNAi 경로의 개시자라고 하였으 며, 블런트 말단의 siRNA 분자나 19 bp(base pair)보다 짧은 이중결합 부위를 갖는 siRNA 분자는 고농도로 테스트한 경우에도 효율이 낮았다고 보고하였다 (Elbashir et al ., EMBO J., 20:6877, 2001). 이에 19bp보다 긴 siRNA 분자에 대하여는 실험되어 왔음에 반하여, 상기 부정적인 논문 결과보고로 인하여 19bp보다 짧은 siRNA의 유전자 발현 억제(gene silencing) 효율에 대해서는 시험하지 않아 왔다.
한편, RNAi 분자에 의해 매개되는 유전자 발현 억제에 있어서 예상치 못했던 문제점들이 발견되었는데, 이는 외부에서 도입된 siRNA 분자의 경우 RNAi 기구(machinery)의 포화를 일으킨다는 것이었다. 이러한 포화는 siRNA 분자들간의 경쟁을 발생시키며, 이에 세포 내 miRNA의 효율 저하 및 2가지 이상의 siRNA 분자가 도입되는 경우 siRNA 억제 효율의 저하 발생의 문제가 발생하였다. 또한, 종래 siRNA 구조의 경우 안티센스 가닥이 아닌 센스 가닥이 작용할 수 있어 오프-타겟 효과(off-target effect)의 우려가 역시 상존하였다.
이에, 본 발명자들은 유전자 억제 효율이 높으면서도 외부 또는 내부에서 기인한 타 RNAi기작을 저해하지 않는 새로운 구조의 siRNA 분자를 제공하고자 예의 노력한 결과, 새로운 구조의 siRNA 분자를 제작한 다음, 이의 유전자 발현 억제 효과가 종래 알려진 구조의 siRNA 분자에 비하여 더 높거나 유사한 유전자 발현 억제효율을 보이며 외부 또는 내부 유래의 타 RNAi기작을 저해하지 않고 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과를 나타내지 않음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 RNAi 기구를 포화시키지 않아 siRNA간 경쟁에 따른 문제점을 해결할 수 있으며, siRNA 분자의 센스에 의한 오프-타겟 효과로 인한 문제점을 해결하면서도 목적 유전자의 발현 억제 효과가 우수한 신규한 구조의 siRNA 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 siRNA 분자를 이용하여 세포 내 목적 유전자의 발현을 억제시키는 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 19~21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스 (antisense); 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15~19nt의 센스(sense);로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5'방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3'말단에 돌출부(overhang)를 갖는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 siRNA 분자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스의 길이는 19nt이고, 상기 센스의 길이는 15~17nt이며, 상기 돌출부의 길이는 2~4nt인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA 분자는 화학적 또는 효소학적으로 합성된 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA 분자를 이용하여 세포 내 목적 유전자의 발현을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA 분자의 안티센스는 목적 유전자의 mRNA 서열에 상보적인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 siRNA의 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과의 발생이나 외부 또는 내부 유래의 타 RNAi기작을 저해함 없이 우수한 목적 유전자 발현 억제 효율을 제공하는 새로운 구조의 siRNA 분자 및 이를 이용한 목적 유전자 발현 억제 방법을 제공하는 효과가 있다.
이에 본 발명에 따른 siRNA 구조는 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 유전자 치료 등 siRNA를 기반으로 하는 유전자 발현 억제 기법에 널리 사용될 것으로 기대된다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
'siRNA'는 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA (dsRNA)이다.
'내인성 유전자(endogeneous gene)'란 세포에 대해 고유한 것으로 본래 세포에 내재되어 있는 유전자를 의미한다. 이에 대하여, '삽입유전자(transgene)'란 바 이러스, 세포 내 기생충 등 외인성 공급원에서 유래된 유전자 또는 재조합 수단이나 다른 물리적 수단에 의해 도입된 유전자를 말한다.
'유전자'란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 목적 유전자는 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호할 수 있다. "조절 단백질" 은 전사 인자, 열 충격 단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 목적 유전자는 바이러스 게놈에 내재된 것으로, 동물 유전자로 통합되거나 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다. 예컨대, 목적 유전자는 HIV 게놈상의 유전자일 수 있다. 이 경우, siRNA 분자는 포유동물 세포 내 HIV 유전자의 번역을 불활성화시키는 데 유용하다.
"뉴클레오티드(nucleotide, nt)"란 핵산의 기본단위로서, 19nt의 핵산이란 19개의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥의 핵산을 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, 19~21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스 (antisense); 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15~19nt의 센스(sense);로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5'방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3'말단에 돌출부(overhang)를 갖는 것을 특징으로 하는 것을 siRNA 분자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스의 길이는 19nt이고, 상기 센스의 길이는 15~17nt이며, 상기 돌출부의 길이는 2~4nt인 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 siRNA 구조는 소위 "17+2A", "16+3A" 및 "15+4A"구조를 포함하며, 각 그 구조는 이와 같다.
"17+2A"구조란, 19nt의 안티센스 및 이에 상보적인 서열을 갖는 17nt의 센스로 구성되는 이중가닥의 siRNA 분자로 안티센스의 5'방향의 말단이 블런트 말단이고, 안티센스의 3'말단에는 2nt의 돌출부를 갖는 구조를 의미한다.
또한, "16+3A"구조란, 19nt의 안티센스 및 이에 상보적인 서열을 갖는 16nt의 센스로 구성되는 이중가닥의 siRNA 분자로 안티센스의 5'방향의 말단이 블런트 말단이고, 안티센스의 3'말단에는 3nt의 돌출부를 갖는 구조를 의미한다.
마지막으로, "15+4A"구조란, 19nt의 안티센스 및 이에 상보적인 서열을 갖는 15nt의 센스로 구성되는 이중가닥의 siRNA 분자로 안티센스의 5'방향의 말단이 블런트 말단이고, 안티센스의 3'말단에는 4nt의 돌출부를 갖는 구조를 의미한다.
본 발명에 따른 siRNA 구조는 효율적으로 목적 유전자의 발현을 억제하면서도 RNAi 기구를 포화시키지 않는 효과가 있다. 또한, siRNA의 센스 가닥(sense strand)에 의한 오프-타겟 효과(Off-target effect)를 제거하는 효과가 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 센스의 길이는 15 nt이고, 상기 안티센스의 3'말단의 돌출부의 길이는 4nt인 구조임을 특징으로 할 수 있는데, 즉 15+4A구조를 말한다. 15+4A구조의 siRNA의 경우, 우수한 목적 유전자 억제 효율을 나타내면서도 siRNA간 경쟁을 거의 일으키지 않는 구조로서, siRNA에 의한 유전자 억제 시 부작용을 최소화한다. 즉, RNAi 기구를 포화시키지 않으며, 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과(off-target effect)를 최소화하는 구조이다.
본 발명에 있어서, 또한 바람직하게는 상기 센스의 길이는 16nt이고, 상기 안티센스의 3'돌출부의 길이는 3nt인 구조임을 특징으로 할 수 있는데, 즉 16+3A구조를 말한다. 16+3A구조의 siRNA의 경우도 우수한 목적 유전자 억제 효율을 나타내면서도 siRNA간 경쟁을 거의 일으키지 않으며, 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과(off-target effect)를 최소화한다.
한편, 본 발명의 siRNA 분자는 일반적으로 합성된 것일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 있어서, 상기 siRNA 분자는 화학적 또는 효소학적으로 합성된 것일 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 표준 재조합 기법에 의해 자연 발생적 유전자로부터 유도할 수 있으나, 이 경우 발현을 변화시킬 목적 유전자의 mRNA의 적어도 일부분과 뉴클레오티드 서열 수준에서 실질적으로 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, '실질적으로 상보적인'이란 합성된 siRNA의 안티센스 가닥의 서열이 목적 유전자의 mRNA에 대하여 약 80∼90% 이상, 보다 바람직하게는 약 90∼95% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95∼99% 이상 서열이 서로 상보적이거나 완전히 상보적으로 혼성화 될 수 있음을 의미한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 siRNA 분자를 이용하여 세포 내 목적 유전자의 발현을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA 분자의 안티센스는 목적 유전자의 mRNA 서열에 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 유전자는 내인성(endogeneous) 유전자이거나 삽입유전자(transgene)일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 목적 유전자로서 TIG3 , LaminA /C 및 Survivin 유전자만을 예시하였으나, 기타 다른 목적 유전자를 타겟으로 하여 siRNA 분자를 제조한 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1. siRNA 분자의 제조: TIG3 의 mRNA 를 타겟으로 하는 siRNA
몇몇 인간의 종양세포주에서 억제조절하는 것으로 알려진 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)인 TIG3 유전자의 mRNA를 타겟으로 하는 다양한 siRNA 구조 변이체를 하기 표 1과 같이 제조하였다.
<표 1> TIG3의 mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'-(dTdT)AUCUCUUGCGGACUCUGUC 서열번호 1 서열번호 2
(b) 19+0 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGACUCUGUC 서열번호 3 서열번호 4
(c) 17+0 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGAC 3'- AUCUCUUGCGGACUCUG 서열번호 5 서열번호 6
(d) 17+2A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGACUCUG 서열번호 3 서열번호 6
(e) 16+0 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGA 3'- AUCUCUUGCGGACUCU 서열번호 7 서열번호 8
(f) 16+3A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGACUCU 서열번호 3 서열번호 8
(g) 15+0 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAG 3'- AUCUCUUGCGGACUC 서열번호 9 서열번호 10
(h) 15+4A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGACUC 서열번호 3 서열번호 10
(i) 13+0 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUG 3'- AUCUCUUGCGGAC 서열번호 11 서열번호 12
(j) 13+6A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGAC 서열번호 3 서열번호 12
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 siRNA 구조인 "17+2A", "16+3A" 및 "15+4A"와 대비하여 간략히 표현하기 위하여, 표 1의 (a)와 같이 종래 가장 효율적인 유전자 억제 효과를 가지는 siRNA 분자의 구조로 알려진 19 염기쌍(base pair, bp)의 이중가닥에 각 2nt의 3'돌출부를 가지는 구조를 "19+2" 구조라 명명하였다.
또한, 표 1의 (b), (c), (e), (g) 및 (i)와 같이 모두 블런트 말단 이중가닥 RNA구조로서, 각각 19 bp, 17 bp, 16 bp, 15 bp 및 13 bp의 길이를 가지는 구조들을 각각 19+0구조, 17+0구조, 16+0구조, 15+0구조 및 13+0구조로 명명하였다.
또한, 유사하게 표 1의 (j)와 같이, 19nt의 안티센스 가닥 및 이에 상보적인 서열을 갖는 13nt의 센스가닥으로 구성되는 이중가닥의 siRNA 분자로 안티센스 가닥의 5'방향의 말단이 블런트 말단이고, 안티센스 가닥의 3'말단에는 6nt의 돌출부 를 갖는 구조를 13+6A구조라 명명하였다.
실시예 2. siRNA 의 유전자( TIG3 유전자) 억제 효율 분석 Ⅰ
상기 실시예 1에서 제조된 표 1의 구조의 siRNA들을 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 T98G 세포 (인간 글리오블라스토마 세포주 (a human glioblastoma cell line), ACTC CRL1690)에 도입하였다. siRNA의 농도는 각각 100nM, 10nM 및 1nM로 처리하였으며, TIG3 유전자의 억제 효율은 정량적인 리얼타임 역 전사 PCR (real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 종래 가장 효율적인 구조로 알려져 온 19+2 구조에 비해, 19+0, 17+0, 15+0 및 13+0의 블런트 말단의 이중 가닥 siRNA 처리군에서 TIG3 mRNA 수준이 높게 나타나, 19+2 구조에 비하여 TIG3 유전자의 억제 효과가 낮은 것으로 나타났다. 특히, 13+0구조의 경우 거의 억제 효과가 없는 것으로 나타났으며, 15+0 구조의 경우도 siRNA를 100nM과 10nM로 처리한 경우 40%까지 TIG3 mRNA 수준을 감소시켰으나, 1nM의 농도로 처리한 경우 억제효과가 매우 낮은 것으로 나타났다.
이에 반하여, 본 발명에 따른 17+2A구조 및 15+4A구조 siRNA의 경우, 이중가닥 부위가 19nt보다 짧음에도 불구하고, 가장 효율성이 큰 구조로 알려진 19+2구조 siRNA와 거의 유사한 TIG3 mRNA 수준이 관찰되었다. 그러나, 13+6A 구조에서는 mRNA 양의 감소의 폭이 적게 관찰되었다.
상기의 실험결과는 종전에 19nt보다 짧은 siRNA 구조는 유전자 억제 효과가 종래 알려진 19+2 구조에 비하여 유전자 억제 효율이 낮다고 알려진 것에 반하여, 이중가닥 부위가 17nt, 15nt로 짧음에도 불구하고 안티센스 가닥의 3'에 각각 2nt 및 4nt의 돌출부(overhang)를 가지고, 안티센스 가닥의 5' 쪽의 말단은 블런트 말단으로 구성하는 경우 유전자 억제 효율이 종래 가장 효율이 높은 것으로 알려진 19+2 구조와 거의 동일한 억제 효율을 보임을 의미한다. 다만, 13+6A구조에서는 유전자 억제 효율이 크지 않은 것으로 나타난바, 바람직한 siRNA구조는 17+2A, 16+3A 및 15+4A 구조인 것으로 판단되었다.
이하 타 mRNA를 타겟으로 더 실험을 수행하여 상기 실험결과가 TIG3 유전자에만 국한되는 결과가 아닌 지 살펴 보았다.
실시예 3. siRNA 의 유전자 ( LaminA /C 및 Survivin 유전자) 억제 효율 분석 Ⅱ
라민A/C(LaminA/C) 및 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA를 다음의 표 2 및 3에 나타난 바와 같이, 19+2구조, 19+0구조, 17+0구조, 17+2A구조, 15+4A구조로 준비하였다. 표 2는 라민A/C(LaminA/C) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자이고, 표 3은 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA를 나타낸다.
<표 2> 라민A/C(LaminA/C) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'-(dTdT)ACAAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 13 서열번호 14
(b) 19+0 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG 3'- ACAAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 15 서열번호 16
(c) 17+0 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCC 3'- ACAAGAAGACCUUCAGG 서열번호 17 서열번호 18
(d) 17+2A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG 3'- ACAAGAAGACCUUCAGG 서열번호 15 서열번호 18
(e) 15+4A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG 3'- ACAAGAAGACCUUCA 서열번호 15 서열번호 19
<표 3> 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT) 3'-(dTdT)ACUUUUACAACUAGAGGAA 서열번호 20 서열번호 21
(b) 19+0 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU 3'- ACUUUUACAACUAGAGGAA 서열번호 22 서열번호 23
(c) 17+0 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCC 3'- ACUUUUACAACUAGAGG 서열번호 24 서열번호 25
(d) 17+2A 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU 3'- ACUUUUACAACUAGAGG 서열번호 22 서열번호 25
(e) 15+4A 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU 3'- ACUUUUACAACUAGA 서열번호 22 서열번호 26
상기 제조된 siRNA를 100nM, 10nM 및 1nM의 농도로 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 HeLa cells(ACTC CCL-2)에 도입하고, 역시 정량적인 리얼타임 역전사 PCR (real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 mRNA 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 17+2A구조 siRNA는 LaminA/C 및 Survivin mRNA의 양을 테스트한 농도에서 모두 매우 효율적으로 감소시키는 것으로 관찰되었으며, 이는 19+2 구조보다도 더 효율이 좋은 것으로 나타났다. 15+4A구조 의 경우 100nM과 10nM에서는 19+2와 동일한 억제효율을 나타냈으며, 1nM에서는 19+2나 17+2A구조보다 약간 억제효율이 감소된 것으로 나타났다.
상기의 실험결과는 실시예 2와 같이, 다른 유전자를 타겟으로 siRNA를 제조한 경우에도 본 발명에 따른 17+2A 구조 및 15+4A구조가 19+2구조의 유전자 억제 효과와 거의 동일한 억제 효율을 가지는 것을 나타내는바, 본 발명에 따른 siRNA구조가 특정 유전자에만 국한되는 것이 아닌 일반적으로 적용될 수 있는 구조임을 알 수 있었다.
실시예 4. siRNA 의 유전자 억제 효율 분석 Ⅲ: 16+3A구조 실험
상기 실시예 2 및 3의 실험에 추가하여, TIG3, 라민A/C(LaminA/C) 및 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 16+3A구조의 siRNA 분자들에 대하여 1nM 및 10nM의 농도로 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하고, 각 mRNA의 수준을 측정하였다. 라민A/C(LaminA/C) 및 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 16+3A구조의 siRNA는 제조하였으며, 그 서열은 다음과 같다.
LaminA/C 16+3A구조 5' UGUUCUUCUGGAAGUCCAG (서열번호 15)
3' ACAAGAAGACCUUCAG (서열번호 27)
Survivin 16+3A구조 5' UGAAAAUGUUGAUCUCCUU (서열번호 22)
3' ACUUUUACAACUAGAG (서열번호 28)
그 결과, 도 3의 (a), (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, TIG3, 라민 A/C(LaminA/C) 및 서바이빈(Survivin) mRNA의 수준을 측정한 결과, 모두 16+3A 구조 siRNA를 도입시킨 경우, 19+2구조 또는 17+2A구조와 유사한 수준의 mRNA가 관찰되었다. 상기의 실험결과는 16+3A구조 siRNA의 경우, 15+4A구조보다 17+2A구조에 더 가깝게 유전자 억제 효율을 가짐을 제시한다.
실시예 5. siRNA 의 유전자 억제 효율 분석 Ⅳ: 안티센스의 길이가 21 nt 인 경우
상기 실험에 추가하여, TIG3, 라민A/C(LaminA/C) 및 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA의 구조를 안티센스의 길이가 21nt가 되도록 하여 준비하였다. 제조된 siRNA구조는 표 4 내지 6과 같다.
<표 4> TIG3의 mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'-(dTdT)AUCUCUUGCGGACUCUGUC 서열번호 1 서열번호 2
(b) 19+2A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- AUCUCUUGCGGACUCUGUC 서열번호 1 서열번호 4
(c) 17+4A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- AUCUCUUGCGGACUCUG 서열번호 1 서열번호 6
(d) 16+5A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- AUCUCUUGCGGACUCU 서열번호 1 서열번호 8
(e) 15+6A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- AUCUCUUGCGGACUC 서열번호 1 서열번호 10
(f) 14+7A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- AUCUCUUGCGGACU 서열번호 1 서열번호 29
(g) 13+8A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- AUCUCUUGCGGAC 서열번호 1 서열번호 12
<표 5> 라민A/C(LaminA/C) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'-(dTdT)ACAAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 13 서열번호 14
(b) 19+2A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'- ACAAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 13 서열번호 16
(c) 17+4A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'- ACAAGAAGACCUUCAGG 서열번호 13 서열번호 18
(d) 16+5A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'- ACAAGAAGACCUUCAG 서열번호 13 서열번호 27
(e) 15+6A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'- ACAAGAAGACCUUCA 서열번호 13 서열번호 19
<표 6> 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT) 3'-(dTdT)ACUUUUACAACUAGAGGAA 서열번호 20 서열번호 21
(b) 19+2A 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT) 3'- ACUUUUACAACUAGAGGAA 서열번호 20 서열번호 23
(c) 17+4A 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT) 3'- ACUUUUACAACUAGAGG 서열번호 20 서열번호 25
(d) 16+5A 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT) 3'- ACUUUUACAACUAGAG 서열번호 20 서열번호 28
(e) 15+6A 안티센스 센스 5'- UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT) 3'- ACUUUUACAACUAGA 서열번호 20 서열번호 26
상기 제조된 siRNA를 10nM 및 1nM의 농도로 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 HeLa cells(ACTC CCL-2)에 도입하고, 역시 정량적인 리얼타임 역전사 PCR (real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 mRNA 수준을 측정하였다.
먼저 표 4의 siRNA를 세포 내에 도입하여 측정한 결과, 도 4의 (a)에 나타난 바와 같이, TIG3 mRNA 수준을 측정한 결과, 19+2A구조, 17+4A구조, 16+5A구조 및 15+6A구조의 경우 10nM의 농도로 siRNA를 도입한 경우, 종래의 19+2구조와 거의 동 일한 억제효율을 나타냈으며 14+7A구조 및 13+8A구조에서 점차 억제효율이 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 1nM의 농도로 도입한 경우, 14+7A 및 13+8A구조로 가면서 역시 억제효율이 크게 감소하기 시작하였다.
상기의 실험결과는 siRNA분자의 안티센스의 길이를 21nt까지 확장시킨 경우에도 안티센스의 5'방향의 말단을 블런트 말단으로 구성시키고, 안티센스의 3'말단에 돌출부(overhang)를 갖도록 하는 경우 우수한 유전자 억제효율을 나타냄을 의미한다. 다만, 14+7A구조나 13+8A구조의 경우 억제효율이 감소하는 것으로 나타나므로, siRNA분자의 센스의 길이는 15~19nt로 하는 것이 바람직한 것으로 나타났다.
한편, 도 4의 (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, 라민A/C(LaminA/C) 및 서바이빈(Survivin) mRNA의 수준을 측정한 결과, 표 5의 siRNA를 세포 내에 도입한 경우 15+6A구조에서 유전자 억제효율이 감소하는 것으로 나타났으나 19+2A구조, 17+4A구조 및 16+5A구조에서 우수한 억제효율을 나타났다. 또한, 표 6의 siRNA를 세포 내에 도입한 경우 15+6A를 1nM의 농도로 처리한 경우에는 약간 유전자 억제효율을 감소하는 것으로 나타났으나, 15+6A구조의 siRNA를 10nM의 농도로 처리한 경우 및 19+2A구조, 17+4A구조 및 16+5A구조의 경우 유전자 억제효율이 종래의 19+2구조와 거의 동일한 것으로 나타났다.
상기의 실험결과는 상기 TIG3 유전자뿐만 아니라, 다른 유전자를 타겟으로 siRNA를 제조한 경우에도 본 발명에 따른 siRNA구조인 19+2A, 18+3A, 17+4A 및 16+5A의 구조가 종래의 19+2구조의 유전자 억제 효과와 거의 동일한 억제 효율을 가지는 것을 나타내는바, 본 발명에 따른 siRNA구조가 특정 유전자에만 국한되는 것이 아닌 일반적으로 적용될 수 있는 구조임을 의미한다.
실시예 6. 블런트 말단 및 돌출부의 방향성 Ⅰ
본 발명에 따른 siRNA 구조에서 블런트 말단 및 돌출부의 방향성이 유전자 억제 효율에 미치는 효과를 살펴보기 위하여, 표 7 및 표 8과 같은 구조의 siRNA분자들을 제조하여 실시예 2 (TIG3) 및 3(LaminA/C)과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
<표 7> TIG3의 mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- (dTdT)AUCUCUUGCGGACUCUGUC 서열번호 1 서열번호 2
(b) 15+4A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGACUC 서열번호 3 서열번호 10
(c) 15+4S 안티센스 센스 5'- GAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGACUCUGUC 서열번호 30 서열번호 4
<표 8> 라민A/C(LaminA/C) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스가닥 센스가닥 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'- (dTdT)ACAAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 13 서열번호 14
(b) 17+2A 안티센스가닥 센스가닥 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG 3'- ACAAGAAGACCUUCAGG 서열번호 13 서열번호 18
(c) 17+2S 안티센스가닥 센스가닥 5'- UUCUUCUGGAAGUCCAG 3'- ACAAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 31 서열번호 16
그 결과, 도 5의 (a)에 나타난 바와 같이, TIG mRNA를 타겟으로 하는 표 7의 siRNA 분자들의 도입 시 mRNA수준을 살펴보면, 표 7의 (b) 15+4A구조에 비하여 표 7의 (c) 15+4S구조의 경우 mRNA 수준이 매우 높게 나타남을 관찰할 수 있었다. 또한, 도 5의 (b)에 나타난 바와 같이, 라민 mRNA를 타겟으로 하는 표 8의 siRNA 분자들을 도입한 후 라민 mRNA의 수준을 관찰한 결과, 1nM의 농도로 siRNA 도입 시 17+2A구조에 비하여 17+2S구조의 mRNA 수준이 약간 더 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
상기의 실험결과는 본 발명에 따른 siRNA 구조와 달리 안티센스 가닥의 3'방향의 말단이 블런트 말단이고 안티센스 가닥이 15 내지 17nt이고 센스가닥이 19nt이 되도록 siRNA 구조를 구성시키는 경우 유전자 발현 억제 효율이 감소됨을 나타낸다. 즉, siRNA 구조에서 안티센스 가닥의 5'방향의 말단을 블런트 말단으로 하고 안티센스의 3'말단에 돌출부를 갖는 경우가 더 높은 유전자 발현 효율을 보임을 알 수 있었다. 다만, 이는 안티센스 가닥의 길이 변화에 따른 영향일 수 있으므로, 다음과 같은 실험을 더 수행하였다.
실시예 7. 블런트 말단 및 돌출부의 방향성 Ⅱ
표 9 및 표 10과 같은 구조의 siRNA분자들을 제조하여 실시예 3(LaminA/C) 및 실시예 2 (TIG3)와 동일한 방법으로 실험을 수행하고 mRNA수준을 측정하였다.
<표 9> 라민A/C(LaminA/C) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dTdT) 3'- (dTdT)ACAAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 13 서열번호 14
(b) 17+0 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCC 3'- ACAAGAAGACCUUCAGG 서열번호 17 서열번호 18
(c) 17+2A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG 3'- ACAAGAAGACCUUCAGG 서열번호 13 서열번호 18
(d) 17-2A 안티센스 센스 5'- UGUUCUUCUGGAAGUCCAG 3'- AAGAAGACCUUCAGGUC 서열번호 13 서열번호 32
<표 10> TIG3의 mRNA를 타겟으로 하는 siRNA 분자들
구조명 서열 서열번호
(a) 19+2 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG(dTdT) 3'- (dTdT)AUCUCUUGCGGACUCUGUC 서열번호 1 서열번호 2
(b) 15+0 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAG 3'- AUCUCUUGCGGACUC 서열번호 9 서열번호 10
(c) 15+4A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- AUCUCUUGCGGACUC 서열번호 3 서열번호 10
(d) 15-4A 안티센스 센스 5'- UAGAGAACGCCUGAGACAG 3'- CUUGCGGACUCUGUC 서열번호 3 서열번호 33
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 17+2A 및 17-2A구조를 서로 비교할 때, 모든 농도에서 17-2A 구조의 라민 mRNA 수준이 높게 나타났으며(도 6의 (a)), 15+4A 및 15-4A구조를 비교한 경우에도 15-4A 구조의 TIG3 mRNA 수준이 높게 나타났다(도 6의 (b)). 특히 15-4A구조의 경우 농도를 1nM로 처리한 경우 mRNA 수준은 매우 높게 나타났다.
상기의 실험결과는 안티센스 가닥의 5'방향의 말단이 블런트 말단이고 안티센스의 3'말단에 돌출부가 있는 경우, 종래 가장 효율적인 구조로 알려진 19+2 구조와 거의 동일한 유전자 발현 억제 효율을 나타내나, 안티센스 가닥의 3'방향의 말단이 블런트 말단이고 안티센스의 5'말단에 돌출부가 있는 경우에는 그 효율이 낮음을 나타낸다.
이러한 결과는 상기 실시예 6의 결과와 함께 siRNA구조의 블런트 말단과 돌출부의 방향성이 siRNA 구조의 효율에 영향을 줌을 의미한다.
실시예 8. RNAi 기구( machinery )의 saturation 분석 Ⅰ
실시예 1 및 3에서 제조한 siRNA들, 즉 TIG3 mRNA를 타겟으로 한 siRNA (이하 siTIG3이라 함), 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 한 siRNA (이하 siSurvivin) 및 라민A/C(LaminA/C) mRNA를 타겟으로 한 siRNA (이하 siLamin이라 함)들 중 19+2, 17+2A 및 15+4A 구조의 siRNA들을 각각 HeLa 세포에 CREB3 mRNA를 타겟으로 하는 또 다른 19+2 구조의 siRNA (이하 siCREB3이라 함)와 함께 도입시킨 후, mRNA 수준을 측정하였다. siRNA의 도입 및 mRNA의 양 측정은 상기 실시예 2 및 3과 동일하다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, siRNA들을 도입하지 않은 음성대조군과 비교하여 19+2 구조의 siCREB3을 처리한 양성대조군에서 CREB3 mRNA 수준이 약 20%까지 감소하는 것과 대비할 때, 19+2 구조의 siTIG3, siSurvivin 및 siLamin을 19+2구조의 siCREB3과 함께 도입한 경우 CREB3 mRNA의 수준은 음성대조군의 mRNA 수준과 비교할 때 각각 66%, 52% 및 42%로 관찰되었다.
이에 반하여, 17+2A 및 15+4A 구조의 siTIG3, siSurvivin 및 siLamin을 각각 19+2구조의 siCREB3과 함께 도입한 경우에는 음성대조군의 mRNA 수준과 비교할 때 모두 40%이하로 관찰되었다. 특히, 15+4A 구조의 siSurvivin 및 siLamin과 17+2A 구조의 siLamin의 경우 양성대조군에 비하여 거의 증가되지 않은 mRNA 수준을 보임을 관찰할 수 있었다.
상기의 실험 결과는 19+2구조의 siRNA들은 다른 siRNA와 함께 세포 내에 도입되는 경우 서로 경쟁하여 목적 유전자 억제 효과가 감소되나, 본 발명에 따른 siRNA 구조는 다른 siRNA의 억제 효과를 감소시키는 정도가 매우 낮음을 나타낸다. 즉, 본 발명에 따른 siRNA 구조는 다른 siRNA와 거의 경쟁하지 않으며 세포 내 RNAi 기구(machinery)를 포화시키지 않음을 알 수 있었다.
실시예 9. RNAi 기구( machinery )의 saturation 분석 Ⅱ
본 발명에 따른 siRNA구조들이 내부 miRNA(microRNA) 활성을 저해하지 않는지 살펴보기 위하여, 상기 실시예 7에서 사용한 siTIG3들에 대하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.
먼저 루시퍼라제 유전자 발현을 억제하는 miR-21 활성을 평가하기 위하여, 루시퍼라제 유전자(luciferase gene)의 3' 비번역부위에 miR-21 타겟 서열을 포함하는 루시퍼라제 리포터를 사용하였다. 이러한 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 세포 내에 도입시켰을 때, 루시퍼라제 활성은 miR-21 타겟 서열을 포함하지 않는 루시퍼라제 리포터 대조군을 도입한 세포에 의해 비해 상대적으로 매우 크게 감소한다.
이에 miR-21 결합부위를 가지는 pMIR-luc-based 반딧불이 루시퍼라제 리포터 플라스미드, 도입 효율의 표준화를 위한 pRL-SV40 Renilla 루시퍼라제 발현 벡터 및 10nM의 siRNA들(siTIG3)을 HeLa 세포에 도입하고 상대적으로 표준화된 루시퍼라제 활성(miR-21 타겟 부위 없는 리포터의 표준화된 루시퍼라제 활성에 대한 miR-21 타겟 부위를 가지는 리포터의 표준화된 루시퍼라제 활성의 비)을 측정하였다. 반딧불이 루시퍼라제 활성은 Renilla 루시퍼라제 활성에 의하여 표준화된다. 대조군(mock)은 siRNA 경쟁자를 도입하지 않고 pMIR-luc-based 반딧불이 루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 pRL-SV40 Renilla 루시퍼라제 발현 벡터만을 도입하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 19+2 구조의 siTIG3은 상대적인 루시퍼라제 활성 비가 0.15로 나타났으나, 17+2A 구조 및 15+4A 구조의 siTIG3의 경우 활성비가 0.1과 0.08로 0.12보다 낮은 것으로 나타났다.
상기의 실험결과는 외부에서 도입된 19+2 구조의 siRNA들이 miRNA에 의해 매개되는 루시퍼라제 유전자 발현 억제 활성을 저해하나, 17+2A 및 15+4A구조의 siRNA들은 miRNA에 의해 매개되는 루시퍼라제 유전자 발현 억제 활성의 저해하는 정도가 낮음을 의미한다. 특히, 15+4A 구조의 siRNA는 siRNA를 도입하지 않는 대조군에 비하여 근소하게 상대적 루시퍼라제 활성 비가 높게 나타나 내부 miRNA(microRNA) 활성을 저해하는 정도가 낮은 구조임이 증명되었다.
이러한 결과는 상기 실시예 8의 결과와 함께 본 발명에 따른 siRNA구조들이 세포 내 RNAi 기구를 거의 포화시키지 않음을 의미한다.
실시예 10. 오프 - 타겟 효과(o ff - taget effect ) 분석
본 발명에 따른 siRNA구조의 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과를 분석하기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다. 여기서 "오프-타겟 효과(Off-target effect)"란 본래 siRNA는 안티센스 가닥과 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 분해를 유도하여 해당 mRNA의 유전자 발현을 억제하는 효과를 얻기 위하여 사용하는 것임에 불구하고, siRNA의 센스 가닥에 의해 타 mRNA의 분해가 발생하게 되는 경우 센스 가닥에 의해 발생하는 이러한 예상치 못한 타 mRNA의 분해 내지 해당 유전자의 발현 억제 효과를 의미한다.
루시퍼라제(luciferase) 유전자를 포함하는 벡터(pMIR-REPORTTM-Luciferase, Ambion)를 2개의 군으로 나눈 후, 하나의 실험군(A)에는 루시퍼라제 유전자 뒤에 서열번호 34의 DNA 단편을 삽입하고, 다른 실험군(B)에는 서열번호 35의 DNA 단편을 삽입하여 벡터를 준비하고 시퀀싱(sequencing)을 통해 DNA의 삽입이 제대로 이루어짐을 확인하였다.
서열번호 34 5'-TGAAAATGTTGATCTCCTT
서열번호 35 5'-AAGGAGATCAACATTTTCA
실험군 A의 벡터를 도입한 HeLa 세포(ACTC CCL-2)에서는 도 9의 (a)와 같이, 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 siRNA(siSurvivin)의 센스 가닥과 상보적인 단편(서열번호 36)을 포함하는 mRNA(sense-target)가, 실험군 B의 벡터를 도입한 HeLa 세포에서는 도 9의 (b)와 같이, siSurvivin의 안티센스 가닥과 상보적인 단편(서열번호 37)을 포함하는 mRNA(antisense-target)가 발현되었다.
서열번호 36 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU-3'
서열번호 37 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
이에 상기 각 벡터 200ng을 HeLa 세포에 Lipofectamin 2000(Invitrogen)을 이용하여 19+2구조 및 16+3A구조의 siRNA들과 함께 도입하고, 도입 24시간 후에 Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega)을 사용하여 Victor3 plate reader (PerkinElmer)로 루시퍼라제 활성을 측정하여 센스와 안티센스의 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 19+2구조의 siSurvivin은 실험군 A 및 B 군 모두 루시퍼라제 활성이 모두 낮게 나타났으나, 16+3A구조의 경우에는 실험군 B에서 루시퍼라제 활성이 19+2구조와 같이 루시퍼라제 활성이 낮게 나타났으나, 실험군 A에서는 루시퍼라제 활성이 높게 나타났다. 이는 16+3A의 안티센스와 19+2의 안티센스의 루시퍼라제 활성 억제 효율은 거의 유사하지만 16+3A의 센스가 19+2의 센스보다 활성이 적음을 나타낸다.
상기의 결과는 종래의 19+2구조의 경우 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과가 발생하나, 본 발명에 따른 siRNA 구조인 16+3A구조의 경우 센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과가 발생하지 않음을 의미한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태 일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 TIG3 mRNA를 타겟으로 한 siRNA 도입 시 siRNA 분자들의 구조에 따른 TIG3 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다.
도 2는 라민(Lamin) 및 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 한 siRNA 도입 시 siRNA 분자들의 구조에 따른 각 mRNA의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 3은 TIG3, 라민(Lamin) 및 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는 16+3A구조의 siRNA분자의 유전자 억제 효율을 보여주는 그래프이다.
도 4는 TIG3, 라민(Lamin) 및 서바이빈(Survivin) mRNA를 타겟으로 하는, 안티센스의 길이가 21nt인 siRNA분자의 유전자 억제 효율을 보여주는 그래프이다.
도 5는 15+4A구조 및 17+2A구조와 대비하여, 15+4S구조 및 17+2S구조의 siRNA 도입 시 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다.
도 6은 17+2A구조 및 15+4A구조와 대비하여, 17-2A구조 및 15-4A구조의 siRNA 도입 시 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다.
도 7은 siCREB3과 함께 각각 siTIG, siSurvivin 및 siLamin 도입 시 siRNA구조에 따른 CREB3 mRNA의 수준을 보여주는 그래프이다.
도 8은 siTIG3 도입 시 siRNA 구조별 miR-21 타겟 부위 없는 리포터의 표준화된 루시퍼라제 활성에 대한 miR-21 타겟 부위를 가지는 리포터의 표준화된 루시퍼라제 활성의 비를 나타내는 그래프이다.
도 9는 오프-타겟 효과 실험 설계 시 센스-타겟 mRNA와 안티센스-타겟 mRNA의 예시도이다.
도 10은 오프-타겟 효과 실험에서 siRNA 구조별 siRNA의 센스 가닥에 의한 루시퍼라제 유전자 발현 억제 효과와 안티센스 가닥에 의한 루시퍼라제 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
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<212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 4 cugucucagg cguucucua 19 <210> 5 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 5 uagagaacgc cugagac 17 <210> 6 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 6 gucucaggcg uucucua 17 <210> 7 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 7 uagagaacgc cugaga 16 <210> 8 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 8 ucucaggcgu ucucua 16 <210> 9 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 9 uagagaacgc cugag 15 <210> 10 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 10 cucaggcguu cucua 15 <210> 11 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 11 uagagaacgc cug 13 <210> 12 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 12 caggcguucu cua 13 <210> 13 <211> 21 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <220> <223> molecule is combined RNA/DNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 13 uguucuucug gaaguccagt t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <220> <223> molecule is combined RNA/DNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucletides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 14 cuggacuucc agaagaacat t 21 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <400> 15 uguucuucug gaaguccag 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <400> 16 cuggacuucc agaagaaca 19 <210> 17 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <400> 17 uguucuucug gaagucc 17 <210> 18 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <400> 18 ggacuuccag aagaaca 17 <210> 19 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <400> 19 acuuccagaa gaaca 15 <210> 20 <211> 21 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for Survivin mRNA <220> <223> molecule is combined RNA/DNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> deoxyribonucleotides <400> 20 ugaaaauguu gaucuccuut t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for Survivin mRNA <220> <223> molecule is combined RNA/DNA <220> 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28 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for Survivin mRNA <400> 28 gagaucaaca uuuuca 16 <210> 29 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 29 ucaggcguuc ucua 14 <210> 30 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 30 gaacgccuga gacag 15 <210> 31 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <400> 31 uucuucugga aguccag 17 <210> 32 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for LaminA/C mRNA <400> 32 cuggacuucc agaagaa 17 <210> 33 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for TIG3 mRNA <400> 33 cugucucagg cguuc 15 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment that encodes sense-target of siSurvivin <400> 34 tgaaaatgtt gatctcctt 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment that encodes antisense-target of siSurvivin <400> 35 aaggagatca acattttca 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary fragment for siSurvivin sense strand <400> 36 ugaaaauguu gaucuccuu 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary fragment for siSurvivin antisense strand <400> 37 aaggagauca acauuuuca 19

Claims (6)

19~21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스 (antisense); 및
상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15~19nt의 센스(sense);
로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서,
상기 siRNA의 안티센스의 5'방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3'말단에 돌출부(overhang)를 갖는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 siRNA 분자.
제1항에 있어서,
상기 안티센스의 길이는 19nt이고, 상기 센스의 길이는 15~17nt이며, 상기 돌출부의 길이는 2~4nt인 것을 특징으로 하는 siRNA 분자.
제2항에 있어서,
상기 센스의 길이는 16nt이고, 상기 돌출부의 길이는 3nt인 것을 특징으로 하는 siRNA 분자.
제2항에 있어서,
상기 센스의 길이는 15nt이고, 상기 돌출부의 길이는 4nt인 것을 특징으로 하는 siRNA 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 siRNA 분자를 이용하여 세포 내 목적 유전자의 발현을 억제시키는 방법.
제5항에 있어서,
상기 siRNA 분자의 안티센스는 목적 유전자의 mRNA 서열에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
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