CN116096893A - 急性心肌梗死后左心室功能障碍的治疗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含化合物的组合物，相对于在不存在该化合物下在心脏细胞中观察到的表达，该化合物能够降低人或动物对象的所述心脏细胞中Yin Yang‑1(Yy1)基因的表达，其中该化合物是Yy1基因的RNA干扰(RNAi)，并且其中所述组合物用于治疗该对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中，并且其中在对象发作心肌梗死(AMI)后12小时至7天之间施用所述组合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地涉及急性心肌梗死后左心室功能障碍的治疗方法。
背景技术
对于患有急性心肌梗死(AMI)的患者，开通阻塞的冠状动脉是恢复氧气供应和限制缺血性心肌损伤的最佳策略。然而，基于直接血管成形术和/或纤维蛋白溶解剂的再灌注疗法仅在症状发作后最初12小时内实施才有效[1]。不幸的是，相当一部分患者没有及时地接受再灌注疗法，每延迟30分钟与一年的死亡风险相对增加7.5％相关[2]。将这种过高的死亡率解释为缺血持续时间是梗死面积的主要决定因素，梗死面积导致心脏功能和结构发生病理性变化。这些病理过程被称为不良心脏重塑并且包括收缩功能障碍、腔室扩张和心肌异常[3,4]。在短期和长期的随访中，这些过程的延长决定心力衰竭(HF)、室性心律失常和死亡的进展。因此，寻找最大程度减少AMI后不良心肌重塑和心脏并发症的新疗法是心血管医学中的优先事项。
可溶性肿瘤发生抑制因子2(sST2)是白细胞介素1受体家族的成员，也称为白细胞介素1受体样1(IL1RL1)[5]，具有两种主要的同种型：膜结合受体(ST2配体[ST2L])和可溶性ST2同种型(sST2)[4]。sST2是与病理性心脏过程相关的独特生物标志物[6,7]。特别是，在患有AMI的患者中，在短期(30天)且在长期随访中，sST2的循环浓度已经反复表明死亡以及由不良心肌重塑进展为心力衰竭的风险较高[8-13]。
白细胞介素33(IL-33)，通过与ST2L相互作用[14]，来触发心脏保护性抗重塑反应[7,15]，这与IκBα磷酸化的阻断以及NF-κB启动子活性的激活有关[16]。循环中升高浓度的sST2可以直接与IL-33结合并且作为诱饵受体，通过抑制IL-33与膜结合ST2L的结合，从而阻断IL-33的心脏保护作用；这种抑制导致心脏肥大、心肌纤维化和心室功能障碍[7,15]。几项实验研究已经表明，在心脏成纤维细胞和心肌细胞中IL-33和sST2的表达响应于心脏应激而增加。Weinberg等人在2002年确定ST2是响应于生物力学应激诱导程度最高的转录物，并且在经受周期性应变的新生儿心肌细胞中诱导出sST2和ST2L形式[10]。因此，使用心肌梗死模型，我们已经示出，4周后心肌sST2水平的升高与心脏重塑标志物(例如炎症标志物和纤维化标志物)呈正相关[17]。因此，已经建议将有利调节IL-33/ST2L通路作为一种治疗性选择[18]。
虽然我们知晓可溶性且膜形式的ST2是通过双重启动子的细胞特异性调节表达的[10]，但是尚不清楚与AMI后的特定sST2表达相关的分子元素。使用计算基因组学和生物力学应变下的新生儿心肌细胞，我们将Yin yang-1(Yy1)鉴定为与心脏sST2表达相关的转录因子[19]。在这项体外研究中，内源性Yy1表达的沉默导致sST2的表达和释放减少[19]。总而言之，这些发现支持这样的观点，即降低Yy1表达水平将是AMI后抗不良心脏重塑的有希望疗法。
本发明提供了改善AMI后心脏功能障碍和不良心肌重塑的新疗法。
参考文献
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附图说明
图1.-Yy1表达水平在LV梗死区域增加。(a)Yy1 mRNA水平；数据基于GAPDH mRNA水平归一化。(b)LV远端区域的Yy1 mRNA水平；数据基于GAPDH mRNA水平归一化。与假手术组比，**p<0.01，***p<0.001。ns：不显著。
图2.-siYy1疗法预防LV梗死区域中心脏Yy1转录因子的上调。(a)代表性方案的实验程序。(b)Yy1 mRNA水平；数据相对于GAPDH mRNA水平归一化。相对于它们各自的假手术组，***p<0.001；相对于AMI+siCtrl组，###p<0.001。siCtrl：干扰RNA对照；siYy1：针对Yy1转录因子的特异性干扰ARN；AMI：急性心肌梗死；ns：不显著；Yy1：Yin yang-1转录因子。
图3.-siYy1疗法改善AMI后的心脏功能。(a-f)超声心动图分别确定EF(a)、FS(b)、LVEdD(c)、LVEsD(d)、LVEdV(e)或LVEsV(f)。相对于它们各自的假手术组，*p<0.05,***p<0.001；相对于AMI+siCtrl组，###p<0.001。EF：射血分数；FS：缩短分数；LVEdD：左心室舒张末期内径；LVEsD：左心室收缩末期内径；LVEdV：左心室舒张末期容积；LVEsV：左心室收缩末期容积；其他缩写如上所示。
图4.-siYy1疗法改善心脏功能和AMI引起的心脏肥大。(a)心脏重量与胫骨长度之间的比率(HW/TL)作为心脏肥大的量度。(b,c)左心室组织中用于心脏重塑的标志物的实时PCR定量；Myh7/Myh6，编码β-肌球蛋白重链的mRNA与编码α-肌球蛋白重链的mRNA的比率。Nppa，心房利钠肽。(d)CM区域。ns：不显著；相对于它们各自的假手术组，***p<0.001。相对于AMI+siCtrl组，##p<0.01，###p<0.001。CM：心肌细胞。
图5.-siYy1疗法预防AMI后的心脏纤维化。(a-f)TGF-β、smad-2、smad-3、α-sma、col1a1和col3a1的mRNA水平；数据基于GAPDH mRNA水平归一化。(g)来自指定组的天狼星红和马松染色的心肌的代表性图像切片；比例尺：0.25cm。ns：不显著；相对于它们各自的假手术组，***p<0.001。相对于AMI+siCtrl组，###p<0.001。
图6.-siYy1疗法阻断AMI后的不良心脏炎症。(a-d)TNFα、IL-6、PTX3和CRP的mRNA水平；数据基于GAPDH mRNA水平归一化。ns：不显著；相对于它们各自的假手术组，***p<0.001；相对于AMI+siCtrl组，###p<0.001。TNF：肿瘤坏死因子；IL：白细胞介素；PTX：正五聚蛋白：CRP：C-反应蛋白。
图7.-siYy1疗法改善AMI后的心肌死亡。(a-c)MyO、H-FABP和BNP的mRNA水平；数据基于GAPDH mRNA水平归一化。相对于它们各自的假手术组，***p<0.001；相对于AMI+siCtrl组，###p<0.001。MyO：肌红蛋白；H-FABP：脂肪酸结合蛋白；BNP：脑利钠肽。
图8.-siYy1疗法调节IL-33/ST2L轴。(a-c)IL-33、ST2L和sST2的mRNA水平；数据相对于GAPDH mRNA水平归一化。相对于它们各自的对照，***p<0.001；相对于AMI+siCtrl组，###p<0.001。IL：白细胞介素；ST2L：膜受体ST2L；sST2：可溶性同种型ST2。
图9.时间依赖性策略的代表性实验设计。基于MI后siYy1启动的不同时间的研究设计。黑色箭表示假手术/MI程序。箭头表示处理的时间点。在MI后30分钟，将存活的动物随机分为两个全局组：MI组和假手术组。根据MI后siYy1疗法或siCtrl或DPBS的开始时间，将动物随机分配到不同的处理小组：1小时(＝S1h)、24小时(＝S24h)、3天(＝S3d)、7天(＝S7d)或14天(＝S14d)。每7天重复一次SiYy1疗法(6mg/kg，静脉内)，直至完成3个剂量。在MI后4周时处死S1h、S24h、S3d和S7d小组中的动物，而在MI后8周时处死S14d中的动物。
图10.无论开始时间是何时，SiYy1疗法诱导MI后的Yy1转录因子的下调。MI后4周(从S1h组至S7d组)或MI后8周(S14d组)LV梗死区域中的Yy1 mRNA水平。与假手术组相比，LV梗死心肌中的Yy1 mRNA水平在MI(MI-siYy1)存在时升高，并且在所有处理组(MI+siYy1)中通过siYy1疗法显著地降低(p<0.001，在所有情形下)。
图11.siYy1疗法预防MI后的心脏肥大。(a)经或未经siYy1处理的MI后4周(S1h至S7d)或8周(S14d)收获的心脏的代表性图像；比例尺：0.5cm。(b)心脏重量与体重的比率。(c)心肌细胞肥大的分子标志物(Myh7/Myh6和Nppa)的定量实时PCR分析。每次用2个复制品进行PCR。将所有定量数据报告为MI和假手术(MI-假手术)之间的变化的平均值±SEM。计算出的平均值是用于对每组中不同数量动物进行校正的边际平均值。进行对照，以根据每次开始来比较多个处理之间变化的差异(差异-对-差异)(学生t检验)。虚线(三角形)表示未经处理的MI，而实线(圆圈)表示用siYy1处理的MI。***p<0.001，**p<0.01和*p<0.05。缩写：BW：体重；DPBS：平衡盐溶液；HW：心脏重量；LW：左心室重量；Myh：肌球蛋白重链；Nppa：利钠肽A；ns：不显著；S1h…S14d：处理的开始；siCtrl：干扰RNA对照；siYy1：沉默Yy1的特异性干扰RNA组合物。其他缩写同前。在肉眼可见的心脏肥大(a)、HW/BW比率(b)方面，在前3天内开始的siYy1疗法预防MI诱导的心脏肥大。在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平(c)方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防MI诱导的心脏肥大。在第14天开始的siYy1疗法没有效果。
图12.通过超声心动图评估LV收缩功能障碍和LV扩张[0]，siYy1疗法预防MI后的不良LV重塑。沉默Yy1的基于RNA干扰的疗法预防MI后的心脏功能障碍。(a,b)MI后4周(从S1h组至S7d组)或MI后8周(S14d组)的假手术和MI手术小鼠的左心室射血分数(a)和左心室缩短分数(b)的超声心动图分析。(c,d)MI后4周(从S1h组至S7d组)或MI后8周(S14d组)的假手术和MI手术小鼠的左心室舒张末期内径(c)和左心室收缩末期内径(d)的超声心动图分析。(e,f)MI后4周(从S1h组至S7d组)或MI后8周(S14d组)的假手术和MI手术小鼠的左心室舒张末期容积(e)和左心室收缩末期容积(f)的超声心动图分析。所有定量数据报告为MI和假手术(MI-假手术)之间变化的平均值±SEM。计算出的平均值是用于对每组中不同数量动物进行校正的边际平均值。进行对照，以根据每次开始来比较多个处理之间变化的差异(差异-对-差异)(学生t检验)。虚线(三角形)表示未经处理的MI，而实线(圆圈)表示用siYy1处理的MI。***p<0.001，**p<0.01和*p<0.05。缩写：LVEdD：左心室舒张末期内径；LVEsD：左心室收缩末期内径；LVEdV：左心室舒张末期容积；LVEsV：左心室收缩末期容积；ml：毫升；mm：毫米。其他缩写同前。在显著降低LV射血分数(a)和缩短分数(b)方面，在前3天内开始的siYy1疗法预防LV收缩功能障碍。在降低LV舒张末期内径和收缩末期内径(c,d)以及LV舒张末期容积和收缩末期容积(e,f)的增加方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防LV扩大。在第14天开始的siYy1疗法没有效果。
图13.siYy1疗法预防MI后的纤维化。在显著降低天狼星红染色(a)(小图b中的代表性图像)以及显著降低不同纤维化相关标志物基因失调的水平(c-f)方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防梗死心肌的纤维化。(a)代表性显微照片(×20)，示出指定组中的天狼星红染色。图示出间质纤维化的定量分析。比例尺：100μm。(b-e)心脏纤维化的分子标志物(TGF-β,α-sma,Col1a1和Col3a1)的定量实时PCR分析。每次用两个重复品进行PCR。将所有定量数据报告为MI和假手术(MI-假手术)之间变化的平均值±SEM。计算出的平均值是用于对每组中不同数量动物进行校正的边际平均值。进行对照以根据每次开始来比较多个处理之间变化的差异(差异-对-差异)(学生t检验)。虚线(三角形)表示未经处理的MI，而实线(圆圈)表示用siYy1处理的MI。***p<0.001和*p<0.05。缩写：α-sma：α-平滑肌肌动蛋白；TGF-β：转化生长因子β；Col：胶原。其他缩写同前。在第14天开始的疗法没有效果。
图14.siYy1疗法预防MI后的心脏炎症。(a)代表性显微照片(×20)，示出指定组中的CD45染色。图示出CD45阳性的定量分析。比例尺：100μm。(b,c)心脏炎症的分子标志物(IL-6和TNFα)的定量实时PCR分析。每次用两个重复品进行PCR。将所有定量数据报告为MI和假手术(MI-假手术)之间变化的平均值±SEM。计算出的平均值是用于对每组中不同数量动物进行校正的边际平均值。进行对照以根据每次开始来比较多个处理之间变化的差异(差异-对-差异)(学生t检验)。虚线(三角形)表示未经处理的MI，而实线(圆圈)表示用siYy1处理的MI。***p<0.001。缩写：IL：白细胞介素；TNF：肿瘤坏死因子。其他缩写同前。在降低CD45阳性染色(a)(小图b中的代表性图像)和炎症相关特异性标志物(c-d)的水平方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防梗死心肌中的炎症。在第14天开始的疗法没有效果。
图15.siYy1疗法预防MI后的心肌死亡。(a)代表性显微照片(×20)，示出指定组中的活性半胱天冬酶3染色。图示出活性半胱天冬酶3的定量分析。比例尺：100μm。(b,c)心脏死亡的分子标志物(BNP和MyO)的定量实时PCR分析。每次用两个重复品进行PCR。将所有定量数据报告为MI和假手术(MI-假手术)之间变化的平均值±SEM。计算出的平均值是用于对每组中不同数量动物进行校正的边际平均值。进行对照以根据每次开始来比较多个处理之间变化的差异(差异-对-差异)(学生t检验)。虚线(三角形)表示未经处理的MI，而实线(圆圈)表示用siYy1处理的MI。***p<0.001。缩写：MyO：肌红蛋白；H-FABP：脂肪酸结合蛋白；BNP：脑利钠肽。其他缩写同前。在显著降低半胱天冬酶3蛋白水平(a)以及BNP和MyO的mRNA水平(c-d)增加方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防细胞死亡。
图16.siYy1疗法预防源自人iPs心肌细胞的拉伸诱导性肥大。(a)拉伸评估后CM中Yy1mRNA水平的量化。(b,c)心肌细胞肥大的分子标志物(Myh7/Myh6和Nppa)的定量实时PCR分析。每次用两个重复品进行PCR。将所有定量数据报告为平均值±SEM。与对照组(Scr)相比，***p<0.001；与Scr+PMA组相比，###p<0.001；通过双向ANOVA确定，然后进行Bonferroni事后检验。缩写：Scr：混杂序列(scramble)。其他缩写同前。
发明简述
本发明的最初的方面涉及一种组合物，该组合物包含化合物，相对于在不存在该化合物下在心脏细胞中观察到的表达，该化合物能够降低人或动物对象的所述心脏细胞中Yin Yang-1(Yy1)基因的表达，其中该化合物是Yy1基因的RNA干扰(RNAi)，并且其中所述组合物用于治疗该对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中，并且其中在对象发作心肌梗死(AMI)后12小时至7天之间施用所述组合物。
优选地，在该对象发作心肌梗死(AMI)后1天至7天之间施用所述组合物。
更优选地，在该对象发作心肌梗死(AMI)后12小时至3天之间施用所述组合物。更优选地，在该对象发作心肌梗死(AMI)后1天至3天之间施用所述组合物。
更优选地，在该对象发作心肌梗死(AMI)后3天至7天之间施用所述组合物。
在优选的实施方式中，当在该对象发作心肌梗死(AMI)后12小时至3天之间施用所述组合物或者在该对象发作心肌梗死(AMI)后1天至3天之间施用所述组合物时，通过预防、治疗、减轻或降低LV射血分数和/或LV缩短分数的损失和/或通过预防、治疗、减轻或降低MI诱导的心脏肥大，所述组合物用于治疗该对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中。
在优选的实施方式中，当在该对象发作心肌梗死(AMI)后1天至7天之间施用该组合物，或者在该对象发作心肌梗死(AMI)后3天至7天之间施用该组合物时，通过预防、治疗、减轻或降低LV扩大，所述组合物用于治疗该对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中。
在优选的实施方式中，Yy1基因的干扰RNA(RNAi)是选自由任意下列化合物组成的列表的siRNA：具有正义SEQ ID NO 1和反义SEQ ID NO 2的化合物1、具有正义SEQ ID NO 3和反义SEQ ID NO 4的化合物2、具有正义SEQ ID NO 5和反义SEQ ID NO 6的化合物3、具有正义SEQ ID NO 7和反义SEQ ID NO 8的化合物4、具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQ ID NO50的化合物5、具有正义SEQ ID NO 51和反义SEQ ID NO 52的化合物6、具有正义SEQ ID NO53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ ID NO 55和反义SEQ ID NO 56的化合物8。
在优选的实施方式中，通过静脉内施用该化合物。
在优选的实施方式中，该组合物是一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的siRNA或表达这些寡核苷酸的运载体(vector)和药学上可接受的载体(carrier)，该siRNA选自由任意下列化合物组成的列表：具有正义SEQ ID NO 1和反义SEQ ID NO 2的化合物1、具有正义SEQ ID NO 3和反义SEQ ID NO 4的化合物2、具有正义SEQ ID NO 5和反义SEQ ID NO 6的化合物3、具有正义SEQ ID NO 7和反义SEQ ID NO 8的化合物4、具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQ ID NO 50的化合物5、具有正义SEQ ID NO 51和反义SEQ ID NO52的化合物6、具有正义SEQ ID NO 53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ IDNO 55和反义SEQ ID NO 56的化合物8。
发明描述
本发明大体上涉及化合物，该化合物使内源性Yy1表达沉默，导致sST2的表达和释放减少，从而促进与IL-33/ST2L轴相关的心脏保护反应；特别涉及小干扰RNA(siRNA)，该小干扰RNA(siRNA)降低Yy1的表达水平，并且涉及在AMI后2小时至48小时向有此需要的对象施用这些siRNA，以预防或治疗不良的心肌重塑，特别是预防或治疗AMI后的心脏并发症，例如心肌纤维化、心脏炎症、心脏肥大和/或心脏功能损伤。总而言之，这些发现解决了如下技术问题：提供在AMI后两小时或更长时间的替代再灌注疗法的有效治疗。
此外，本发明大体上还提供在AMI后12小时至7天之间施用的在治疗左心室功能障碍的方法中的化合物，该化合物使内源性Yy1表达沉默，导致sST2的表达和释放减少，从而促进与IL-33/ST2L轴相关的心脏保护反应；特别是降低Yy1表达水平的小干扰RNA(siRNA)，其量有效地下调内源性Yy1在细胞中的表达。特别地，在AMI后前3天内开始以治疗或预防AMI诱导的心脏肥大、优选在肉眼可见的心脏肥大方面的治疗方法中。优选地，在前7天内开始以治疗或预防AMI诱导的心脏肥大、优选在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平方面的治疗方法中。优选地，在前3天内开始以在显著降低LV射血分数和/或缩短分数下降方面来治疗或预防LV收缩功能障碍的治疗方法中。优选地，在AMI后前7天内开始以治疗或预防LV扩大、优选地降低LV舒张末期内径和收缩末期内径和/或LV舒张末期容积和收缩末期容积的增加方面的治疗方法中。
在本文中注意到，Yy1(Yin Yang-1)是由Yy1基因编码的人转录抑制蛋白(Shi Yet al.,Cell.1991Oct 18；67(2)：377-88；Zhu W et al.,Mamm Genome.1994Apr；5(4)：234-6)。
更优选地，本发明涉及相对于在不存在该化合物下在心脏细胞中观察到的表达，下调人或动物对象的所述心脏细胞中内源性Yy1的表达的化合物，例如siRNA，优选如下列出的那些：具有正义SEQ ID NO 1和反义SEQ ID NO 2的化合物1、具有正义SEQ ID NO 3和反义SEQ ID NO 4的化合物2、具有正义SEQ ID NO 5和反义SEQ ID NO 6的化合物3、具有正义SEQ ID NO 7和反义SEQ ID NO 8的化合物4、具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQ ID NO50的化合物5、具有正义SEQ ID NO 51和反义SEQ ID NO 52的化合物6、具有正义SEQ ID NO53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ ID NO 55和反义SEQ ID NO 56的化合物8；并且涉及这些化合物在预防或治疗AMI后的不良心肌重塑中的用途，特别是在预防或治疗AMI后的心脏并发症，如心肌纤维化、心脏炎症、心脏肥大和/或心脏功能损伤中的用途，其中在AMI发作后2小时至48小时向有此需要的对象施用这些化合物。优选地，在AMI后4小时至48小时之间施用此类化合物。更优选地，在AMI后6小时至48小时之间。还更优选地，在AMI后12小时至48小时或24小时至48小时之间。还更优选地，在AMI后2小时、4小时、6小时或12小时至24小时之间。
此外，本发明涉及上述化合物在左心室功能障碍的疗法中的用途，在AMI后12小时至7天之间、优选在AMI后1天至7天之间施用该化合物。特别地，在AMI后前3天内、优选12小时至3天之间、更优选1天至3天之间开始以治疗或预防AMI诱导的心脏肥大、优选在肉眼可见的心脏肥大方面的治疗方法中。优选地，在前7天内、优选12小时至7天之间、更优选1天至7天之间开始以治疗或预防AMI诱导的心脏肥大、优选在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平方面的治疗方法中。优选地，在前3天内、优选12小时至3天之间、更优选1天至3天之间开始以在显著降低LV射血分数和/或缩短分数下降方面来治疗或预防LV收缩功能障碍的治疗方法中。优选地，在AMI后前7天内、优选12小时至7天之间、更优选1天至7天之间开始以治疗或预防LV扩大、优选地在降低LV舒张末期内径和收缩末期内径和/或LV舒张末期容积和收缩末期容积的增加方面的治疗方法中。
本发明还提供了治疗有效剂量的一种或多种下调内源性Yy1表达的化合物用于制备组合物的用途，该化合物例如siRNA，优选为如下列出的那些：具有正义SEQ ID NO 1和反义SEQ ID NO 2的化合物1、具有正义SEQ ID NO 3和反义SEQ ID NO 4的化合物2、具有正义SEQ ID NO 5和反义SEQ ID NO 6的化合物3、具有正义SEQ ID NO 7和反义SEQ ID NO 8的化合物4、具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQ ID NO 50的化合物5、具有正义SEQ ID NO 51和反义SEQ ID NO 52的化合物6、具有正义SEQ ID NO 53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ ID NO 55和反义SEQ ID NO 56的化合物8；通过在AMI后任一种上述时间间隔内向有此需要的患者施用所述组合物，该组合物用于促进患有AMI后不良心肌重塑的患者、特别是患有AMI后心脏并发症(如心肌纤维化、心脏炎症、心脏肥大和/或心脏功能损伤)的患者恢复。
因此，本发明提供了用于抑制人或动物对象的心脏细胞中内源性Yy1的体内表达(相对于不存在化合物时在所述细胞中观察到的表达)的方法和组合物。通常，该方法包括施用足以通过RNA干扰机制下调内源性Yy1表达的量的寡核糖核苷酸，例如小干扰RNA(即siRNA)，其靶向心脏细胞中内源性Yy1并在生物学条件下(在心脏细胞内)与该mRNA杂交或相互作用。
因此，根据本发明，内源性Yy1的siRNA分子或抑制剂可以用作药物，以通过在AMI发作后的先前指示的时间间隔内施用这些药物来预防、治疗或促进AMI后有此需要的患者恢复。特别地，施用这些药物以预防或治疗AMI后的不良心肌重塑，特别是预防或治疗AMI后的心脏并发症(如心肌纤维化、心脏炎症、心脏肥大和/或心脏功能损伤)。更具体地，内源性Yy1的siRNA分子或抑制剂用于左心室功能障碍的治疗方法中，在AMI后12小时至7天之间、优选在AMI后1天至7天之间施用。特别地，在AMI后前3天内、优选12小时至3天之间、更优选1天至3天之间开始以治疗或预防AMI诱导的心脏肥大、优选在肉眼可见的心脏肥大方面的治疗方法中。优选地，在前7天内、优选12小时至7天之间、更优选1天至7天之间开始以治疗或预防AMI诱导的心脏肥大、优选在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平方面的治疗方法中。优选地，在前3天内、优选12小时至3天之间、更优选1天至3天之间开始以在显著降低LV射血分数和/或缩短分数下降方面来治疗或预防LV收缩功能障碍的治疗方法中。优选地，在AMI后前7天内、优选12小时至7天之间、更优选1天至7天之间开始以治疗或预防LV扩大、优选地在降低LV舒张末期内径和收缩末期内径和/或LV舒张末期容积和收缩末期容积的增加方面的治疗方法中。
因此，本发明提供了双链寡核糖核苷酸(siRNA)，相对于不存在化合物下在心脏细胞中观察到的表达，该双链寡核糖核苷酸(siRNA)下调人或动物对象的所述心脏细胞中内源性Yy1表达(在下文的“本发明的化合物”或“本发明的siRNA”)。本发明的siRNA或本发明的化合物是双链体寡核糖核苷酸，其中正义链源自内源性Yy1的mRNA序列，反义链与正义链互补。通常，在不损害siRNA活性的情况下，可以容忍与靶mRNA序列有一些偏差(参见例如Czauderna等人2003Nucleic Acids Research H(H),2705-2716)。本发明的siRNA在转录后水平抑制基因表达，破坏或不破坏mRNA。在不受理论束缚的情况下，siRNA可以靶向mRNA以进行特异性切割和降解和/或可以抑制靶向信息的翻译。
通常，在本发明中使用的siRNA包含含有双链结构的核糖核酸，其中双链结构包含第一链和第二链，其中第一链包含连续核苷酸的第一段，并且其中所述第一段与靶核酸(内源性Yy1)至少部分互补，并且第二链包含连续核苷酸的第二段，并且其中所述第二段与靶核酸(内源性Yy1)至少部分相同。这些链可以在糖和/或磷酸和/或碱基上进行修饰，或者可选地可以是未修饰的。在本发明的一个实施方式中，所述第一链和/或所述第二链包含多个修饰核苷酸组，其在2'-位置具有修饰，由此在该链内，每个修饰核苷酸组经由侧翼核苷酸组侧接在一侧或两侧，由此形成侧翼核苷酸组的侧翼核苷酸是未修饰的核苷酸或修饰与修饰核苷酸的修饰不同的核苷酸。此外，所述第一链和/或所述第二链可以包含该多种修饰核苷酸并且可以包含该多个修饰核苷酸组。
修饰核苷酸组和/或侧翼核苷酸组可以包含多个数目的核苷酸，其中该数目选自包括一个核苷酸至十个核苷酸的组。关于本文指定的任何范围，应该理解的是，每个范围公开用于定义范围的各个数字(包括定义该范围的两个数字)之间的任意单个整数。因此，在本发明中，该组包括一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸、四个核苷酸、五个核苷酸、六个核苷酸、七个核苷酸、八个核苷酸、九个核苷酸和十个核苷酸。
所述第一链的修饰核苷酸的模式可以相对于第二链的修饰核苷酸的模式移动一个或多个核苷酸。
上面讨论的修饰可以选自包括以下的组：氨基、氟、甲氧基、烷氧基、烷基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫代酸酯(thioate)、Ci至Cio低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、或芳烷基、OCF3、OCN；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或取代的甲硅烷基，等，其描述在欧洲专利EP O 586 520B1或EP O 618 925B1中。
siRNA的双链结构可以在一侧或两侧是平末端。更具体地，双链结构可以在由第一链的5'-端和第二链的3'-端限定的双链结构侧是平末端，或者双链结构可以在由第一链的3'端和第二链的5'端限定的双链结构侧是平末端。
另外，两条链中的至少一条链可以在5'端具有至少一个核苷酸的突出端；突出端可以由至少一个脱氧核糖核苷酸组成。两条链中的至少一条链还可以可选地在3'端具有至少一个核苷酸的突出端。siRNA的双链结构的长度通常为约17个至27个碱基，更优选为19个或21个碱基。此外，所述第一链的长度和/或所述第二链的长度可以彼此独立地选自包括约15个至约27个碱基、17个至21个碱基、和18个或19个碱基的范围的组。具体的实例是27个碱基。此外，所述第一链和靶核酸之间的互补性可以是完美的，或者第一链和靶核酸之间形成的双链体可以包含至少15个核苷酸，其中形成所述双链结构的所述第一链和靶核酸之间存在一个错配或两个错配。
在一些情况下，第一链和第二链各自都包含至少一个修饰核苷酸组和至少一个侧翼核苷酸组，其中每个修饰核苷酸组包含至少一个核苷酸并且其中每个侧翼核苷酸组包含至少一个核苷酸，其中第一链的每个修饰核苷酸组与第二链上的侧翼核苷酸组对齐，其中第一链的最末端5'核苷酸是该修饰核苷酸组的核苷酸，并且第二链的最末端3'核苷酸是侧翼核苷酸组的核苷酸。每个修饰核苷酸组可以由单个核苷酸组成和/或每个侧翼核苷酸组可以由单个核苷酸组成。
此外，在第一链上形成侧翼核苷酸组的核苷酸可能是未修饰的核苷酸，其相对于形成修饰核苷酸组的核苷酸排列在3'方向，并且在第二链上形成修饰核苷酸组的核苷酸是相对于形成侧翼核苷酸组的核苷酸排列在5'方向的修饰核苷酸。
此外，siRNA的第一链可以包含八个至十二个、优选九个至十一个修饰核苷酸组，并且第二链可以包含七个至十一个、优选八个至十个修饰核苷酸组。
第一链和第二链可以通过环结构连接，环结构可以由非核酸聚合物(例如尤其是聚乙二醇)构成。或者，环结构可以由核酸组成。
此外，siRNA的第一链的5'-末端可以与第二链的3'-末端连接，或者第一链的3'-末端可以与第二链的5'-末端连接，所述连接通过核酸接头进行，该核酸接头通常具有10个至2000个核碱基的长度。
特别地，并且已经如前所述，本发明提供了本发明的化合物或本发明的siRNA，其选自由如下组成的组：具有正义SEQ ID NO 1和反义SEQ ID NO 2的化合物1、具有正义SEQID NO 3和反义SEQ ID NO 4的化合物2、具有正义SEQ ID NO 5和反义SEQ ID NO 6的化合物3、具有正义SEQ ID NO 7和反义SEQ ID NO 8的化合物4、具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQ ID NO 50的化合物5、具有正义SEQ ID NO 51和反义SEQ ID NO 52的化合物6、具有正义SEQ ID NO 53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ ID NO 55和反义SEQ IDNO 56的化合物8，其中这些化合物中的任一种化合物可以可选地包含贯穿本说明书指出的任一种修饰。优选地，本发明提供了选自由如下组成的组的本发明的化合物或本发明的siRNA：具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQ ID NO 50的化合物5、具有正义SEQ ID NO51和反义SEQ ID NO 52的化合物6、具有正义SEQ ID NO 53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ ID NO 55和反义SEQ ID NO 56的化合物8，其中这些化合物中的任一种化合物可以可选地包含贯穿本说明书指出的任一种修饰。
因此，本领域技术人员将容易地理解，本发明的化合物由多个核苷酸组成，这些核苷酸通过共价键连接。每个这样的共价键可以是沿着单条链的核苷酸序列长度的磷酸二酯键、硫代磷酸酯键或两者的组合。其他可能的主链修饰尤其描述在第5,587,361号；第6,242,589号；第6,277,967号；第6,326,358号；第5,399,676号；第5,489,677号；和第5,596,086号美国专利中。
本发明还提供了一种运载体，其能够在细胞中表达未修饰形式的任意前述寡核糖核苷酸，之后可以对该寡核糖核苷酸进行适当的修饰。
本发明还提供了一种组合物，其包含在载体、优选为药学上可接受的载体中的一种或多种本发明的化合物或本发明的siRNA。该组合物可以包含两种或更多种不同siRNA的混合物。
更具体地，本发明提供了一种组合物，其包含载体和有效下调内源性Yy1在细胞中的表达的量的一种或多种本发明化合物。特别地，如实施例2中已经指出并解释的，图11中示出的实验数据表明，siYyl疗法利用包含载体和有效下调内源性Yy1在细胞中的表达的量的一种或多种本发明化合物的任何组合物，在前3天内开始的该siYyl疗法在肉眼可见的心脏肥大(a)、HW/BW比率(b)方面预防MI诱导的心脏肥大。在前7天内开始的该siYyl疗法在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平(c)方面预防MI诱导的心脏肥大。在第14天开始的siYy1疗法没有效果。图12示出在前3天内开始的siYy1疗法在显著降低LV射血分数(a)和缩短分数(b)下降方面预防LV收缩功能障碍。在前7天内开始的siYy1疗法在降低LV舒张末期和收缩末期内径(c、d)以及LV舒张末期和收缩末期容积(e、f)增加方面预防LV扩大。在第14天开始的siYy1疗法没有效果。图13示出在前7天内开始的siYy1疗法在显著降低天狼星红染色(a)(小图b中的代表性图像)以及显著降低不同纤维化相关标志物基因失调(TGF-β,α-sma,Col1a1和Col3a1)的水平(c-f)方面预防梗死心肌的纤维化。在第14天开始的疗法没有效果。图14示出在前7天内开始的siYy1疗法在降低CD45阳性染色(a)(小图b中的代表性图像)和炎症相关特异性标志物(c-d)的水平方面预防梗死心肌的炎症。在第14天开始的疗法没有效果。图15示出在前7天内开始的siYy1疗法在显著降低半胱天冬酶3蛋白水平(a)以及BNP和MyO mRNA水平(c-d)方面预防细胞死亡。图16示出siYy1疗法预防源自人诱导性多能干细胞(iPs)的心肌细胞的拉伸诱导性肥大。与对照组(Scr)相比，源自人iPs的心肌细胞(hiPsCM)中的Yy1 mRNA水平在拉伸后(PMA+Scr)升高(p<0.001)，并且通过siYy1疗法(siYy1+PMA)显著降低(p<0.001)(a)。此外，在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平(b,c)方面，siYy1疗法预防拉伸诱导的心脏肥大。
因此，本发明提供了一种治疗患者急性心肌梗死后(AMI后12小时至7天之间)的左心室(LV)功能障碍的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本发明所述的化合物或组合物，从而因此预防性或治病性地治疗该患者。优选地，在AMI后1天至7天之间施用该方法。更优选地，在AMI后12小时至3天之间、优选为在AMI后1天至3天之间。还优选地，在AMI后3天至7天之间。
本发明还提供了一种治疗AMI后不良心肌重塑的方法，特别是预防或治疗AMI后的心脏并发症(如心肌纤维化、心脏炎症、心脏肥大和/或心脏功能损伤)，更具体地是一种治疗患者急性心肌梗死后(AMI后2小时至48小时)的左心室功能障碍的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本发明所述的化合物或组合物，从而预防性或治病性地治疗该患者。优选地，在AMI后4小时至48小时之间施用该方法。更优选地，在AMI后6小时至48小时之间。还更优选地，在AMI后12小时至48小时或24小时至48小时之间。还更优选地，在AMI后2小时、4小时、6小时或12小时至24小时之间。
本发明还提供了一种治疗患者急性心肌梗死后(AMI后12小时至7天)的左心室(LV)功能障碍的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本发明所述的化合物或组合物，从而预防性或治病性地治疗该患者。优选地，在AMI后1天至7天之间施用该方法。更优选地，在AMI后12小时至3天之间，优选地在AMI后1天至3天之间。还更优选地，在AMI后3天至7天之间。
在优选的实施方式中，本发明提供了一种治疗患者急性心肌梗死后(AMI后12小时至72小时)的左心室(LV)功能障碍的方法，优选地通过预防、治疗、减轻或降低LV射血分数和/或缩短分数的损失进行，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本发明所述的化合物或组合物，从而预防性或治病性地治疗该患者。优选地，在AMI后24小时至72小时之间施用该方法。更优选地，在AMI后36小时至72小时之间。还更优选地，在AMI后48小时至72小时之间。
在优选的实施方式中，本发明提供了一种治疗患者急性心肌梗死后(AMI后12小时至72小时)的左心室(LV)功能障碍的方法，优选地通过预防、治疗、减轻或降低MI诱导的心脏肥大进行，优选在肉眼可见的心脏肥大方面，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本发明所述的化合物或组合物，从而因此预防性或治病性地治疗该患者。优选地，在AMI后24小时至72小时之间施用该方法。更优选地，在AMI后36小时至72小时之间。还更优选地，在AMI后48小时至72小时之间。
在优选的实施方式中，本发明提供了一种治疗患者急性心肌梗死后(AMI后3天至7天)的左心室(LV)功能障碍的方法，优选地通过预防、治疗、减轻或降低LV扩大进行，优选为在降低LV舒张末期和收缩末期内径和/或LV舒张末期和收缩末期容积增加方面，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本发明所述的化合物或组合物，从而因此预防性或治病性地治疗该患者。
递送：已经开发出专门旨在增强并改善siRNA递送至哺乳动物细胞的递送系统，参见，例如，Shen等人(FEBS letters 539：111-114(2003))，Xia等人，Nature Biotechnology20：1006-1010(2002)，Reich等人，Molecular Vision 9：210-216(2003)，Sorensen等人，(J.Mol.Biol.327:761-766(2003)，Lewis等人，Nature Genetics 32:107-108(2002)和Simeoni等人，Nucleic Acids Research 31,11:2717-2724(2003)。已经将siRNA成功地用于灵长类动物的抑制；更多详情参见Tolentino等人，Retina 24(1)2004年2月I 132-138。siRNA的呼吸道制剂描述于Davis等人的第2004/0063654号美国专利申请中。胆固醇缀合的siRNA(以及其他类固醇和脂质缀合的siRNA)可以用于递送，参见Soutschek等人Nature432:173-177(2004)Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemicadministration of modified siRNAs；以及Lorenz等人Bioorg.Med.Chemistry.Lett.14:4975-4977(2004)Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellularuptake and gene silencing in liver cells。
根据良好医疗实践，考虑个体患者的临床状况、施用部位和方法、施用时间安排、患者的年龄、性别、体重和医师已知的其他因素来施用和给予本发明的化合物、siRNA或药物组合物。
因此，用于本文目的的“治疗有效剂量”是通过本领域已知的此类考虑来确定的。剂量必须有效以实现改善，包括但不限于存活率改善或恢复更快，或改善或消除症状，和由本领域技术人员选择作为适当度量的其他指标。本发明的化合物可以通过任何常规的施用途径进行施用。应当注意，该化合物可以作为化合物或作为药学上可接受的盐进行施用，并且可以单独地施用或作为活性成分与药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和溶媒组合施用。可以通过口腔、皮下或肠胃外(包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、和鼻内施用)以及鞘内和输注技术来施用该化合物。优选地，通过肠胃外、优选为通过静脉内途径施用本发明的化合物、siRNA或药物组合物。
化合物的植入物也是有用的。可以制备液体形式以用于注射，该术语包括皮下、透皮、静脉内、肌肉内、鞘内和其他肠胃外施用途径。液体组合物包括含有或不含有机助溶剂的水性溶液剂、水性或油性混悬剂、含有食用油的乳剂以及相似药物溶媒。此外，在某些情况下，用于本发明的新的治疗方法的组合物可以形成为气溶胶，用于鼻内等施用。接受治疗的患者是恒温动物，尤其是包括人的哺乳动物。药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和溶媒以及植入物载体(implant earner)通常是指不与本发明的活性成分发生反应的惰性、无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料，并且它们包括脂质体和微球。可用于本发明的递送系统的实例包括第5,225,182号；第5,169,383号；第5,167,616号；第4,959,217号；第4,925,678号；第4,487,603号；第4,486,194号；第4,447,233号；第4,447,224号；第4,439,196号；和第4,475,196号美国专利。许多其他的这类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员所熟知的。在本发明的一个具体实施方式中，局部制剂和透皮制剂是特别优选的。
一般而言，用于人体的化合物有效剂量在每天1ng/kg体重至约20-100mg/kg体重、优选为每天约0.01mg至约2-10mg/kg体重的范围内。
本文中所用的术语“治疗”是指施用有效改善与疾病相关的症状、减轻严重程度或治愈疾病、或预防疾病发生的治疗性物质。在特定的实施方式中，施用包括静脉内施用。在另一个特定的实施方式中，施用包括表面或局部施用。
本发明的另一个方面是一种在AMI后贯穿本说明书中指示的时间间隔内治疗患者的心肌纤维化、心脏炎症、心脏肥大和/或心脏功能损伤的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物，从而因此预防性或治病性地治疗该患者。
在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含化合物1至3中的任一种或表达这些寡核苷酸的运载体和药学上可接受的载体。本发明的另一个方面是治疗有效量的任一种上述寡核糖核苷酸或运载体在制备药物中的用途，该药物用于在AMI后贯穿本说明书中指示的时间间隔内促进患有心肌纤维化、心脏炎症、心脏肥大和/或心脏功能损伤的患者恢复。
本发明还提供了一种用于制备药物组合物的方法，该方法包括将一种或多种本发明的化合物与药学上可接受的载体混合。
在优选的实施方式中，将用于制备药物组合物的化合物以药物有效剂量与载体混合。在特定的实施方式中，将本发明的化合物与类固醇或脂质或另一种合适的分子(例如胆固醇)缀合。
可以引入核苷酸的修饰或相似物以改善核苷酸的治疗性特性。改善的特性包括核酸酶抗性增强和/或渗透细胞膜的能力增强。
因此，本发明还包括基本上不影响多核苷酸或寡核苷酸的功能的本发明寡核苷酸的所有相似物或修饰。在优选的实施方式中，这种修饰与核苷酸的碱基部分、核苷酸的糖部分和/或核苷酸的磷酸部分相关。
在本发明的实施方式中，核苷酸可以选自天然存在的或合成修饰的碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。寡核苷酸的修饰碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤，6-甲基-、2-丙基-和其他烷基-腺嘌呤，5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-巯基烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其他取代鸟嘌呤、其他氮杂和去氮腺嘌呤、其他氮杂和去氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。
此外，可以制备核苷酸相似物，其中核苷酸的结构被从根本上改变并且更适合作为治疗性或实验性药剂。核苷酸相似物的实例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸主链用与肽中发现的聚酰胺主链相似的聚酰胺主链取代。已经示出PNA相似物可以抵抗酶的降解，并且在体内和在体外具有延长的寿命。此外，已经示出PNA与互补性DNA序列的结合强于与DNA分子的结合。该观察结果归因于PNA链和DNA链之间缺乏电荷排斥。可以对寡核苷酸进行的其他修饰包括聚合物主链、环状主链、或无环主链。
在一个实施方式中，修饰是磷酸部分的修饰，其中修饰的磷酸部分选自包括硫代磷酸酯的组。
本发明的化合物可以通过本领域熟知的用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的任何方法来合成。这种合成尤其描述在Beaucage S.L.和Iyer R.P.,Tetrahedron1992；48:2223-2311，Beaucage SX.和Iyer R.P.,Tetrahedron 1993；49:6123-6194，和Caruthers M.H.等人，Methods Enzymol.1987；154:287-313中；硫代酸酯的合成尤其描述在Eckstein F.,Annu.Rev.Biochem.1985；54:367-402中；RNA分子的合成描述在SproatB.,in Humana Press 2005Edited by Herdewijn P.；Kap.2:17-31中；以及相应的下游过程尤其描述在Pingoud A.et.al.,in IRL Press 1989Edited by Oliver R.W.A.；Kap.7:183-208和Sproat B.,in Humana Press 2005Edited by Herdewijn P.；Kap.2:17-31(同上)中。
其他合成程序是本领域已知的，例如这些程序描述在Usman et al.,1987,J.Am.Chem.Soc,109,7845；Scaringe et al.,1990，nucleic Acids Res.,18,5433；Wincott et al.,1995，nucleic Acids Res.23,2677-2684；and Wincott et al.,1997,Methods MoI.Bio.,74,59中；以及这些程序可以使用常见的核酸保护基团和核酸偶联基团，例如5'端的二甲氧基三苯甲基和3端的亚磷酰胺。根据需要掺入修饰的(例如2'-O-甲基化的)核苷酸和未修饰的核苷酸。
本发明的寡核苷酸可以单独地合成并且在合成后连接在一起，例如通过连接(Moore et al.,1992,Science 256,9923；Draper et al.,International PCTpublication No.WO93/23569；Shabarova et al.,1991，nucleic Acids Research 19,4247；Bellon et al.,1997，nucleosides Sc Nucleotides,16,951；Bellon et al.,1997,Bioconjugate Chem.8,204)或者通过合成和/或脱保护后的杂交。
应该注意的是，可以使用市售机器(尤其从Applied Biosystems可获得)；根据本文公开的序列制备寡核苷酸。化学合成片段的重叠配对可以使用本领域熟知的方法来进行连接(例如，参见第6,121,426号美国专利)。这些链被分别合成，然后在管中相互退火。然后，通过HPLC将双链siRNA与未退火的单链寡核苷酸(例如，因为两种寡核苷酸中的一种寡核苷酸过量)进行分离。关于本发明的siRNA或者siRNA片段，可以合成两种或多种这样的序列并且将其连接在一起用于本发明。
本发明的化合物也可以通过串联合成方法来进行合成，如描述在公开号为US2004/0019001的美国专利申请(McSwiggen)中，其中两种siRNA链合成为被可裂解接头分隔的单个连续寡核苷酸片段或链，其随后被切割以提供单独的siRNA片段或链，它们杂交并且允许siRNA双链体的纯化。接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。
本发明的化合物可以被直接递送或用病毒或非病毒运载体递送。当直接递送时，通常使得序列具有核酸酶抗性。或者，可以将序列掺入至表达盒或构建体中，使得序列在如下文所述的细胞中表达。通常，构建体包含合适的调控序列或启动子，以允许序列在靶细胞中表达。可选用于递送本发明化合物的运载体是可商购的，并且可以通过本领域技术人员已知的方法进行修饰以用于递送本发明化合物的目的。
以下实施例说明但不限制本发明。
实施例
实施例1
材料与方法
动物护理和伦理方面。C57Bl/6J雄性小鼠(25-30g的体重)购买自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。将小鼠安置在23±2℃下50±5％的相对湿度和12小时的光照和黑暗循环的特定无病原体的环境中。小鼠可以自由地获取食物和水。所有动物实验均经过穆尔西亚大学的伦理审查委员会批准进行动物使用(许可证号：A13150105)。经过7天适应后，使动物经受外科手术以诱导AMI，之后进行全身性Yy1基因沉默。将动物随机分成六个组(参见组和实验设计)。
在小鼠中诱导实验性AMI。在外科手术之前，动物用氯胺酮(75mg/kg)和美托咪定(0.5mg/kg)经腹膜内麻醉，然后用18G静脉内导管进行插管和通气，并且将其以仰卧姿势置于温度控制垫上。经由皮下插入的小针通过与四肢连接的心电图(ECG)电极来监测动物。通过第三肋间隙和第四肋间隙之间的小切口进行左侧开胸术。通过钝头牵开器，以使得在牵开区域避开肺部的方式扩张切口。心脏周围的心包囊被切开，但是不取出心脏。将冠状动脉左前降支(LAD)的结扎部位确定为距离起点4mm。使用锥形无创针，将8-0丝线从LAD下方穿过并打三个结。左心室前壁可见的变白和发绀以及左心房肿胀被认为是结扎成功的指示。如果ECG显示ST段抬高并且左心室前壁变白，则认为手术成功。使用6-0薇乔(vicryl)可溶解性缝线来缝合肋骨和肌肉，留下小缝隙以吸出胸腔内残留的任何空气。由内置管(2毫米的直径)吸出空气，再次不会接触肺部。缝合时，分别在肌肉和皮肤缝合部位施用新霉素粉末和必妥碘。每天包扎手术部位以避免任何感染并且监测缝合部位的任何开裂。在诱导麻醉后20分钟内完成整个手术。假手术鼠经受相同的手术，但不进行任何结扎。手术后，动物以8小时的间隔接受四剂的丁丙诺啡(0.05mg/kg，皮下)。假手术组除了LAD冠状动脉未阻塞外，经受相同的外科手术。心电图监测用于确认AMI诱导后ST段抬高。为了评估心脏损伤的演变，在手术前以及AMI后24小时、1周和4周对每只小鼠进行超声心动图研究(16)。
实验设计和研究方案。在AMI后24天，将存活的动物随机分为六个实验组：(1)通过静脉内途径用PBS处理的假手术组(假手术组PBS，n＝10)；(2)通过静脉内途径用si对照(siCtrl，参见表3)处理的假手术组(假手术组siCtrl，n＝10)；(3)通过静脉内途径用siYy1(术语“siYy1”在本文中应理解为由四种沉默内源性Yy1水平的特异性siRNA序列(表3的化合物1至4)形成的组处理的假手术组(假手术组siYy1，n＝10)；(4)通过静脉内途径以安慰剂(PBS)处理的梗死组(AMI组PBS，n＝10)；(5)通过静脉内途径用si对照(siCtrl)处理的梗死组(AMI组siCtrl，n＝10)；(6)通过静脉内途径用siYy1处理的梗死组(AMI组siYy1，n＝10)。将动物保持在上述条件下直至处死它们(AMI后4周)。
小鼠内源性Yin-Yang 1转录因子沉默。为了生成使内源性Yy1因子表达水平沉默的实验模型，用4种特异性干扰RNA序列(表3的化合物1至4)的混合物转染小鼠。在AMI后24小时，通过动物的尾静脉进行静脉内输注。针对Yy1转录因子的siRNA序列(CustomsiRNA，体内HPLC Accell)获得自Dharmacon(A-050273-13、-14、-15和-16)，并且在AMI后第1天、第7天和第14天以6mg/kg的三个独立剂量施用，导致18mg/kg的累积最终浓度。图2a中示出实验程序的概要。简而言之，在临用前，使用来自GE Healthcare的Accell siRNA递送介质(B-005000)混合75μg的四种siRNA中的每一种siRNA。在下表3中示出小鼠特异性Yy1转录因子的靶序列以及非靶向Accell siRNA序列(siCtrl)。
LV结构和功能。在手术前(基线)、AMI后24小时和AMI后4小时，使用Vevo机器和13-MHz探头(MJFP)对麻醉小鼠(1.8％异氟醚，吸入)进行经胸腔的超声心动图检查(2D和M型超声心动图)。从四腔长轴视图，由Simpson方法确定左心室收缩末期容积(LVEsV)和左心室舒张末期容积(LVEdV)，根据EF(％)＝LVEdV-LVEsV/LVEdV×100自动地确定射血分数(EF)。在二尖瓣的腱索水平，通过M模式进行左心室舒张末期内径(LVEdD)和左心室收缩末期内径(LVEsD)的测量。数据列于表1。分析数据的研究人员对实验组不知情。
表1AMI后4周时假手术和AMI对照以及siYy1处理的小鼠的超声心动图测量
从研究中获得的超声心动图参数
BW，体重；HR，心率；LV，左心室；LVEDV，左心室舒张末期容积；LVESV，左心室收缩末期容积；LVEDD，左心室舒张末期内径；LVESD，左心室收缩末期内径；FS，缩短分数；EF，射血分数。对比Sham+siCtrl，###P<0.001，对比AMI+siCtrl，*p<0.05和***p<0.001。使用未配对的双尾学生t检验来计算P值。数据表示为平均值±SEM。
RNA提取和定量RT-PCR
用冷DPBS清洗新鲜的梗死心室(～20mg)。然后，将样品放置在预冷的皮氏玻璃培养皿中，并且在冰浴中用锋利的剪刀切碎。根据稍微改良的制造商方法进行RNA分离和定量实时PCR(15)。表2中描述了用于定量实时PCR分析的引物序列。
表2.用于定量实时PCR分析的引物序列
统计分析
数据表示为平均值±平均值的标准误差。使用科莫戈洛夫-斯米尔诺夫检验来测试正态性。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验来测试所有组之间的差异。使用Siegel-Castellan检验以用于与假手术组的多重比较。按照肯德尔的方法，仅在梗死动物中研究非参数相关性。假设p<0.05时具有统计显著性。使用SPSS statistics 22(IBM公司,美国，纽约州，阿蒙克市)对数据进行统计分析。使用SigmaPlot 11.0软件进行绘图。P值<0.05被认为具有统计显著性。
结果
AMI诱导Yin yang-1(Yy1)转录因子上调
首先，我们量化了从梗死小鼠和非梗死小鼠的左心室(LV)中提取的总RNA中的Yy1水平(图1)。如图1a所示，从AMI起一周后，LV梗死区域的Yy1 mRNA水平显著增加(p<0.01)；当时间延长至4周时，增加更高(p<0.001)(图1a)。在LV远端区域不发生Yy1 mRNA的增加(图1b)。
Yy1转录因子的遗传缺陷预防AMI后的不良心脏重塑
接下来，从通过特异性siRNA降低Yy1水平和活性来预防体外新生儿心肌细胞肥大的观察开始(15)，我们探寻Yy1的整体基因缺失是否预防AMI后的病理性心脏重塑。如图2a所示，并且如上所述，在AMI诱导后、ST段抬高后立即开始siYy1疗法。当我们评估LV梗死区域(AMI+siCtrl组)中的Yy1 mRNA水平时，与假手术组(Sham+siCtrl组)中获得的mRNA水平相比，我们观察到当动物用siYy1处理时，显著增加受到阻止(p<0.001)(AMI+siYy1对比AMI+siCtrl；p<0.001)(图2b)。
重要的是，用siYy1处理的梗死小鼠免受AMI诱导的心脏肥大和功能损伤。经处理的动物表现出更好的心脏功能(图3)(p<0.001)、较低的肉眼可见的心脏肥大(即心脏重量)(p<0.001)(图4a)、较低的肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关))和Nppa水平(p<0.001，在这两种情况下)(图4，b-c)、和较低的心肌细胞肥大(p<0.01)(图4d)。
明显地，这些siYy1缺陷小鼠中的心肌纤维化也降低，这由纤维化相关标志物基因失调确定(图5，a-f)。天狼星红和马松染色证实了这些保护结果(图5g)。
当我们评估siYy1疗法对AMI后心脏炎症的影响时，获得了相似的效果。同样，siYy1疗法在炎症相关标志物基因失调方面预防AMI后的不良炎症(图6)。
接下来，我们进行了与心肌死亡相关的实验。如图7所示，AMI诱导LV梗死心肌细胞的死亡，其特点是MyO水平(p<0.001)、H-FABP水平(p<0.001)和BNP mRNA水平(p<0.001)显著增加(图7)。siYy1疗法阻止了这种增加(p<0.001，对于所有情形)。
siYy1疗法的心脏保护作用与IL-33/ST2轴的调节有关
接下来，为了确认siYy1疗法在体内心脏重塑期间的有益效果是否与IL33/ST2L轴相关，通过定量RT-PCR在小鼠的LV梗死区域评估了IL-33、ST2L和sST2的mRNA水平(图8)。AMI与IL-33(p<0.001)、ST2L(p<0.001)和sST2(p<0.01)的mRNA表达的增加有关。有趣的是，内源性Yy1的缺乏对IL-33和ST2L的mRNA水平没有影响，并且阻止了心肌sST2 mRNA水平的上调。与其各自的对照相比，在没有损伤或不使用PBS的情况下，Yy1的沉默对IL33、ST2L和sST2表达没有影响。
实施例2
材料与方法
动物护理和伦理方面。C57Bl/6J雄性小鼠(25-30g的体重)购自杰克逊实验室。将小鼠安置在23±2℃下50±5％的相对湿度和12小时的光照和黑暗循环的特定无病原体的环境中。小鼠可以自由地获取食物和水。所有动物实验均经过穆尔西亚大学的伦理审查委员会批准进行动物使用(许可证号：A13150105)。经过7天适应后，使动物经受外科手术以诱导MI，之后进行全身性Yy1基因沉默。
在小鼠中诱导实验性MI。在外科手术之前，动物用氯胺酮(75mg/kg)和美托咪定(0.5mg/kg)经腹膜内麻醉，然后用18G静脉内导管进行插管和通气，并且将其以仰卧姿势置于温度控制垫上。经由皮下插入的小针通过与四肢连接的心电图(ECG)电极来监测动物。通过第三肋间隙和第四肋间隙之间的小切口进行左侧开胸术。通过钝头牵开器以使得在牵开区域避开肺部的方式来扩张切口。切开心脏周围的心包囊，但是不取出心脏。将冠状动脉左前降支(LAD)的结扎部位确定为距离起点4mm。使用锥形无创针，将8-0丝线从LAD下方穿过并打三个结。左心室前壁可见的变白和发绀以及左心房肿胀被认为是结扎成功的指示。如果ECG显示ST段抬高并且左心室前壁变白，则认为手术成功。使用6-0薇乔(vicryl)可溶解性缝线来缝合肋骨和肌肉，留下小缝隙以吸出胸腔内残留的任何空气。由内置管(2毫米的直径)吸出空气，再次不会接触肺部。缝合时，分别在肌肉和皮肤缝合部位施用新霉素粉末和必妥碘。每天包扎手术部位以避免任何感染并且监测缝合部位的任何开裂。在诱导麻醉后20分钟内完成整个手术。假手术鼠经受相同的手术，但不进行任何结扎。手术后，动物以8小时的间隔接受四个剂量的丁丙诺啡(0.05mg/kg，皮下)。假手术组除了LAD冠状动脉未阻塞外，经受相同的外科手术。心电图监测用于确认MI诱导后ST段抬高。手术诱导MI后，梗死小鼠的心电图相比于假手术组的心电图显示出显著变化(图9中的上部小图)。为了评估心脏损伤的演变，在处死时(MI后4周或8周)对每只小鼠进行超声心动图研究(Sacks D.等人，Int J Stroke.2018Aug；13(6)：612-632)。
小鼠的实验设计和研究方案。在MI后30分钟，将存活的动物随机分为两个全局组：MI组和假手术组。在每种情形下，根据MI后第1小时(S1h)、第24小时(S24h)、第3天(S3d)、第7天(S7d)或第14天(S14d)开始的siYy1疗法启动(6mg/kg，静脉内)对动物进行重新分组。每7天重复一次SiYy1疗法，直到每个组完成总共3次循环(图9)。在MI后4周时处死属于S1h组、S24h组、S3d组和S7d组的动物，而在MI后8周时处死属于S14d的动物(图9中的方案)。
源自人诱导性多能干细胞(iPs)的心肌细胞(hiPsCM)的制备和生物力学应变。人诱导性多能干细胞(hiPSC)购买自Phenocell(PCi-CAU)；将约0.5×10 5个活细胞提供在冷冻管中。最初，在允许细胞团附着的合适基质
上，使用mTeSRTMplus培养基让hiPSC生长至80％汇合度，并且将hiPSC保持在37℃的5％ CO2和95％空气的潮湿气氛中。在第20代，使用我们实验室的归一化方法开始重编程程序。简而言之，除去培养基，并且更换为含B27(去除胰岛素)补充剂(基础分化补充剂)和4μM CHIR99021的RPMI-1640(第0天)。第3天，将培养基更换为基础分化补充剂和3μM IWR-1。第5天，用基础分化补充剂更新培养基。第8天将培养基更换为含B27补充剂的RPMI 1640(上文引用为RMPI/B27)。在第11天，将培养基更换为不含葡萄糖但含去除胰岛素的B27的RPMI 1640。第14天，将培养基更换为RPMI/B27。将用于分化的培养物保持在37℃的5％ CO2和95％空气的环境中。在分化期间，每3天更换一次培养基。20天后观察到搏动簇。在实验前，允许HiPsCM在诱导细胞维持液(Cellular Dynamics International)中恢复12天。在测定开始之前，对每个分离的人克隆中的hiPSC和hiPsCM进行归一化基因表达谱分析(RT-qPCR)。将OCT4和NANOG的mRNA水平用作hiPSC特异性标志物，并且将cTnT和NKX 2-5的mRNA水平用作iPsCM特异性标志物。使用Asensio-Lopez MC等人(Sci Rep.2021Feb 16；11(1)：3915)描述的实验设计的改编进行生物力学应变。在本文，将hiPsCM与0.2μM PMA和0.4μM A23187共刺激6小时，从而诱导持续的细胞拉伸。
内源性Yin-Yang 1转录因子沉默。为了生成Yy1表达水平下调的实验模型，用四种特异性干扰RNA序列(化合物1至4)的混合物处理小鼠，并且用为人Yy1 mRNA序列而特定设计的等效混合物(化合物5至8)转染hiPsCM。
表3.沉默Yy1水平的特异性短干扰RNA序列。
化合物1(siRNA1)：
正义序列：CUGUUGUCCAGAAUACUUAUU(SEQ ID NO 1)
反义序列：5′-PUAAGUAUUCUGGACAACAGUU(SEQ ID NO 2)
化合物2(siRNA2)：
正义序列：CAUGUAGAAUCAAAUAUUAUU(SEQ ID NO 3)
反义序列：5′-PUAAUAUUUGAUUCUACAUGUU(SEQ ID NO 4)
化合物3(siRNA3)：
正义序列：GCUCCAAGAACAAUAGCUUUU(SEQ ID NO 5)
反义序列：5′-PAAGCUAUUGUUCUUGGAGCUU(SEQ ID NO 6)
化合物4(siRNA 4)：
正义序列：CAACUAACCUGAAAUCUCAUU(SEQ ID NO 7)
反义序列：5′-PUGAGAUUUCAGGUUAGUUGUU(SEQ ID NO 8)
化合物5(siRNA 5)：
正义序列：CAU GUA GUA UCA AAU AUU A(SEQ ID NO 49)
反义序列：5'-UAA UAU UUG AUA CUA CAU G(SEQ ID NO 50)
化合物6(siRNA6)：
正义序列：GGG AUA UGC UUA GUA AUG C(SEQ ID NO 51)
反义序列：5'-UAA UAU UUG AUA CUA CAU G(SEQ ID NO 52)
化合物7(siRNA 7)：
正义序列：CUC AGU UGU AGAAUG UAU U(SEQ ID NO 53)
反义序列：5'-UAAUAU UUG AUACUACAU G(SEQ ID NO 54)
化合物8(siRNA8)：
正义序列：CAACUAACC UGAAAU CUC A(SEQ ID NO 55)
反义序列：5'-UAA UAU UUG AUA CUA CAU G(SEQ ID NO 56)
非靶向Accell siRNA序列(siCtrl/Scr)：
正义：UAGCGACUAAACACAUCAAUU(SEQ ID NO 9)
反义：5'-PUUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU(SEQ ID NO 10)
在小鼠中，在MI后1小时、24小时、3天、7天或14天后通过动物的尾静脉进行静脉内输注。针对Yy1转录因子的siRNA序列(CustomsiRNA，体内HPLC Accell)获得自Dharmacon(A-050273-13、-14、-15和-16)，并且在MI后以每周6mg/kg的三个独立剂量一起施用。图9中示出实验程序的概要。简而言之，在临用前，使用来自GE Healthcare的Accell siRNA递送介质(B-005000)混合75μg的四种siRNA中的每一种siRNA。在上表3中示出小鼠特异性Yy1转录因子的靶序列以及非靶向Accell siRNA序列(siCtrl)(引用为化合物1至4和非靶向Accell siRNA序列(siCtrl))。
在hiPsCM中，使用Lipofectamine RNAiMAX将Yy1特异性siRNA或对照siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)转染到细胞中。为了预防由正义链和反义链引起的脱靶效应，使用设计用于靶向一个基因的四种单独双链体的商业混合物(化合物5至8和Scr；表3)。简而言之，将hiPsCM(约20×10 3个细胞)接种到六孔板中，并且在37℃下在完全培养基中培养2天。接下来，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)对细胞进行转染。转染浓度为25nM。添加转染混合物后将细胞保持24小时。然后，如前所述，在37℃下用DPBS洗涤经转染的细胞两次，然后用PMA和A23187共刺激6小时。
LV结构和心脏功能。在MI后4周或8周后，使用VEVO机器和13-MHz探头对麻醉小鼠(1.8％异氟醚，吸入)进行经胸腔的超声心动图检查(2D和M型超声心动图)。从四腔长轴视图，由Simpson方法确定左心室收缩末期容积(LVEsV)和左心室舒张末期容积(LVEdV)，并且根据EF(％)＝LVEdV-LVEsV/LVEdV×100自动地确定射血分数(EF)。在二尖瓣的腱索水平，通过M模式进行左心室舒张末期内径(LVEdD)和左心室收缩末期内径(LVEsD)的测量。分析数据的研究人员对实验组不知情。
组织样本和组织学。LAD动脉结扎后第4周(S1h组、S24h组、S3d组和S7d组)或第8周(S14d组)处死动物，并且通过静脉内注射0.2ml 10％(w/v)氯化钾(MERCK，美国)使它们的心脏停滞在舒张期。然后，将心脏切除并用冰冷的DPBS冲洗，之后除去右心室和心房。对于组织病理学分析，将来自每个处理组的七只小鼠的左心室的中间乳头肌薄片固定在4％甲醛中最长至24小时，之后进行石蜡包埋。进行天狼星红染色以评估纤维化。对于其量化，从每张载玻片以20倍放大倍率拍摄至少六张边缘梗死区域的随机图片。将胶原沉积(红色)用于定义纤维化，它表示为红色像素与红色像素的百分比，使用DIGITAL IMAGE HUB软件版本4.0.6进行定量。对于其他分子细胞生物学研究，收集梗死区域并且储存在-80℃下用于RNA提取。实施图像分析以及分子和细胞生物学实验的观察者对实验组不知情。
免疫组织化学。如前所述并进行一些改良(Asensio-Lopez MC.等人,SciRep.2021Feb16；11(1)：3915)来实施接下来的实验程序。简而言之，将来自石蜡包埋的LV中间乳头肌薄片的切片(3μm)置于聚-l-赖氨酸包被的载玻片上。然后，将切片在DAKO PTLink中脱石蜡并且在97℃下预处理20分钟。对于CD45或半胱天冬酶3染色，将再水合化的切片与兔多克隆CD45抗体(工作稀释度1:500，ABCAM[ab10558])或兔多克隆半胱天冬酶3抗体(工作稀释度1:300，CELL SIGNALING[9661])孵育过夜。接下来，根据制造商的说明书，将切片与抗兔生物素标记的聚合物(DAKO ENVISION)一起孵育，并用2-2'二氨基联苯胺(DAB)显影。细胞质深棕色沉淀指示阳性的免疫染色。使用Zeiss Axio Scope A10(CARL ZEISS，马德里，西班牙)显微镜拍摄图像。以20倍放大倍率对每张载玻片拍摄六张随机照片(n＝7个薄片/每个处理组)。
RNA提取和定量RT-PCR。从梗死心肌组织样本以及拉伸下的hiPsCM中分离出总RNA。根据制造商的建议，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)来纯化RNA，并且使用iScriptcDNA合成试剂盒(BIORAD LAB.INC.,马德里)来制备cDNA。使用TB Green Premix Ex TaqII(Tli RNase H Plus)Master Mix(TAKARA BIO INC.,欧洲)进行定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)。将甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作管家基因。所用引物(MERCK，美国)的序列列于附加的表4中。
表4.用于定量实时PCR分析的引物序列
统计分析。实施梗死(MI对比假手术)、处理(siYy1对比对照)和处理开始时间之间的相互作用的线性回归模型，以估计平均值和标准误差(SE)。由于每组中动物的不平衡，使用了边际平均值(EMM，估计的边际平均值)。估计梗死的影响(MI和假手术之间的变化，MI-Sham)并且以表格和数字报告。根据疗法的每个开始时间，还估计了这些变化的差异(差异-对-差异)，以用于比较和计算多种处理之间的p值。p值<0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用统计软件R(v.4.0)和package emmeans(v.1.5.4)进行。
结果
图9至16中示出了这个实施例的结果。从这个意义上讲，本文注意到，图11示出在肉眼可见的心脏肥大(a)、HW/BW比率(b)方面，在前3天内开始的siYy1疗法预防MI诱导的心脏肥大。在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平(c)方面，在前7天内开始的siYyl疗法预防MI诱导的心脏肥大。在第14天开始的siYy1疗法没有效果。图12示出在显著降低LV射血分数(a)和缩短分数(b)下降方面，在前3天内开始的siYy1疗法预防LV收缩功能障碍。在降低LV舒张末期内径和收缩末期内径(c、d)以及LV舒张末期容积和收缩末期容积(e、f)增加方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防LV扩大。在第14天开始的siYy1疗法没有效果。此外，如图13所示，在显著降低天狼星红染色(a)(小图b中的代表性图像)以及显著降低不同纤维化相关标志物基因失调(TGF-β,α-sma,Col1a1和Col3a1)的水平(c-f)方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防梗死心肌的纤维化。在第14天开始的疗法没有效果。图14示出在降低CD45阳性染色(a)(小图b中的代表性图像)和炎症相关特异性标志物的水平(c-d)方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防梗死心肌的炎症。在第14天开始的疗法没有效果。图15示出在显著降低半胱天冬酶3蛋白水平(a)以及BNP和MyO的mRNA水平的增加(c-d)方面，在前7天内开始的siYy1疗法预防细胞死亡。如图16所示，siYy1疗法预防源自人诱导性多能干细胞(iPs)的心肌细胞的拉伸诱导性肥大。与对照组(Scr)相比，源自人iPs的心肌细胞(hiPsCM)中的Yy1 mRNA水平在拉伸后(PMA+Scr)升高(p<0.001)并且其通过siYy1疗法(siYy1+PMA)显著降低(p<0.001)(a)。在肥大相关标志物基因Myh7(与Myh6相关)和Nppa的水平(b,c)方面，siYy1疗法预防拉伸诱导的心脏肥大。
序列表
<110> 穆尔西亚大学
<120> 急性心肌梗死后左心室功能障碍的治疗方法
<130> 906 181
<140> PCT
<141> 2021-06-09
<160> 68
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (1) 正义序列
<400> 1
cuguugucca gaauacuuau u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (1) 反义序列
<400> 2
uaaguauucu ggacaacagu u 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (2) 正义序列
<400> 3
cauguagaau caaauauuau u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (2) 反义序列
<400> 4
uaauauuuga uucuacaugu u 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (3) 正义序列
<400> 5
gcuccaagaa caauagcuuu u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (3) 反义序列
<400> 6
aagcuauugu ucuuggagcu u 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (4) 正义序列
<400> 7
caacuaaccu gaaaucucau u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA (4) 反义序列
<400> 8
ugagauuuca gguuaguugu u 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非靶向 Accell siRNA 正义序列 (siCtrl)
<400> 9
uagcgacuaa acacaucaau u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非靶向 Accell siRNA 反义序列 (siCtrl)
<400> 10
uugauguguu uagucgcuau u 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BNP-F
<400> 11
cgtcttggcc ttttggcttc 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BNP-R
<400> 12
ggtggtctag caggttcttg aaa 23
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Col1a1-F
<400> 13
ctggcaagaa gggagatga 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Col1a1-R
<400> 14
caccatccaa accactgaaa 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Col3a1-F
<400> 15
acagcaaatt cacttacaca gttc 24
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Col3a1-R
<400> 16
ctcattgcct tgcgtgttt 19
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRP-F
<400> 17
gaactttcag ccgaatacat ctttt 25
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRP-R
<400> 18
ccttcctcga catgtctgtc t 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-33-F
<400> 19
cagaatcatc gagaaaaggc gg 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-33-R
<400> 20
gccggggaaa tcttggagtt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6-F
<400> 21
cacttcacaa gtcggaggct 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6-R
<400> 22
tgccattgca caactctttt ct 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh6-F
<400> 23
accaacctgt ccaagttccg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh6-R
<400> 24
gtcgtgcatc ttcttggcac 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh7-F
<400> 25
cgcatcaagg agctcaccta 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh7-R
<400> 26
cttggacagg ttggtgttgg 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MyO-F
<400> 27
catggttgca ccgtgctcac ag 22
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MyO-R
<400> 28
gagcccatgg ctcagccctg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nppa-F
<400> 29
gcttccaggc catattggag 20
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nppa-R
<400> 30
gggggcatga cctcatctt 19
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTX3-F
<400> 31
caggatgcac gcttccaaaa a 21
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PTX3-R
<400> 32
tgcccgcagg ttgtgaaac 19
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Smad2-F
<400> 33
aagccatcac cactcagaat tg 22
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Smad2-R
<400> 34
cactgatcta ccgtatttgc tgt 23
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Smad3-F
<400> 35
gaggagaagt ggtgcgagaa g 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Smad3-R
<400> 36
atgcacttgg tgttcacgtt c 21
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sST2-F
<400> 37
gctaggacct ctggctaatg tatc 24
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sST2-R
<400> 38
atggtgtgtt cactaggcgg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2L-F
<400> 39
tgggcaaggt aaaccgactg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ST2L-R
<400> 40
caccccctcc tcactaccta 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF-b-F
<400> 41
caacccaggt ccttcctaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF-b-R
<400> 42
ggagagccct ggataccaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-a-F
<400> 43
agttctatgg cccagaccct 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-a-R
<400> 44
ggtggtttgc tacgacgtg 19
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Yy1-F
<400> 45
tgagaaagca tctgcacacc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Yy1-R
<400> 46
cgcaaattga agtccagtga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> a-SMA-F
<400> 47
gtgctgtccc tctatgcctc tgg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> a-SMA-R
<400> 48
ggcacgttgt gagtcacacc atc 23
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 5 正义序列
<400> 49
cauguaguau caaauauua 19
<210> 50
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 5 反义序列
<400> 50
uaauauuuga uacuacaug 19
<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 6 正义序列
<400> 51
gggauaugcu uaguaaugc 19
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 6 反义序列
<400> 52
uaauauuuga uacuacaug 19
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 7 正义序列
<400> 53
cucaguugua gaauguauu 19
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 7 反义序列
<400> 54
uaauauuuga uacuacaug 19
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 8 正义序列
<400> 55
caacuaaccu gaaaucuca 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA 8 反义序列
<400> 56
uaauauuuga uacuacaug 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-F
<400> 57
gtgaaggtcg gtgtgaacg 19
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-R
<400> 58
tcgttgatgg caacaatctc 20
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-F
<400> 59
tcaacgacca ctttgtcaag ctca 24
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH-R
<400> 60
gctggtggtc caggggtctt act 23
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh6-F
<400> 61
caagccaaca ccaacctgtc c 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh6-R
<400> 62
ttggcaagag tgaggttccc 20
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh7-F
<400> 63
ctcgccagaa tggagtacaa a 21
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Myh7-R
<400> 64
cttcatccag ggccaattct 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nppa-F
<400> 65
ccccggttca gcctcggact 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nppa-R
<400> 66
acggatgccc tcggtggcta 20
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Yy1-F
<400> 67
acatctgcac acccacggt 19
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Yy1-R
<400> 68
gcgtttccca cagccttcg 19
Claims (12)
1.一种组合物，包含化合物，相对于在不存在所述化合物的情况下在心脏细胞中观察到的表达，所述化合物能够降低人或动物对象的所述心脏细胞中Yin Yang-1(Yy1)基因的表达，其中所述化合物是Yy1基因的RNA干扰(RNAi)，并且其中所述组合物用于治疗所述对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中，并且其中在所述对象发作心肌梗死(AMI)后12小时至7天之间施用所述组合物。
2.根据权利要求1使用的所述组合物，其中在所述对象发作心肌梗死(AMI)后1天至7天之间施用所述组合物。
3.根据权利要求1使用的所述组合物，其中在所述对象发作心肌梗死(AMI)后12小时至3天之间施用所述组合物。
4.根据权利要求1使用的所述组合物，其中在所述对象发作心肌梗死(AMI)后1天至3天之间施用所述组合物。
5.根据权利要求1使用的所述组合物，其中在所述对象发作心肌梗死(AMI)后3天至7天之间施用所述组合物。
6.根据权利要求3或4中任一项使用的所述组合物，其中，通过预防、治疗、减轻或降低LV射血分数和/或缩短分数的损失，所述组合物用于治疗所述对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中。
7.根据权利要求3或4中任一项使用的所述组合物，其中，通过预防、治疗、减轻或降低MI诱导的心脏肥大，所述组合物用于治疗所述对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中。
8.根据权利要求5使用的所述组合物，其中，通过预防、治疗、减轻或降低LV扩大，所述组合物用于治疗所述对象心肌梗死(AMI)后左心室(LV)功能障碍的方法中。
9.根据权利要求1至8中任一项使用的所述组合物，其中所述Yy1基因的干扰RNA(RNAi)是选自由任意下列化合物组成的列表的siRNA：具有正义SEQ ID NO 1和反义SEQ ID NO 2的化合物1、具有正义SEQ ID NO 3和反义SEQ ID NO 4的化合物2、具有正义SEQ ID NO 5和反义SEQ ID NO 6的化合物3、具有正义SEQ ID NO 7和反义SEQ ID NO8的化合物4、具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQ ID NO 50的化合物5、具有正义SEQ IDNO 51和反义SEQ ID NO52的化合物6、具有正义SEQ ID NO 53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ IDNO 55和反义SEQ ID NO 56的化合物8。
10.根据权利要求1至8中任一项使用的所述组合物，其中所述Yy1基因的干扰RNA(RNAi)是选自由任意下列化合物组成的列表的siRNA：具有正义SEQ ID NO 49和反义SEQID NO 50的化合物5、具有正义SEQ ID NO 51和反义SEQ ID NO 52的化合物6、具有正义SEQID NO 53和反义SEQ ID NO 54的化合物7、和具有正义SEQ ID NO 55和反义SEQID NO 56的化合物8。
11.根据权利要求1至10中任一项使用的所述组合物，其中通过静脉内施用所述化合物。
12.根据权利要求1至8中任一项使用的所述组合物，其中所述组合物是药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的如权利要求9或10定义的siRNA或表达这些寡核苷酸的运载体和药学上可接受的载体。
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