CN116438305A - 用于治疗心力衰竭的miRNA的组合抑制 - Google Patents

用于治疗心力衰竭的miRNA的组合抑制 Download PDF

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CN116438305A CN202180065249.9A CN202180065249A CN116438305A CN 116438305 A CN116438305 A CN 116438305A CN 202180065249 A CN202180065249 A CN 202180065249A CN 116438305 A CN116438305 A CN 116438305A
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袁婷
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Abstract

本发明涉及针对miRNA组合的抑制性核酸剂组合，其用于治疗心力衰竭。所述被抑制的miRNA的组合包括选自miR‑1a和miR‑15b；或miR‑1a、miR‑15b和miR‑27b；或miR‑1a、miR‑27b和miR‑34a的组的一个。对这些miRNA的组合抑制显示增加心肌细胞增殖。

Description

用于治疗心力衰竭的miRNA的组合抑制
技术领域
本发明涉及针对miRNA组合的抑制性核酸剂组合，其用于治疗心力衰竭。所述被抑制的miRNA的组合包括选自miR-1a和miR-15b；或miR-1a、miR-15b和miR-27b；或miR-1a、miR-27b和miR-34a的组的一个。对这些miRNA的组合抑制显示增加心肌细胞增殖。
背景技术
心血管疾病是世界上死亡的主要原因。特别是心力衰竭是心血管发病和死亡的主要原因。心力衰竭由心肌梗塞、慢性高血压、心脏纤维化和炎症引起的心脏适应不良的重塑引起。心肌细胞的损失是心力衰竭的主要标志。然而，在成人心脏以及衰竭的人心脏中存在的心肌细胞增殖能力有限。因此，用再生方法补充丢失的心肌细胞对于恢复心脏的收缩能力将是必要的。因此，靶向心肌细胞增殖是用于心肌再生和修复的潜在新治疗策略之一。
小的调节性microRNA(miRNA)是抑制基因表达的小的、约22个核苷酸的非编码RNA，其增强了它们的靶向编码蛋白的mRNA的降解或衰变。miRNA通过与靶mRNA的3′-非翻译区域结合，在转录后水平调控基因表达。已经显示许多miRNA在心肌病中被调节，并且microRNA过表达或单miRNA的抑制可以通过靶向参与炎症、代谢和心脏功能的关键基因来干扰心力衰竭的发展。鉴于在健康和疾病中的基因表达调节中的重要作用，miRNA已经成为多种疾病的潜在治疗靶标。
基于上述现有技术，本发明的目的是提供治疗心力衰竭的手段和方法。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现。
发明内容
本发明的第一方面涉及用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合。每个核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA。核酸剂组合能够抑制和/或降解细胞内的microRNA组合。被抑制的或被降解的microRNA的组合是
a.miR-1a，和
b.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b，或
miR-27b和miR-34a。
本发明的第二方面涉及一种表达构建体、或多种表达构建体，其在人心肌细胞中可操作的启动子的控制下，编码用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合。每个核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA，从而抑制和/或降解microRNA的组合。所述microRNA的组合包括
a.miR-1a，和
b.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b，或
miR-27b和miR-34a。
本发明的第三方面涉及用于治疗或预防心脏病的药物组合物，其包括根据第一方面的核酸剂组合、或根据第二方面的多种表达构建体。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其包括至少一个本发明的化合物或其药学上可接受的盐和至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
具体实施方式
术语和定义
为了解释本说明书，将应用以下定义，并且在任何适当的时候，以单数使用的术语也将包含复数，反之亦然。在以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献冲突的情况下，将以所阐述的定义为准。
如本文所用，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”以及其它类似形式及其语法等效物旨在在含义上等效并且是开放式的，因为这些词语中的任一个之后的一个或多个项并不意味着是这一个或多个项的详尽列表，或者意味着仅限于所列出的一个或多个项。例如，“包括”组分A、B、和C的物可以由组分A、B、和C组成(即，仅含有组分A、B、和C)，或者可以不仅含有组分A、B、和C，而且可以包括一或更多个其它组分。因此，意图并理解的是，“包括”及其类似形式及其语法等同形式包含“基本上由……组成”或“由……组成”的实施例的公开。
在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在所述范围的上限与下限之间的到下限的单位的十分之一的每一中间值，和在所述范围中的任何其它陈述的，或中间值包含在本发明内，但受所述范围中的任何特定排除的限制。在所述范围包含一个或二个限值的情况下，排除那些所包含的限值中的任一个或二个的范围也包含在本公开中。
本文提及的“约”值或参数包含(且描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包含“X”的描述。
如本文所用，包含在所附权利要求中，单数形式“一”、“或”、和“所述”包含复数指代物，除非上下文另外清楚地指明。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同的含义。标准技术使用于分子、遗传和生物化学方法(一般见Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,4th ed.(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology(2002)5th Ed,John Wiley&Sons,Inc.)以及化学方法。
在本说明书的上下文中，术语能够形成杂交或杂交序列涉及在哺乳动物细胞的胞质溶胶内存在的条件下，能够选择性结合其靶序列的序列。这样的杂交序列可以与靶序列连续反向互补，或可以包括缺口、错配或额外的非匹配核苷酸。能够形成杂交体的序列的最小长度取决于其组成，其中C或G核苷酸比A或T/U核苷酸对结合能贡献更多，并且取决于骨架化学。
在本说明书的上下文中，术语核苷酸涉及核酸或核酸类似物结构单元，其寡聚物，能够基于碱基配对与RNA或DNA寡聚物形成选择性杂交。在此上下文中，术语核苷酸包含典型的核糖核苷酸结构单元腺苷、鸟苷、尿苷(和核糖基胸腺嘧啶)、胞苷、典型的脱氧核糖核苷酸脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷。它还包含核酸的类似物，例如磷酸二酯、2′-O-甲基硫代磷酸酯、肽核酸(PNA；通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元，其中核碱基连接到甘氨酸的α-碳)或锁核酸(LNA；2′-O、4′-C亚甲基桥连的RNA结构单元)。无论本文中何处提及杂交序列，此类杂交序列可由任何上述核苷酸或其混合物组成。
本说明书的上下文中，术语miRNA(microRNA)涉及在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用的小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)。
本说明书的上下文中，术语反义寡核苷酸涉及具有与RNA基本互补、并能够与RNA杂交的序列的寡核苷酸。对这种RNA的反义作用将导致对RNA生物学效应的调节，特别是抑制(inhibition)或阻抑(suppression)。如果RNA是mRNA，则所得基因产物的表达被抑制或被阻抑。反义寡核苷酸可以由DNA、RNA、核苷酸类似物和/或其混合物组成。技术人员知道用于计算给定靶的理论上最佳反义序列的各种商业和非商业来源。可以在核碱基序列方面和在骨架(核糖、脱氧核糖、类似物)组成方面进行优化。存在许多用于递送实际物理寡核苷酸的来源，所述实际物理寡核苷酸通常通过固态合成来合成。本发明的反义寡核苷酸的实例，是由DNA、在其主链中具有硫代磷酸酯修饰的键的DNA、核糖核苷酸寡聚物、包括桥连或锁定的核苷酸的RNA(特别是其中核糖环通过2′-O和4′-C原子之间的亚甲基桥连接)、在其主链中具有硫代磷酸酯修饰的键的RNA，或作为寡聚物的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸碱基的任何混合物，制成的反义寡聚物。
在某些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包括核酸类似物，例如磷酸二酯、2′-O-甲基硫代磷酸酯、肽核酸(PNA；通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元，其中核酸碱基连接到甘氨酸的α-碳)或锁核酸(LNA；2′-O、4′-C亚甲基桥连的RNA结构单元)。反义序列可以部分地由任何上述核酸类似物组成，其余核苷酸是天然存在的“天然”核糖核苷酸，或者可以是不同类似物的混合物，或者可以完全由一种类似物组成。
在本说明书的上下文中，术语核酸表达载体涉及用于用某一目的基因转染(在质粒的情况下)或转导(在病毒基因组的情况下)靶细胞的质粒或病毒基因组。目的基因在启动子序列的控制下，并且启动子序列在靶细胞内是可操作的，因此，目的基因组成型地或响应刺激或依赖于细胞的状态而转录。在某些实施方案中，病毒基因组被包装到衣壳中以成为能够转导靶细胞的病毒载体。
与本文公开的序列相似或同源(例如，至少约70％序列同一性)的序列也是本发明的一部分。在核酸水平，序列同一性可以是约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当核酸区段在选择性杂交条件(例如，非常高严格性杂交条件)下与链的互补物杂交时，存在基本同一性。核酸可以以全细胞、细胞裂解物、或部分纯化或基本纯的形式存在。
在本说明书的上下文中，术语序列同一性和序列同一性百分比是指代表通过逐个位置比较二个比对序列确定的序列比较结果的单一定量参数。用于比对序列以进行比较的方法是本领域公知的。用于比较的序列比对可以通过Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的全局比对算法、通过Pearson and Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性搜索方法、或通过这些算法的计算机化实施来进行，包括但不限于：CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。进行BLAST分析的软件是公众可获得的，例如通过国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。
用于核酸序列比较的一个这样的例子是BLASTN算法，其使用默认设置：期望阈值：10；字长：28；查询范围中的最大匹配：0；匹配/不匹配分数：1.–2；空位罚分：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指使用BLAST程序套件(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403–410(1990))用上述指明的默认参数进行蛋白质和核酸比较得到的值。
提及相同序列而没有指定百分比值暗示100％相同的序列(即相同序列)。
在本说明书的上下文中，术语杂交序列包括了，包括RNA(核糖核苷酸)、DNA(脱氧核糖核苷酸)、硫代磷酸脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基修饰的硫代磷酸核糖核苷酸、LNA和/或PNA核苷酸类似物或基本上由其组成的，多核苷酸序列。
本文所用的术语药物组合物是指本发明的化合物、或其药学上可接受的盐，以及至少一个药学上可接受的载体。在某些实施方式中，根据本发明的药物组合物以适于局部、肠胃外或可注射的施用的形式提供。
如本文所用，术语药学上可接受的载体包含本领域技术人员已知的任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合(参见例如Remington:the Science and Practice of Pharmacy,ISBN0857110624)。
如本文所用，术语治疗或治疗任何疾病或病症(例如癌症)是指，在一个实施方式中，改善疾病或病症(例如减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方式中，治疗或治疗是指减轻或改善至少一种身体参数，包含患者可能无法辨别的那些。在另一个实施方案中，治疗或治疗是指调节疾病或病症，在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)、或在二者上。除非下文具体描述，否则评估疾病的治疗和/或预防的方法通常是本领域已知的。
miR-1a：
hsa-miR-1-3p：登录号：MIMAT0000416；UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU(SEQ ID NO019)。
MMU-miR-1-3p：登录号：MIMAT0000123；UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU(SEQ ID NO020)。
miR-15b：
hsa-miR-15b-5p：登录号：MIMAT0000417；UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA(SEQ ID NO021)。
mmu-miR-15b-5p：登录号：MIMAT0000124；UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA(SEQ ID NO022)。
miR-27b：
hsa-miR-27b-5p：登录号：MIMAT0004588；AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC(SEQ ID NO023)。
mmu-miR-27b-5p：登录号：MIMAT0004522；AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC(SEQ ID NO024)。
miR-34a：
hsa-miR-34a-5p：登录号：MIMAT0000255；UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO025)。
mmu-miR-34a-5p：登录号：MIMAT0000542；UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(SEQ ID NO026)。
本发明的第一方面涉及用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合。每个核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA。核酸剂组合能够抑制和/或降解细胞内的microRNA组合。被抑制的或被降解的microRNA的组合是
a.miR-1a，和
b.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b，或
miR-27b和miR-34a。
在某些实施方案中，microRNA的组合包括miR-1a和miR-15b。
当细胞分裂停止时，在P7大鼠心肌细胞中测试核酸剂组合(图3)。这种情况最类似于心力衰竭中的治疗情况，因为在心力衰竭治疗情况下，心肌细胞的细胞分裂也已经停止。本发明人发现miR-1a和miR-15b的组合诱导以末期心肌细胞的百分比测量的最高的细胞分裂率(图3)。
在某些实施方案中，核酸剂是反义核苷酸。
在某些实施方案中，每种核酸剂包括核苷酸的杂交序列。在某些实施方案中，每种核酸剂基本上由核苷酸的杂交序列组成。核苷酸的杂交序列能够与其各自的靶microRNA形成杂交体。
在某些实施例中，每一核酸剂包括选自序列SEQ ID NO 001–004的(不同)序列。在某些实施例中，每一核酸剂基本上由选自序列SEQ ID NO 001–004的(不同)序列组成。
在某些实施例中，每一核酸剂包括选自序列SEQ ID NO 001–002的(不同)序列。在某些实施例中，每一核酸剂基本上由选自序列SEQ ID NO 001–002的(不同)序列组成。
在某些实施方案中，核酸剂中的一个包括一个或几个锁核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)部分或基本上由其组成。在某些实施方案中，所有所述核酸剂包括一个或几个锁核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)部分或基本上由其组成。在某些实施方案中，核酸剂基本上由锁核酸(LNA)部分组成。
在某些实施方案中，核酸剂中的一个包括连接相邻(脱氧)核糖核苷部分或核糖核苷酸类似物部分的一个或几个硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，几个或所有核酸剂包括连接相邻(脱氧)核糖核苷部分或核糖核苷酸类似物部分的一个或几个硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，核酸剂中的一个包括通过硫代磷酸酯键连接至相邻核糖核苷或核糖核苷酸类似物部分的LNA部分。在某些实施方案中，核酸剂中的一个包括在核酸剂的任一端通过硫代磷酸酯键连接的2、3或4个LNA部分。
在某些实施方案中，所述核酸剂中的一个在细胞内从包括编码在人心肌细胞中可操作的启动子控制下的核苷酸杂交序列的序列外源(转基因)表达构建体表达。
在某些实施方案中，几个或所有所述核酸剂在细胞内从包括编码在人心肌细胞中可操作的启动子控制下的核苷酸杂交序列的序列外源(转基因)表达构建体表达。
本发明的第二方面涉及一种表达构建体、或多种表达构建体，其在人心肌细胞中可操作的启动子的控制下，编码用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合。每个核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA，从而抑制和/或降解microRNA的组合。所述microRNA的组合包括
a.miR-1a，和
b.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b，或
miR-27b和miR-34a。
在某些实施方案中，microRNA的组合包括miR-1a和miR-15b。
在某些实施方案中，每个和所有表达构建体包括在单个核酸分子内。
在某些实施方案中，包括所有表达构建体的单个核酸分子是多顺反子构建体，其具有几个开放阅读框，一个开放阅读框对应于本发明的核酸剂组合中的一个。
在某些实施方案中，核酸剂或表达构建体与纳米颗粒结合或被选自病毒和脂质体的颗粒结构包封。
脂质体是具有至少一个脂双层的球形囊泡。脂质体可以通过破坏生物膜(例如通过超声处理)来制备。脂质体的主要类型是多层囊泡(MLV，具有几个层状相脂质双层)、小单层脂质体囊泡(SUV，具有一个脂质双层)、大单层囊泡(LUV)和蜗状囊泡。
纳米颗粒是直径在1和100纳米(nm)之间的物质的颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒由选自银、金、羟基磷灰石、粘土、二氧化钛、二氧化硅、二氧化锆、碳、金刚石、氧化铝和三氟化镱的材料组成。
在某些实施方案中，病毒选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、和腺伴随病毒，或上述病毒的杂合体。在某些实施方案中，病毒选择性转导心肌细胞。
在某些实施方式中，纳米颗粒或颗粒结构包括促进纳米颗粒或颗粒结构递送至心肌细胞或进入心肌细胞的配体。在某些实施方案中，配体选自抗CD71 Fab′片段和抗cTnIFab′片段。这些配体通过靶向心肌细胞特异性细胞表面受体以进行靶向递送而发挥作用。
在某些实施方案中，启动子允许所述核酸剂的心脏特异性表达。在某些实施方案中，启动子是心脏组织特异性RNA聚合酶2启动子。在某些实施方案中，启动子选自肌球蛋白轻链2v(MLC2v)启动子、心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子、肌球蛋白重链α(MHCa)启动子和肌联蛋白(Ttn)启动子。
在某些实施方案中，心脏病的特征在于心肌细胞的损失。在某些实施方案中，所述心脏病是特征在于心肌细胞损失的心力衰竭。在某些实施方案中，心力衰竭是心肌梗塞、狭窄、先天性疾病、炎症和/或败血症的结果。
在某些实施方案中，心脏病的特征在于心肌细胞缺氧。
心力衰竭(HF)发生在心脏不能充分泵送以维持血流满足身体需要时，并且如果不治疗会导致死亡。HF是适应症包含冠状动脉疾病、缺血性心脏病、主动脉狭窄、高血压和代谢疾病的疾病进展的顶点。心力衰竭可能由心肌细胞的损失引起。心肌细胞通常由于氧供应不足(缺氧)而失去。使用本发明的核酸剂组合触发剩余的心肌细胞分裂并替代失去的心肌细胞。
本发明的第三方面涉及用于治疗或预防心脏病的药物组合物，其包括根据第一方面的核酸剂组合、或根据第二方面的多种表达构建体。
在某些实施方案中，将药物组合物给予心脏。
医学治疗、剂型和盐
类似地，在本发明的范围内的是治疗有需要的患者的心脏病的方法，其包括向所述患者施用根据以上描述的核酸序列。
类似地，提供了用于预防或治疗心脏病的剂型，其包括根据本发明的上述方面或实施方案中的任一个的反义分子。
技术人员知道任何具体提及的药物可以作为所述药物的药学上可接受的盐存在。药学上可接受的盐包括离子化的药物和带相反电荷的抗衡离子。药学上可接受的阴离子盐形式的非限制性实例包含乙酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、酒石酸氢盐、溴盐、碳酸盐、氯盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、恩波酸盐、十二烷基磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、溴化甲基盐、硫酸甲基盐、黏酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、帕莫酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、水杨酸盐、水杨酸氢盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、碘化三乙基盐和戊酸盐。药学上可接受的阳离子盐形式的非限制性实例包含铝盐、苄星盐、钙盐、乙二胺盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、钾盐、普鲁卡因盐、钠盐、氨丁三醇盐和锌盐。
剂型可以是用于肠内施用，例如鼻、颊、直肠、经皮或口服施用，或作为吸入形式或栓剂。或者，可以使用肠胃外给药，例如皮下、静脉内、肝内或肌内注射形式。任选地，可以存在药学上可接受的载体和/或赋形剂。
局部给药也在本发明的有利用途的范围内。本领域技术人员知道用于提供局部制剂的宽范围的可能配方，例如Benson and Watkinson(Eds.),Topical and TransdermalDrug Delivery:Principles and Practice(1st Edition,Wiley 2011,ISBN-13:978-0470450291)；和Guy and Handcraft:Transdermal Drug Delivery Systems:Revised andExpanded(2nd Ed.,CRC Press 2002,ISBN-13:978-0824708610)；Osborne and Amann(Eds.):Topical Drug Delivery Formulations(1st Ed.CRC Press 1989；ISBN-13:978-0824781835)。
药物组合物和给药
本发明的另一方面涉及包括本发明化合物、或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的载体，的药物组合物。在进一步的实施方式中，组合物包括至少二个药学上可接受的载体，例如本文所述的那些。
在本发明的某些实施方式中，本发明的化合物通常被配制成药物剂型以提供药物的容易控制的剂量并给予患者简洁的且容易操作的产品。
在涉及本发明化合物的局部用途的本发明实施方式中，以适于局部给药的方式配制药物组合物，例如水溶液、悬浮液、软膏、乳膏、凝胶或可喷雾制剂，例如用于通过气雾剂等递送，包括活性成分以及本领域技术人员已知的增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂中的一或更多个一起。
所述药物组合物可以配制成用于口服给药、肠胃外给药、或直肠给药。此外，本发明的药物组合物可以制成固体形式(包含但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂或栓剂)，或液体形式(包含但不限于溶液、悬浮液或乳液)。
本发明化合物的剂量方案将根据已知因素而变化，例如特定药剂的药效学特征及其施用模式和途径；接受者的人种、年龄、性别、健康、医学状况、和体重；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗频率；给药途径、患者的肾和肝功能、以及所需的效果。在某些实施方式中，本发明的化合物可以以单次日剂量施用，或者总日剂量可以以每日二次、三次、或四次的分剂量施用。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物或组合可以是约1–1000mg活性成分的单位剂量，用于约50–70kg的受试者。化合物、药物组合物、或其组合的治疗有效剂量取决于所治疗的受试者的物种、体重、年龄和个体状况、病症或疾病或其严重性。普通的内科医生、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病进展所需的每个活性成分的有效量。
本发明的药物组合物可以进行常规的制药操作，例如灭菌和/或可以含有常规的惰性稀释剂、润滑剂、或缓冲剂，以及佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。它们可以通过标准方法生产，例如通过常规的混合、制粒、溶解或冻干方法。许多制备药物组合物的程序和方法是本领域已知的，参见例如L.Lachman et al.The Theory andPractice of Industrial Pharmacy,4th Ed,2013(ISBN 8123922892)。
本发明还包括以下项：
项
1.一种用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中每个所述核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA，由此所述核酸剂组合能够抑制和/或降解细胞内的microRNA组合，其中所述microRNA组合是
a.miR-1a，和
b.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b，或
miR-27b和miR-34a。
2.根据项1所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述microRNA组合包括miR-1a和miR-15b。
3.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中每个核酸剂包括核苷酸杂交序列、或基本上由其组成，所述核苷酸杂交序列能够与靶microRNA形成杂交体。
4.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中每个核酸剂包括选自序列SEQ ID NO 001–004的序列、或基本上由其组成。
5.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个包括以下或基本上由其组成，
特别是其中所有所述核酸剂包括以下或基本上由其组成，
一个或几个锁核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)部分，特别是其中所述核酸剂基本上由锁核酸(LNA)部分组成。
6.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个包括，
特别是其中所有所述核酸剂包括
一个或几个硫代磷酸酯键。
7.根据前述项5或6任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个包括通过硫代磷酸酯键与相邻部分连接的LNA部分，
特别是其中所述核酸剂中的一个包括在其任一端通过硫代磷酸酯键连接的2、3或4个LNA部分。
8.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个是，
特别是其中所有所述核酸剂是，
在细胞内由包括编码在人心肌细胞中可操作的启动子控制下的核苷酸杂交序列的序列外源(转基因)表达构建体表达。
9.一种用于治疗或预防心脏病的表达构建体、或多种表达构建体，其在人心肌细胞中可操作的启动子的控制下编码核酸剂组合，其中每个所述核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA，从而抑制和/或降解microRNA的组合，其中所述microRNA的组合包括
a.miR-1a，和
b.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b，或
miR-27b和miR-34a；
特别是其中所述microRNA的组合包括miR-1a和miR-15b。
10.根据项9所述的用于治疗或预防心脏病的多种表达构建体，其中每个和所有所述表达构建体中包括在单个核酸分子内。
11.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或表达构建体，其中所述核酸剂或所述表达构建体被结合至纳米颗粒或被选自病毒和脂质体的颗粒结构包封。
12.根据项11所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或表达构建体，其中所述纳米颗粒、或所述颗粒结构包括配体，所述配体促进纳米颗粒或颗粒结构递送至心肌细胞或进入心肌细胞。
13.根据项9至12任一所述的用于治疗或预防心脏病的表达构建体、或多种表达构建体，其中所述启动子允许所述核酸剂的心脏特异性表达，特别是其中所述启动子是心脏组织特异性RNA聚合酶2启动子，特别是选自肌球蛋白轻链2v(MLC2v)启动子、心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子、肌球蛋白重链α(MHCa)启动子、和肌联蛋白(Ttn)启动子的启动子。
14.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或多种表达构建体，其中所述心脏病的特征在于心肌细胞的损失，特别是所述心脏病的特征在于心肌细胞损失的心力衰竭，更特别是所述心力衰竭是心肌梗塞、狭窄、先天性疾病、炎症和/或脓毒症的结果。
15.根据前述项任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或多种表达构建体，其中所述心脏病的特征在于心肌细胞缺氧。
16.一种用于治疗或预防心脏病的药物组合物，其包括根据前述项任一的所述核酸剂组合、或所述多种表达构建体。
17.根据项16所述的用于治疗或预防心脏病的药物组合物，其中所述药物组合物被给予至心脏。
通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从这些实施例和附图中可以得到进一步的实施方式和优点。这些实施例用于说明本发明，而不是限制其范围。
附图说明
图1通过EdU筛选缩小候选miRNA LNA。发明人选择了17种miRNA作为负调节心肌细胞增殖的因子的候选物。为了敲低大鼠心肌细胞中的这些miRNA，在本研究中使用来自Exiqon的锁核酸(LNA)。用从17LNA的库中除去单个因子处理大鼠新生心肌细胞，同时用17LNA一起处理细胞作为对照。处理2天后，通过双重染色分析DNA合成(EdU)的EdU(绿色)和α-肌动蛋白(红色)(A、B、C)。(D)通过qRT-PCR分析miRNA表达水平。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01。通过双尾Student’s t检验进行统计学分析。
图2体外大鼠心肌细胞的细胞增殖。基于EdU筛选，发明人选择了DNA合成所必需的5个LNA(LNA-1a、LNA-15b、LNA-27b、LNA-34c)。为了鉴定最佳组合，在新生大鼠心肌细胞中处理所有组合LNA，然后通过Aurora B(绿色)、α-肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)的三重染色分析心肌细胞增殖(A、B)。基于Aurora B筛选，发明人选择了2种可以增加心肌细胞增殖的组合。通过Aurora B分析心肌细胞增殖(B、C、E)，并通过qRT-PCR分析miRNA表达水平(D、F)。*P<0.05、**P<0.01。
图3 7天龄大鼠心肌细胞的细胞体外增殖。发明人选择LNA-1a、LNA-15b和LNA-27b，并测试所有组合在7天龄大鼠心肌细胞中的效果。用所有组合LNA处理大鼠心肌细胞2天，并通过Aurora B(绿色)、α-辅肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)的三重染色分析心肌细胞增殖(A、B)。通过qRT-PCR分析miRNA表达水平(C)。*P<0.05、**P<0.01。
图4miRNA体内表达水平。对12周龄的小鼠注射单独的LNA-1a、LNA-15b、LNA-1a和LNA-15b的组合、或LNA-对照。注射7天后，收获左心室，并通过qRT-PCR分析miRNA基因表达(A、B、C和D)。通过pHH3(绿色)、α-辅肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)三重染色分析心肌细胞增殖(E和F)。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01。
图5 12周龄的小鼠经历心肌梗塞，然后注射LNA-1a和LNA-15b的组合、或LNA-对照。在第0、7、14、21和28天进行超声心动图(A)。(B)注射28天后，从小鼠收获整个心脏。(C、D)在远端区域、边界区域和梗塞区注射LNA-对照或LNA-1a/15b进行MI后miR-1a和miR-15b表达的分析。(E)心脏射血分数(％EF)的纵向监测。(F、G、H)在注射LNA和在远端区域、边界区域和梗塞区域的MI损伤后，通过qRT-PCR定量病理重塑标记基因(NPPA、my77和Myh7/myh6比值)。(I、J、K)在注射LNA和在远端区域、边界区域和梗塞区域的MI损伤后，通过qRT-PCR定量纤维化重塑标记基因(TGFβ2、Col3a1和Thbs1)。MI：心肌梗塞，NPPA：利钠肽，MYH7：β-肌球蛋白重链，MYH6：β-肌球蛋白重链(Myh7)对于假阳性的n＝5，对于MI的n＝7。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01。所有这些都通过单向ANOVA分析，随后是Dunnett’s多重比较后检验。
图6心肌梗塞后，体内miR-1a和miR-15b的抑制增加心肌细胞增殖。(A)MI损伤后28天，注射LNA-1a/15b或对照的成年心脏切片上Ki67的代表性免疫荧光图像。Ki67标记增殖细胞(绿色)；心肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)。(B)Ki67+心肌细胞百分比的定量。(C)MI损伤后28天，注射LNA-1a/15b或对照LNA-对照的成年心脏的心脏切片上的pHH3的代表性免疫荧光图像。pHH3标记增殖细胞(绿色)；心肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)。(D)pHH3+心肌细胞百分比的定量。(E)Aurora B在成年心脏的心脏切片上的代表性免疫荧光图像。Aurora B标记增殖细胞(绿色)；心肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)。(F)Aurora B+心肌细胞百分比的定量。数据表示为平均值±SEM。
*P<0.05、**P<0.01。所有这些都通过单向ANOVA分析，随后是Dunnett’s多重比较后检验。
图7人iPS-CM上的体外细胞增殖。用LNA-1a和LNA-15b的组合或LNA-对照处理人iPSC-CM，然后将细胞暴露于常氧(20％ O2)或低氧(3％ O2)2天。通过Aurora B分析心肌细胞增殖(A、B)。通过qRT-PCR分析miRNA表达水平(C、D)。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01。
图8LNA-1a和LNA-15b的组合对人类模拟组织中的心肌细胞增殖和心脏功能的影响。用LNA-1A/15b或LNA-对照处理人心脏类器官(A)，然后在常氧和低氧下培养3天(B、C)。通过qRT-PCR分析miR-1a和miR-15B表达水平。(D)在用LNA-1a/15b或对照LNA-对照处理的人心脏类器官的切片上的EdU的代表性免疫荧光图像。麦胚凝集素(WGA)标记细胞表面(绿色)；EdU标记增殖细胞(洋红)；心肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(红色)、和DAPI(蓝色)。(E)EdU+心肌细胞百分比的定量。(F)在常氧和低氧下用LNA-1a/15b或LNA-对照处理的单一培养心脏类器官切片上的pHH3的代表性免疫荧光图像。pHH3标记增殖细胞(绿色)；心肌细胞特异性α-辅肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)。(G)pHH3+心肌细胞百分比的定量。(H)在常氧和低氧下用LNA-1a/15b或LNA-对照处理人类单一培养心脏类器官3天，然后通过测定收缩的单一培养心脏类器官的振幅峰值进行收缩性测定。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01。所有这些都通过单向ANOVA分析，随后是Dunnett’s多重比较后检验。hiPSC-CM，人诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞。
图9LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a的组合对体外和体内心肌细胞增殖的影响。用LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a的组合、或LNA对照，处理大鼠新生心肌细胞2天。心肌细胞增殖通过Aurora B(绿色)、α-辅肌动蛋白(红色)和DAPI(蓝色)三重染色进行分析(A和B)。12周龄的小鼠分别注射LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a的组合、或LNA-对照，为期1周。心肌细胞增殖通过Ki67(绿色)、α-辅肌动蛋白(红色)、和DAPI(蓝色)三重染色进行分析(A和B)。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05、**P<0.01。
图10A：对用miR1a-LNA或miR-15a-LNA单独或组合(miR1a/15b-LNA)处理的成体心肌细胞进行深度RNA测序(RNaseq)。维恩图(A)揭示了在各自条件下的独有和共同基因。B：对应于生物过程(BP)途径的差异表达基因的基因本体论(GO)分析表明，与miR1a-LNA、miR-15a-LNA和miR1a/15B-LNA处理(共有)的共同途径相比，在用miR1a/15b(独有)处理的心肌细胞中独特途径的出现和激活(B)。C和D：在各自LNA处理后存在的细胞组分(CC)的GO分析表明，与miR1a-LNA、miR-15a-LNA和miR1a/15b-LNA处理(共有)的共同途径相比，在用miR1a/15b(独有)处理的心肌细胞中独特途径的出现和激活(C)。miR1a/15b-LNA治疗独有的基因与其与特定细胞组分(CC)途径的连接性描述于(D)中。
实施例
实施例1：筛选对促进心肌细胞增殖的miRNA的抑制
本发明人选择了17种miRNA作为诱导心肌细胞增殖的候选物。为了评价这17种候选miRNA，在体外大鼠心肌细胞中它们被基于锁核酸(LNA)的antimiR(LNA-miRNA)抑制。发明人开发了检测心肌细胞增殖的组合方法。为了确定17种候选LNA中的哪一种是关键的，发明人用所有17种LNA一起作为对照处理新生大鼠心肌细胞(NRC，P1)，并通过使用EdU(5-乙炔基-2′-脱氧尿苷)掺入检测从17种LNA的库中撤除单个LNA的心肌细胞增殖(图1A、1B和1C)。最初的EdU评估在LNA处理后48小时内进行，大鼠心肌细胞用肌节α-辅肌动蛋白标记。如图1B和1C所示，去除靶向miR-1a、miR-15B、miR-27B或miR-34C的单个LNA导致S期心肌细胞的数目减少。除去剩余的LNA没有显著影响心肌细胞增殖。通过定量实时PCR检测miRNA表达水平(图1D)。这些结果表明miR-1a、miR-15b、miR-27b和miR-34c在大鼠心肌细胞中的DNA合成中起重要作用。
实施例2：miR-1a和miR-15b的组合抑制诱导心肌细胞增殖
EdU作为DNA从头合成和S期掺入的重要标记，它阻碍了细胞周期完成和子细胞形成的确定。为了确定我们的miRNA驱动胞质分裂和细胞周期完成，本发明人利用Aurora B作为标记。Aurora B与内部着丝粒蛋白和有丝分裂存活素蛋白物理相关。它在有丝分裂早期与着丝粒异染色质结合，转移至中央纺锤体，并最终定位于收缩环和中体。因此，Aurora B染色和在收缩环和中体定位作为胞质分裂和细胞周期完成的标志物。
为了确定哪种组合可以增强胞质分裂，在1天龄的大鼠心肌细胞中测试了对应于靶向miR-1a、miR-15b、miR-27b和miR-34c的5种候选LNA的组合的31种条件。通过收缩环的共定位和用肌节α-辅肌动蛋白染色的中间体Aurora B染色来标记胞质分裂中的细胞来评估心肌细胞增殖(图2A和2B)。这些结果显示，2种组合(LNA-1a和LNA-15B；LNA-1a、LNA-15B和LNA-27B)比其它组合具有更多数量的末期心肌细胞(图
2B、2C和2E)。miRNA表达水平示于图2D和2F中。
此外，当细胞分裂停止时，在7天龄的大鼠心肌细胞(P7)中筛选来自靶向miR-1a、miR-15b和miR-27b的LNA的所有组合。48小时后，通过Aurora B染色评估心肌细胞增殖。LNA-1A和LNA-15B的组合导致7天龄大鼠心肌细胞中Aurora B在末期的进一步增强(图3A和3B)。miR-1a和miR-15b表达水平显示于图2D和2F中。这些数据表明miR-1a和miR-15b的组合抑制在体外有效和高效地增强P1和P7大鼠心肌细胞中的心肌细胞增殖。
实施例3：miR-1a和miR-15b的抑制增强体内心肌梗塞后的心脏功能
为了在体内敲低miR-1A和miR-15b，通过腹膜内注射施用基于LNA的antimiR(LNA-1A、LNA-15b)(图4A)。在12周龄小鼠中测试单一和组合LNA，并在注射后7天收获心脏。定量实时PCR证实了与LNA-对照相比，LNA之一或二者的成功递送(图4B、4C和4D)。为了确定LNA之一或二者对心肌细胞增殖的作用，发明人检查了pHH3的表达，并发现注射LNA-1a/15b后小鼠心脏中pHH3信号与LNA-对照相比增加(图4E和4F)。
为了确定miR-1A和miR-15B抑制对损伤后心肌细胞增殖和心脏功能的影响，通过在12周龄小鼠中，在心肌梗塞(MI)后4小时腹膜内注射抑制miR-1A和miR-15B(图5A)，并在第28天收获心脏(图5B)。在第0、7、14、21和28天进行超声心动图。28天后，收获心脏并将其分为3个部分：远端区域、边界区域和梗塞区域。与对照组相比，在LNA-1a/15b处理的小鼠中，miR-1a和miR-15b的miRNA水平在远端区域、边界区域和梗塞区域中显著降低(图5c和5D)。
通过超声心动图测定心脏功能，发明人发现，与对照组相比，注射LNA-1a/LNA-15b的小鼠在作为心脏收缩功能的量度射血分数(EF)方面表现出显著的增加(图5E)。发明人进一步检查了病理性肥大的分子标记物的表达，并且我们发现与对照LNA注射相比，在注射LNA-1a/15b后，在边界区域和梗塞区域中脑利钠肽(NPPA)和β-肌球蛋白重链(Myh7)都减少(图5F和5G)。MI诱导的Myh7：通过miR-1a和miR-15b的组合抑制，Myh6比率显著降低(图5H)。此外，MI后，通过注射LNA-1a/15b，在边缘区域和梗塞区域，纤维化相关基因(TGFβ2，Col3a1和Thbs1)的表达水平都被抑制(图5I，5J和5K)。这些结果表明LNA-1a/15b组合处理在MI中产生了显著更强的保护作用。
实施例4：miR-1a和miR-15b的抑制增加体内心肌梗塞后的心肌细胞增殖
发明人已证明，miR-1a和miR-15b的组合抑制驱动P1和P7大鼠心肌细胞中的心肌细胞增殖，因此发明人检查了miR-1a和miR-15b的抑制是否可类似地增加响应MI的心肌细胞增殖。为了确定成年小鼠心脏中的LNA-1a和LNA-15b是否能够增强心肌细胞增殖，发明人检测了LNA-1a和LNA-15b或对照LNA注射且MI后，小鼠心脏中的心肌细胞中的Ki67。与对照LNA相比，我们在对照小鼠和MI小鼠中注射LNA-1a和LNA-15b后，在心肌细胞中检测到Ki67信号增加(图6A和6B)。此外，发明人检查了pHH3的表达，并发现在LNA-1a/15b注射和MI后小鼠心脏中pHH3信号类似地增加(图6C和6D)。此外，发明人检验胞质分裂标记Aurora B，并发现LNA-1a/15b在对照和MI中诱导小鼠心肌细胞中Aurora B的表达(图6E和6F)。总之，这些数据表明LNA-1a/15b可在小鼠体内诱导响应于MI的心肌细胞增殖。
实施例5：miR-1a和miR-15b的抑制增强hiPSC-CM中的心肌细胞增殖
为了测试在人心肌细胞中的组合，发明人在有丝分裂后40天龄的人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(hiPSC-CM)中处理组合LNA(LNA-1a、LNA-15b)或阴性对照LNA(LNA-对照)。发明人观察到LNA-1a和LNA-15b在常氧条件和低氧条件下均增加心肌细胞增殖(图7A和7B)。通过定量实时PCR检测miRNA表达水平(图7C和7D)。
实施例6：miR-1a和miR-15b的组合抑制在拟人组织中增强心肌细胞增殖并改善心 脏功能
接下来，发明人确定miR-1A和miR-15b的组合是否影响人单一培养心脏类器官中的心肌细胞增殖和心脏收缩性(图8A)。发明人处理LNA-1a与LNA-15b的组合或LNA-对照，并将其在人类心脏类器官中于常氧和低氧中培养3天。定量实时PCR显示，在单一培养心脏类器官中，通过LNA处理，miR-1和miR-15B的表达水平显著下调(图8B和8C)。通过EdU掺入和pHH3测定心肌细胞增殖。如图8D和8E所示，发明人发现组合LNA(miR-1a、miR-15b)基于增加的EdU掺入增加了低氧中的心肌细胞增殖。此外，pHH3显示组合LNA-1a/15b处理在低氧条件下增强心肌细胞增殖，但在常氧条件下不增强心肌细胞增殖(图8F和8G)。此外，通过miR-1a和miR-15b抑制拯救低氧降低的收缩性(图8H)。总之，这些数据显示miR-1a和miR-15b的组合抑制可增加心肌细胞增殖并增强人类心脏模拟物的收缩性。
实施例7：miR-1a、miR-27b和miR-34a的组合抑制诱导心肌细胞增殖
此外，Dimmeler已显示miR-34a抑制能够诱导心肌细胞增殖并改善心脏功能。我们的数据显示miR-1a和miR-27b对于心肌细胞中的细胞分裂是关键的。因此，本发明人想要检测miR-1a、miR-27b和miR-34a的组合抑制是否能够在体外和体内驱动心肌细胞增殖。首先，用LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a的组合或LNA-对照处理分离的新生大鼠心肌细胞2天，通过Aurora B、α-辅肌动蛋白和DAPI染色细胞。LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a处理的组合通过显著增加末期Aurora B阳性心肌细胞而显著增加新生大鼠心肌细胞中的心肌细胞增殖(图9A和9B)。然后，发明人询问miR-1a、miR-27b和miR-34a的组合抑制是否也可促进心肌细胞增殖，对12周龄的小鼠注射LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a的组合或LNA-对照1周。如图9C和9D所示，LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a的组合通过Ki67-阳性心肌细胞的增加而增加心肌细胞增殖。总之，数据显示LNA-1a、LNA-27b和LNA-34a的组合能够在体外和体内驱动心肌细胞增殖。
材料和方法
动物
所有动物均获自Janvier(法国勒热内－圣伊勒)。本实验中使用的所有动物，按照NIH动物护理指南、德国动物保护法第八条、德国动物福利法规以及实验动物协会(GV-SOLAS)和实验动物科学协会联盟(FELASA)的指南，都圈养在具有12小时的亮暗循环的温度受控的房间中，并且允许自由获取食物和水。
心肌梗塞(MI)
MI是在12周龄雄性C57BL/6J小鼠中进行，并通过永久性结扎左前降支冠状动脉(LAD)诱导。在手术后至多28天监测小鼠，在第0、7、14、21、和28天通过超声心动图测定心脏尺寸和心脏功能。在MI后4小时，将体内miRCURY LNA Power抑制剂腹膜注射给小鼠，剂量为10mg/kg。以下体内miRCURY LNA Power抑制剂购自QIAGEN：miR-1a-3p(339203YCI0200659-FZA)、miR-15b-5p(339203YCI0200641-FZA)、和阴性对照LNA(339203YCI0200578-FZA)。
原代新生大鼠心肌细胞的分离和维持
交配的雌性Sprague Dawley大鼠获自Janvier(法国勒热内－圣伊勒)。通过使用新生心脏解离试剂盒(Miltenyi Biotec)和gentleMACS解离器，根据制造商的说明书从P1和P7大鼠幼鼠分离原代新生大鼠心肌细胞(NRC)。如前所述，在37℃和5％ CO2的潮湿氛围下，将分离的细胞在10cm细胞培养皿(Nunc)中在平板培养基(DMEM高葡萄糖、M199 EBS(BioConcept)、10％马血清、5％胎牛血清、2％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素)中预铺板1.5小时，以除去成纤维细胞[20]。将NRC铺板于I型牛胶原包被的(Advanced Biomatrix)平板或平板培养基的平皿上。分离NRC的24小时后，将平板培养基更换为维持培养基(DMEM高葡萄糖、M199 EBS、1％马血清、2％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素)。
锁核酸(LNA)的体外施用
将miRCURY LNA Power抑制剂以50nM的终浓度直接加入到细胞培养基中。所有miRCURY LNA Power抑制剂和阴性对照LNA购自QIAGEN：miR-1a-3p(1999990-801)、miR-15a-5p(339146YCI0200640-FDA)、miR-15b-5p(339146YCI0200641-FDA)、miR-16(339146YCI0200647-FDA)、miR-27b-5p(339146YCI0200648-FDA)、miR-29a-3p(339146YCI0200644-FDA)、miR-34a-5p(339146(YCI0200649-FDA)、miR-34b-5p(339146YCI0200645-FDA)、miR-34c-5p(339146YCI0200650-FDA)、miR-92a-3p(339146YCI0200646-FDA)、miR-132-3p(1999990-801)、miR-133a-3p(1999990-801)、miR-155-3p(1999990-
801)、miR-195a-5p(339146YCI0200642-FDA)、miR-208a-3p(1999990-801)、miR-497a-5p(339146YCI0200643-FDA)、mR-873a-5p(1999990-801)、和阴性对照LNA CEL-CONTROL-INH(339147
YCI0199066-FFA)。
RNA分离、逆转录和qRT-PCR
在QIAzol裂解试剂(QIAGEN)中收集样品，根据制造商的方案用miRNA微型试剂盒(QIAGEN)分离总miRNA和总mRNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒(QIAGEN)，根据制造商的方案将200ng总RNA逆转录为cDNA。使用具有Fast SYBR Green Master Mix(Thermo FisherScientific)的Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统(美国加州AppliedBiosystems)进行分析。用于mmu-miR-1a-3p(ID：mmu482914_mir)、has-miR-1-3p(ID：mmu482914_mir)、rno-miR-15a-5p(ID：rno483022_mir)、mmu-miR-15b-5p(ID：mmu482957_mir)、rno-miR-16-5p(ID：rno481312_mir)、rno-miR-27b-5p(ID：rno481016_mir)、hsa-miR-27b-sp(ID：478789_mir)、hsa-miR-29a-3p(ID：478587_mir)、hsa-miR-34a-5p(ID：rno481304_mir)、hsa-miR_34c-5p(ID：478052_mir)、rno-miR-132-3p(ID：rno480919_mir)、rno-miR-133a-3p(ID：rno481491_mir)、mmu-miR-155-3p(ID：mmu481328_mir)、mmu-miR-195a-5p(ID：mmu482953_mir)、mmu-miR-497a-5p(ID：mmu482607_mir)、miR-873a-5p(ID：rno481425_mir)、和hsa-miR-26a-5p(ID：477995_mir)的TaqManTM高级miRNA测定。
人iPSC-CM的制备和维持
人类诱导多能干细胞(hiPSCs)购自Cellular Dynamics International(CMC-100-010-001)，并按照制造商的推荐进行培养。使用STEMdiffTM心肌细胞分化试剂盒(STEMCELL Technologies)，根据制造商的方案将人iPSC衍生的心肌细胞(hiPSC-CM)重编程。简言之，使用补充有5μM ROCK抑制剂(Y-27632，STEMCELL Technologies)的mTeSRTM培养基，将人iPS细胞以3.5×105细胞/孔的细胞密度铺板在基质胶包被的12孔板上24小时，1天(-1)后，用新鲜TeSRTM培养基替换该培养基。为了诱导心脏分化，在第0天用培养基A(包含补充物A的STEMdiffTM心肌细胞分化基础培养基)代替TeSRTM培养基，在第2天用培养基B(包含补充物B的STEMdiffTM心肌细胞分化基础培养基)代替，在第4天和第6天用培养基C(包含补充物C的STEMdiffTM心肌细胞分化基础培养基)代替，在第8天将培养基换成STEMdiffTM心肌细胞维持培养基，每2天完全更换培养基，以促进进一步分化成成熟的心肌细胞。所有实验均在第40天在hiPSC-CM中进行，通过使用缺氧室实现低氧条件，并将hiPSC-CM在3％ O2培养2天。
单一培养心脏类器官形成技术
由hiPSC-CM产生三培养类器官。使用AggrewellTM800微孔培养板在STEMdiffTM心肌细胞支持培养基(STEMCELL Technologies)中产生单一培养的心脏类器官。将2ml细胞悬浮液中的约900,000个孔移液至每个孔中。培养2天后，将培养基换成STEMdiffTM心肌细胞维持培养基，用于长期培养。
收缩性测量
将每个单一培养的心脏类器官转移到96孔板中，并用要么LNA-1a和LNA-15b或者LNA-NC处理。通过使用缺氧室实现缺氧条件，并在1％ O2培养心脏类器官3天，然后通过IonOptix系统分析收缩性。通过用测微计校准系统来确定单位/像素。
免疫荧光染色
用4％多聚甲醛(PFA)/PBS固定NRC，将细胞透化并用稀释于2％(v/v)HS/PBS中的抗肌节α-辅肌动蛋白(Sigma Aldrich)、Aurora B(Abcam)、或Ki67(Abcam)的一抗在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤3次5分钟后，将细胞与4′,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI；ThermoFisher Scientific)、AlexaFluor 555抗小鼠(Thermo Fisher Scientific)和AlexaFluor488抗兔(Thermo Fisher Scientific)二抗在室温下孵育1小时。将培养皿置于载玻片(Fisher Scientific)上并滴上Prolong Antifade(Thermo Fisher Scientific)。荧光图像是用SP5共焦显微镜(Leica)以40×放大率获得的。
统计分析
数据表示为平均值，误差条表示平均值的标准误(SEM)。如各图图例中所示，使用双尾未配对Student’s t检验(Excel)或单向ANOVA分析，随后进行检验后Dunnett’s多重比较(与单一对照的多重比较)或Bonferroni校正(不同组之间的多重比较)。n.s.＝不显著；*p<0.05；**p<0.01。
miRNA抑制剂的序列
LNA 序列5′–3′ SEQ ID NO
LNA-1a ACTTCTTTACATTCC 001
LNA-15a ACCATTATGTGCTGCT 005
LNA-15b CCATGATGTGCTGCT 002
LNA-16 TATTTACGTGCTGCT 006
LNA-27b ACCAATCAGCTAAGCT 003
LNA-29a GATTTCAGATGGTGCT 007
LNA-34a AGCTAAGACACTGCC 004
LNA-34b AGCTAATTACACTGCC 008
LNA-34c AGCTAACTACACTGCC 009
LNA-92a CGGGACAAGTGCAAT 010
LNA-132 ATGGCTGTAGACTGTT 011
LNA-133a GTTGAAGGGGACCAA 012
LNA-155 ATGCTAACAGGTAGGA 013
LNA-195a ATATTTCTGTGCTGCT 014
LNA-208a CTTTTTGCTCGTCTTA 015
LNA-497a ACCACAGTGTGCTGCT 016
LNA-873a GACTCACAAGTTCCTG 017
对照LNA TCCTAGAAAGAGTAGA 018
序列表
<110> 法兰克福大学（Goethe Universitaet）
<120> 用于治疗心力衰竭的miRNA的组合抑制
<130> tar108wo
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 1
acttctttac attcc 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 2
ccatgatgtg ctgct 15
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 3
accaatcagc taagct 16
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 4
agctaagaca ctgcc 15
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 5
accattatgt gctgct 16
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 6
tatttacgtg ctgct 15
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 7
gatttcagat ggtgct 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 8
agctaattac actgcc 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 9
agctaactac actgcc 16
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 10
cgggacaagt gcaat 15
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 11
atggctgtag actgtt 16
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 12
gttgaagggg accaa 15
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 13
atgctaacag gtagga 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 14
atatttctgt gctgct 16
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 15
ctttttgctc gtctta 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 16
accacagtgt gctgct 16
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 17
gactcacaag ttcctg 16
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> miRNA抑制剂
<400> 18
tcctagaaag agtaga 16
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 19
uggaauguaa agaaguaugu au 22
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 20
uggaauguaa agaaguaugu au 22
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 21
uagcagcaca ucaugguuua ca 22
<210> 22
<211> 22
<212> RNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 22
uagcagcaca ucaugguuua ca 22
<210> 23
<211> 22
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 23
agagcuuagc ugauugguga ac 22
<210> 24
<211> 22
<212> RNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 24
agagcuuagc ugauugguga ac 22
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 25
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 26
<211> 22
<212> RNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 26
uggcaguguc uuagcugguu gu 22

Claims (17)

1.一种用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中每个所述核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA，由此所述核酸剂组合能够抑制和/或降解细胞内的microRNA组合，其中所述microRNA组合是
c.miR-1a，和
d.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b。
2.根据权利要求1所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述microRNA组合包括miR-1a和miR-15b。
3.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中每个核酸剂包括核苷酸杂交序列、或基本上由其组成，所述核苷酸杂交序列能够与靶microRNA形成杂交体。
4.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中每个核酸剂包括选自序列SEQ ID NO 001–004的序列、或基本上由其组成。
5.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个包括以下或基本上由其组成，
特别是其中所有所述核酸剂包括以下或基本上由其组成，
一个或几个锁核酸(LNA)和/或肽核酸(PNA)部分，特别是其中所述核酸剂基本上由锁核酸(LNA)部分组成。
6.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个包括，
特别是其中所有所述核酸剂包括
一个或几个硫代磷酸酯键。
7.根据前述权利要求5或6任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个包括通过硫代磷酸酯键与相邻部分连接的LNA部分，
特别是其中所述核酸剂中的一个包括在其任一端通过硫代磷酸酯键连接的2、3或4个LNA部分。
8.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合，其中所述核酸剂中的一个是，
特别是其中所有所述核酸剂是，
在细胞内由包括编码在人心肌细胞中可操作的启动子控制下的核苷酸杂交序列的序列外源(转基因)表达构建体表达。
9.一种用于治疗或预防心脏病的表达构建体、或多种表达构建体，其在人心肌细胞中可操作的启动子的控制下编码核酸剂组合，其中每个所述核酸剂针对且能够特异性抑制和/或降解靶microRNA，从而抑制和/或降解microRNA的组合，其中所述microRNA的组合包括
c.miR-1a，和
d.miR-15b，或
miR-15b和miR-27b；
特别是其中所述microRNA的组合包括miR-1a和miR-15b。
10.如权利要求9所述的用于治疗或预防心脏病的多种表达构建体，其中每个和所有所述表达构建体中包括在单个核酸分子内。
11.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或表达构建体，其中所述核酸剂或所述表达构建体被结合至纳米颗粒或被选自病毒和脂质体的颗粒结构包封。
12.根据权利要求11所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或表达构建体，其中所述纳米颗粒、或所述颗粒结构包括配体，所述配体促进纳米颗粒或颗粒结构递送至心肌细胞或进入心肌细胞。
13.根据权利要求9至12任一所述的用于治疗或预防心脏病的表达构建体、或多种表达构建体，其中所述启动子允许所述核酸剂的心脏特异性表达，特别是其中所述启动子是心脏组织特异性RNA聚合酶2启动子，特别是选自肌球蛋白轻链2v(MLC2v)启动子、心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子、肌球蛋白重链α(MHCa)启动子、和肌联蛋白(Ttn)启动子的启动子。
14.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或多种表达构建体，其中所述心脏病的特征在于心肌细胞的损失，特别是所述心脏病的特征在于心肌细胞损失的心力衰竭，更特别是所述心力衰竭是心肌梗塞、狭窄、先天性疾病、炎症和/或脓毒症的结果。
15.根据前述权利要求任一所述的用于治疗或预防心脏病的核酸剂组合、或多种表达构建体，其中所述心脏病的特征在于心肌细胞缺氧。
16.一种用于治疗或预防心脏病的药物组合物，其包括根据前述权利要求任一所述的核酸剂组合、或多种表达构建体。
17.根据权利要求16所述的用于治疗或预防心脏病的药物组合物，其中所述药物组合物被给予至心脏。
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