TW201406774A - 微ｒｎａ之ｍｉｒ－１５家族之抑制劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供能夠抑制包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497在內之miR-15家族miRNA之表現(例如豐度)的化學修飾之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供能夠以特異性方式抑制miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497中每一者之表現或豐度之寡核苷酸。本發明進一步提供包含該等寡核苷酸之醫藥組合物，及治療患有諸如心血管病狀的有關或涉及miR-15家族miRNA之病狀或病症之病患的方法。在各種實施例中，該等寡核苷酸在效力、遞送效率、靶特異性、毒性及/或穩定性中之一或多個方面提供益處。

Description

微RNA之MIR-15家族之抑制劑 相關申請案
本申請案主張2012年6月21日申請之美國臨時申請案第61/662,772號與2013年3月13日申請之美國臨時申請案第61/780,352號的優先權與權益，其各自以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於微RNA(miRNA或miR)抑制劑之化學基元。更具體言之，本發明係關於化學修飾之寡核苷酸，其靶向一或多個miR-15家族成員且當向病患投與時在效力、遞送效率、靶特異性、穩定性及/或毒性方面具有益處。
微RNA(miR)已牽涉於多個生物過程中，包括調節與維護心臟功能(參見，E.Van Rooij等人，J.Clin.Invest.117(9)：2369-2376(2007)；K.Chien,Nature 447：389-390(2007))。因此，miR代表了針對諸如心臟肥大、心肌梗塞、心臟衰竭、血管損傷及病理性心臟纖維化等病狀之一類相對較新的治療靶。miR為約18個至約25個核苷酸長的非蛋白質編碼之小RNA，且當其與靶mRNA序列完全互補時藉由促進靶mRNA降解，或當二者的序列含有錯配時藉由抑制轉譯，來充當該等靶mRNA之抑制劑。該機制涉及將成熟miRNA鏈併入RNA誘導之沉默複合物(RISC)中，其中其藉由鹼基對互補性來與其靶RNA締合。
可藉由反義聚核苷酸或藉由模擬miRNA功能之聚核苷酸 (「miRNA模擬劑」)治療性靶向miRNA功能。然而，用基於寡核苷酸之試劑治療性靶向miRNA具有若干挑戰，包括RNA結合親和力與特異性、細胞攝取之效率及核酸酶抗性。舉例而言，當將聚核苷酸引入至完整細胞中時，其被核酸酶攻擊且降解，導致活性缺失。雖然已經製備聚核苷酸類似物以試圖避免其降解，例如藉助2'取代(B.Sproat等人，Nucleic Acids Research 17：3373-3386,(1989))，但該等修飾常常影響聚核苷酸對於其預定生物作用之效力。在每一情況下，此類降低之效力可歸因於經修飾聚核苷酸不能與靶RNA形成穩定雙螺旋體及/或與細胞機器相互作用之缺失。其他修飾包括使用鎖核酸，該鎖核酸具有改良RNA結合親和力之潛能(參見，R.Veedu等人，RNA Biology 6(3)：321-323(2009))。
用於miRNA抑制劑之寡核苷酸化學模式或基元具有改良抑制劑之遞送、穩定性、效力、特異性及/或毒性型態之潛能，且在治療情況下此為有效地靶向miRNA功能所需的。
本發明提供化學修飾之寡核苷酸，其能夠降低或抑制包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424與miR-497在內之一或多個miR-15家族成員之活性。本發明進一步提供包含該等寡核苷酸之醫藥組合物，及治療患有有關或涉及一或多個miR-15家族成員之病狀或病症之個體的方法。在各種實施例中，所揭示的寡核苷酸在效力、遞送效率、靶特異性、毒性及/或穩定性中之一或多個方面提供益處。
在一個態樣中，本發明提供一種化學修飾之寡核苷酸，其能夠降低或抑制一或多個miR-15家族成員之活性。該寡核苷酸之活性或效力可在活體外及/或活體內測定。舉例而言，在約50nM或50nM以下之濃度下，或在其他實施例中在約40nM或40nM以下、約20nM或20nM以下，或約10nM或10nM以下之濃度下，該寡核苷酸可顯著抑制 (例如，約50%抑制)一或多個miR-15家族成員之活性(如例如以兩步驟即時PCR分析或雙螢光素酶分析所測定)。或者，或此外，該寡核苷酸之活性可在適合小鼠或大鼠模型，或非人類靈長類動物模型中測定，其中在約50mg/kg或50mg/kg以下，諸如約25mg/kg或25mg/kg以下、約10mg/kg或10mg/kg以下，或約5mg/kg或5mg/kg以下之劑量下觀測到對一或多個miR-15家族成員之抑制(例如，至少約50%)。本文描述了用於測定靶去抑制作用(de-repression)之例示性標記物。在此等實施例中，該寡核苷酸可經皮下或靜脈內(且如本文所描述)給予，且可在水性製劑(例如，生理食鹽水)中調配。
該寡核苷酸包含核苷酸序列5'-GTGCTGCT-3'，且與一或多個miR-15家族成員之核苷酸序列實質上互補。該寡核苷酸進一步含有至少一個鎖核苷酸。在一實施例中，該寡核苷酸含有至少8個鎖核苷酸。鎖核苷酸可具有如WO 2012/083005(以全文的方式併入本文中)中所描述之2'至4'橋結構。舉例而言，鎖核苷酸可具有包含伸乙基或亞甲基之2'至4'橋。在另一實例中，鎖核苷酸可具有2'至4'亞甲基橋。
一般而言，該寡核苷酸之長度以及鎖核苷酸之數目及位置係使得該寡核苷酸在活體外即時PCR分析或螢光素酶分析中在約50nM或50nM以下之寡核苷酸濃度下，或在如本文所描述之適合齧齒動物模型或非人類靈長類動物模型中在約25mg/kg或25mg/kg以下之劑量下，降低一或多個miR-15家族成員之活性。在一實施例中，該寡核苷酸為約8個至約18個核苷酸長。在另一實施例中，該寡核苷酸為12個至約17個核苷酸長。
在一例示性實施例中，該寡核苷酸為約16個核苷酸長。該寡核苷酸可包含選自以下之核苷酸序列或基本上由選自以下之核苷酸序列組成：5'-ACCATTATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.1)、5'-ACCATGATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.2)、5'-ATATTTACGTGCTGCT-3' (SEQ ID NO.3)及5'-ATATTTCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.4)。該寡核苷酸可包括9個鎖核苷酸及7個非鎖核苷酸。鎖核苷酸之模式可使得至少位置1、5、8、10及16為鎖核苷酸。
在另一例示性實施例中，該寡核苷酸為約12個核苷酸長。該寡核苷酸可包含選自以下之核苷酸序列或基本上由選自以下之核苷酸序列組成：5'-TTATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.5)、5'-TTACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.6)、5'-TTCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.7)、5'-TTCCGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.8)、5'-TGATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.9)、5'-TGACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.10)、5'-TGCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.11)及5'-TGCCGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.12)。該寡核苷酸可包括8個鎖核苷酸及4個非鎖核苷酸。鎖核苷酸之模式可使得至少位置1、4、9及12為鎖核苷酸。
在又一例示性實施例中，該寡核苷酸為約8個核苷酸長。該寡核苷酸可基本上由或由核苷酸序列5'-GTGCTGCT-3'組成，其中全部或實質上全部(例如，至少約6個或至少約7個)為鎖核苷酸。
在各種實施例中，與一或多個miR-15家族成員之種子區互補之區域包含至少約四個鎖核苷酸。在另一實施例中，該寡核苷酸不含有具有3個以上鄰接非鎖核苷酸及/或3個以上鄰接鎖核苷酸之核苷酸段。
就非鎖核苷酸而言，核苷酸可含有針對2'羥基之2'修飾。在一些實施例中，2'修飾可獨立地選自脫氧基、O-烷基、O-甲基、鹵基與氟基。舉例而言，2'修飾可為脫氧基。在一實施例中，在寡核苷酸中的所有非鎖核苷酸均為2'脫氧基。
寡核苷酸亦可含有一或多個硫代磷酸酯鍵。舉例而言，寡核苷酸可為完全硫代磷酸酯鍵聯的或可含有約半數或¾之硫代磷酸酯鍵。
例示性寡核苷酸抑制劑顯示於表1中。
在其他實施例中，寡核苷酸可含有5'及或3'帽子結構。在又一實施例中，寡核苷酸可進一步包括側接親脂性基團。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之寡核苷酸之醫藥組合物及調配物，其可涉及將該寡核苷酸併入用於細胞遞送之多種大分子組件、微胞或脂質體組合物中。在某些實施例中，該等寡核苷酸經調配用於習知靜脈內、皮下或肌肉內給藥。此類調配物可為習知水性製劑，諸如在生理食鹽水中之調配物。在某些實施例中，該等組合物適合或經調配用於皮內、皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈注射，或直接注射至靶組織(例如，心臟組織)中。
在其他態樣中，本發明提供一種用於將寡核苷酸及醫藥組合物在活體外或離體遞送至哺乳動物細胞之方法，例如，用於治療、改善或預防哺乳動物個體之病狀的進展。該方法可包含向靶細胞群體或哺乳動物個體投與有效使靶Pim1去抑制之劑量的寡核苷酸或包含該寡核苷酸之組合物。該個體可具有與一或多個miR-15家族成員之表現相關，由其介導或由其引起之病狀。舉例而言，此類病狀包括心臟肥大、心肌梗塞、心臟衰竭(例如，充血性心臟衰竭)、局部缺血、缺血再灌注損傷、血管損傷、再狹窄、病理性心臟纖維化或與心臟移植相關之病狀。因此，本發明提供一種經修飾寡核苷酸及組合物之用途，其係用於治療此類病狀且用於製備供此類治療用之藥劑。
本發明之其他態樣及實施例將自以下本發明實施方式顯而易知。
圖1. 心肌細胞中miR-15家族成員之豐度。每個細胞之微RNA複本數係藉由即時PCR分析來量測，且針對市售標準品(Ambion)校正。
圖2. 心臟組織中之miR-15靶。即時PCR分析表明，皮下遞送25mg/kg抗miR-15b(M-10134)誘導小鼠中Bcl2L2、Birc5、Grn及Cdc2A 之表現的穩固變化。
圖3. 抗miR-15b(M-10134)治療以劑量依賴性方式影響靶基因表現。即時PCR分析表明小鼠中miR-15靶，尤其Birc5、Grn及Cdc2A之劑量依賴性去抑制。M-10591為非靶向性對照寡核苷酸。
圖4. 藉由即時PCR分析所量測的miR-15抑制劑針對miR-15靶之功效。抑制劑M-10670、M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220、M-11221及M-11222似乎對小鼠中之miR-15靶基因發揮最強作用。誤差棒描繪SEM。p值<0.001之組以星號指示。
圖5. 在活體外使用即時PCR分析來定量抑制劑活性之TaqMan®微RNA分析(Applied Biosystems)。
圖6. 圖6A顯示藉由兩步驟即時PCR分析所量測的miR-15抑制劑針對miR-15a、miR-15b、miR-16及miR-195之功效。圖6B為概述每一miR-15抑制劑之功效之圖表。
圖7. 在活體外使用雙螢光素酶分析來定量抑制劑活性之psiCHECKTM-2構築體(Promega)。
圖8. 圖8A顯示藉由雙螢光素酶分析所量測的miR-15抑制劑針對miR-15a、miR-15b、miR-16及miR-195之功效。圖8B為概述每一miR-15抑制劑之功效之圖表。
圖9. 一組miR-15抑制劑針對靶基因去抑制之功效。圖9A顯示，3次劑量(每劑25mg/kg)之miR-15抑制劑之治療方案誘導小鼠中靶基因去抑制。具有指定p值的統計學顯著之組係以星號指示。圖9B顯示，3次劑量(每劑25mg/kg)之miR-15抑制劑之治療方案比單次劑量方案(每劑25mg/kg)更有效。
圖10. miR-15抑制劑使靶基因去抑制之動力學。圖10顯示，單次劑量(25mg/kg)之M-11215之遞送早在注射後24小時誘導小鼠中miR-15靶有效沉默。
圖11. miR-15抑制劑使靶基因整體及特異性去抑制。圖11顯示，M-11214引起靶基因去抑制，其對miR-15家族具特異性(p值：0.01)。使用超幾何分佈函數來計算針對富集之p值。
圖12. 一組miR-15抑制劑針對大鼠中靶基因去抑制之功效。圖12A顯示，皮下注射單次劑量之miR-15抑制劑(25mg/kg)在治療後四日誘導靶基因去抑制。在大鼠中，16-mer抑制劑似乎比12-mer抑制劑更有效。圖12B比較在治療後兩天miR-15抑制劑對於大鼠中與對於小鼠中靶基因的去抑制作用。左圖之資料係產生於大鼠中，且右圖之資料係產生於小鼠中。一般而言，miR-15抑制劑似乎在大鼠中具有比在小鼠中更有效的作用，但12-mer抑制劑除外，其在大鼠中似乎無效。
圖13. 在大鼠應激模型中miR-15抑制劑針對靶基因去抑制之功效。圖13顯示，單次劑量之miR-15抑制劑(25mg/kg)在大鼠缺血再灌注損傷模型中誘導靶基因去抑制(n=4；相對於基線，p值<0.05)。該p值係使用ANOVA紐曼-柯伊爾事後檢驗(Newman-Keuls post test)計算。基線表示非梗塞對照組。IR/生理食鹽水表示生理食鹽水處理之對照組。M-10591為非靶向性對照寡核苷酸。
圖14. 在大鼠應激模型中miR-15抑制劑針對發炎性標記物之表現之功效。圖14顯示單次劑量之miR-15抑制劑(25mg/kg)在大鼠缺血再灌注損傷模型中針對各種發炎性標記物之表現的影響(n=4)。基線表示非梗塞對照組。IR/生理食鹽水表示生理食鹽水處理之對照組。M-10591為非靶向性對照寡核苷酸。
圖15. 在大鼠應激模型中miR-15抑制劑針對心肌梗塞之功效。圖15A及15B顯示miR-15抑制劑在大鼠缺血再灌注損傷模型中分別針對風險面積(area of risk)及心肌梗塞尺寸之影響(n=10)。生理食鹽水表示生理食鹽水處理之對照組。M-10591為非靶向性對照寡核苷酸。
圖16. 在大鼠應激模型中miR-15抑制劑(M-11211及M-11214)針對 射血分數之功效。圖16顯示miR-15抑制劑在大鼠缺血再灌注損傷模型中針對射血分數之影響。AMC表示無損傷之年齡匹配對照組。IR/生理食鹽水表示生理食鹽水處理之對照組。
本發明提供能夠抑制miR-15家族miRNA(包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497)之表現(例如豐度)的化學修飾之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供能夠以特異性方式抑制miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497中每一者之表現或豐度之寡核苷酸。本發明進一步提供包含該等寡核苷酸之醫藥組合物，及治療患有有關或涉及miR-15家族miRNA之病狀或病症(諸如各種心血管病狀)之病患的方法。在各種實施例中，該寡核苷酸在效力、遞送效率、靶特異性、毒性及/或穩定性中之一或多個方面提供益處。
在一個態樣中，本發明提供一種能夠減少miR-15家族微RNA之表現或豐度之寡核苷酸。該寡核苷酸之活性可在活體外及/或活體內測定。舉例而言，當在活體外測定miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497活性之抑制時，該活性可使用如本文所描述之兩步驟即時PCR分析或雙螢光素酶分析來測定。如例如在雙螢光素酶分析中所測定，該寡核苷酸在約75nM或75nM以下，或在其他實施例中在約50nM或50nM以下、約40nM或40nM以下、約20nM或20nM以下，或約10nM或10nM以下之濃度下顯著抑制此活性。舉例而言，如在雙螢光素酶分析中所測定，該寡核苷酸可具有約50nM或50nM以下、約40nM或40nM以下、約30nM或30nM以下，或約20nM或20nM以下的針對miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497活性之抑制的IC50。
如市售TaqMan®微RNA分析(Applied Biosystems)所例示，兩步驟 PCR分析涉及定量PCR讀出，其可藉由寡核苷酸抑制劑以兩個步驟來抑制：1)藉由抑制逆轉錄酶引子在cDNA合成期間延長之能力；及2)藉由抑制PCR引子擴增cDNA產物之能力。
如市售產品PsiCHECKTM(Promega)所例示，雙螢光素酶分析涉及在可偵測蛋白(例如海腎螢光素酶)基因之3'UTR中置放miR識別位點。該構築體與靶miRNA共表現，以致於可藉由信號之變化來測定抑制劑活性。編碼可偵測蛋白(例如螢火蟲螢光素酶)之第二基因可包括在同一質體上且測定信號比作為抗miR活性之指示。
或者，或此外，可在適合小鼠或大鼠模型(諸如本文中所述之彼等)中測定寡核苷酸之活性，其中在約50mg/kg或50mg/kg以下、約25mg/kg或25mg/kg以下，諸如約10mg/kg或10mg/kg以下，或約5mg/kg或5mg/kg以下之寡核苷酸劑量下觀測到對miR-15家族miRNA之抑制(例如，至少約50%)。在一些實施例中，在WO 2008/016924(以引用的方式併入本文中)中描述之動物模型中測定寡核苷酸活性。舉例而言，該寡核苷酸可在約50mg/kg或50mg/kg以下、約25mg/kg或25mg/kg以下，諸如約10mg/kg或10mg/kg以下，或約5mg/kg或5mg/kg以下之劑量下展現至少約50%之靶miRNA抑制或靶去抑制。在此類實施例中，該寡核苷酸可經靜脈內或皮下向小鼠或大鼠給予，且該寡核苷酸可在生理食鹽水中調配。
在該等或其他實施例中，本發明之寡核苷酸在投藥之後為穩定的，其在投藥後在至少約三週、至少約四週、至少約五週或至少約六週或更長時間內於循環及/或靶器官中可偵測到。因此，本發明之寡核苷酸具有提供不太頻繁之投藥、較低劑量及/或較長治療作用持續時間的潛能。
該寡核苷酸包含核苷酸序列5'-GTGCTGCT-3'且與人miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497之核苷酸序列實質 上互補。該寡核苷酸進一步含有至少一個鎖核苷酸。舉例而言，該寡核苷酸可含有至少8個或至少9個鎖核苷酸。一般而言，寡核苷酸之長度以及鎖核苷酸之數目及位置係使得該寡核苷酸在活體外螢光素酶分析中在約50nM或50nM以下之寡核苷酸濃度下，或在適合小鼠或大鼠模型中在約50mg/kg或50mg/kg以下或者約25mg/kg或25mg/kg以下之劑量下(各如本文所描述)，降低miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497之活性。實質上互補之寡核苷酸關於其靶miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497之序列可具有約1個至約5個錯配(例如，1個或約2個，或約3個，或約4個，或約5個錯配)。
WO 2009/062169中描述了miR-15家族成員(包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497)之結構及加工，以及其用於治療心臟肥大、心臟衰竭或心肌梗塞(及其他病狀)之潛能，該案以引用的方式併入本文中。可用於設計根據本發明之抑制性miRNA之人miR-15家族成員之miRNA前體序列(例如莖環序列)列於下文：
人miR-15a前體
CCUUGGAGUA AAGUAGCAGC ACAUAAUGGU UUGUGGAUUU UGAAAAGGUG CAGGCCAUAU UGUGCUGCCU CAAAAAUACA AGG(SEQ ID NO.13)
人miR-15b前體
UUGAGGCCUU AAAGUACUGU AGCAGCACAU CAUGGUUUAC AUGCUACAGU CAAGAUGCGA AUCAUUAUUU GCUGCUCUAG AAAUUUAAGG AAAUUCAU(SEQ ID
NO.14)
人miR-16-1前體
GUCAGCAGUG CCUUAGCAGC ACGUAAAUAU UGGCGUUAAG AUUCUAAAAU UAUCUCCAGU AUUAACUGUG CUGCUGAAGU AAGGUUGAC(SEQ ID NO.15)
人miR-16-2前體
GUUCCACUCU AGCAGCACGU AAAUAUUGGC GUAGUGAAAU AUAUAUUAAA CACCAAUAUU ACUGUGCUGC UUUAGUGUGA C(SEQ ID NO.16)
人miR-195前體
AGCUUCCCUG GCUCUAGCAG CACAGAAAUA UUGGCACAGG GAAGCGAGUC UGCCAAUAUU GGCUGUGCUG CUCCAGGCAG GGUGGUG(SEQ ID NO.17)
人miR-424前體
CGAGGGGAUA CAGCAGCAAU UCAUGUUUUG AAGUGUUCUA AAUGGUUCAA AACGUGAGGC GCUGCUAUAC CCCCUCGUGG GGAAGGUAGA AGGUGGGG(SEQ ID NO.18)
人miR-497前體
CCACCCCGGU CCUGCUCCCG CCCCAGCAGC ACACUGUGGU UUGUACGGCA CUGUGGCCAC GUCCAAACCA CACUGUGGUG UUAGAGCGAG GGUGGGGGAG GCACCGCCGA GG(SEQ ID NO.19)
將每一miR-15家族成員之miRNA前體序列各自加工成成熟序列及衛星序列(star sequence)。該衛星序列係自莖環結構之另一鏈加工。每一miR-15家族成員之成熟序列及衛星序列提供於下：人成熟miR-15a
UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG(SEQ ID NO.20)
人miR-15a*
CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA(SEQ ID NO.21)
人成熟miR-15b
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA(SEQ ID NO.22)
人miR-15b*
CGAAUCAUUAUUUGCUGCUCUA(SEQ ID NO.23)
人成熟miR-16-1/miR-16-2
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG(SEQ ID NO.24)
人miR-16-1*
CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA(SEQ ID NO.25)
人miR-16-2*
CCAAUAUUACUGUGCUGCUUUA(SEQ ID NO.26)
人成熟miR-195
UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC(SEQ ID NO.27)
人miR-195*
CCAAUAUUGGCUGUGCUGCUCC(SEQ ID NO.28)
人成熟miR-424
CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA(SEQ ID NO.29)
人miR-424*
CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU(SEQ ID NO.30)
人成熟miR-497
CAGCAGCACACUGUGGUUUGU(SEQ ID NO.31)
人miR-497*
CAAACCACACUGUGGUGUUAGA(SEQ ID NO.32)
雖然所有家族成員之種子區(例如跨越成熟miRNA序列之2個至8個核苷酸之鹼基)係高度保守的(AGCAGCAC)，但是不同家族成員間成熟miRNA之3'端不同。
預期可藉由投與單一miR-15抑制劑或藉由投與多種抑制劑來同時抑制miR-15家族之多個成員。舉例而言，每一抑制劑可靶向單個miR-15家族成員或可靶向多個miR-15家族成員。在一些實施例中，單一miR-15抑制劑抑制兩個或兩個以上miR-15家族成員之表現或活性。此類抑制劑包括(但不限於)：M-10670、M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220、M-11221及M-11222。在其他實施例中，單一miR-15抑制劑抑制三個或三個以上miR-15家族成員之表現或活性。此類抑制劑包括(但不限於)：M-10670、M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220、M-11221及M-11222。在其他實施例中，單一miR-15抑制劑抑制四個或四個以上miR-15家族成員之表現或 活性。此類抑制劑可包括(但不限於)：M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220及M-11221。
寡核苷酸含有一或多個鎖核酸(LNA)殘基或「鎖核苷酸」。舉例而言，LNA係描述於美國專利6,268,490、美國專利第6,316,198號、美國專利第6,403,566號、美國專利第6,770,748號、美國專利第6,998,484號、美國專利第6,670,461號及美國專利第7,034,133號中，其全部以全文引用的方式併入本文中。LNA為在核糖部分之2'與4'碳之間含有額外橋，由此產生「鎖」構形及/或雙環結構的經修飾核苷酸或核糖核苷酸。在一實施例中，寡核苷酸含有一或多個具有如以下結構A顯示之結構的LNA。或者或此外，寡核苷酸可含有一或多個具有如以下結構B顯示之結構的LNA。或者或此外，寡核苷酸含有一或多個具有如以下結構C顯示之結構的LNA。
可併入本發明之寡核苷酸中之其他適合鎖核苷酸包括描述於美國專利第6,403,566號及美國專利第6,833,361號中之鎖核苷酸，該等專利均以全文引用的方式併入本文中。
在例示性實施例中，鎖核苷酸具有2'至4'亞甲基橋，例如，如結 構A中所示。在其他實施例中，鎖核苷酸具有包含伸乙基之橋，其在2'位可含有或可不含有醚鍵。
寡核苷酸可包含miR-15家族成員之全長或截短的反義序列，基本上由該序列組成或由該序列組成。如本文所使用，關於miRNA序列之術語「全長」係指成熟miRNA反義對應物之長度。因此，本文中所述之抑制劑可為截短的或全長的反義成熟miRNA序列，或可包含該等序列與其他聚核苷酸序列之組合。在某些實施例中，本文中所述之化學修飾基元使全長反義miRNA(成熟)序列變得不必要。在此等實施例中，寡核苷酸為約8個至約20個核苷酸長，或為約8個至約18個核苷酸長，或為約12個至約17個核苷酸長。在一些實施例中，寡核苷酸為約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個核苷酸長。截短的寡核苷酸可具有藉由反義抑制來靶向以下各序列之序列：5'-UAGCAGCACAUAAUGGU-3'(SEQ ID NO.33)內之miR-15a序列、5'-UAGCAGCACAUCAUGGU-3'(SEQ ID NO.34)內之miR-15b序列、5'-UAGCAGCACGUAAAUAU-3'(SEQ ID NO.35)內之miR-16序列、5'-UAGCAGCACAGAAAUAU-3'(SEQ ID NO.36)內之miR-195序列、5'-CAGCAGCAAUUCAUGUU-3'(SEQ ID NO.37)內之miR-424序列或5'-CAGCAGCACACUGUGGU-3'(SEQ ID NO.38)內之miR-497序列。
寡核苷酸通常具有經設計以靶向成熟miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497之核苷酸序列。在該等或其他實施例中，寡核苷酸亦可經設計或者可替代性地經設計以靶向miRNA前體或初級轉錄本(pri-miRNA)形式。在某些實施例中，寡核苷酸可經設計以具有相對於完全互補(成熟)的miR-15序列含有約1個至約5個(例如，約1個、約2個、約3個或約4個)錯配之序列。在某些實施例中，此類反義序列可併入至例如shRNA或含有莖及環部分之其他RNA結構 中。
在一例示性實施例中，寡核苷酸為約16個核苷酸長。寡核苷酸可包含選自以下之核苷酸序列或基本上由選自以下之核苷酸序列組成：5'-ACCATTATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.1)、5'-ACCATGATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.2)、5'-ATATTTACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.3)及5'-ATATTTCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.4)。寡核苷酸可包括鎖核苷酸與非鎖核苷酸之混合物。舉例而言，寡核苷酸可包括9個鎖核苷酸及7個非鎖核苷酸。鎖核苷酸之模式可使得至少位置1、5、8、10及16為鎖核苷酸。
在另一例示性實施例中，寡核苷酸為約12個核苷酸長。寡核苷酸可包含選自以下之核苷酸序列或基本上由選自以下之核苷酸序列組成：5'-TTATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.5)、5'-TTACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.6)、5'-TTCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.7)、5'-TTCCGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.8)、5'-TGATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.9)、5'-TGACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.10)、5'-TGCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.11)及5'-TGCCGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.12)。寡核苷酸可包括鎖核苷酸與非鎖核苷酸之混合物。舉例而言，寡核苷酸可包括8個鎖核苷酸及4個非鎖核苷酸。鎖核苷酸之模式可使得至少位置1、4、9及12為鎖核苷酸。
在又一例示性實施例中，寡核苷酸為約8個核苷酸長。寡核苷酸可基本上由或由核苷酸序列5'-GTGCTGCT-3'組成，其中全部或實質上全部(例如，至少約6個或至少約7個)為鎖核苷酸。
寡核苷酸通常含有至少約8個鎖核苷酸，但在各種實施例中不完全由鎖核苷酸構成。一般而言，鎖核苷酸之數目及位置係使得如所描述在活體外或活體內測定時，寡核苷酸降低miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497之活性。在某些實施例中，寡核苷 酸不含有具有約4個以上或約3個以上鄰接非鎖核苷酸之核苷酸段。在該等或其他實施例中，與miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497種子區互補之區域包含至少3個或至少4個鎖核苷酸。
對於非鎖核苷酸而言，核苷酸可含有針對2'羥基之2'修飾。舉例而言，2'修飾可為2'脫氧基。在反義寡核苷酸中併入2'修飾之核苷酸可增加寡核苷酸對核酸酶之抗性及其在互補RNA存在下之熱穩定性兩者。在2'位之各種修飾可獨立地選自增加核酸酶敏感性而不損害分子與RNA靶或細胞機器之相互作用的修飾。此類修飾可基於其活體外或活體內效力之增加來選擇。用於測定針對miRNA抑制之效力增加(例如IC50)之例示性方法描述於本文中，包括雙螢光素酶分析及活體內miRNA表現或靶去抑制。
在一些實施例中，2'修飾可獨立地選自O-烷基(其可經取代)、鹵基及脫氧(氫)基。在某些實施例中，非鎖核苷酸之實質上所有或所有核苷酸之2'位可為經修飾的，例如，如獨立地選自O-烷基(例如，O-甲基)、鹵基(例如，氟基)、脫氧(氫)基及胺基。舉例而言，2'修飾各自可獨立地選自O-甲基及氟基。在例示性實施例中，嘌呤核苷酸各自具有2'OMe，且嘧啶核苷酸各自具有2'-F。在某些實施例中，1個至約5個2'位，或約1個至約3個2'位保持未經修飾(例如，呈2'羥基)。
根據本發明之2'修飾亦包括小的烴取代基。烴取代基包括烷基、烯基、炔基及烷氧基烷基，其中烷基(包括烷氧基之烷基部分)、烯基及炔基可為經取代或未經取代的。烷基、烯基及炔基可為C1至C10烷基、烯基或炔基，諸如C1、C2或C3。烴取代基可包括1個或2個或3個非碳原子，該等非碳原子可獨立地選自N、O及/或S。2'修飾可進一步包括呈O-烷基、O-烯基及O-炔基形式之烷基、烯基及炔基。
根據本發明之例示性2'修飾包括2'-O-烷基(C1-3烷基，諸如2'OMe 或2'OEt)、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)取代。
在某些實施例中，寡核苷酸含有至少一個2'-鹵基修飾(例如，代替2'羥基)，諸如2'-氟基、2'-氯基、2'-溴基及2'-碘基。在一些實施例中，2'鹵基修飾為氟基。寡核苷酸可含有1個至約5個2'-鹵基修飾(例如，氟基)，或1個至約3個2'-鹵基修飾(例如，氟基)。在一些實施例中，寡核苷酸含有在非鎖位置處之所有2'-氟基核苷酸，或在所有非鎖嘧啶核苷酸上之2'-氟基。在某些實施例中，2'-氟基獨立地為雙甲基化、三甲基化或未甲基化的。
寡核苷酸可具有一或多個2'-脫氧基修飾(例如，針對2'羥基之氫)，且在一些實施例中，在非鎖位置處含有約2個至約10個2'-脫氧基修飾，或在所有非鎖位置處含有2'脫氧基。
在例示性實施例中，寡核苷酸在非鎖位置中含有修飾為2'OMe之2'位。或者，非鎖嘌呤核苷酸在2'位修飾為2'OMe，且非鎖嘧啶核苷酸在2'位修飾為2'-氟基。
在某些實施例中，寡核苷酸進一步包含至少一個末端修飾或「帽子」。帽子可為5'及/或3'帽子結構。術語「帽子」或「端帽」包括在寡核苷酸任一末端(針對末端核糖核苷酸)處之化學修飾，且包括在5'端上最後兩個核苷酸與3'端上最後兩個核苷酸之間之鍵處的修飾。如本文所描述之帽子結構可增加寡核苷酸對外切核酸酶之抗性，而不損害分子與RNA靶或細胞機器之分子相互作用。此類修飾可基於其活體外或活體內效力之增加來選擇。帽子可存在於5'末端(5'帽子)或3'末端(3'帽子)，或可存在於兩端上。在某些實施例中，5'及/或3'帽子係獨立地選自單磷酸硫代磷酸酯、無鹼基殘基(部分)、硫代磷酸酯 鍵、4'-硫基核苷酸、碳環核苷酸、二硫代磷酸酯鍵、反向核苷酸或反向無鹼基部分(2'-3'或3'-3')、單磷酸二硫代磷酸酯及甲基膦酸酯部分。當硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鍵為帽子結構之一部分時，其通常定位於5'端上之兩個末端核苷酸與3'端上之兩個末端核苷酸之間。
在某些實施例中，寡核苷酸具有至少一個末端單磷酸硫代磷酸酯。單磷酸硫代磷酸酯可藉由抑制外切核酸酶之作用來支持較高之效力。單磷酸硫代磷酸酯可在寡核苷酸之5'及/或3'端處。單磷酸硫代磷酸酯係藉由以下結構定義，其中B為鹼基，且R為如上文所描述之2'修飾：
在帽子結構可支持鎖核苷酸之化學性質情況下，帽子結構可併入如本文所描述之鎖核苷酸。
硫代磷酸酯鍵可存在於一些實施例中，諸如在5'與3'端上最後兩個核苷酸之間(例如，作為帽子結構之一部分)，或與磷酸二酯鍵交替。在該等或其他實施例中，寡核苷酸可在5'及3'端中任一者或兩者處含有至少一個末端無鹼基殘基。無鹼基部分不含有公認的嘌呤或嘧啶核苷酸鹼基，諸如腺苷、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。因 此，此類無鹼基部分在1'位處缺乏核苷酸鹼基或具有其他非核苷酸鹼基化學基團。舉例而言，無鹼基核苷酸可為反向無鹼基核苷酸，例如，其中反向無鹼基胺基磷酸酯係經由5'醯胺(amidite)(而非3'醯胺)偶合，產生5'-5'磷酸酯鍵。以下顯示了聚核苷酸之5'及3'端之反向無鹼基核苷的結構。
寡核苷酸可含有一或多個硫代磷酸酯鍵。已使用硫代磷酸酯鍵來使寡核苷酸對核酸裂解更具抗性。舉例而言，聚核苷酸可為部分地硫代磷酸酯鍵聯的，例如，硫代磷酸酯鍵可與磷酸二酯鍵交替。然而，在某些實施例中，寡核苷酸為完全硫代磷酸酯鍵聯的。在其他實施例中，寡核苷酸具有約1個至約5個或約1個至約3個磷酸酯鍵。
在一些實施例中，如WO 2012/061810(以引用的方式併入本文中)中所描述，核苷酸具有一或多個經甲醯胺基修飾之鹼基，包括關於該專利中所揭示的具有雜環取代基之所有例示性嘧啶甲醯胺基修飾。
在例示性實施例中，寡核苷酸具有下表1中所列的化合物之結構。如表1中所描繪，加號(例如，+A)指示LNA鹼基。所有其他鹼基 為DNA。每一miR-15抑制劑具有完全硫代磷酸酯鍵聯之主鏈。
藉由固相合成來合成包括經修飾聚核苷酸在內之寡核苷酸為熟 知的，且評述於New Chemical Methods for Synthesizing Polynucleotides中。Caruthers MH,Beaucage SL,Efcavitch JW,Fisher EF,Matteucci MD,Stabinsky Y.Nucleic Acids Symp.Ser.(7)：215-23,(1980)。
寡核苷酸可被併入多種大分子組件或組合物中。此類用於遞送之複合物可包括經調配用於遞送至病患的多種脂質體、奈米粒子及微胞。該等複合物可包括一或多個融合性或親脂性分子以起始細胞膜穿透。此類分子描述於例如美國專利第7,404,969號及美國專利第7,202,227號中，其以全文引用的方式併入本文中。或者，寡核苷酸可進一步包含側接親脂性基團以輔助細胞遞送，諸如WO 2010/129672中描述之基團，該案以引用的方式併入本文中。
組合物或調配物可使用複數個治療性寡核苷酸，包括本文中所述之至少一者。舉例而言，組合物或調配物可使用至少約2個、約3個、約4個或約5個本文中所述之miRNA抑制劑。
本發明之寡核苷酸可被調配為多種醫藥組合物。醫藥組合物將以適於預定應用之形式製備。一般而言，此將需要製備基本上不含熱原質以及對人類或動物有害之其他雜質的組合物。例示性遞送/調配系統包括膠態分散系統、大分子複合物、奈米囊、微球體、珠粒，及包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體在內之基於脂質之系統。適於將本發明之核酸遞送至心臟及骨胳肌組織之市售脂肪乳液包括Intralipid®、Liposyn®、Liposyn® II、Liposyn® III、Nutrilipid及其他類似的脂質乳液。用作活體內遞送媒劑之較佳膠態系統為脂質體(亦即，人工膜囊)。此類系統之製備及使用在此項技術中為熟知的。例示性調配物亦揭示於以下中：美國專利第5,981,505號、美國專利第6,217,900號、美國專利第6,383,512號、美國專利第5,783,565號、美國專利第7,202,227號、美國專利第6,379,965號、美國專利第 6,127,170號、美國專利第5,837,533號、美國專利第6,747,014號及WO 2003/093449，該等專利以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，寡核苷酸被調配用於習知的皮下或靜脈內投藥，例如藉由用適當水性稀釋劑(包括無菌水及生理食鹽水)調配。
醫藥組合物及調配物可使用適當鹽及緩衝劑以使遞送媒劑穩定且能被靶細胞攝取。本發明之水性組合物包含溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑或水性介質中的有效量之包含抑制劑寡核苷酸之遞送媒劑(例如脂質體或其他複合物)。短語「醫藥學上可接受」或「藥理學上可接受」係指分子實體及組合物當向動物或人類投與時不會產生不良反應、過敏反應或其他不當反應。如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」可包括一或多種溶劑、緩衝劑、溶液、分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，以及用於調配醫藥可接受之類似物，諸如適於向人類投與之醫藥。此類介質及試劑在醫藥學活性物質中之使用在此項技術中為熟知的。輔助性活性成分亦可併入至組合物中。
投與或遞送根據本發明之醫藥組合物可經由任何途徑進行，只要靶組織經由該途徑可利用即可。舉例而言，可藉由皮內、皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射，或藉由直接注射至靶組織中(例如，心臟組織)來進行投藥。本文揭示之寡核苷酸之穩定性及/或效力允許便利的投藥途徑，包括皮下、皮內及肌肉內。為將治療劑遞送至心臟，包含miRNA抑制劑之醫藥組合物亦可藉由導管系統或分離冠脈循環之系統來投與。用於將治療劑遞送至心臟及冠狀血管之各種導管系統為此項技術中已知的。適用於本發明中之基於導管之遞送方法或冠脈分離方法的一些非限制性實例揭示於以下中：美國專利第6,416,510號、美國專利第6,716,196號、美國專利第6,953,466號、WO 2005/082440、WO 2006/089340、美國專利公開案第2007/0203445 號、美國專利公開案第2006/0148742號及美國專利公開案第2007/0060907號，其均以全文引用的方式併入本文中。
該等組合物或調配物亦可非經腸或腹膜內投與。舉例而言，可在適當地混合有界面活性劑(諸如羥丙基纖維素)之水中製備呈游離鹼或藥理學上可接受之鹽形式之結合物的溶液。亦可在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中以及在油中製備分散液。在儲存及使用之一般條件下，該等製劑通常含有防腐劑以防止微生物生長。
適於注射使用或導管遞送之醫藥形式包括例如無菌水性溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。一般而言，該等製劑為無菌的且其流動性達到易於注射之程度。製劑應在製造及儲存條件下為穩定的，且應針對微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用提供防腐。適當的溶劑或分散介質可含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液態聚乙二醇，及類似物)、其適合混合物，及植物油。可例如藉由使用塗層，諸如卵磷脂；在分散液情況下藉由維持所需粒度；及藉由使用界面活性劑，來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑或抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及類似物)來防止微生物之作用。在許多情況下，將較佳包括等張劑，例如糖或氯化鈉。可藉由在組合物中使用吸收延遲劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射組合物之吸收。
可藉由將適量結合物併入至溶劑以及所需任何其他成分(例如，如以上所列舉)中來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將各種滅菌之活性成分併入至含有鹼性分散介質及所需其他成分(例如，如以上所列舉)之無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，較佳製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥技術，其自預先無菌過濾之溶液得到活性成分及任何其他所需成分之粉末。
在調配之後，溶液較佳以與劑量調配物相容的方式且以如治療 有效之量投與。該等調配物可易於以多種劑型(諸如可注射溶液、藥物釋放膠囊及類似物)投與。舉例而言，對於以水性溶液形式非經腸投藥，該溶液通常經適當地緩衝，且液態稀釋劑首先例如用足夠的生理食鹽水或葡糖而變為等張的。此類水性溶液可例如用於靜脈內、肌肉內、皮下及腹膜內投與。較佳採用熟習此項技術者已知之無菌水性介質，尤其是根據本發明。舉例而言，可將單次劑量溶解於1ml等張NaCl溶液中，且添加至1000ml皮下灌注液中或注射於所提出之輸注部位(參見例如，「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版，第1035至1038頁及第1570至1580頁)。取決於所治療個體之病狀，將必定地發生一些劑量變化。在任何情況下，負責投藥之人員將決定個別個體之適當劑量。此外，對於人類投藥而言，製劑應滿足FDA生物製品標準辦公室(FDA Office of Biologics standards)所要求之無菌性、致熱原性、總體安全性及純度標準。
本發明提供一種用於將寡核苷酸遞送至哺乳動物細胞之方法(例如，作為本文中所述之組合物或調配物之一部分)，及用於治療、改善或預防哺乳動物病患之病狀之進展的方法。可使寡核苷酸或醫藥組合物在活體外或活體內與靶細胞(例如，哺乳動物細胞)接觸。該細胞可為心臟細胞。
該方法通常包含向哺乳動物病患或靶細胞群投與寡核苷酸或包含該寡核苷酸之組合物。如已描述之寡核苷酸為miRNA抑制劑(例如，具有經設計以抑制miR-15家族miRNA之表現或活性之核苷酸序列)。因此，病患可患有與miR-15家族表現相關、由其介導或由其引起之病狀。此類病狀描述於WO 2009/062169中，其以引用的方式併入本文中。該等病狀包括例如心臟肥大、心肌梗塞、心臟衰竭(例如，充血性心臟衰竭)、血管損傷、局部缺血、缺血再灌注損傷、再狹窄或病理性心臟纖維化，以及與心臟移植相關之病狀。因此，本發 明提供一種本發明之經修飾寡核苷酸及組合物之用途，其係用於治療此類病狀及用於製備供此類治療用之藥劑。
在某些實施例中，病患(例如，人類病患)具有一或多個風險因素，包括例如長期存在的未加控制之高血壓、未校正之瓣膜病、慢性心絞痛、近期心肌梗塞、充血性心臟衰竭、先天性心臟病傾向性及病理性肥大。或者或此外，病患可被診斷為具有例如心臟肥大之遺傳傾向，或可具有例如心臟肥大之家族病史。
在此態樣中，投與miR-15家族成員之抑制劑使個體之(例如)心臟肥大、心臟衰竭、局部缺血、缺血再灌注損傷或心肌梗塞之一或多種症狀改良，或使心臟肥大至心臟衰竭之轉變延遲。該一或多種改良之症狀可為例如增加之運動能力、增加之心臟射血量、降低之左心室舒張末期壓、降低之肺毛細血管楔壓、增加之心輸出量、增加之心指數、降低之肺動脈壓、降低之左心室收縮及舒張末期尺寸、降低之左心室及右心室壁應力、降低之壁張力、增加之生活品質及降低之疾病相關性發病率或死亡率。此外，使用miR-15家族成員之抑制劑可防止心臟肥大及由其引起之相關症狀。
在本發明之一些實施例中，miR-15家族成員之抑制劑可與其他治療模態組合投與。舉例而言，本發明之miR-15抑制劑可與其他類型之治療劑聯合投與，該等其他類型之治療劑為諸如抗高脂蛋白血劑、抗動脈硬化劑、抗血栓劑/纖維蛋白溶解劑、血液凝結劑、抗心律不整劑、抗高血壓劑、充血性心臟衰竭之治療劑、抗心絞痛劑、抗細菌劑、血管擴張劑、激素拮抗劑、強心劑、利尿劑、內皮素受體拮抗劑、鈣離子通道阻斷劑、磷酸二酯酶抑制劑、血管緊張素II轉換酶(ACE)抑制劑、細胞激素阻斷劑/抑制劑、HDAC抑制劑或其組合。組合療法亦可涉及抑制心臟重塑中所涉及之額外miRNA之表現或活性，該等額外miRNA為諸如miR-499、miR-208、miR-208b及miR-21，其 描述於WO 2012/083005及WO 2009/058818中，其內容以引用的方式併入本文中。此外，miR-15抑制劑可與手術聯合投與。miR-15抑制劑亦可與非藥理學治療方式一起投與。舉例而言，就心臟病症而言，非藥理學治療可涉及減少膳食中的鈉。
在各種實施例中，醫藥組合物係藉由非經腸投藥或藉由直接注射至心臟組織中來投與。非經腸投藥可為靜脈內、皮下或肌肉內投藥。在一些實施例中，該組合物係藉由經口、經皮、持續釋放、控制釋放、延遲釋放、栓劑、導管或舌下投藥來投與。在某些實施例中，寡核苷酸係以約25mg/kg或25mg/kg以下之劑量，或約10mg/kg或10mg/kg以下之劑量，或約5mg/kg或5mg/kg以下之劑量來投與。在此等實施例中，寡核苷酸或組合物可藉由肌肉內或皮下注射或靜脈內來投與。
在某些實施例中，在心臟組織中或如在病患血清中所測定，miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497之活性降低或受抑制。
在一實施例中，本發明之方法可包含向靶細胞群或哺乳動物個體投與有效使靶Pim1去抑制之劑量的miR-15家族抑制劑，該抑制劑可為本文中所述之寡核苷酸。在另一實施例中，本發明亦提供調節細胞中Pim1及其他靶基因(諸如Bcl2L2、Birc5、Grn及Cdc2A)之表現之方法，該方法包含使該細胞與miR-15抑制劑接觸。在一實施例中，在投與miR-15抑制劑後，Pim1、Bcl2L2、Birc5、Grn及Cdc2A之表現增加。可在治療前、治療期間或治療後監測Pim1及/或本文中所述之其他標記物之表現以測定治療反應。
在一些實施例中，該方法進一步包含在治療後清除或去除miRNA抑制劑。舉例而言，具有與抑制劑互補之核苷酸序列之寡核苷酸可在治療後投與以衰減或終止抑制劑之功能。
藉由以下實例來進一步說明本發明，該等實例不應解釋為限制。在本申請案通篇所引用之所有參考文獻、專利及公開之專利申請案的內容以及圖式均以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。
實例 實例1：心臟組織中miR-15家族成員之豐度
藉由即時PCR分析來評估心臟組織中miR-15家族成員之豐度。具體言之，自人(n=6)、豬(n=6)及小鼠(n=30)心肌細胞中提取出全部RNA。接著使用即時PCR測定每個細胞之微RNA複本數，且針對市售標準品(Ambion)進行校正。
結果(圖1)顯示，miR-16為心臟組織中最豐富之miR-15家族成員，每個細胞大約10,000個複本。包括miR-15a、miR-15b、miR-195、miR-497、miR-424及miR-322在內之其他miR-15家族成員係以每個細胞大約1,000個複本來表現。此外，miR-322似乎僅在齧齒動物中表現，而miR-424表現似乎限於較大動物(例如，人類及豬)。
實例2：受miR-15家族成員調節之基因靶之鑑別
合成靶向miR-15家族(miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-497、miR-424及miR-322)之一組miRNA抑制劑(單鏈寡核苷酸)。序列及修飾模式顯示於表1中。該組包括範圍在8個核苷酸至16個核苷酸內之多種長度的反向補體抑制劑。LNA修飾之數目以及寡核苷酸中LNA修飾之位置係變化的。
先前的研究已鑑別出受miR-15家族成員調節之潛在基因靶。為了鑑別心臟組織中之特定miR-15家族靶，對野生型C57BL6小鼠皮下注射生理食鹽水，或者25mg/kg對照寡核苷酸或抗miR-15b寡核苷酸(M-10134)。在3天之治療期期間給予3次劑量。在最後一次注射之後24小時收集心臟組織，且藉由即時PCR來評估靶基因表現。結果(圖2)顯示，Bcl2L2、Birc5、Grn及Cdc2A之表現在miR-15b抑制之後顯著 增加，表明該等基因在心臟組織中受miR-15家族成員調節。
為進一步驗證miR-15家族靶，對野生型C57/BL6小鼠皮下注射生理食鹽水，或者2.8mg/kg、10mg/kg或25mg/kg對照寡核苷酸或抗miR-15b寡核苷酸(M-10134)。在3天之治療期期間給予3次劑量。在最後一次注射之後24小時收集心臟組織，且藉由即時PCR來評估靶基因表現。結果(圖3)顯示，Birc5、Cdc2A及Grn對於miR-15b抑制特別敏感。具體言之，該等基因之表現響應miR-15b抑制以劑量依賴性方式增加。
實例3：靶向miR-15家族之miRNA抑制劑之活性
對25種miRNA抑制劑(如表1中所示)抑制miR-15家族成員之能力進行測試。
A.在活體內藉由miRNA抑制劑抑制miR-15家族成員
為了測定miR15抑制劑針對miR15靶基因表現之功效，對野生型C57/BL6小鼠皮下注射生理食鹽水，或者25mg/kg對照寡核苷酸或個別抗miR-15寡核苷酸。在3天之治療期期間給予3次劑量。在最後一次注射之後24小時收集心臟組織，且藉由即時PCR來評估靶基因表現。如圖4中所示，miRNA抑制劑之長度以及LNA模式賦予了不同的抑制活性。特定言之，抑制劑M-10670、M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220、M-11221、M-11222強烈地影響miR-15靶基因(諸如Birc5、Cdc2A、Grn、CcnD1及CcnD2)之表現。該等抑制劑之長度在12個核苷酸至16個核苷酸間變化。其中，12-mer抑制劑M-11211似乎展現最有效的抑制活性，影響了五分之四之miR-15靶基因之表現。
利用兩步驟即時PCR分析(Applied Biosystems)來評估miRNA抑制劑抑制個別miR-15家族成員之能力。具體言之，對於先前鑑別的包括M-10670、M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220、M-11221、M-11222在內之有效化合物對miR-15a、miR-15b、miR-16及 miR-195表現之影響進行測試。如先前所描述，對野生型C57/BL6小鼠皮下注射生理食鹽水，或者25mg/kg對照寡核苷酸或抗miR-15寡核苷酸。在3天之治療期期間給予3次劑量。結果(圖6A及6B)顯示，12-mer抑制劑M-11220為所測試的最佳抑制劑，且抑制包括miR-15a、miR-15b、miR-16及miR-195在內之全部4個miR-15家族成員。16-mer抑制劑(亦即，M-10670、M-11211、M-11213、M-11214及M-11215)在不同程度上抑制三個或三個以上家族成員。
B.在活體外藉由miRNA抑制劑抑制miR-15家族成員
在活體外利用雙螢光素酶分析來測試miRNA抑制劑之活性。具體言之，用不同濃度之miR-15抑制劑以及每孔25ng報告質體來轉染HeLa細胞。特定言之，如藉由需要在2至50nM範圍內之轉染抑制劑濃度所證實，與其他構築體之0.31至8.3nM相比較，miR-195雙螢光素酶構築體在微RNA抑制方面似乎不如其他構築體敏感。結果(圖8A及8B)顯示，12-mer抑制劑M-11220為所測試的最佳抑制劑，且抑制全部4個miR-15家族成員。16-mer抑制劑(亦即，M-10670、M-11211、M-11213、M-11214及M-11215)在不同程度上抑制三個或三個以上家族成員。
實例4：靶向miR-15家族之miRNA抑制劑之活體內活性 A. miRNA抑制劑以劑量依賴性方式使miR-15靶去抑制
進行研究以比較miR-15抑制劑之不同劑量方案。具體言之，對一組小鼠皮下注射25mg/kg劑量之抑制劑M-10670、M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220、M-11221或M-11222。該等抑制劑在3天之時程內投與3次(3×25MPK方案)(圖9A)。比較而言，第二組小鼠僅用單次劑量之25mg/kg之miR-15抑制劑(1×25MPK方案)處理。結果(圖9B)顯示，3×25MPK方案在影響靶基因表現方面比1×25MPK方案更有效。
B. miRNA抑制劑使靶去抑制之動力學
進行時程研究以測定miR-15抑制劑使靶去抑制之動力學。具體言之，對小鼠皮下注射25mg/kgM-11215。僅投與單次劑量。在注射後24小時、48小時、72小時或98小時收集心臟組織。如圖10中所示，單次劑量之M-11215早在處理後24小時即引起靶基因(諸如Birc5)之去抑制。
C. miRNA抑制劑使靶整體及特異性去抑制
進行全基因組微陣列分析以測定miR-15抑制劑使靶去抑制之特異性。具體言之，自經M-11214處理之小鼠及經生理食鹽水處理之小鼠之心臟組織中提取出全部RNA。RNA隨後經歷全基因組微陣列分析。在將經M-11214處理之心臟全部RNA與經生理食鹽水處理之全部RNA相比時上調之基因中，含有miR-15種子之基因富集於上調之基因印記中(p值：0.01；圖11)。此結果證實，M-11214引起miR-15家族特異性靶基因去抑制。
實例5：在大鼠中miR-15抑制劑之活體內活性
在大鼠中進一步測試miR-15抑制劑之活體內活性。更具體言之，對史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat)(49至52日之年齡)注射25mg/kg miR-15抑制劑，包括M-10670、M-11211、M-11213、M-11214、M-11215、M-11220、M-11221或M-11222。僅投與單次劑量。在注射後第4天收集心臟組織，且分析靶基因表現。結果顯示(圖12A)，16-mer抑制劑在大鼠中似乎對靶基因表現上具有更有效之作用。
結果亦表明Pim1為一個新穎的miR-15家族基因靶。先前已顯示Pim1之過度表現引起心臟祖細胞(CPC)之增殖活性增加。CPC為產生子細胞之自更新細胞，該等子細胞向心臟供應新的肌細胞及血管，進而刺激心肌再生。miR-15與Pim1之間之聯繫表明，抑制miR-15使得 產生新的心肌細胞，其對於修復心臟損傷可能有益。
此外，進行比較研究以檢驗miR-15抑制劑在大鼠中與在小鼠中之功效。如先前所描述，用miR-15抑制劑處理史-道二氏大鼠，且在注射後48小時分析心臟組織中miR-15靶基因之表現。如圖12B中所示，除在大鼠中似乎無效之12-mer抑制劑外，miR-15抑制劑在大鼠中似乎比在小鼠中具有更有效之作用。
實例6：miR-15抑制劑在大鼠缺血再灌注損傷模型中之活體內活性 A. miR-15抑制劑使靶基因去抑制
在大鼠缺血再灌注損傷模型中測試miR-15抑制劑之活體內活性。具體言之，在缺血/再灌注模型中，對大鼠靜脈內注射單次劑量(25mg/kg)之miR-15抑制劑，包括M-10670、M-11211、M-11214或M-10591。在再灌注之後72小時處死大鼠，且收集組織並分析靶基因表現(如藉由即時PCR量測)。如圖13中所示，當與非梗塞對照組(基線)相比時，所有miR-15抑制劑均誘導包括Birc5、Cdc2a及Granulin在內之靶基因之顯著去抑制。
B. miR-15抑制劑抑制發炎性標記物
缺血再灌注損傷使心肌梗塞邊緣區域中包括VCAM、ITGAM及CD40在內之各種發炎性標記物之mRNA表現升高。圖14中顯示了miR-15抑制劑對該邊緣區域中發炎性標記物表現之影響。
C. miR-15抑制劑使心肌梗塞減少
此研究評估了miR-15抑制劑對心肌梗塞之影響。具體言之，在缺血再灌注損傷後3天，分析風險面積以及心肌梗塞尺寸。圖15A及15B中分別顯示了miR-15抑制劑對風險面積及心肌梗塞尺寸之影響。
D. miR-15抑制劑使射血分數改良
此研究使用大鼠缺血再灌注損傷模型評估了miR-15抑制劑對射血分數之影響。具體言之，在再灌注時以及在再灌注之後一週、兩週 及三週，對大鼠靜脈內注射單次劑量(25mg/kg)之miR-15抑制劑，包括M-11211及M-11214。如圖16中所示，在缺血再灌注損傷之後四週，當與經生理食鹽水處理之動物相比時，miR-15抑制劑使射血分數顯著改良。
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Claims (45)

  1. 一種含有至少一個鎖核苷酸之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含核苷酸序列5'-GTGCTGCT-3'，且與一或多個miR-15家族成員之核苷酸序列實質上互補，且其中該寡核苷酸在活體外螢光素酶分析中在約50nM或50nM以下之寡核苷酸濃度下，或在齧齒動物模型中在約25mg/kg或25mg/kg以下之劑量下，降低或抑制一或多個miR-15家族成員之活性。
  2. 如請求項1之寡核苷酸，其中該一或多個miR-15家族成員係選自miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424及miR-497。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸，其含有至少8個鎖核苷酸。
  4. 如請求項1至3中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為約8個至約18個核苷酸長。
  5. 如請求項4之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為約12個至約17個核苷酸長。
  6. 如請求項5之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為約16個核苷酸長。
  7. 如請求項5或6之寡核苷酸，其包含選自以下之核苷酸序列：5'-ACCATTATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.1)、5'-ACCATGATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.2)、5'-ATATTTACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.3)及5'-ATATTTCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.4)。
  8. 如請求項6或7之寡核苷酸，其含有9個鎖核苷酸及/或7個非鎖核苷酸。
  9. 如請求項6至8中任一項之寡核苷酸，其中至少位置1、5、8、10及16為鎖核苷酸。
  10. 如請求項4之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為約12個核苷酸長。
  11. 如請求項4或10之寡核苷酸，其包含選自以下之核苷酸序列：5'-TTATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.5)、5'-TTACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.6)、5'-TTCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.7)、5'-TTCCGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.8)、5'-TGATGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.9)、5'-TGACGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.10)、5'-TGCTGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.11)及5'-TGCCGTGCTGCT-3'(SEQ ID NO.12)。
  12. 如請求項10或11之寡核苷酸，其含有8個鎖核苷酸及/或4個非鎖核苷酸。
  13. 如請求項10至12中任一項之寡核苷酸，其中至少位置1、4、9及12為鎖核苷酸。
  14. 如請求項4之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為約8個核苷酸長。
  15. 如請求項14之寡核苷酸，其具有實質上所有鎖核苷酸及一個核苷酸序列5'-GTGCTGCT-3'。
  16. 如請求項1至15中任一項之寡核苷酸，其中與該一或多個miR-15家族成員之種子區互補之區域包含至少4個鎖核苷酸。
  17. 如請求項1至16中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸不含有具有3個以上鄰接非鎖核苷酸及/或3個以上鄰接鎖核苷酸之核苷酸段。
  18. 如請求項1至17中任一項之寡核苷酸，其中至少一個非鎖核苷酸係選自2'脫氧基、2'-O-甲基、2'-O-烷基、2'-鹵基及2'-氟基核苷酸。
  19. 如請求項18之寡核苷酸，其中至少一個非鎖核苷酸為2'脫氧基核苷酸。
  20. 如請求項19之寡核苷酸，其中所有非鎖核苷酸均為2'脫氧基核苷酸。
  21. 如請求項1至20中任一項之寡核苷酸，其中該鎖核苷酸具有包含伸乙基或亞甲基之2'至4'橋。
  22. 如請求項21之寡核苷酸，其中該鎖核苷酸具有2'至4'亞甲基橋。
  23. 如請求項1至22中任一項之寡核苷酸，其具有5'及/或3'帽子結構。
  24. 如請求項1至23中任一項之寡核苷酸，其含有一或多個硫代磷酸酯鍵。
  25. 如請求項24之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為完全硫代磷酸酯鍵聯的。
  26. 如請求項24之寡核苷酸，其具有1個至3個磷酸酯鍵。
  27. 如請求項1之寡核苷酸，其具有以下化合物之結構：M-10113、M-10134、M-10564、M-10566、M-10567、M-10670、M-11206、M-11207、M-11208、M-11209、M-11210、M-11211、M-11212、M-11213、M-11214、M-11215、M-11216、M-11217、M-11218、M-11219、M-11220、M-11221、M-11222、M-11223或M-11224。
  28. 如請求項1至27中任一項之寡核苷酸，其進一步包含側接親脂性基團。
  29. 一種醫藥組合物，其包含有效量之如請求項1至28中任一項之寡核苷酸，或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  30. 如請求項29之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含膠態分散系統、大分子複合物、奈米囊、微球體、珠粒、水包油乳液、微胞、混合微胞或脂質體。
  31. 如請求項29之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑基本上由生理食鹽水組成。
  32. 一種降低或抑制細胞中之一或多個miR-15家族成員之活性的方法，其包含使該細胞與如請求項1至28中任一項之寡核苷酸或如請求項29至31中任一項之組合物接觸。
  33. 如請求項32之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  34. 如請求項33之方法，其中該細胞為心臟細胞。
  35. 如請求項32之方法，其中該細胞為活體內或離體的。
  36. 一種預防或治療個體之與一或多個miR-15家族成員相關或由其介導之病狀的方法，其包含向該個體投與足以使靶Pim1去抑制之劑量的至少一種miR-15家族抑制劑。
  37. 如請求項36之方法，其中該miR15家族抑制劑為如請求項1至28中任一項之寡核苷酸。
  38. 如請求項36之方法，其包含向該個體投與如請求項29至31中任一項之醫藥組合物。
  39. 如請求項38之方法，其中該醫藥組合物係藉由非經腸投藥或藉由直接注射至心臟組織中來投與。
  40. 如請求項39之方法，其中該非經腸投藥為靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內投藥。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，其中該組合物係藉由經口、經皮、持續釋放、控制釋放、延遲釋放、栓劑、導管或舌下投藥來投與。
  42. 如請求項36至41中任一項之方法，其中該病狀為心臟病狀。
  43. 如請求項42之方法，其中該心臟病狀為病理性心臟肥大、心肌梗塞、心臟衰竭、局部缺血或缺血再灌注損傷。
  44. 如請求項42之方法，其中該心臟病狀與心臟移植相關。
  45. 如請求項36至44中任一項之方法，其中該個體為人類。
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