KR101589869B1

KR101589869B1 - 단백질 키나아제 C 억제제(Protein Kinase C Inhibitor)로 인한 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 미백효과 및 항산화효과 관련 성장인자 발현 제어 및 분비를 촉진하는 성장인자 대량 생산방법

Info

Publication number: KR101589869B1
Application number: KR1020150049145A
Authority: KR
Inventors: 박문서; 황기철
Original assignee: 가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2016-01-29

Abstract

하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물에 관한 것으로,
본 발명에서는 화학식 1의 화합물을 함유하는 배지에서 줄기세포를 증식 및 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있으며, 특히 중간엽 줄기세포의 성장인자의 측분비 효과를 극대화하여 인간 성장인자를 대량으로 얻을 수 있다. 또한 미백 효능 및 항산화 효능을 갖는 배지 조성물을 얻을 수 있다.
[화학식 1]

Description

단백질 키나아제 C 억제제(Protein Kinase C Inhibitor)로 인한 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 미백효과 및 항산화효과 관련 성장인자 발현 제어 및 분비를 촉진하는 성장인자 대량 생산방법{Fine controlled the expression and the production of growth factors related skin whitening and anti-oxidant effect of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells by protein kinase c inhibitor}

본 발명은 단백질 인산화효소 C 억제제로 처리된 지방 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로 단백질 인산화효소 C 억제제를 이용하여 줄기세포에서 분비되는 성장인자 중에서 특정 기능과 관련된 성장인자의 발현을 높이는 것에 관한 것이다.

줄기세포는 1960년 대에 캐나다 Ontario cancer institute의 Ernest A. McCulloch와 James E. Till에 의해 발견되었으며, 무한 자기복제 능력과 정상 염색체 유지 및 다양한 세포로의 분화능력을 갖고 있는 세포를 의미한다. 줄기세포의 유래에 따라 성체 줄기세포와 배아 줄기세포 및 그리고 최근에 개발된 역분화 줄기세포 등으로 나누어지는데 윤리적 논란이 있는 배아 줄기세포와 안전성이 확인되지 않은 역분화 줄기세포보다는 성체 줄기세포를 활용한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

성체 줄기세포는 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포활성화 물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제한다고 알려져 있다. 성체 줄기세포의 가장 중요한 생물학적 역할은 손상된 조직을 재생시키는데 있고, 평소에도 손상을 입자 않도록 꾸준히 복구하며 여러 가지 생리-생화학적인 일들을 하고 있으나 조직이 크게 손상된 경우 줄기세포들은 여러 가지 복부방법으로 손상된 부위를 빠르게 복구할 수 있다. 줄기세포를 피부에 적용하고자 하려는 아이디어는 다음 두 가지 실험에서 얻어졌는데, 쥐를 이용한 실험에서 손상된 조직에 줄기세포를 투여하면 손상된 부위가 복구될 수 있으며, 손상된 모낭은 줄기세포를 투여하면 새로운 털이 자라는 것을 볼 수 있다는 실험결과에서 줄기세포의 항노화, 항염증, 상처치유는 물론 탈모방지나 육모 등에 이용하려는 시도로 이루어지고 있다.

화장품 산업은 기술적 측면에서 화학, 생물학, 생리학 및 약학 등의 기초과학과 응용 기술이 복합적으로 적용되는 분야로, 기술집약적이고 고부가가치 산업이다. 오늘날 화장품은 사람의 피부에 직접 사용하는 제품으로써, 피부에 다한 안전성, 효능 및 사용 편의성 등을 갖추어야 하며, 아름다움을 가꾸는 미적 기능뿐 아니라 피부를 보호, 청결, 보습, 유연 및 피부 생리적 기능을 유지하는 생물학적 기능 또한 갖추어야 한다. 이 점에서, 최근 기능성이 높은 줄기세포에서 분비되는 성장인자들을 화장품에 적용하여 기능성이 높은 제품을 개발하고자 하는 시도들이 꾸준히 화장품 업체와 관련 소재개발 바이오 기업들을 중심으로 진행되고 있다.

멜라닌 색소는 눈, 머리카락, 피부의 색을 결정하고, 유해한 자외선조사 약물 및 화학물질들로부터 피부를 보호하는 역할을 수행한다. 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 세포에 의해 형성되는 멜라닌 색소는 흑색이나 갈색을 띄는 Eumelanin과 적색이나 황색을 띄는 Pheomelanin의 두 종류가 있는데, 검은 피부의 특징은 Pheomelanin보다 Eumelanin의 함량이 상대적으로 많고, 멜라닌 합성효소인 Tyrosinase 또는 TRP-1이나 TRP-2같은 단백질의 함량이 높다. 멜라닌 색소의 생성은 자외선이나 염증 같은 자극에 의해 촉진되는데, 이를 억제시키기 위한 방법으로 자외선과 같은 외부로부터의 자극을 줄이거나 상기 자극을 멜라닌 세포로 전달하는 신호를 차단하는 방법, 멜라닌 색소 형성효소인 Tyrosinase의 합성을 억제시키거나 활성을 저해 시키는 방법, 또는 생성된 밀라닌 색소를 환원시키거나 각질 박리 작용으로 외부로 배출시키는 방법을 사용할 수 있다. 각각의 방법별 대표적 활성물질들의 예를 하기 표 1에 정리 하였다 (비특허문헌 1).

Mechanism	Example
UV Protection	Titanium oxide, Zinc oxide, Octyl methoxycinnamate, Oxybenzone
Control of Signal Transduction	Immelin, Chamomile extract
Inhibition of Tyrosinase Synthesis	Phytoclear EL-1, Selina
Inhibition of Tyrosinase Activity	Arbutin, Licorice extract, Mulberry extract
Reduction of Melanin	Vitamin C, Glutathion, Coenzyme Q10
Stimulation of Skin Turnover	AHA, Salicylic acid, Protease

단백질 키나아제 C-β(Protein Kinase C-β, PKC-β)는 자외선 자극을 받은 후 Inositol triphosphate/diacylglycerol(IP3/DAG)를 거쳐 활성화되고, Tyrosinase를 활성화 시켜 멜라닌 색소 형성을 시키는 주요 인자이다(비특허문헌 2).

인간 형질 전환 성장인자 베타1(Transforming growth factor-β1, TGF β1)은 표피섬유아세포를 자극하여 콜라겐 타입 1과 3(Collagen type 1 and 3), 알파 평활근 엑틴(Alpha smooth muscle actin), 기질 금속단백분해효소-1, 2, 8(matrix metalloproteinase-1, 2, 8)의 mRNA와 단백질의 발현을 증가시켜 상처 후 재생을 촉진시킨다고 보고 되었다(비특허문헌 3). 특히 줄기세포에서 유래된 인간 형질 전환 성장인자 베타 1이 B16 멜라닌세포에서 멜라닌의 형성을 억제하여 미백효과를 보였다는 보고로 인하여 기능성 화장료 조성물의 핵심 인자로 알려졌다(비특허문헌 4).

자외선 조사(UV irradiation)는 (100~400nm 파장) 파장대 별로 UVA (320~400nm), UVB (280~320nm), UVC (200~280nm)로 구분되고, 이 중에서 UVB는 전체 자외선 조사량의 4% 밖에 되지는 않지만, 피부에 심각한 악영향과 유전적 독성을 야기시킨다. 또한 일중항 산소(singlet oxygen), 과산화수소(hydrogen peroxide), 과산화물 음이온(superoxide anion)과 히드록실 라디칼(hydroxyl radical)을 포함하는 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)의 형성과 광분해 생성물을 초래하는 주원인으로 알려져 있다.

간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor, HGF)는 망막색소 상피세포(Retinal pigment epithelium cell)에 세포의 사멸을 유도하는 DL-buthionine-(S,R)-sulfoxinine(BSO)를 처리했을 때, 세포 내 반응성 산소종(Intracellular reactive oxygen species, iROS)의 발현감소와 Bcl-2의 발현을 증가시켜 강력한 항산화 효과를 통하여 세포사멸을 감소시킨다고 보고 되었다(비특허문헌 5).

맥관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관신생을 돕고 노화되어 피부세포 내에 증가된 과산화물 발현을 낮추어 세포의 대사활성을 회복시킨다고 다양한 연구를 통해 널리 알려져 있다(비특허문헌 6).

Kyong KY; KIC News, Volume 13, No. 4, 2010 Ines Ferreira dos Santos Videira, Daniel Filipe Lima Moura, Sofia Magina; An Bras Dermatol. 2013;88(1):76-83. Shi JH, Guan H, Shi S, Cai WX, Bai XZ, Hu XL, Fang XB, Liu JQ, Tao K, Zhu XX, Tang CW, Hu DH; Arch Dermatol Res. 2013 May;305(4):341-52 Kim WS, Park SH, Ahn SJ, Kim HK, Park JS, Lee GY, Kim KJ, Whang KK, Kang SH, Park BS, Sung JH, Biol Pharm Bull. 2008 Apr;31(4);606-10 Jin M, Yaung J, Kannan R, He S, Ryan SJ, Hinton DR; Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Nov; 46(11):4311-9 Roy S, Khanna S, Sen CK; Free Radic Biol Med. 2008 Jan 15;44(2):180-92

본 발명의 목적은 단백질 인산화 효소 C 억제제로 유도된 중간엽 줄기세포의 성장인자 함유 배양액을 포함하는 미백 및/또는 항산화용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 전술한 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 생산된 줄기세포 성장인자를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 항산화용 또는 미백용으로 사용할 수 있다.

본 발명에서는 단백질 인산화효소 C 억제제(PKC Inhibitor)인

를 포함하는 배지에서 줄기세포를 증식 및 배양하여, 안정적으로 상기 줄기세포를 증식 및 배양할 수 있으며, 특히, 중간엽 줄기세포의 성장인자의 측분비 효과를 극대화하여 인간 성장인자를 대량으로 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 배양된 배양액 중의 성장인자는 미백, 항산화 효과가 기대되어 피부 외용제 또는 화장료에 사용할 수 있다.

도 1 내지 3은 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지의 사이토카인 및 특정 성장인자의 발현을 측정하고자 실시된 사이토카인 분석결과를 나타내는 사진(도 1) 및 그래프(도 2 및 3)이다.
도 4는 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배양액의 미백 효능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배양액의 항산화 효능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지에서의 세포독성평가 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 줄기세포 성장인자의 대량 생산을 위한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(이하, 화학식 1의 화합물이라 한다.)의 용도, 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물 및 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.

여기서, 용어 ‘줄기세포 성장인자’는 줄기세포에서 분비되는 성장인자를 의미한다.

[화학식 1]

본 발명에서 줄기세포 성장인자의 대량 생산을 위한 화학식 1로 표시되는 화합물(이하, 화학식 1의 화합물이라 할 수 있다.)은

일 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 합성하여 이용하거나, 시판되고 있는 화합물을 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘줄기세포’는 스스로 세포 분열을 할 수 있고, 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포이다. 이러한 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 한 구체예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 지방, 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 상기 지방, 골수 또는 조직 등의 채취 대상 동물은 포유동물일 수 있으며, 구체적으로 인간일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 특히 본 발명에서는 인간 지방 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포(이하, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포라 할 수 있다.)를 이용할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포에서는 성장인자가 세포 밖으로 분비된다. 이러한, 중간엽 줄기세포에 분비되는 성장인자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1^α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE₂(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), FGF-2(fibroblast growth factor-2), ET-a, α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, IL-6(Interleukin-6), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 줄기세포에서 분비되는 성장인자(줄기세포 성장인자)는 항산화 효과 또는 미백 효과를 가지는데, 미백 효과를 가지는 성장인자는 TGF-β1(Transforming growth factor beta1), ET-a, SCF(stem cell growth factor), FGF-2(fibroblast growth factor-2) HGF(Hepatocyte Growth Factor) 또는 α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone)일 수 있으며, 항산화 효과를 가지는 성장인자는 IGF(Insulin-like growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), HGF(Hepatocyte Growth Factor) PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 또는 IL-6(Interleukin-6)일 수 있다.

본 발명에서는 이러한 항산화 및 피부 미백과 관련된 성장인자의 세포 내 발현이 매우 높으며, 동시에 세포 밖으로 고농도로 분비할 수 있으므로, 성장인자의 발현-분비 기전에 대한 연구 및 분비된 성장인자를 이용한 관련 질환 개선-치료제 또는 화장품 원료 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에서는 전술한 줄기세포 성장인자를 대량 생산하기 위한 배지 조성물을 제공하며, 상기 배지 조성물은 화학식 1의 화합물을 포함할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물은

일 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), IL-6(Interleukin-6), 및 PEDF(Pigment epithelium derived factor)의 발현 및 세포 외 분비를 증가시킬 수 있다. 따라서 미백기능의 주요한 멜라닌 색소형성을 억제하는 정도를 측정하는 Tyrosinase Inhibition 기능을 증가시킬 수 있고, 항산화 기능 평가인 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물은 무혈청 배지(serum-free)일 수 있다. 무혈청 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청(동물 유래 혈청)을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지는 동물 유래 혈청을 총 조성물 함량 대비 0.1 중량% 미만 또는 0.01 중량% 미만으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 동물 유래 혈청을 함유하지 않을 수 있다.

줄기세포 성장인자를 대량 생산하기 위한 일반적인 배지는 당업계에 공지되어 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 배양 시 동물 유래 혈청을 약 5 내지 20% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 그러나, 동물 유래 혈청은 미확인된 미량성분을 포함하므로, 세포의 성장에 영향을 미치며, 분석이 어렵고, 재현성 있는 시험 및 생산공정을 확립하는데 어려움이 있었다.

본 발명에서는 줄기세포 성장인자의 대량 생산 및 배양을 위해 필요한 동물 유래 혈청 대신 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있고, 재현성 있는 시험 및 생산공정의 확립이 가능하며, 줄기세포 성장인자를 대량 생산할 수 있다.

상기 줄기세포 성장인자 대량 생산용 무혈청 배지 조성물에서 화학식 1의 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 10 uM 이하 또는 1 uM 이하의 범위로 조절될 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 0.3 uM 이상의 농도를 가질 수 있다.

본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 전술한 종류를 사용할 수 있으며, 구체적으로 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.

또한, 줄기세포 성장인자의 종류는 전술한 바와 같으며, 배지의 조성 또한 전술한 바와 같다.

상기 화학식 1의 화합물의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 배지 내에서 10 uM 이하 또는 1 uM 이하의 범위로 조절될 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 0.3 uM 이상의 농도를 가질 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법은,

(a) 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포를 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 한 구체예에서, (b)에서 배양된 배양액에서 줄기세포 성장인자를 분리하는 (c) 단계를 추가로 수행할 수 있다.

단계 (A)에서 혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 CNT-57, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용할 수 있으며, 세포 배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함할 수 있다.

혈청은 0.1 내지 20％의 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

또한, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가할 수 있다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 80％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 75％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포는 화학식 1의 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양할 수 있다(단계 (b)).

상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물이 첨가된 무혈청 배지에서 배양된 줄기세포 배양액은 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있다. 예컨대, 줄기세포 성장인자, 즉, IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1^α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE₂(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장인자가 포함될 수 있으며, 구체적으로 IL-6(Interleukin-6), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장인자가 고농축으로 존재할 수 있다.

이러한 배양액 중의 성장인자는 상기 성장인자를 분리하는 단계(단계 (c))를 통해 분리될 수 있다. 상기 성장인자의 분리는 당업계에서 사용되는 일반적인 공정을 통해 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 성장인자의 분리는 배양액을 체에 거르는 공정을 통해 수행될 수 있다. 이때, 체는 성장인자의 크기보다 작고, 전술한 화학식 1의 화합물보다는 큰 구멍을 가짐으로써, 화학식 1의 화합물 등의 성분을 걸러 상기 성장인자를 용이하게 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법에 의해 제조된 줄기세포 성장인자를 포함하는 배양액은 항산화 또는 미백 효과를 가진다.

따라서, 본 발명의 배양액은 항산화 또는 미백을 위한 피부 외용제 또는 화장료 등의 유효성분으로 사용할 수 있다. 상기 배양액은 분획물로 이용될 수도 있다.

구체적으로, 본 발명의 배양액은 전술한 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양됨으로써, 상기 배양액에는 IL-6(Interleukin-6), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)이 고농축으로 존재하며, 항산화 또는 미백 효과를 지닐 수 있다.

상기 배양액을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

상기 배양액이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

상기 배양액을 화장품으로 사용하는 경우, 상기 배양액을 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수; 훼이셜 로션 또는 바디로션 등과 같은 유액; 영양 크림, 수분 크림 또는 아이 크림 등과 같은 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제; 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

또한 상기 화장품은 상기 배양액에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

상기 배양액은 화장품으로 제품화되는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제 또는 세정제와 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 배양액을 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림 또는 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 화학식 1의 화합물을 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 상기 배양액을 전체 조성물 중량에 대하여 0.000001 중량% 내지 10 중량%(바람직하게는 0.001 중량% 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%)로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 배양액을 0.000001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부 재생 또는 주름개선 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1> 화합물의 물질 정보

[화학식 1]

명칭:

; 3-[1-[3-(Dimethylamino)propyl]-5-methoxy-1H-indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione

CAS No.: 133053-19-7

실시예

실시예 1

(1) 골수 유래 중간엽 줄기세포 수득

인간 지방 유래 중간엽 줄기세포는 Invitrogen으로부터 STEMPRO^® Human Adipose Derived Stem Cells, cat# R7788-110를 구매하였다.

(2) 줄기세포의 배양

지방 유래 중간엽 줄기세포를 60 mm 배양 플레이트(3.2 x 10⁵cells/plate)에, PBS 10% 첨가된 low glucose DMEM 배지를 이용하여 1일 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 세포배양기에서 배양하였다.

그 후, 배양액을 흡입관을 통하여 제거한 다음, PBS 용액을 이용하여 배지 성분을 제거하고, PBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 화학식 1의 화합물 1 uM을 처리하여 5％ CO₂ 및 37℃ 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.

비교예 1

화학식 1의 화합물을 사용하지 않은 무혈청 배지를 사용하였다.

비교예 2

화학식 1의 화합물을 사용하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법으로 배양액을 제조하였다.

비교예 3

화학식 1의 화합물을 사용하지 않고, 1% O₂의 저산소에서 배양한 것을 제외하고는, 실시예 2의 방법으로 배양액을 제조하였다.

실험예 1. 사이토카인 발현 측정

사이코카인의 발현 측정은 Human Cytokine Arrays(RayBiotech, Inc.)을 이용하여 측정하였다.

측정 방법은 하기와 같다.

냉동 보관된 키트를 실온에 두어 실온과 동일한 온도를 만들어준다. Antibody Arrays를 조심스럽게 제거하고 # 마킹 부분이 위로 올라오도록 well에 넣는다. 2ml의 blocking buffer를 각 well에 넣고 30분 실온에서 배양한다. Blocking buffer를 제거하고 1 ml의 샘플(MSC 배양액만 농축하여 사용)을 각 well에 넣고 2시간 실온에서 배양한다. 샘플을 제거한 뒤 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. 1ml biotin-conjugated antibody cocktail을 넣고 실온에서 2시간 배양한다. Biotinylated antibody cocktail을 제거한 뒤 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. 2 mL의 HRP-Streptavidin을 각 well에 넣고 실온에서 2시간 배양한다. HRP-Streptavidin을 제거하고 2 ml 1X wash buffer I으로 5분씩 3번 세척한 뒤, 2 ml 1X wash buffer II로 5분씩 2번 세척한다. Detection buffer C와 D를 1:1로 섞은 뒤, 500 μl씩 각 well에 넣고 실온에서 2 분 배양한 뒤 X-ray film을 사용하여 각 멤브레인 마다 spot을 얻는다.

본 발명에서 도 1 내지 3은 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지의 사이토카인 및 특정 성장인자의 발현을 측정하고자 실시된 사이토카인 분석결과를 나타내는 사진(도 1) 및 그래프(도 2 및 3)이다.

상기 도에서 control은 비교예 2의 배양액을 사용한 경우, Hypoxia은 비교예 3의 배양액을 사용한 경우,

은 실시예 1의 배양액을 사용한 경우를 나타낸다.

상기 도 1에 나타나듯이 화학식 1의 화합물을 사용한

이 인간 형질 전환 성장인자 베타 1(Transforming growth factor-β1, TGF β1), 맥관내피세포 성정인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 색소 상피성 인자(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)의 발현을 효과적으로 높인 것을 확인할 수 있다.

구체적으로

에서 미백 효과로 알려져 있는 인간 형질 전환 성장인자 베타 1(Transforming growth factor-β1, TGF β1)의 발현을 증가되었으며(도 2), 또한, 항산화 효과로 알려져 있는 맥관내피세포 성정인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 색소 상피성 인자(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)의 발현이 증가되었다.

이를 통해 줄기세포를 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양시킴으로써 미백 및 항산화 효과를 지니는 기능성 조성물을 생성할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 2. 미백효능평가

미백효능평가는 Tyrosinase(Sigma-Aldrich)을 이용하여 측정되었다.

측정방법은 하기와 같다.

먼저, 실시예 및 비교예의 배양액을 체에 걸러 성장인자를 분리하여 성장인자 샘플(sample)을 제조한다.

50mM sodium phosphate buffer(pH 6.8)를 준비한다. 각각의 sample을 50mM sodium phosphate buffer(pH 6.8)로 농도에 맞게 희석한다. 5mM L-DOPA solution을 제작한다. Microtube에 labeling 하고 50mM sodium phosphate buffer(pH 6.8)를 200㎕씩 넣은 후, L-DOPA 200㎕를 넣는다. 각각의 sample 500㎕를 넣는다. Tyrosinase를 100unit/㎖로 희석하여 100㎕씩 넣는다. 상온에서 2분간 반응시킨 뒤 475nm에서 흡광값을 측정한다.

본 발명에서 도 4는 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배양액의 미백 효능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4에서 Control은 비교예 1의 배양액을 사용한 경우, CM은 비교예 2의 배양액을 사용한 경우, Hypoxia은 비교예 3의 배양액을 사용한 경우, 및

은 실시예 1의 배양액을 사용한 경우를 나타내며, Kojic acid은 양성대조군으로 무혈청 배지에 Kojic acid 5 μg/ml를 첨가하여 사용한 경우를 나타낸다.

상기 도 4에 나타난 바와 같이, 화학식 1을 사용한 화합물을 사용한

군이 멜라닌 형성을 억제하는 효능이 월등히 높음으며, 양성 대조군인 Kojic acid와 비교하여도 그 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 3. 항산화효능평가

항산화효능평가는 2,2-diphenylpicrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich)를 이용하여 측정되었다.

측정방법은 하기와 같다.

먼저, 실시예 및 비교예의 배양액을 체에 걸러 성장인자를 분리하여 성장인자 시료를 제조한다.

메탄올을 이용하여 시료를 실험 농도별로 total volume을 고려하여 희석하여 준비한다. 시료 자체의 흡광값 때문인지 확인하기 위하여 DPPH 시약을 처리하지 않은 시료 자제의 흡광값도 측정하여 대조군으로 사용한다. 메탄올을 이용하여 100mM DPPH 시약 stock을 제조한다. 100mM DPPH 시약을 0.2mM로 희석하여 준비한다. 24well plate에 준비한 시료를 500㎕씩 넣어주고, 0.2mM DPPH 용액을 500㎕씩 넣어준 후, 암조건, room temperature에서 30min 반응시킨다. ELISA reader로 570nm에서 흡광값을 측정한다.

본 발명에서 도 5는 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배양액의 항산화 효능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5에서 Control은 비교예 1의 배양액을 사용한 경우, CM은 비교예 2의 배양액을 사용한 경우, Hypoxia은 비교예 3의 배양액을 사용한 경우, 및

은 실시예 1의 배양액을 사용한 경우를 나타내며, Ascorbic Acid은 양성대조군으로 무혈청 배지에 Ascorbic Acid 5 μg/ml를 첨가하여 사용한 경우를 나타낸다.

상기 도 5에 나타나듯이, 화학식 1을 사용한 화합물을 사용한

군이 DPPH radical 소거능 평가에서 가장 효과가 높았으며, 양성 대조군인 Ascorbic Acid와 비교하여도 그 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 4. 세포 독성평가

세포독성평가는 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)시약(Life Technologies)을 이용해 측정되었다.

측정방법은 하기와 같다.

실험에 사용 할 세포를 96-well plate에 1×105 cells/㎖의 농도로 100㎕씩 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24hr 배양한다. 배양 후 배지를 모두 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 적당한 농도로 희석한 시료를 well 당 100㎕씩 처리하여 준 후 24hr 배양한다. 배양 후 PBS를 이용하여 5㎎/㎖의 농도로 녹인 MTT 시약을 20㎕씩 넣어주고 4hr 배양한다. MTT 시약과 시료가 포함된 배지를 모두 제거하고 각 well에 100㎕ isopropanol을 첨가하여 30min shaking(암조건)한 후, ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광값을 측정한다.

본 발명에서 도 6은 실시예 및 비교예에서 제조된 성장인자 함유 배지에서의 세포독성평가 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 도 6에서 Control은 비교예 1의 배양액을 사용한 경우, CM은 비교예 2의 배양액을 사용한 경우, Hypoxia은 비교예 3의 배양액을 사용한 경우, 및

은 실시예 1의 배양액을 사용한 경우를 나타낸다.

상기 도 6에 나타나듯이, 화학식 1의 화합물을 사용한

군이 세포 평가에서 98%의 높은 세포 독성 안전성을 가짐을 확인하였으며, 이로 인하여 실시예 1의 배양액은 세포독성에서 안전한 조성물임을 확인할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 지방 유래 중간엽 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물:
[화학식 1]
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
줄기세포 성장인자는 IGF(Insulin-like growth factor), EGF(epidermal growth factor), IL-1^α(Interleukin-1 alpha), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), TGF-β(Transforming growth factor beta), SCF(stem cell growth factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PGE₂(Prostaglandin E2), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), FGF(fibroblast growth factor), FGF-2(fibroblast growth factor-2), α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone), VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β2(Transforming growth factor beta2), PEDF(Pigment epithelium-derived factor) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
제 1 항에 있어서,
줄기세포 성장인자는 IL-6(Interleukin-6), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
제 1 항에 있어서,
화학식 1로 표시되는 화합물은 10 uM 이하의 농도로 포함되는 줄기세포 성장인자 대량 생산용 배지 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 배지에서 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법:
[화학식 1]
제 7 항에 있어서,
줄기세포를 배양하는 단계는 (a) 줄기세포를 혈청 함유 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 배양된 줄기세포를 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
제 8 항에 있어서,
(c) 단계 (b)에서 배양된 배양액에서 줄기세포 성장인자를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법
삭제
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제 7 항에 있어서,
줄기세포 성장인자는 IL-6(Interleukin-6), TGF-β1(Transforming growth factor beta1), VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
제 7 항에 있어서,
화학식 1로 표시되는 화합물은 10 uM 이하의 농도로 포함되는 줄기세포 성장인자 대량 생산 방법.
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