CN112679752A - 一种基于低共熔溶剂的糖基化蛋白制备方法 - Google Patents

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宋亮
赵珂瑶
付晶晶
徐献兵
孙丛
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姜鹏飞
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Abstract

本发明提供一种基于低共熔溶剂的糖基化蛋白制备方法，包括：S1、低共熔溶剂制备：将摩尔质量比为1:1‑1.5:1的氯化胆碱与葡萄糖混合搅拌，得到均匀透明的DES；S2、糖基化蛋白制备：将S1制得的所述DES用PBS按5:2‑2:1m/m的比例稀释并充分混合，再与BSA以20:1‑25:1m/m混合，于90‑100℃油浴1.5‑2.5小时，得到GBSA。本发明制备的蛋白糖基化程度高，其乳化活性和乳化稳定性良好，极大地提高了糖蛋白的功能特性，且工艺简单、可操作性强，适于工业化生产。低共熔溶剂具有可生物降解、无毒、溶解性好、反应产物容易分离等优势，适于食品药品的应用。

Description

一种基于低共熔溶剂的糖基化蛋白制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质的加工技术领域，更具体地说，涉及一种低共熔溶剂制备糖基化蛋白的方法。
背景技术
蛋白质作为功能添加剂与传统的化学合成添加剂相比具有无毒、无害、营养、天然等优势。研究显示，蛋白质产品难以兼具多种功能特性，如稳定性、乳化性、起泡性等，不能满足所有食品加工的要求，而生产上要求的却是具有专项功能或兼具集中功能平衡点的产品。因此要扩大蛋白质的应用范围，改性是蛋白质未来发展的主导方向。
近年来，研究人员通过研究蛋白质改性，以改善食品中蛋白质的物理化学和功能特性，主要采用物理、化学和酶处理等修饰方法。然而，由于潜在的健康危害和在感官方面的不良影响，大多数化学修饰不能应用于食品领域。与上述三种修饰方法相比，美拉德反应是利用蛋白质与糖在一定条件下发生的羰氨反应，该方法不需要任何化学试剂作为催化剂，仅加热就可进行反应，被认为是一种有效改善蛋白质功能特性的绿色方法。因此，利用美拉德反应来研究蛋白质的改性具有很大优势。
目前蛋白质与糖，发生美拉德反应的方法主要有两种，干热法反应和湿热法反应。干热法反应对湿度要求严格，操作过程较湿热法复杂，且干热法反应的反应时间长，并远远高于湿热法反应。湿热法反应，回收产品时需要将水或者缓冲溶液除去，在贮存方面较干热法差，美拉德反应程度也较干热法低。而传统美拉德反应，所得糖基化蛋白，其乳化能力和乳化稳定性较差，且糖基化程度不高，对蛋白质产业的应用有很大限制。
发明内容
本发明提供了一种利用低共熔溶剂制备糖基化蛋白的方法，以解决传统美拉德反应，所得糖蛋白乳化能力和乳化稳定性较差的问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于低共熔溶剂的糖基化蛋白制备方法，包括以下步骤：
S1、低共熔溶剂制备：将摩尔质量比为1:1-1.5:1的氯化胆碱与葡萄糖以150-250rpm的转速混合搅拌，于85-100℃油浴4-6小时，得到均匀透明的DES；
S2、糖基化蛋白制备：将S1制得的所述DES用0.01M且pH＝6.9-7.2的PBS按5:2-2:1m/m的比例稀释，并充分混合；再将稀释后的DES溶液与BSA，以20:1-25:1m/m混合，于90-100℃油浴1.5-2.5小时，得到GBSA。
优选方式下，GBSA的纯化：将步骤S2中制得的所述GBSA溶液用0.01M且pH＝6.9-7.2的PBS稀释至100-150mL，并将GBSA在室温条件下透析20-30小时；再将透析后的澄清GBSA冷冻干燥得到纯化的GBSA。
优选方式下，步骤S3中所述透析使用3-8kDa的透析袋。
一种基于低共熔溶剂的糖基化蛋白，其特征在于组分包括：氯化胆碱、葡萄糖、PBS、BSA，其中氯化胆碱、葡萄糖、PBS混合物与BSA的比例为20:1-25:1m/m。
优选方式下，所述氯化胆碱与所述葡萄糖的摩尔质量比为1:1-1.5:1。
优选方式下，氯化胆碱、葡萄糖混合物与PBS的比例为5:2-2:1m/m。
本发明的有益效果为：
本发明将常用于蛋白质改性的美拉德反应，以葡萄糖与氯化胆碱为原料制备低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvent，DES)，以该溶剂体系进行蛋白质美拉德反应。由于该DES组分之一为葡萄糖，即可作为反应物参与反应，又可以作为溶剂提高果糖与蛋白质接触程度；且该DES不含水分，可以通过控制加水稀释比例来有效控制水分含量，降低水分对美拉德反应的抑制。利用这种低共熔溶剂可以有效改善食品蛋白质美拉德修饰中传统湿热法反应程度低和反应耗时长的问题。
本发明在基于DES对牛血清白蛋白(BSA)糖基化改性的基础上,可进一步提高BSA乳化能力指数(emulsifying activity index,EAI)达到现有技术的1.74倍，提高乳化稳定性(emulsion stability index,ESI)达到现有技术的1.49倍；比传统的湿热法美拉德反应，可明显缩短反应时间7倍，且提高BSA糖基化程度达87.6％，从而更易获得较高功能改性的蛋白,大大提高了工业效率。
综上所述，本发明制备的蛋白糖基化程度高，其乳化活性和乳化稳定性良好，极大地提高了糖蛋白的功能特性，且工艺简单、可操作性强，适于工业化生产。低共熔溶剂具有可生物降解、无毒、溶解性好、反应产物容易分离等优势，适于食品药品的应用。
附图说明
图1是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的SDS-PAGE电泳图；
图2是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的MALDI-TOF-MS谱图；
图3是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的圆二色谱图；
图4是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的红外光谱图；
图5是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的内源性荧光光谱图；
图6是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的紫外-可见吸收光谱图；
图7是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的表面疏水性；
图8是BSA、DES法制备GBSA和湿热法制备GBSA的乳化能力指数(ESI)和乳化稳定性指数(EAI)。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。
其中，透明的低共熔溶剂缩写为：DES；牛血清白蛋白缩写为：BSA；糖基化牛血清白蛋白缩写为：GBSA。
S1、低共熔溶剂制备：将氯化胆碱与葡萄糖(Glucose,G)，混合在烧杯中以搅拌，油浴孵育，得到均匀透明的低共熔溶剂(deep eutectic solvent，DES)；
具体来说，将摩尔质量比为1:1-1.5:1的氯化胆碱与葡萄糖(Glucose,G)，混合在烧杯中以150-250rpm搅拌，并置于85-100℃油浴孵育4-6小时，得到均匀透明的低共熔溶剂(deep eutectic solvent，DES)；
S2、糖基化蛋白制备：将S1制得的DES用PBS(0.01M，pH＝6.9-7.2)以5:2-2:1(m/m)稀释，并采用涡流混合器充分混合；再将稀释后的DES溶液与牛血清白蛋白(BSA)以20:1-25:1m/m混合，90-100℃油浴孵育1.5-2.5小时，得到糖基化牛血清白蛋白(GBSA)；
具体来说，将S1制得的DES用PBS(0.01M，pH＝7)以5:2(m/m)稀释，充分混合；再将稀释后的DES溶液与牛血清白蛋白(BSA)以20:1(m/m)混合，油浴90-100℃孵育1.5-2.5小时，得到糖基化牛血清白蛋白(GBSA)溶液；
S3、传统湿热法制备糖基化蛋白(对照组)：将葡萄糖以PBS(0.01M，pH＝6.9-7.2)稀释，充分混合；再与BSA混合，置于油浴孵育，得到糖基化牛血清白蛋白(Water-GBSA)溶液；
具体来说，将2.82g葡萄糖用2mL的PBS(0.01M，pH＝7)稀释，充分混合；再与0.25g的BSA混合，置于90-110℃油浴孵育1.5-2.5小时，得到糖基化牛血清白蛋白(Water-GBSA)溶液；
S4、糖基化蛋白纯化：将S2、S3制得的两种GBSA溶液，以PBS(0.01M，pH＝7)稀释至100-150mL，并采用透析袋将GBSA在室温条件下透析20-30小时；再将透析后的澄清GBSA冷冻干燥得到纯化糖蛋白样品；
具体来说，将S2、S3制得的两种GBSA溶液，以PBS(0.01M，pH＝7)稀释至100mL，并采用3-8kDa透析袋将GBSA在室温条件下透析20-30小时；再将透析后的GBSA离心取上清液，冷冻干燥得到纯化糖蛋白样品。
实施例1
一种低共熔溶剂制备糖蛋白的方法，经过下列工艺步骤：
S1、低共熔溶剂制备：将摩尔质量比为1：1的氯化胆碱与葡萄糖(Glucose,G)，混合在烧杯中以200rpm搅拌，并置于90℃油浴孵育5小时，得到均匀透明的低共熔溶剂(deepeutectic solvent，DES)；
S2、糖基化蛋白制备：将S1制得的DES以PBS(0.01M，pH＝7)稀释成60％(w/w)DES溶液，并采用涡流混合器充分混合；再将稀释后的DES溶液(5g)与牛血清白蛋白(BSA，0.25g)置于100℃油浴孵育2小时，得到糖基化牛血清白蛋白(GBSA)；
S3、传统湿热法制备糖基化蛋白(对照组)：将2.82g葡萄糖以2mL的PBS(0.01M，pH＝7)稀释，充分混合；再与0.25g的BSA混合，置于100℃油浴孵育2小时，得到糖基化牛血清白蛋白(Water-GBSA)溶液；
S4、糖基化蛋白纯化：将S2、S3制得的两种GBSA溶液，以PBS(0.01M，pH＝7)稀释至100mL，并采用5kDa透析袋将GBSA在室温条件下透析24小时；
再将透析后的GBSA离心取上清液，冷冻干燥得到纯化糖蛋白样品。
对本发明实施例1制备的糖基化牛血清白蛋白(GBSA)的SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF-MS、圆二色谱、红外光谱、内源性荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、乳化活性指数(ESI)和乳化稳定性(EAI)进行检测；以未经糖基化的BSA和传统湿热法制备的GBSA为对照。
如图1-7所示，SDS-PAGE(图1)和MALDI-TOF-MS(图2)结果表明BSA与葡萄糖通过共价键合的，DES可以提高蛋白质与葡萄糖进行美拉德反应的程度。与传统湿热法制备的GBSA相比，基于DES制备的GBSA具有更多的无序二级结构(图3)，更多的-OH基团(图4)，更低的内源性荧光强度(图5)和更高的紫外-可见吸收率(图6)；且其表面疏水性由1356降低到1100(图7)，乳化活性指数由46.92m2/g提高到66.17m2/g(图8)，乳液稳定性由63.61％提高到79.62％(图8)。本发明制备的低共熔溶剂，其组分之一为葡萄糖，即可作为反应物参与反应，又可以作为溶剂提高葡萄糖糖与蛋白质接触程度；且该低共熔溶剂不含水分，可以通过控制加水稀释比例来有效控制水分含量，降低水分对美拉德反应的抑制；而基于该低共熔溶剂制备的糖基化蛋白，可明显改善食品蛋白质美拉德修饰中湿热法反应程度低且耗时长的问题；其糖基化蛋白的乳化特性有了较大的提高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于低共熔溶剂的糖基化蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、低共熔溶剂制备：将摩尔质量比为1:1-1.5:1的氯化胆碱与葡萄糖以150-250rpm的转速混合搅拌，于85-100℃油浴4-6小时，得到均匀透明的DES；
S2、糖基化蛋白制备：将S1制得的所述DES用0.01M且pH＝6.9-7.2的PBS按5:2-2:1m/m的比例稀释，并充分混合；再将稀释后的DES溶液与BSA，以20:1-25:1m/m混合，于90-100℃油浴1.5-2.5小时，得到GBSA。
2.根据权利要求1所述基于低共熔溶剂的糖基化蛋白制备方法，其特征在于，GBSA的纯化方法为：将步骤S2中制得的所述GBSA溶液用0.01M且pH＝6.9-7.2的PBS稀释至100-150mL，将GBSA在室温条件下透析至澄清，再冷冻干燥得到纯化的GBSA。
3.根据权利要求2所述基于低共熔溶剂的糖基化蛋白制备方法，其特征在于，步骤S3中所述透析使用3-8kDa的透析袋，透析时间20-30小时。
4.一种基于低共熔溶剂的糖基化蛋白，其特征在于组分包括：氯化胆碱、葡萄糖、PBS、BSA，其中氯化胆碱、葡萄糖、PBS混合物与BSA的比例为20:1-25:1m/m。
5.根据权利要求4所述的基于低共熔溶剂制备的糖基化蛋白，其特征在于，所述氯化胆碱与所述葡萄糖的摩尔质量比为1:1-1.5:1。
6.根据权利要求4所述的基于低共熔溶剂制备的糖基化蛋白，其特征在于，氯化胆碱、葡萄糖混合物与PBS的比例为5:2-2:1m/m。
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