WO2016080732A1 - 세포 배양 배지， 표피성장인자 및 소혈청알부민을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

세포 배양 배지， 표피성장인자 및 소혈청알부민을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 Download PDF

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    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]

Definitions

  • Cosmetic composition for improving skin condition including cell culture medium, epidermal growth factor and bovine serum albumin
  • the present invention relates to a cosmetic composition for improving skin condition comprising a cell culture medium, epidermal growth factor and bovine serum albumin as an active ingredient, a method for improving skin condition using the same, and a method for preventing or treating skin diseases.
  • Epidermal growth factor is a representative component that promotes collagen synthesis and shows wrinkle improvement.
  • EGF Epidermal growth factor
  • the skin cells constituting ⁇ cells are a kind of animal cells are typical of keratinocytes (kerat inocytes) and fibroblasts (fibroblasts).
  • General compositions of the medium for culturing the cells include DMEM (Dulbecco's Modi Eagle Eagle's Medium) and fetal bovine serum (FBS).
  • Serum is known to play a role in promoting growth, supplying nutrients, and protecting cells from oxidation and toxins.
  • serum is excluded from the cell culture, the cell culture itself is hardly made, and serum is recognized as an essential ingredient for cell growth and proliferation.
  • the serum albumin contained in the serum accounts for about 55-60% of the total serum protein, it is known that the albumin acts to attract water to maintain the moisture content in the blood, and help skin elasticity have.
  • Most widely Serum components used include FBS and FCS (fetal cal f serum).
  • FBS may be a cause of human mad cow disease. This may jeopardize the safety of the investigator and may be problematic for animal protection as serum is collected directly from fetuses. In addition, since FBS is expensive, there is a disadvantage in raising the badge price.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition having the same composition as the cosmetic composition, and a method for preventing or treating skin diseases using the same.
  • EGF Epidermal growth factor
  • BSA bovine serum albumin
  • the present invention provides a method for improving the skin condition using the cosmetic composition.
  • the present invention provides a use of the cosmetic composition for use in the manufacture of a cosmetic for improving the skin condition.
  • the present invention provides a use of the cosmetic composition for use in the manufacture of a cosmetic for improving the skin condition.
  • EGF Epidermal growth factor
  • BSA bovine serum albumin
  • the present invention provides a method for preventing or treating skin diseases using the pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a use of the pharmaceutical composition for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of skin diseases.
  • composition of the present invention is not only effective for improving skin conditions such as wrinkle improvement, skin regeneration, wound healing, and the like, and may be usefully used for preventing or treating skin diseases such as atopic dermatitis and allergy.
  • FIG. 1 shows the time-dependent treatment of human fibroblasts with the compositions of Example 1- Comparative Examples 1 and 2. This graph shows the cell proliferation rate.
  • Figure 2 is a graph showing the results of comparing the type 3 collagen synthesis performance after treatment of the compositions of Example 1, Comparative Examples 1 and 2 to human fibroblasts.
  • 3 and 4 are graphs showing the wound healing ability quantified by the cell image and the rate of cell migration before and after treatment of the compositions of Examples 1 and Comparative Examples 1 and 2 to human fibroblasts, respectively.
  • Example 5 and 6 are treated with the composition of Example 6, Comparative Examples 3 and 4 to human fibroblasts
  • the graph shows the wound healing ability quantified by the cell image before and after and the cell movement.
  • FIG. 7 and 8 are graphs showing the wound healing capacity quantified by cell image and cell migration rate before and after treatment of the compositions of Examples 7 and Comparative Examples 5 and 6 to human fibroblasts, respectively.
  • 11 and 12 are graphs showing wound healing capacity quantified by cell image and cell migration rate before and after treatment of the compositions of Examples 1, 4 and 5, and Comparative Examples 1 and 2 to human fibroblasts, respectively. .
  • the present invention provides a cell culture medium; b) Epidermal growth factor (EGF) 0.4-0.8 ng / ml; And c) a cosmetic composition for improving skin condition comprising 10 to 1,000 Ug / nil of bovine serum albumin (BSA) as an active ingredient.
  • EGF Epidermal growth factor
  • BSA bovine serum albumin
  • composition according to the present invention When the composition according to the present invention is applied to human skin, it promotes or activates an increase in fibroblasts, etc. present in the skin, and improves collagen synthesis, thereby improving wrinkles, inhibiting skin aging, improving skin elasticity, and recovering wounds such as skin scars. , It can improve the condition of skin by showing effects such as skin regeneration.
  • the cosmetic composition of the present invention protects the skin or improves the skin condition from deterioration or loss of skin cells; Or it can be used to prevent or treat skin diseases.
  • the skin diseases may include, for example, inflammatory skin diseases such as atopic dermatitis, allergy, skin eczema, acne, psoriasis and the like. Therefore, the present invention provides a method for improving the skin condition using the cosmetic composition. _
  • the present invention provides a "use of said cosmetic composition for when for the manufacture of a cosmetic composition for improving skin conditions.
  • the method may include applying to the skin of a subject in need of improvement of the skin condition.
  • Cosmetic compositions of the present invention include cell culture media.
  • the cell culture medium may be a medium capable of culturing mammalian cells such as fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, stem cells, muscle cells, germ cells and immune cells, which are cells in the skin.
  • cell culture media selected from the group consisting of DMEM / F-12, DMEM and ⁇ ⁇ can be used.
  • the cell culture medium may be FBS-free medium.
  • FBS FBS-free medium.
  • Cosmetic compositions of the present invention include EGF as a cytokine.
  • the EGF may be included in an amount of 0.4 to 0.8 ng / ml.
  • Preferably, in an amount of 0.4 to 0.6 ng / ml, 0.6 to 0.8 ng / ml, 0.4 to 0.5 ng / ml, 0.5 to 0.8 ng / ml, (X6 to 0.7 ng / ml or 0.5 to 0.7 ng / ml can be
  • the composition of the present invention can be cultured at a cell growth rate superior to conventional serum-containing medium by adding EGF to the cell culture medium.
  • the composition of the present invention does not have a problem of cell growth even if only a small amount of 0.4 to 0.8 ng / ml EGF.
  • collagen synthesis can be promoted, and skin regeneration effects such as wound healing can be exhibited.
  • This is a synergistic effect of the cosmetic composition of the present invention including EGF and BSA together.
  • the cosmetic composition of the present invention includes BSA as a nutritional component.
  • the BSA may be included in an amount of 10 to 1,000 yg / ml. Preferably from 10 to 100 ug / ml, 10 to 500 ug / ml, 100 to 500 ug / ml, 500 to 1,000 ug / ml, 50 to 200 ug / ml or 80 to 120 ug / ml.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include an ingredient selected from the group consisting of amino acids, vitamins, carbon sources, inorganic salts, and combinations thereof.
  • the amino acid may be an amino acid component used in a general animal cell culture medium, for example, glycine, L-alanine, L-arginine hydrochloride, L-asparagine-monohydrate, L-aspartic acid, L-cysteine hydro Chloride ⁇ monohydrate, L-cystine 2HC1, L-glutamic acid, L-glutamine, L-histidine hydrochloride-monohydrate, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine hydrochloride, L-methionine, L-phenylalanine, L -Proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine disodium salt dihydrate, L-valine, L histidine, L-tyrosine disodium salt and combinations thereof.
  • glycine L-alanine, L-arginine hydrochloride, L-asparagine-monohydrate, L-aspart
  • amino acids play a role in the growth of cells as a raw material of protein synthesis.
  • the amino acid may be included in an amount of 0.111 to 0.161 ring%, for example, 1.110 to 1.606 g / L, based on the total weight of the composition. Inclusion of amino acids in amounts within this range can aid in cell growth and maintenance and improve formulation stability.
  • the vitamin may be a vitamin component used in general animal cell culture medium, for example, biotin, calcium Eh pantothenate, folic acid, niacinamide, pyridoxine hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, vitamin B12, choline chloride, i Inosi can be selected from the group consisting of ascorbic acid and mixtures thereof.
  • vitamins play a role in maintaining cellular activity.
  • the vitamin may be included in an amount of 0.027 to 0.060 g / L, for example, 0.0027 to 0.0060 based on the total weight of the composition. By including vitamins in the content within the above range can help maintain cell activity.
  • the carbon source may be a carbon source component used in a general animal cell culture medium, for example D "glucose (textrose), sodium pyruvate hippoxanthin Na, thymidine, linoleic acid, lipoic acid, adenosine, cytidine, guano Shin, Uridon, 2'-deoxyadenosine, 2'-deoxycytidine HCI, 2'-deoxyguanosine and combinations thereof.
  • the carbon source serves as an energy source, and in particular, sodium bicarbonate may play a role of maintaining the pH of the medium.
  • the carbon source may be included in an amount of 0.120 to 0.463% by weight, for example, 1.201 to 4.625 g / L, based on the total weight of the composition.
  • the inorganic salt may be an inorganic salt component used in general animal cell culture medium, for example calcium chloride (CaCl 2 ) (anhydrous), copper sulfate pentahydrate (CuS0 4 -53 ⁇ 4), ferric sulfate heptahydrate (FeS0 4 -7H20), magnesium chloride (anhydrous), magnesium sulfate (MgS0 4 ) (anhydrous), potassium chloride (KC1), sodium chloride (NaCl), disodium hydrogen phosphate (Na2HP0 4 ) anhydrous, sodium hydrogen phosphate monohydrate (NaH2P0 4 -3 ⁇ 40) Zinc sulfate heptahydrate (ZnS0 4 -73 ⁇ 40), ferric nitrate nonahydrate (Fe (N (3 ⁇ 4) 3 . ⁇ ), It may be selected from the group consisting of sodium hydrogen carbonate (NaHC3 ⁇ 4) and combinations thereof.
  • CaCl 2 calcium chloride
  • inorganic salts play a role in regulating the function of cells.
  • the inorganic salt may be included in an amount of 0.984 to 1.092 heavy rings, for example, 9.838 to 10.923 g / L, based on the total weight of the composition. Including the inorganic salts in the content within the above range is helpful in regulating cell function and there is no difficulty in formulating into pharmaceuticals or cosmetics.
  • the cosmetic composition of the present invention can be applied directly to the skin for the purpose of improving the skin condition.
  • the cosmetic composition may be formulated into a cosmetic formulation commonly prepared in the art.
  • the cosmetic composition may be formulated, for example, as a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray.
  • the present invention is not limited thereto. More specifically, the soft cosmetics, the nourishing cosmetics, the nutrition cream, the massage cream, the essence, the eye cream, the cleansing cream, the cleansing product, the cleansing water, the pack, the spray or the powder formulation It can be formulated as
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide and It may include a carrier component selected from the group consisting of mixtures thereof.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a powder or a spray
  • it may include a carrier component selected from the group consisting of lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder and mixtures thereof, in particular spray
  • a carrier component selected from the group consisting of lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder and mixtures thereof, in particular spray
  • chlorofluorohydrocarbon it may further include propane / butane or dimethyl ether.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention may comprise a carrier component selected from the group consisting of solvents, solvating agents, emulsifying agents and mixtures thereof which are solutions or emulsions.
  • a carrier component selected from the group consisting of solvents, solvating agents, emulsifying agents and mixtures thereof which are solutions or emulsions. Examples thereof include water, ethanol, isopropane, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol, sorbitan fatty acid ester, and Or a combination thereof.
  • the microcrystalline cell may comprise a carrier component selected from the group consisting of loose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar, tragacanth and mixtures thereof.
  • the cosmetic composition of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
  • a carrier component selected from the group consisting of ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives, ethylated glycerol fatty acid esters, and mixtures thereof.
  • the "carrier component" in the cosmetic composition of the present invention is a compound or composition already known and used that can be included in cosmetic preparations, and is a component that is free of toxicity, instability, or irritation more than the body can contact when contacted with the skin.
  • the cosmetic composition of the present invention in addition to the carrier component, may further include an adjuvant selected from the group consisting of antioxidants, stabilizers, solubilizers, humectants, pigments, flavors, sunscreens, colorants, surfactants, and combinations thereof.
  • the auxiliary agent is not limited to use as long as the auxiliary agent commonly used in the preparation of the cosmetic composition.
  • the present invention provides a cell culture medium; b) Epidermal growth factor,
  • EGF 0.4 to 0.8 ng / ml
  • BSA Bovine serum albumin 10 to 1,000 yg / ml
  • the pharmaceutical composition of the present invention can prevent or treat skin diseases selected from inflammatory skin diseases composed of atopic dermatitis, allergy, skin eczema, acne, psoriasis and combinations thereof. Accordingly, the present invention provides a method for preventing or treating thorax disease using the pharmaceutical composition.
  • the present invention also provides a use of the pharmaceutical composition for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of skin diseases.
  • the method may comprise applying the pharmaceutical composition according to the invention to the skin of a subject in need.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier as necessary in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in the manufacture of medicines, lactose, dextrose, sucrose, sorbetle, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystals But may include, but are not limited to, sex cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like. It doesn't work.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and combinations thereof.
  • a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and combinations thereof.
  • the carrier may be included in about 1 ring to about 99.99 ring, preferably about 90 ring to about 99.99 ring based on the total weight of the pharmaceutical composition of the present invention, Pharmaceutically acceptable additives may be included in about 0.1 to about 20 rings.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and may be administered directly to the skin, preferably by topical administration.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of external skin preparations such as transdermal injections, ointments, solutions, creams, payments, sprays, patches.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined in view of various related factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response.
  • the dosage should not be understood as limiting the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention will be described in more detail based on the following examples. The following examples are only for illustrating the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.
  • Example 4 To the DMEM / F12 medium not containing FBS having the composition of Table 1, EGF 0.8 ng / ml and BSA 10 ug / ml was added to prepare a composition for improving skin condition.
  • Example 5 To the DMEM / F12 medium not containing FBS having the composition of Table 1, EGF 0.8 ng / ml and BSA 10 ug / ml was added to prepare a composition for improving skin condition.
  • Example 5 To the DMEM / F12 medium not containing FBS having the composition of Table 1, EGF 0.8 ng / ml and BSA 10 ug / ml was added to prepare a composition for improving skin condition.
  • DMEM / F12 medium does not contain FBS composition of Table 1, EGF 0.8 ng / ml and BSA 1,000 U g / ml was added to prepare a composition for improving skin condition.
  • Disodium hydrogen phosphate ( ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ) anhydrous 0.07102 sodium hydrogen phosphate monohydrate (Na3 ⁇ 4PQrH 2 0) 0.0625
  • composition was prepared by adding only EGF at 1 ng / ml or 20 ng / ml to the DMEM medium without FBS having the composition shown in Table 2. Comparative Examples 5 and 6
  • composition was prepared by adding EGF alone at 1 ng / ml or 20 ng / ml, respectively, to MEM ⁇ medium without FBS having the composition shown in Table 3.
  • Table 4 shows the results of the compositions of the compositions according to the Examples and Comparative Examples. Table 4
  • Experimental Example 1 Comparison of cell proliferation rate Human dermal fibroblast cells (Korea Cell Line Bank) in culture in a culture dish were treated with trypsin 0.05% (w / v) and separated from the culture dish.
  • the isolated human skin fibroblasts 3 ⁇ 10 3 were mixed with DMEM / F12 culture medium not containing FBS having a composition of Table 1 of 100 ⁇ l and then put into each well of a 96 well plate. After culturing in an incubator at 37 ° C. and 03 ⁇ 4 conditions for one day, the cells were completely adhered to the bottom of the 96 well plate, and then the existing culture solution was removed, and then the compositions of Example 1, Comparative Example 1 or Comparative Example 2 were treated.
  • the negative control group was DMEM / F12 medium without FBS without EGF and BSA.
  • the mixture was incubated for 24 hours, 48 hours, and 72 hours in an incubator at 37 ° C. and 5) C3 ⁇ 4 conditions, then using an aspirator to remove the additives and using sterile phosphate physiological saline (PBS). The remaining culture was completely removed from the 96 well plate.
  • PBS sterile phosphate physiological saline
  • FIG. 1 The results of comparing the absorbance values of each well based on the absorbance values of the cells grown in the culture medium without adding the cytokine as a negative control are shown in FIG. 1.
  • the composition-treated group of Example 1 did not show cytotoxicity, and thus the cell proliferation rate was excellent.
  • EGF was added at a high concentration of 20 ng / ml. It was confirmed that the cell proliferation rate was improved than the composition treatment group.
  • Example 2 As shown in Figure 2, the composition treatment group of Example 1 exhibited the best collagen synthesis ability, it can be seen that the EGF was similar to the composition treatment group of Comparative Example 2 with a high concentration of 20 ng / ml.
  • Experimental Example 3 Confirmation of migration ability of human skin fibroblasts In order to confirm the wound healing ability of the composition of the present invention, the migration ability of human skin fibroblasts was confirmed.
  • IBIDI Culture insert (Ibidi GmbH, M.), consisting of 6xl0 4 / ml human skin fibroblasts (Korea Cell Line Bank), and two reservoirs separated by 70 ⁇ septa. Germany) into the chamber. The cells in the chamber were then incubated for 12 hours at 5 »C3 ⁇ 4 and 37 ° C.
  • the cultured cells were treated with the compositions of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, respectively.
  • An image obtained by photographing the degree of cell migration before and after the treatment of the composition and 9 hours after the treatment with an inverted microscope (Olympus) is shown in FIG. 3.
  • the composition treatment group of Example 1 exhibited the best wound healing ability, which is similar to the composition treatment group of Comparative Example 2 in which EGF was added at a high concentration of 20 ng / ml. there was.
  • the results of confirming the wound healing ability in the same manner as described above using the compositions of Example 6, Comparative Examples 3 and 4 are shown in Figures 5 and 6.
  • the results of confirming the wound healing ability in the same manner as above using the compositions of Example 7, Comparative Examples 5 and 6 are shown in Figures 7 and 8.
  • the composition treatment group of Examples 6 and 7 prepared by simultaneously adding BGF and BSA to DMEM medium without FBS or MEM ⁇ medium without FBS It showed the best wound healing ability, and they were similar to the composition treatment group of Comparative Examples 4 and 6 where EGF was added alone at 20 ng / ml, respectively.
  • the experiment was performed in the same manner as described above using the compositions of Examples 1 to 3, and Comparative Examples 1 and 2 and the results are shown in Figure 9 And 10.
  • Figures 9 and 10 all of the composition treatment groups of Examples 1 to 3 containing EGF in 0.4 to 0.8 ng / ml 4
  • composition of the present invention comprising a combination of EGF and BSA
  • the composition of the present invention does not exhibit cytotoxicity, and even when a small amount of EGF is added to increase collagen synthesis, as well as to improve wrinkles, as well as to show an improved wound healing ability, the skin regeneration effect is excellent.
  • the cost of production can be lowered to about 1/20, leading to excellent price competitiveness, and significantly lowering the incidence of cancer due to EGF overdose.

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Abstract

본 발명은 세포 배양 배지， 표피성장인자 및 소혈청알부민을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물， 이를 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법， 및 피부 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로， 본 발명에 따르면 EGF를 소량만 사용하여도 우수한 주름 개선， 상처 치유 (wound healing) 효과를 나타낼 수 있어 피부 상태를 개선하거나， 피부 질환을 예방또는 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
세포 배양 배지， 표피성장인자 및 소혈청알부민을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료조성물
【기술분야】
본 발명은 세포 배양 배지， 표피성장인자 및 소혈청알부민을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물, 이를 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법， 및 피부질환을예방또는치료하는방법에 관한것이다.
[배경기술】
표피성장인자 (epidermal growth factor , EGF)는 콜라겐 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 대표적인 성분이다. 그러나 EGF의 과도한 사용은 암세포의 성장과 이동을 촉진하는 문제가 있어, 안전상의 이유로 그 사용량에 제한이 있다. 따라서， EGF를 적은 양을 사용하고도 그 효과를 극대화할 수 있는 조성물의 개발이 요구된다. 한편， 피부 세포를 구성히^ 세포는 동물 세포의 일종으로 각질세포 (kerat inocyte)와 섬유아세포 (fibroblast )가 대표적이다. 상기 세포를 배양하기 위한배지의 일반적인조성은 DMEM(Dulbecco' s Modi f ied Eagle' s Medium)및 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)을포함한다.
혈청은 성장 증진 작용, 영양분의 공급， 산화나 독소로부터 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 세포 배양에 있어 혈청이 배제되는 경우에는 세포 배양자체가거의 이루어 지지 않아혈청은세포의 성장및 증식에 필수적인성분으로 인식되고 있다. 또한， 혈청에 포함되어 있는 혈청 알부민은전체 혈청 단백질의 약 55-60%를 차지하며， 상기 알부민이 수분을 끌어들이는 작용을 하여 혈액 속의 수분함량을유지하고, 피부탄력에 도움을주는 것으로 알려져 있다. 현재 가장 널리 사용되는혈청 성분으로는 FBS, FCS( fetal cal f serum) 등이 있다.
그러나， 최근 FBS가 인간광우병 발병의 원인이 될 수 있다고보고된 바 있다. 이로 인해 시험자의 안전성이 위협받을 수 있고， 소태아로부터 직접 혈청을 채취하므로 동물보호 차원에서도문제가될 수 있다. 또한， FBS는고가이기 때문에 배지 가격을상승시키는단점이 있다.
이에， 생체에 안전하고 FBS를 함유하지 않고도 주름 개선， 피부 재생 및 상처 치유등의 피부상태를 개선시키는 데 우수한효과를나타내는조성물에 대한개발이 지속적으로요구되고있다.
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
따라서, 본발명의 목적은생체에 안전하면서도주름 개선， 피부 재생 및 상처 치유와같은피부상태를개선하는데우수한효과를나타내는화장료조성물， 및 상기 화장료조성물을이용하여 피부상태를개선시키는방법을제공하는것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화장료 조성물과 동일한 조성을 갖는 약학 조성물, 및 이를이용하여 피부질환을예방또는치료하는방법을제공하는것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을달성하기 위하여 본발명은，
a) 세포배양배지 ;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/tnl ; 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1 ,000 yg/ml를 유효성분으로포함하는피부상태 개선용화장료조성물을제공한다.
상기 목적을달성하기 위하여, 본발명은상기 화장료조성물을 이용하여 피부 상태를개선시키는방법을제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 피부상태 개선을 위한 화장료의 제조에 사용하기 위한상기 화장료조성물의 용도를제공한다. 상기 또다른목적을달성하기 위하여， 본발명은，
a) 세포배양배지 ;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml ; 및 c)소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10내지 1,000 yg/ml를포함하는 피부질환예방또는치료용약학조성물을제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 약학 조성물을 이용하여 피부질환을예방또는치료하는방법을제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 피부질환의 예방 또는 치료를위한약제의 제조에 사용하기 위한상기 약학조성물의 용도를제공한다.
【유리한효과】
본 발명의 조성물은 주름 개선， 피부 재생， 상처 치유 등의 피부 상태를 개선하는 데 효과적일 뿐만아니라， 아토피성 피부염, 알러지 등의 피부 질환을 예방 또는치료하는데유용하게사용될수 있다.
【도면의 간단한설명]
본 발명의 상기 및 다른목적과특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다: 도 1은 실시예 1ᅳ 비교예 1 및 2의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리한 후 시간에 따른세포증식률을보여주는그래프이다.
도 2는실시예 1，비교예 1및 2의 조성물을인간섬유아세포에 처리한후제 3형 콜라겐합성능을비교한결과를나타낸그래프이다.
도 3 및 4는실시예 1， 비교예 1 및 2의 조성물을인간섬유아세포에 처리하기 전 /후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한상처 치유능을보여주는그래프를 각각나타낸것이다.
도 5및 6은실시예 6， 비교예 3 및 4의 조성물을 인간섬유아세포에 처리하기 전 /후의 세포 이미지 및 세포의 이동를로 정량화한상처 치유능을보여주는그래프를 각각나타낸것이다.
도 7 및 8은실시예 7， 비교예 5 및 6의 조성물을 인간섬유아세포에 처리하기 전 /후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한상처 치유능을보여주는그래프를 각각나타낸 것이다.
도 9및 10은실시예 1내지 3,및 비교예 1및 2의 조성물을인간섬유아세포에 처리하기 전 /후의 세포 이미지 및 세포의 이동를로정량화한상처 치유능을보여주는 그래프를각각나타낸것이다.
도 11 및 12는 실시예 1， 4 및 5, 및 비교예 1 및 2 의 조성물을 인간 섬유아세포에 처리하기 전 /후의 세포 이미지 및 세포의 이동률로 정량화한 상처 치유능을보여주는그래프를각각나타낸 것이다.
【발명의 실시를위한최선의 형태】
이하본발명에 대하여 보다상세히 설명한다. 본발명은 a) 세포배양배지; b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml ; 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10내지 1,000 Ug/nil를유효성분으로포함하는피부상태 개선용화장료조성물을제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 인체 피부에 적용하는 경우 피부에 존재하는 섬유아세포 등의 증가를 촉진하거나 활성화시키고， 콜라겐 합성을 증진시킴으로써 주름의 개선， 피부노화억제， 피부탄력 개선， 피부흉터 등의 상처 회복， 피부 재생 등의 효과를나타내어 피부의 상태를개선시킬수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선시키거나; 또는 피부 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용 ¾수있다 .
상기 피부 세포의 기능 저하또는 손실로부터 피부를 보호하거나 피부 상태를 개선시키는것은주름의 발생 억제,피부노화억제， 피부탄력 개선，피부재생，상처 또는창상치유 (wound heal ing) 및각막재생등을포함할수 있다.
상기 피부 질환은예를들어,아토피성 피부염，알러지，피부습진，여드름，건선 등과같은염증성 피부질환을포함할수 있다. 따라서， 본 발명은 상기 화장료 조성물을 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법을제공한다. _
또한， 본 발명은 피부상태 개선을 위한 화장료의 제조에 시"용하기 위한 상기 화장료조성물의 용도를제공한다.
상기 방법은 피부 상태의 개선을 필요로 하는 대상의 피부에 도포하는 단계를 포함할수있다. 본발명의 화장료조성물은세포배양배지를포함한다.
상기 세포 배양 배지는 피부 내 세포인 섬유아세포， 각질형성세포， 멜라닌형성세포， 줄기세포， 근육세포， 생식세포 및 면역세포 등의 포유동물 세포를 배양할수있는배지일수 있다.
본발명에서는 DMEM/F-12, DMEM및 ΜΕΜ α로이루어진군에서 선택되는세포배양 배지를사용할수있다.
상기 세포 배양배지는 FBS-무함유 배지일 수 있다. 본 발명에서는고가이면서 안전성 문제를유발할수 있는 FBS를영양성분으로포함하지 않아도우수한세포성장 및 증식을촉진시킬수있다. 본발명의 화장료조성물은사이토카인으로서 EGF를포함한다.
상기 EGF는 0.4 내지 0.8 ng/ml의 양으로 포함될 수 있다. 바람직하게는， 0.4 내지 0.6 ng/ml , 0.6내지 0.8 ng/ml , 0.4내지 0.5 ng/ml , 0.5내지 0.8 ng/ml , (X6내지 0.7 ng/ml 또는 0.5내지 0.7 ng/ml의 양으로포함될수있다.
본 발명의 조성물은 EGF를세포 배양배지에 첨가함으로써 세포를종래의 혈청 함유배지보다우수한세포성장율로배양할수 있다. 특히， 본발명의 조성물은 EGF를 0.4내지 0.8 ng/ml의 소량만포함하여도세포 성장의 문제가 없다. 또한， 콜라겐 합성을 촉진시킬 수 있고, 상처 치유 등의 피부 재생 효과를 나타낼 수 있다. 이는 본 발명의 화장료 조성물이 EGF와 BSA를 함께 포함하는것에 따른상승효과이다. 본발명의 화장료조성물은영양성분으로서 BSA를포함한다.
상기 BSA는 10내지 1,000 yg/ml의 양으로포함될 수 있다. 바람직하게는 10 내지 100 ug/ml , 10내지 500 ug/ml , 100내지 500 ug/ml , 500내지 1,000 ug/ml , 50 내지 200 ug/ml 또는 80내지 120 ug/ml의 양으로포함될수 있다. 본발명의 화장료조성물은아미노산， 비타민，탄소원，무기염 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는성분을더 포함할수있다. 상기 아미노산은 일반적인 동물 세포 배양 배지에 사용되는 아미노산 성분을 사용할 수 있으며， 예를 들어， 글리신， L-알라닌， L-아르기닌 하이드로클로라이드， L-아스파라긴-모노하이드레이트， L-아스파르트산， L-시스테인 하이드로클로라이드ᅳ모노하이드레이트， L-시스틴 2HC1 , L-글루탐산， L-글루타민， L-히스티딘 하이드로클로라이드-모노하이드레이트， L-이소류신， L-류신， L-리신 하이드로클로라이드, L-메티오닌， L-페닐알라닌， L-프롤린， L-세린， L-트레오닌, L-트립토판， L-티로신 디소듐염 디하이드레이트， L-발린， L히스티딘， L-티로신 디소듐염 및 이의 흔합물로이루어진군에서 선택될수있다.
본 발명에서 아미노산은단백질 합성의 원료로 세포의 성장에 이용되는 역할을 한다.
상기 아미노산은조성물총중량을기준으로 0.111내지 0.161중링 %， 예를들어 1.110내지 1.606g/L의 양으로포함될수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 아미노산을 포함함으로써 세포의 성장및유지에 도움을주고제형 안정성을향상시킬수 있다. 상기 비타민은일반적인동물세포배양배지에 사용되는비타민성분을사용할 수 있으며， 예를 들어， 바이오틴， Eh판토텐산칼슘， 엽산， 나이아신아미드， 피리독신 하이드로클로라이드， 리보플라빈， 티아민 하이드로클로라이드， 비타민 B12, 염화콜린， i-이노시를， 아스코르브산및 이의 흔합물로이루어진군에서 선택될수 있다.
본발명에서 비타민은세포활성 유지 역할을한다.
상기 비타민은조성물총중량을기준으로 0.0027내지 0.0060중 ， 예를들어 0.027 내지 0.060g/L의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 비타민을 포함함으로써 세포활성 유지에 도움을줄수 있다. 상기 탄소원은일반적인 동물세포 배양배지에 시용되는탄소원 성분을사용할 수 있으며， 예를 들어 D "글루코즈 (텍스트로즈)， 소듐 피루베이트 히포크산틴 Na, 티미딘， 리놀레산， 리포산， 아데노신, 시티딘, 구아노신， 우리던, 2 '-데옥시아데노신， 2 ' -데옥시시티딘 HCI , 2 ' -데옥시구아노신 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 탄소원은 에너지원으로서 역할을하며 특히 소듐바이카보네이트의 경우배지의 PH를유지하는역할을할수 있다.
상기 탄소원은조성물 총 중량을 기준으로 0.120 내지 0.463증량 %， 예를 들어 1.201 내지 4.625g/L의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 탄소원을 포함함으로써 에너지원이 부족하지 않아 세포 성장에 도움을 주고 제형 안정성올 향상시킬수 있다. 상기 무기염은일반적인동물세포배양배지에 사용되는무기염 성분을사용할 수 있으며， 예를들어 염화칼슘 (CaCl2) (무수)， 황산동펜타하이드레이트 (CuS04-5¾)) , 황산제이철 헵타하이드레이트 (FeS04-7H20) , 염화마그네슘 (무수)， 황산마그네슘 (MgS04) (무수)， 염화칼륨 (KC1 ) , 염화나트륨 (NaCl ) , 인산수소이나트륨 (Na2HP04) 무수， 인산수소나트륨 모노하이드레이트 (NaH2P04-¾0) , 황산아연 헵타하이드레이트 (ZnS04-7¾0) , 질산제이철 노나하이드레이트 (Fe(N(¾)3 . ΘΗζΟ) , 탄산수소나트륨 (NaHC¾) 및 이의 흔합물로이루어진군에서 선택될수 있다.
본발명에서 무기염은세포의 기능을조절하는역할을한다.
상기 무기염은 조성물 총 중량을 기준으로 0.984 내지 1.092중링 ， 예를 들어 9.838 내지 10.923g/L의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위 내의 함량으로 무기염을 포함함으로써 세포 기능조절에 도움이 되고의약품이나화장품으로 제형화시키는 데 어려움이 없다. 본 발명의 화장료 조성물은 피부 상태 개선을 목적으로 하는 피부에 직접 적용될수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적 제조되는 화장료 제형으로 제제화될수있다. 상기 화장료조성물은 예를들어， 용액， 현탁액， 유탁액， 페이스트， 겔，크림，로션，파우더，비누，계면활성제 -함유클렌징，오일，분말파운데이션，유탁액 파운데이션，왁스파운데이션 및 스프레이 등으로제형화될수있으나，본발명이 이에 한정되는것은아니다.보다상세하게는，유연화장수,영양화장수，영양크림，마사지 크림, 에센스， 아이 크림， 클렌징 크림, 클렌징품， 클렌징 워터， 팩， 스프레이 또는 파우더의 제형으로제제화될수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유， 식물성유， 왁스， 파라핀， 전분， 트라가칸트, 셀를로오스유도체， 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트， 실리카， 탈크， 산화아연 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는담체성분을포함할수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스， 탈크， 실리카， 알루미늄하이드록시드, 칼슘실리케이트， 폴리아미드파우더 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는담체 성분을포함할수 있으며， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본， 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르 등을더 포함할수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 용매， 용매화제， 유탁화제 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을포함할수 있다. 이의 예로는， 물， 에탄올， 이소프로판을， 에틸 카보네이트， 에틸 아세테이트, 벤질 알코올， 벤질 벤조에이트， 프로필렌 글리콜， 1，3-부틸글리콜 오일， 글리세를 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄지방산에스테르， 및 이의 흔합물등을들수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물， 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제， 에톡실화 이소스테아릴 알코올， 폴리옥시에틸렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미세결정성 셀를로오스, 알루미늄 메타히드록시드， 벤토나이트， 아가， 트라가칸트및 이의 흔합물로이루어진군에서 선택되는담체 성분을포함할수있다. 본발명의 화장료조성물의 제형이 계면-활성제 함유클렌징인 경우에는지방족 알코을 설페이트， 지방족 알코올 에테르 설페이트， 설포숙신산 모노에스테르， 이세티오네이트，이미다졸리늄유도체，메틸타우레이트，사르코시네이트，지방산아미드 에테르 설페이트， 알킬아미도베타인， 지방족 알코을， 지방산 글리세리드， 지방산 디에탄올아미드， 식물성유， 라놀린 유도체， 에특실화 글리세롤 지방산 에스테르 및 이의 흔합물로이루어진군에서 선택되는담체 성분을포함할수있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 "담체 성분"이란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물또는조성물로서， 피부에 접촉 시 인체가 적웅 가능한이상의 독성， 불안정성 또는자극성이 없는성분이다.
본발명의 화장료조성물은담체 성분이외에도，항산화제，안정화제，용해화제， 보습제， 안료， 향료， 자외선차단제， 발색제， 계면활성제 및 이의 조합으로이루어진 군에서 선택되는 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로사용되는보조제라면사용에 제한이 없다.
또한， 본발명은 a)세포배양배지; b)표피성장인자 (Epidermal growth factor ,
EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml ;및 c)소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10내지 1,000 yg/ml를포함하는피부질환예방또는치료용약학조성물을제공한다. 본 발명의 약학조성물의 유효성분은 앞서 전술한 바와 같은화장료 조성물의 유효성분과동일하다.
본발명의 약학조성물은,아토피성 피부염，알러지，피부습진，여드름， 건선 및 이의 조합으로이루어진 염증성 피부질환에서 선택되는피부질환을예방또는치료할 수 있다. 따라서， 본 발명은 상기 약학 조성물을 이용하여 괴부질환을 예방 또는 치료하는방법을제공한다.
또한， 본 발명은 피부질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한상기 약학조성물의 용도를제공한다.
상기 방법은 본 발명에 따른 약학 조성물을 필요로 하는 대상의 피부에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대상은 포유 동물일 수 있고， 구체적으로 인간일수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에도 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한담체를추가로포함할수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스， 수크로스, 솔비틀， 만니를， 전분， 아카시아고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스， 폴리비닐피를리돈， 샐를로스， 물， 시럽, 메틸 셀를로스， 메틸하이드록시벤조에이트， 프로필하이드록시벤조에이트，활석，스테아르산마그네슴，미네랄오일등을포함할수 있으나， 이에 한정되는것은아니다.
또한，본발명의 약학조성물은윤활제,습윤제,감미제，향미제，유화제，현탁제， 보존제， 및 이의 조합으로이루어진군에서 선택되는약학적으로허용가능한첨가제를 추가로포함할수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1중링 내지 약 99.99중링 ， 바람직하게는 약 90중링 내지 약 99.99중링 로포함될 수 있으며, 상기 약학적으로허용가능한첨가제는 약 0.1중 내지 약 20중링 로포함될수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고， 바람직하게는 국소투여 방식으로피부에 직접 투여될수 있다.
본발명의 약학조성물의 제형은경피 투여 주사제，연고제,액제，크림제，결제， 스프레이제， 패취제 등과같은피부외용제 형태일수 있다.
본발명의 약학조성물의 적합한투여량은제제화방법，투여 방식，환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설속도및 반웅감웅성과같은 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를제한하는것으로이해되어서는아니 된다. 이하， 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는것은아니다. 실시예 1
하기 표 1의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM/F12배지에， EGF 0.8 ng/ml 및 BSA lOO yg/ml을첨가하여 피부상태 개선용조성물을제조하였다. 실시예 2
하기 표 1의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM/F12배지에 , EGF 0.4 ng/ml 및 BSA 100 yg/ml을첨가하여 피부상태 개선용조성물을제조하였다. 실시예 3
하기 표 1의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM/F12배지에， EGF 0.6 ng/ml 및 BSA 100 pg/ml을첨가하여 피부상태 개선용조성물을제조하였다. 실시예 4 하기 표 1의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM/F12배지에， EGF 0.8 ng/ml 및 BSA 10 ug/ml을첨가하여 피부상태 개선용조성물을제조하였다. 실시예 5
하기 표 1의 조성올갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM/F12배지에， EGF 0.8 ng/ml 및 BSA l,000 Ug/ml올첨가하여 피부상태 개선용조성물을제조하였다.
【표 1】
FBS가포함되지 않은 DMEM/F12의 조성
성분 농도 (g/L) ' 글리신 0.01875
L-알라닌 0.00445
L-아 기닌하이ᄃ ^클^라이 0.1475
L-아스파라긴—모노하이드레이트 0.0075
L-아스파르트산 0.00665
L-시 테인하이 c e클 라이ᄃ - V하이ᄃ레이 0.01756
L-시스틴 2HC1 0.03129
L-글루탐산 0.00735
L-글루타민 0.365
L—히人티딘하이드 ^클로라이ᄃ— J?노하이ᄃ레이 0.03148
L-이소류신 0.05447
L-류신 0.05905
L-리신하이드로클로라이 c 0.09125
L-메티오닌 0.01724 ᅳ
L-페닐알라닌 0.03548
L-프를린 0.01725
L-세린 0.02625
L-트레오닌 0.05345
L一트립토판 0.00902
L-티로신디소듐염 디하이드레이트 0.05579
L-발린 0.05285
바이오틴 0.000003
D~판토텐산칼슘 0.00224
엽산 0.00265
나이아신아미드 0.00202 피리독신하이드로클로라이드 0.00213 리보플라빈 0.00219 티아민하이드로클로라이드 0.00217 비타민 B12 0.00068 i一이노시틀 0.0126
염화칼슘 (CaCl2) (무수) 0.1166
황산동펜타하이드레이트 (CuSar¾0) 0.000001 황산제이철 ¾타하이드레이트 (FeS04-7¾0) 0.000417 염화마그네슴 (무수) 0.02864 황산마그네슘 (MgS¾) (무수) 0.04884 염화칼륨 (KC1 ) . 0.3118
탄산수소나트륨 (NaHC¾) 2.438
염화나트륨 (NaCl ) 6.9955
인산수소이나트륨 (Ν¾ΗΡ ) 무수 0.07102 인산수소나트륨모노하이드레이트 (Na¾PQrH20) 0.0625
황산아연 헵타하이드레이트 (Ζη -7Η2θ) 0.000432
EH글루코 (덱人 로 3.151
히포크산틴 Na 0.00239 리놀레산 0.000042 리포산 0.000105 소듬피루베이트 0.055
티미딘 0.000365 실시예 6
하기 표 2의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM배지에， 0.8ng/ml 및SA 100 yg/ml을첨가하여 피부상태 개선용조성물을제조하였다.
【표 2]
FBS가포함되지 않은 DMEM의 조성
성분 농도 (g/L) 글리신 0.03
L-아르기닌하이드로클로라이드 0.084
L-시스틴 2HC1 0.063
L-글루타민 0.584
L-히 티딘하이드로클로라이 c - ψ V하이 c레이 E 0.042 L-이소류신 0.105
L—류신 0.105
L-리신하이드로클로라이드 0.146
Lᅳ메티오닌 0.03
L-페닐알라닌 0.066
L-세린 0.042
L-트레오닌 0.095
L-트립토판 0.016
L-티로신디소듐염 디하이드레이트 0.104
L-발린 0.094
염회 린 0.004
D_판토텐산칼슘 0.004
엽산 0.004
나이아신아미드 0.004
피리독신 하이드로클로라이드 0.004
리보플라빈 0.0004
티아민하이드로클로라이드 0.004
i-이노시톨 0.0072
염화칼슴 (CaCl2) (무수) 0.2
질산제이철노나하이드레이트 (Fe(N¾)3 ■ 9 0) 0.0001
황산마그네슘 (MgS04) (무수) 0.09767 염화칼륨 (KC1 ) 0.4
탄산수소나트륨 (NaHC¾) 3.7
염화나트륨 (NaCl ) 6.4
인산수소나 E륨모노하이 c레이 e (NaH2P04-¾0) 0.125
D "글루≤ (덱 트 4.5
소듐피루베이트 0.11 실시예 7
하기 표 3의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 MEM α 배지에 , BGF 0.8ng/ml 및SA 100 yg/ml을첨가하여 피부상태 개선용조성물을제조하였다. 【표 3]
FBS가포함되지 않은 MEM α의 조성
성분 농도 (g/L) 글리신 0.05
L—알라닌 0.025
L-아르기닌하이드로클로라이드 0.105
L—아 파라긴 _모 하이드레이 Ξ 0.05
L-아스파르트산 0.03
L-시 테인하이 c.로클로라이ᄃ. -모노하이 .레이 e 0. 1
L一시스틴 2HC1 0.031
L-글루탐산 ' 0.075
L-글루타민 0.292
L-히스티딘 0.031
L—이소류신 0.0524
L-류신 0.052
L-리신 0.073
L-메티오닌 0.015
L-페닐알라닌 0.032
L-프를린 0.04
L-세린 0.025
L一트레오닌 0.048
L-트립토판 0.01
L-티로신 디소듐염 0.052
L-발린 0.046 아 =? e Η Λ]- 0.05 바이오틴 0.0001 염회" #린 0.001
D"판토텐산칼슴 0.001 엽산 0.001 나이아신아미드 0.001 피리독살하이드로클로라이드 0.001 리보플라빈 0.0001 티아민 하이드로클로라이드 . 0.001 비타민 B12 0.00136 i-이노시틀 0.002 염화칼슴 (CaCl2) (무수) 0.2 황산마그네슴 (MgS04) (무수) 0.09767 염화칼륨 (KC1) 0.4 탄산수소나트륨 (NaH(¾) 2.2
염화나트륨 (NaCl) 6.8
인산수소나트륨모노하이드레이트 (Na¾P04-H20) 0.14
아데노신 0.01
시티딘 0.01
구아^^ 0.01
우리딘 0.01
2'-테옥시아테노신 0.01
2'-데옥시시티딘 HC1 0.011
2'-데옥시구아노신 0.01
티미딘 0.01
D "글루코즈 (덱 로즈) 1
리포산 0.0002
소듐피루베이트 0.11 비교예 1및 2
표 1의 조성을 갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM/F12 배지에， EGF만을 1 ng/ml 또는 20 ng/ml로각각첨가하여 조성물을제조하였다. 비교예 3및 4
표 2의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 DMEM배지에， EGF만을 1 ng/ml또는 20 ng/ml로각각첨가하여 조성물을제조하였다. 비교예 5및 6
표 3의 조성을갖는 FBS가포함되지 않은 MEM α 배지에， EGF만을 1 ng/ml또는 20 ng/ml로각각첨가하여 조성물을제조하였다. 상기 실시예 및 비교예에 따른 조성물의 조성을 정리한 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 【표 4】
Figure imgf000018_0001
실험예 1: 세포증식률비교 배양접시에서 배양중인 인간피부섬유아세포 (human dermal fibroblast cel l , 한국세포주은행)를트립신 0.05%(w/v)로 처리하여 배양 접시로부터 분리시켰다. 상기 분리된 인간 피부 섬유아세포 3X 103개를 100 μ ΐ의 상기 표 1의 조성을 갖는 FBS가 포함되지 않은 DMEM/F12 배양액과 함께 섞어준 후 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣어 주었다. 하루동안 37°C 및 0¾조건의 인큐베이터에서 배양한후 96 웰플레이트 바닥에세포가완전히 붙으면기존의 배양액을제거한후， 여기에 실시예 1, 비교예 1 또는 비교예 2의 조성물을 각각 처리하였다. 이때 음성 대조군으로는 EGF 및 BSA가 첨가되지 않은 FBS가포함되지 않은 DMEM/F12배지로하였다.
이어， 상기 흔합물을 24시간， 48시간 및 72시간 동안 37°C 및 5 ) C¾ 조건의 인큐베이터에서 배양시킨 후, 석션기를 이용하여 첨가물을 제거하고 멸균된 인산완층생리식염수 (PBS)를 이용하여 잔여 배양액을 96 웰 플레이트에서 완전히 제거하였다.
세포 증식를 (cel l prol iferation)을 확인하기 위하여， CCK— 8 반응액 (Doj indo) 10 yL를 각 웰에 처리하고， 37°C에서 2시간 동안 반웅시켰다. 이후, 모델 680 마이크로플레이트 리더 (Bio-rad, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
음성 대조군인 싸이토카인이 첨가되지 않은 배양액에서 자란 세포의 흡광도 값을기준으로하여 각웰의 흡광도값을비교한결과를도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이， 실시예 1의 조성물-처리군에서는 세포 독성을 나타내지 않아세포증식률이 우수함을알수있었다.특히，배양 72시간후에는 EGF를 20 ng/ml의 고농도로 첨가한비교예 2의 조성물 처리군보다세포증식률이 더 향상된 것을확인할수 있었다. 실험예 2: 콜라겐합성 효과평가 사람의 피부조직에서 분리된 인간 피부 섬유아세포 (한국세포주은행)를 10% FBS와 페니실린-스트랩토마이신 (penici l l in-streptomycin) 1%가 함유된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 5% C¾조건에서 배양한후， 6 웰플레이트에 상기 배양세포 3X 105 개를 분주 (seeding)하였다. 다음날 PBS를 이용하여 상기 배양 세포를 한번 세척한 다음, FBS가포함되지 않은 DMEM/F12배지로갈아주고，여기에 실시예 1，비교예 1또는 비교예 2의 조성물을처리하여 24시간동안배양하였다.
반응이 끝난 세포 배양액을 모아 제 3형 콜라겐 (col lagen)에 대한 ELISA 분석 (CUSABIO Biotech Co. , Wuhan, China)을 실시하여 각각의 콜라겐 합성 농도를 측정하였다. ELISA 분석은 키트에 포함된 회사가 제공하는 가이드라인에 따라 실시하였다. 그결과를도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이， 실시예 1의 조성물 처리군은 가장 우수한 콜라겐 합성능을나타내었는데， 이러한 EGF를 20 ng/ml의 고농도로 첨가한비교예 2의 조성물 처리군과유사한수준임을알수 있었다. 실험예 3: 인간피부섬유아세포의 이동능 (migration) 확인 본 발명의 조성물의 상처 치유능을 확인하기 위하여， 인간 피부 섬유아세포에서의 이동능확인하였다.
먼저，인간피부섬유아세포 (한국세포주은행) 6xl04개 /ml를， 70 μηι격막에 의해 분리된 2개의 저장소 (reservoir)로 구성된 IBIDI Culture insert (Ibidi GmbH, M, Germany) 챔버 내에 분주하였다. 이어 챔버 내 세포를 5 » C¾및 37°C조건에서 12시간 동안배양시켰다.
상기 배양 세포에， 실시예 1， 비교예 1 및 비교예 2의 조성물을 각각 처리하였다. 상기 조성물처리 전 및 처리 후 9시간이 경과한때의 세포 이동 정도를 도립현미경 (Olympus)으로촬영하여 얻은이미지를도 3에 나타내었다.
또한, 상기 이미지들을 T-Scratch 소프트웨어 (Computat ional Science & Engineering Laboratory, ETH Zurich, Switzerlane)를 이용하여， 음성 대조군 결과를 100%로 하여 각 처리군의 세포 이동율을 세포로 덮인 부분의 비율 (%)로 산출하였다. 그결과를도 4에 나타내었다.
도 3및 4에서 보는바와같이， 실시예 1의 조성물처리군은가장우수한상처 치유능을 나타내었는데， 이는 EGF를 20 ng/ml의 고농도로 첨가한 비교예 2의 조성물 처리군과유사한수준임을알수 있었다. 또한, 실시예 6， 비교예 3 및 4의 조성물을 이용하여 상기와동일한방식으로 상처 치유능을확인한결과를도 5및 6에 나타내었다. 또한， 실시예 7， 비교예 5및 6의 조성물을이용하여 상기와동일한방식으로상처 치유능을확인한결과를도 7및 8에 나타내었다.
도 5 및 6， 및 도 7및 8에서 보는바와같이， FBS가포함되지 않은 DMEM배지 또는 FBS가포함되지 않은 MEM α 배지에 BGF및 BSA를동시에 첨가하여 제조한실시예 6 및 7의 조성물 처리군이 가장 우수한 상처 치유능을 나타내었으며， 이들은 각각 EGF를 20 ng/ml로단독으로 첨가한비교예 4및 6의 조성물처리군과유사한수준임을 알수 있었다. 한편， 본 발명의 조성물 내 BGF 함량에 따른상처 치유능을확인하기 위하여， 실시예 1 내지 3, 및 비교예 1 및 2의 조성물을 이용하여 상기와 동일한 방식으로 실험을수행하였으며 그결과를도 9 및 10에 나타내었다. 도 9 및 10에서 보는바와 같이， EGF를 0.4 내지 0.8 ng/ml로포함하는실시예 1 내지 3의 조성물 처리군모두 4
음성 대조군보다최대 50%향상된효과를나타내었으며， 이는 EGF 20 ng/ml를단독으로 첨가한비교예 2의 조성물을처리한군과유사한수준임을알수 있었다.
" 또한， 본 발명의 조성물 내 BSA 함량에 따른상처 치유능을확인하기 위하여， 실시예 1, 4 및 5， 및 비교예 1 및 2의 조성물을 이용하여 상기와동일한 방식으로 실험을수행하였으며 그결과를도 11및 12에 나타내었다.도 11및 12에서 보는바와 같이， BSA를 10내지 1，000 pg/ml로포함하는실시예 1， 4및 5의 조성물처리군모두 음성 대조군보다 최대 약 40% 향상된 효과를 나타내었으며, 이는 EGF 20 ng/ml를 단독으로 과량 첨가한 비교예 2의 조성물을 처리한 군과 유사한 수준임을 알 수 있었다.
이와 같은 결과는， EGF 및 BSA의 조합을포함하는본 발명의 조성물의 구성이
EGF만을 단독으로 과량 포함하는 구성에 비해 우수한 콜라겐 합성 및 세포 재생 효과를나타냄을입증한다.
따라서， 본 발명의 조성물은 세포 독성을 나타내지 않고， EGF를 소량 포함하여도콜라겐 합성을 증가시킴으로써 주름 개선 효과를 나타냄은 물론， 향상된 상처 치유능을 나타내어 피부 재생 효과가우수하다. 뿐만아니라， 생산단가를 약 1/20로낮출수 있어 가격 경쟁력이 우수할뿐만아니라， EGF과량시용으로 인한암 발생률을현저히 낮출수 있어 생체에 안전하게 적용할수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1]
a) 세포 배양 배지 ;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml； 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1 ,000 u g/ml 를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 2]
제 1항 있어서，
상기 세포 배양 배지가 소태아혈청ᅳ무함유 배지인 조성물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서,
상기 세포 배양 배지가 포유동물 세포 배양 배지인 조성물.
【청구항 4】
제 3항에 있어서，
상기 포유동물 세포 배양 배지는 DMEM/F-12(Dulbecco ' s Modi f ied Eagle' s Medium/Nutrient Mixture F-12) , DMEM 및 MEM a (Minimum Essent ial Medium a )로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서，
상기 조성물이 아미노산， 비타민， 탄소원， 무기염 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 더 포함하는 조성물.
[청구항 6】
계 5항에 있어서， 상기 아미노산이 글리신， L-알라닌， L-아르기닌 하이드로클로라이드， L-아스파라긴-모노하이드레이트， L-아스파르트산， L-시스테인 하이드로클로라이드-모노하이드레이트， L-시스틴 2HCI , L-글루탐산， L-글루타민 L-히스티딘 하이드로클로라이드—모노하이드레이트， L-이소류신， L-류신， L-리신 하이드로클로라이드， L-메티오닌， L-페닐알라닌， L-프를린， L-세린， L-트레오닌， L-트립토판， L-티로신 디소듐염 디하이드레이트， L-발린， L-히스티딘， L-티로신 다소듐염 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
【청구항 7】
제 5항에 있어서，
상기 비타민이 바이오틴, D-관토텐산칼슘, 엽산， 나이파신아미드， 피리독신 하이드로클로라이드， 리보플라빈， 티아민 하이드로클로라이드， 비타민 B12 , 염화콜린， i -이노시를， 아스코르브산 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
【청구항 8】
저 15항에 있어서，
상기 탄소원이 D-글루코즈 (덱스트로즈)， 소듐 피루베이트， 히포크산틴 Na , 티미딘， 리놀레산， 리포산， 아데노신， 시티딘, 구아노신， 우리딘， 2 ' -데옥시아데노신, 2 ' -데옥시시티딘 HC1 , 2 ' -데옥시구아노신 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
【청구항 9】
제 5항에 있어서'
상기 무기염이 염화칼슴 (CaCl2) (무수)， 황산동 펜타하이드레이트 (CuS04-5H20)， 황산제이철 헵타하이드레이트 (FeS04-7¾0) , 염화마그네슴 (무수)， 황산마그네슘 (MgS04) (무수)， 염화칼륨 (KC1 ) , 염화나트륨 (NaCI ) , 인산수소이나트륨 (Na2HP04) 무수， 인산수소나트륨 모노하이드레이트 (Na¾P04-H20) , 황산아연 헵타하이드레이트 (ZnS04-7¾0) , 질산제이철 노나하이드레이트 (Fe(N03)3 · 9¾0) , 탄산수소나트륨 (NaHC03) 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
【청구항 10】
제 5항에 있어서，
상기 조성물이 1.110 내지 1.606g/L의 아미노산， 0.027 내지 0.060g/L의 비타민， 1.201 내지 4.625g/L의 탄소원 및 9.838 내지 10.923g/L의 무기염을 포함하는 조성물.
【청구항.11】
제 1항에 있어서，
상기 피부 상태 개선이 주름의 발생 억제, 피부 노화 억게， 피부 탄력 개선， 피부 재생， 상처 또는 창상 회복 (wound heal ing) , 각막 재생 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는， 피부 세포의 기능 저하 또는 손실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선시키는 것인 조성물.
【청구항 12]
a) 세포 배양 배지 ;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml； 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1,000 u g/ml 를 이용하여 피부 상태를 개선시키는 방법.
【청구항 13】
피부상태 개선을 위한 화장료의 제조에 사용하기 위한，
a) 세포 배양 배지 ;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml； 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1，000 u g/ml 의 용도.
【청구항 14]
a) 세포 배양 배지;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml； 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1 , 000 y g/ml를 포함하는 피부질환 예방또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 15]
제 14항에 있어서，
상기 피부 질환이 아토피성 피부염， 알러지， 피부 습진, 여드름， 건선 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
【청구항 16】
a) 세포 배양 배지 ;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml； 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1 ,000 u g/ml 를 이용하여 피부질환을 예방 또는 치료하는 방법 .
[청구항 17】
피부질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한， a) 세포 배양 배지 ;
b) 표피성장인자 (Epidermal growth factor , EGF) 0.4내지 0.8 ng/ml； 및 c) 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 10 내지 1 ,000 u g/ml 의 용도.
PCT/KR2015/012344 2014-11-17 2015-11-17 세포 배양 배지， 표피성장인자 및 소혈청알부민을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 WO2016080732A1 (ko)

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