KR102672729B1 - 오가노이드 배양액을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
화장료 조성물에 관한 것으로, 오가노이드 배양액을 포함함으로써 항노화, 보습 활성 및 모근 강화 효과가 우수한 바, 피부 상태 개선 또는 두피 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
화장료 조성물에 관한 것이다.
오가노이드(organoid)란, 줄기세포나 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 3차원 배양법으로 다시 응집 또는 재조합하여 만든 장기 특이적 세포 집합체이다. 오가노이드는 실제 장기와의 유사성을 활용한 질병 모델과 조직 재생능을 활용한 재생 치료제의 두 가지 측면에서 활용이 가능하다.
한편, 오가노이드 배양액은 오가노이드를 분화시키기 위한 일반적인 배양액으로서 배지의 활용도가 한정되어 있다. 뿐만 아니라, 오가노이드 배양액을 피부 세포에 적용하여 피부 상태 개선, 모근 강화, 및 발모 촉진 효능이 있는지에 대한 연구는 진행된 바가 없다.
일 양상은 오가노이드 배양액을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 오가노이드 배양액을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "오가노이드 배양액"은 "오가노이드 배양 상층액", "오가노이드 조건 배양액" 또는 "오가노이드 배양 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 줄기세포 또는 장기 기원세포로부터 분리한 세포가 시험관 내에서 3차원으로 성장 및 응집 또는 재조합할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 세포를 일정기간 동안 배양하여 얻는 상기 오가노이드, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 오가노이드 배양액은 기본 배지에, 글루타맥스(GLUTAMATE 1), B-27, N2, 2-메르캅토에탄올(2-Mercaptoethanol) 및 노르모신(Normocin)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
상기 기본 배지는 Advanced DMEM/F-12, 및 Neurobasal 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
또한, 상기 오가노이드 배양액은 상기 세포를 배양하여 얻은 배양액에서 오가노이드를 제거한 배양액을 의미할 수 있다.
한편, 상기 배양액 중 오가노이드를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 오가노이드를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다.
상기 줄기세포는 자가재생(self-renewal), 분화(differentiation) 및 자가 조직화(self-organization) 기능을 갖는 세포로서, 예를 들어, 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있다. 또한, 상기 장기 기원세포로부터 분리한 세포는 예를 들어, 혈액, 피부 조직, 지방 조직, 편도 등일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 오가노이드 배양액은 줄기세포 또는 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 배양하기 전에 수득한 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 오가노이드 배양액은 줄기세포 또는 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 배양한 이후에 수득한 것일 수 있다. 상기 세포를 배양한 이후 수득한 오가노이드 배양액은 상기 오가노이드의 대사물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 대사물은 피부 상태 개선, 모근 강화, 탈모 예방 또는 발모 촉진에 시너지 효과를 나타낼 수 있다.
일 실시예에서는 줄기세포 또는 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 배양하기 전 또는 배양한 후에 수득한 오가노이드 배양액을 처리한 인간 표피세포에서 보습 관련 인자(AQP3 및 HAS3)의 발현이 증가하고, 인간 섬유아세포에서 피부 탄력 및 주름 관련 인자(COL1A1 및 FBN1)의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 다른 실시예에서는 오가노이드 배양액에서 모유두세포의 증식이 유도되고, 모발 성장 관련 인자(VEGF, FGF7 및 HGF)의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 조성물은 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 노화 억제, 주름 개선, 보습 개선, 피부 장벽 강화, 또는 탄력 개선 효과를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 모근 강화, 탈모 예방 또는 발모 촉진 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.
상기 발효물은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.
상기 노화는 광노화일 수 있다. 용어 "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.
본 명세서에서 용어 "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 색소 침착은 체내에 있는 색소의 양이 비정상적인 경우 또는 색소가 나타나는 장소에 이상이 있는 상태를 의미하며, 예를 들면 기미 및 주근깨 등인 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 재생"은 피부의 일부분이 소실되었거나 손상되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식 및 이동을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 오가노이드 배양액을 포함할 수 있다. 이때, 오가노이드 배양액의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 항노화 및 보습과 같은 피부 상태 개선 또는 모근 강화 효과가 충분히 발휘되지 않는다는 문제점이 있다.
본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 오가노이드 배양액이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물인 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피부외용제 조성물인 것일 수 있다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인 것일 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 조성물 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
다른 양상은 유효한 양의 상기 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 피부 상태의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 오가노이드 배양액은 항노화, 보습 활성 및 모근 강화 효과가 우수한 바, 피부 상태 개선 또는 두피 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 AQP3의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 COL1A1의 발현이 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 FBN의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 모유두세포의 세포증식에 미치는 영향을 나타낸다.
도 6은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 VEGF의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 FGF의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 COL1A1의 발현이 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 FBN의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 모유두세포의 세포증식에 미치는 영향을 나타낸다.
도 6은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 VEGF의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 FGF의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 오가노이드 배양액의 제조(1)
일 양상에 따른 오가노이드 배양액을 제조하였다. 구체적으로, Advanced DMEM/F-12 및 Neurobasal 배지에, X100 GLUTAMATE 1, B-27 supplement, N2 supplement, 2-Mercaptoethanol 및 Normocin을 혼합하여 오가노이드 배양 배지를 제조하였다.
실시예 2. 오가노이드 배양액의 제조(2)
일 양상에 따른 오가노이드 배양액을 제조하였다. 구체적으로, 24 well plate에 500 ㎕의 상기 실시예 1에서 3일에 한 번씩 기존 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체해 주면서 hESC 또는 iPSC 세포를 배양하여 오가노이드를 제조하였다. 100~200일 동안 배양한 후, 털(Hair)이 발생한 오가노이드를 실시예 1 배지로 갈아준 뒤 3일 동안 추가로 배양하였다. 이후, 오가노이드 배양액을 수확한 뒤 원심분리기로 세포 및 잔여물을 침전시키고 상층액만을 수득하였다.
[실험예]
실험예 1. 피부 보습 개선 효과 확인
일 양상에 따른 오가노이드 배양액의 피부 보습 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, 인간 표피세포(HaCaT)를 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였고, 배양은 37℃, 5% CO2 및 습도 95% 조건의 배양기에서 24시간 동안 수행하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣은 후 1차례 워싱하여, FBS가 없는 배지로 갈아준 후, 실시예 1 및 실시예 2를 농도별(10, 100, 1000 및 10000 ppm)로 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 음성 대조군으로 순수 증류수를 사용하고, 양성대조군으로 1 μM Retinoic acid 첨가군을 사용하였다. 이후, 각 배지의 세포를 수득하여 냉각된 PBS로 세척하고 RNAprep 키트(Monarch® Total RNAprep Kit, NEB, 미국)를 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 AQP3, HAS3에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응의 사이클을 40 사이클로 반복하여 수행하였다. AQP3, HAS3 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 1과 2에 나타내었다.
도 1은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 AQP3의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 2는 농도 의존적으로 AQP3 및 HAS3의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 실시예 2는 100 ppm 이상의 농도에서 양성대조군에 비해 AQP3의 발현을 현저하게 증가키시고, 1000 ppm의 농도에서 양성대조군에 비해 HAS3의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액은 AQP3 및 HAS3의 발현을 증가시킴으로써 피부 보습에 효과가 있다.
실험예 2. 피부 탄력 효과 확인
일 양상에 따른 오가노이드 배양액의 피부 탄력 및 주름 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68)를 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였고, 배양은 37℃, 5% CO2 및 습도 95% 조건의 배양기에서 24시간 동안 수행하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣은 후 20 mJ/㎠의 UVB를 조사하거나 조사하지 않았다. UVB 조사 직후 DPBS를 제거하고 FBS가 없는 배지로 갈아 준 후, 실시예 1 및 실시예 2를 농도별(10, 100, 1000 및 10000 ppm)로 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 음성 대조군으로 순수 증류수를 사용하고, 양성대조군으로 1 nM TGF-beta1 첨가군을 사용하였다. 이후, 각 배지의 세포를 수득하여 냉각된 PBS로 세척하고 RNAprep 키트(Monarch® Total RNAprep Kit, NEB, 미국)를 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 COL1A1, 및 FBN1에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응의 사이클을 40 사이클로 반복하여 수행하였다. COL1A1와 FBN1 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 FBN1의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2는 무처리 대조군과 대비하여 COL1A1 및 FBN1의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액은 세포를 배양하기 전 또는 상기 세포를 배양한 후에 수득한 것에 관계 없이 COL1A1 및 FBN1의 발현을 증가시키는 바, 피부 탄력에 탁월한 효과가 있다.
실험예 3. 세포 증식 확인
일 양상에 따른 오가노이드 배양액의 모유두세포의 세포증식 효과를 확인하였다. 구체적으로, HFDPC를 96웰 플레이트에 2x104의 수만큼 분주한 후, 37°C, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 아무것도 포함하지 않은 배지로 교체한 후 상기 오가노이드 배양액을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 양성대조군인 미녹시딜을 사용하였으며, 24시간 후, 각 웰의 배지를 제거하고 Dulbecco's 인산염완충식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline: DPBS)를 이용한 워싱 과정을 1회 거친 다음 각 웰당 500μl의 0.5mg/mL MTT 테트라졸륨 (Sigma-aldrich, St. Louis, USA)를 포함하는 배지로 교체하고 37°C에서 4시간 동안 반응시켰다. 이후 빅터 3를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 모발 발육 촉진제로 알려진 0.1 uM의 미녹시딜(Minoxidil: MXD)을 양성 대조군으로 설정하고, 세포의 생존율은 아무 것도 포함하지 않은 배지를 처리한 경우를 음성 대조군으로 설정하여 이의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타낸 HFDPC 증식능을 측정하였다.
도 5는 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 모유두세포의 세포증식에 미치는 영향을 나타낸다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2는 무처리 대조군과 비교하여 모유두세포의 세포 증식을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 실시예 1 및 실시예 2는 미녹시딜과 유사하거나 또는 그 이상으로 모유두세포의 세포 증식에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액은 세포를 배양하기 전 또는 상기 세포를 배양한 후에 수득한 것에 관계 없이 모유두세포의 세포 증식을 촉진시키는 바, 발모 촉진, 개선 또는 탈모 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 4. 모발 성장 효과 확인
일 양상에 따른 오가노이드 배양액의 모발 성장 효과를 확인하였다. 구체적으로, 인간모유두세포(HFDPC)를 6웰 플레이트에 3x105 세포/웰씩 분주한 후, 세포 배양조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 이후 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음, FBS를 포함하지 않은 배지를 사용하여 세포를 기아 상태로 만들어 준 후, 다음날 FBS 포함하지 않은 배지와 미녹시딜 0.1 uM, 실시예 1 또는 실시예 2의 오가노이드 배양액을 포함하는 배지로 교체해 준 후, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이 후, RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 세포에서 RNA를 분리한 뒤, 나노드롭(nanodrop)을 이용하여 260nm에서 RNA를 정량 한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국)에서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 VEGF, FGF7, 프라이머와 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써, 최종적으로 VEGF, FGF7 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 실시간 PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응의 사이클을 40 사이클로 반복하여 수행하였다. VEGF, 및 FGF유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 VEGF의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
도 7은 일 구체예에 따른 오가노이드 배양액이 FGF의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (7)
- 오가노이드 배양액을 포함하며,
상기 오가노이드 배양액은 2-메르캅토에탄올 및 노르모신을 포함하는 배지에서 오가노이드를 배양한 후에 수득된 배양액 또는 이의 상층액을 포함하는 것인,
주름 개선, 보습 개선, 피부 장벽 강화, 또는 탄력 개선용 화장료 조성물. - 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 Advanced DMEM/F-12 및 Neurobasal 배지인 것인, 주름 개선, 보습 개선, 피부 장벽 강화, 또는 탄력 개선용 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 글루타맥스, B-27 및 N2 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 주름 개선, 보습 개선, 피부 장벽 강화, 또는 탄력 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 오가노이드 배양액을 포함하며,
상기 오가노이드 배양액은 2-메르캅토에탄올 및 노르모신을 포함하는 배지에서 오가노이드를 배양한 후에 수득된 배양액 또는 이의 상층액을 포함하는 것인,
주름 개선, 보습 개선, 피부 장벽 강화, 또는 탄력 개선용 건강기능식품 조성물. - 오가노이드 배양액을 포함하며,
상기 오가노이드 배양액은 2-메르캅토에탄올 및 노르모신을 포함하는 배지에서 오가노이드를 배양한 후에 수득된 배양액 또는 이의 상층액을 포함하는 것인,
모근 강화용 화장료 조성물. - 오가노이드 배양액을 포함하며,
상기 오가노이드 배양액은 2-메르캅토에탄올 및 노르모신을 포함하는 배지에서 오가노이드를 배양한 후에 수득된 배양액 또는 이의 상층액을 포함하는 것인,
탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102672729B1 true KR102672729B1 (ko) | 2024-06-05 |
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