KR102334452B1 - 코리네박테리움 우레아리티쿰 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도 - Google Patents

Abstract

신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.

Description

코리네박테리움 우레아리티쿰 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도{Corynebacterium urealyticum strain and skin condition improving uses of thereof}

신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.

피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 인간은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어있다. 표피는 일명 '벽돌과 몰탈 구조'라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화과정의 마지막을 거친 비늘(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.

이에, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있는 피부상재균의 개발이 필요한 실정이다.

US 10525032 B2 (2020.01.07)

일 양상은 코리네박테리룸 속(Corynebacterium sp.)에 속하는 코리네박테리움 우레아리티쿰(Corynebacterium urealyticum) 균주를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 균주의 파쇄물, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 코리네박테리움 우레아리티쿰(Corynebacterium urealyticum) 균주를 제공한다.

상기 코리네박테리움 우레아리티쿰(Corynebacterium urealyticum) 균주는 기탁번호 KCCM12693P로 기탁된 균주일 수 있다.

상기 코리네박테리움 우레아리티쿰(Corynebacterium urealyticum) 균주는 서열번호 1의 16s rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.

상기 균주는 피부 미용 또는 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 노화 억제, 피부 미백, 피부 장벽 강화, 피부 주름 억제, 또는 피부 보습 효과를 갖는 것일 수 있다.

상기 균주는 항노화 및 항주름 인자(예를 들어, COL1A1 또는 엘라스틴(ELN))의 발현을 증가 시키거나, 피부 보습 및 피부 장벽 관련 히알루론산 합성 효소 3(HAS3: Hyaluronan synthase　3)의 발현을 증가시키거나, 또는 염증성 사이토카인(예를 들어, IL-1β)의 발현을 억제하거나, 또는 피부미백에 관련된 멜라닌의 합성을 감소시키는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 균주의 파쇄물, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공한다.

상기 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 코리네박테리움 우레아리티쿰 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 　한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며,　배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주　자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.

상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.

상기 배양액은 코리네박테리움 우레아리티쿰 균주를 배지(예를 들면, R2A 배지 또는 TSA 배지) 에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

상기 코리네박테리움 우레아리티쿰 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 코리네박테리움 우레아리티쿰 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 그의 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료, 피부 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 등을 포함할 수 있다.

상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 항 주름, 피부 미백, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.

상기 균주 또는 이의 배양액은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.

상기 노화는 광노화일 수 있다. 용어 "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.

본 명세서에서 용어 "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 미백"은　멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미할 수 있다. 상기 "색소 침착"은 체내에 있는 색소의 양이 비정상적인 경우 또는 색소가 나타나는 장소에 이상이 있는 상태를 의미하며, 예를 들면 기미 및 주근깨 등인 것일 수 있다.

상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "항염증"이란 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증일 수 있다. 용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.

상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.

상기 피부 염증성 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 피부 개선 효과를 갖는 다른 균주 코리네박테리움 속에 속하는 균주와 함께 사용되어 시너지 효과를 나타낸 것일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속에 속하는 균주는 예를 들어, C. ammoniagenes, C. glutamicum, C. acetoglutamicum, C. acetoacidophilum, C. thermoaminogenes, C. alkanolyticum, C. callunae, C. lilium, C. melassecola, C. efficiens, C. herculis, C. diphtheria, C. hemolyticum, C. pseudotuberculosis, C. pyogenes, C. ulcerans, 또는 C. pseudodiphthericum 등을 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 코리네박테리움 속에 속하는 균주의 예는 코리네박테리움 아미콜라툼 SB-1 (Corynebacterium amycolatum SB-1), 코리네박테리움 아코렌스 SB-2(Corynebacterium accolens SB-2), 코리네박테리움 제이케이움 SB-3(Corynebacterium jeikeium SB-3), 코리네박테리움 아페르멘탄스 SB-4(Corynebacterium afermentans SB-4), 코리네박테리움 우레아리티쿰 SB-5(Corynebacterium urealyticum SB-5), 코리네박테리움 크롭펜스테드티 SB-6(Corynebacterium kroppenstedtii SB-6), 코리네박테리움 투베르쿨로스테아리쿰 SB-7(Corynebacterium tuberculostearicum SB-7) 또는 코리네박테리움 맥진레이 SB-8(Corynebacterium macginleyi SB-8)를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.

상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.

또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 염증 억제, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.

일 양상에 따른 신규 코리네박테리움 우레아리티쿰 균주에 의하면, 피부 관련 상태 또는 염증 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주가 엘라스틴의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주가 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 균주가 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 균주가 멜라닌 생성 억제에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

건강한 여성의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 확보된 샘플(human epidermal keratinocyte)을 TSB(Tryptic soy broth) 및 0.1% tween 80을 함유하는 액체 배지 또는 고체 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 28℃인큐베이터에서 배양한 뒤 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 48시간 동안 28℃인큐베이터에서 재배양 하였다. 배양이 완료된 집락은 16s rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안되었다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분 30초씩 30 사이클로 실시 하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였을 때 상동성 97% 이하의 신규성 있는 종들만 선별하여 사용하였고, 그 중 상동성 98% 이하의 신규 미생물 코리네박테리움 우레아리티쿰(Corynebacterium urealyticum) 균주(이하 "SB-5"라 함)을 선별하였다. 선별된 SB-5 균주를 2020년 4월 9일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM12963P를 부여 받았고, ob-5 균주는 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다.

[실험예]

항노화 및 항주름 활성 분석

상기 실시예 1에서 분리된 SB-5 균주 배양액이 자외선(UV) 조사에 의한 노화피부 노화 및 주름 생성과 관련된 인자에 미치는 영향을 분석하였다.

구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68) 를 6 웰 플레이트에 3.5x10⁵로 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣은 후 12 mJ/㎠ 의 UVB를 조사하거나 조사하지 않았다. UVB 조사 직후 DPBS를 제거하고 FBS가 없는 배지로 갈아 준 후, 상기 SB-5 균주의 배양액(1%(w/w))을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 음성 대조군으로 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군을 사용하였다. 그 후 각 시료의 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 COL1A1, 및 ELN(elastin)에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다.

도 1은 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 2는 일 구체예에 따른 균주가 엘라스틴의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 자외선에 의해 감소된 COL1A1 및/또는 엘라스틴의 발현을 유의적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 일 구체예에 따른 SB-5 균주는 노화(예를 들면, 광노화) 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.

피부장벽 강화 및 피부 보습 활성 분석

상기 실시예 1에서 분리된 SB-5 균주 배양액이 피부장벽강화 및 피부 보습 활성에 미치는 영향을 분석하였다.

구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 상기 SB-5 균주의 배양액(1%(w/w))을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 피부 장벽 강화 및 보습과 관련된 인자인 HAS3(히알루론산 합성 효소)에 대한 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예와 동일한 방법으로 HAS3의 발현량을 측정하였다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 일 구체예에 따른 균주가 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 HAS3의 발현량을 유의적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 일 구체예에 따른 SB-5 균주는 피부장벽 강화 및 피부 보습에 유용하게 사용될 수 있다.

항염증 활성 분석

상기 실시예 1에서 분리된 SB-5 균주 배양액이 항염증 활성이 있는지 여부를 분석하였다.

구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 수행하였다. 배지는 3~4일마다 교환해 주며 세포가 과다하게 증식되었을 때는 계대배양 하였다. 이후에 상기 세포를 5x10⁵/웰로 분주하고 배양 24시간 후, 인산 완충 식염수 용액(PBS)으로 세척하였다. FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지가 들어있는 각 웰에 세포를 분주하고, Poly I:C 10 ㎍/㎖, 및 IL-4를 10 ng/㎖로 첨가하여 각질형성 세포주에 염증을 유도하였다 다음으로 상기 균주의 배양액을 1% 농도로 처리한 후, 4시간 동안 추가 배양하였다. IL-1β에 대한 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예와 동일한 방법으로 IL-1β의 발현량을 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4는 일 구체예에 따른 균주가 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 무처리 대조군 대비 현저하게 염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 일 구체예에 따른 SB-5 균주는 피부 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

피부 미백 활성 분석

상기 실시예 1에서 분리된 SB-5 균주 배양액의 피부 미백 활성을 분석하였다.

구체적으로, 마우스의 색소 세포인 B16-F10(Murine Melanoma) 세포(ATCC)를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038) 2㎖에 현탁시켜 1x10⁵ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 상기 세포가 웰 바닥에 40~50% 부착될 때까지 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, α-MSH를 100 nM 농도로 처리하여 멜라닌 생성을 유도하였다. 다음으로 상기 균주의 배양액(1%(w/w))을 처리한 후, 3일 동안 추가 배양하였다. 이후, 배양액을 회수하여 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액을 마이크로플레이트 리더(Microlpate reader, Victor 3)로 490 ㎚에서 흡광도를 3회 측정하여 멜라닌 분비 억제능을 평가하였다. 하기 계산식에 의해 평가하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 양성대조군으로는 알부틴(100ppm, Sigma aldrich)를 사용하였다.

[계산식]

Melanin contents(%)=(각 시료 처리군의 평균 흡광도)/(α-MSH 처리군의 평균 흡광도) x 100(%)

도 5는 일 구체예에 따른 균주가 멜라닌 생성 억제에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌을 무처리 대조군 대비 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 일 구체예에 따른 SB-5 균주는 피부 미백에 유용하게 사용될 수 있다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12693P 20200409

<110> Cosmax, INC. <120> Corynebacterium urealyticum strain and skin condition improving uses of thereof <130> PN132221 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1358 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Corynebacterium urealyticum <400> 1 cctgcttgca ggggtactcg agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggtg atctgccctt 60 cacttcggga taagcctggg aaactgggtc taataccgga taggaccaat ctttagtgtg 120 gttggtggaa agttttttcg gtggaggatg agcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg 180 taatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggtggacgg ccacattggg 240 actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg 300 gaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc 360 gctagggaag aagccttcgg gtgacggtac ctggataaga agcaccggct aactacgtgc 420 cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcgag cgttgtccgg aattactggg cgtaaagagc 480 tcgtaggtgg tttgtcgcgt cgtctgtgaa attccggggc ttaactccgg gcgtgcaggc 540 gatacgggca aactggagtg ctgtagggga gactggaatt cctggtgtag gccggtggaa 600 tgcgcagata tcaggaggaa caccgatggc gaaggcaggt ctctgggcag ttactgacac 660 tgaggagcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa 720 cggtgggcgc taggtgtggg gatttttcac gatttccgtg ccgtagctaa cgcattaagc 780 gccccgcctg gggagagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 840 cacaagcggc ggagcatgtg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctgggcttg 900 acatacaccg gatcgctgca gagatgtagt ttcccttcgg ggctggtgta caggtggtgc 960 atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttggatgtta agtcccgtaa cgagcgcaac 1020 ccttgtcttg tgttgccagc acgttgtggt ggggactcac aagagactgc cggggttaac 1080 tcggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca 1140 tgctacaatg gtcgatacag tgggttgcga tgccgtgagg tggagctaat ccctgattaa 1200 gtcggcctca gttcggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga gtcgctagta 1260 atcgcagatc agcaacgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtcg 1320 cgtcatgaaa gttggtaata cccgaagcca gtggccta 1358

Claims (7)

1. 기탁번호 KCCM12693P로 기탁된, 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)에 속하는 코리네박테리움 우레아리티쿰(Corynebacterium urealyticum) 균주.
2. 청구항 1의 균주의 배양액.
3. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 피부 상태 개선용, 피부 미백용 또는 보습용인 것인 화장료 조성물로서, 상기 피부 상태는 자외선에 의한 피부 노화, 피부 장벽 강화, 피부 주름, 또는 피부 탄력인 것인 조성물.
5. 삭제
6. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 염증성 사이토카인인 IL-1β를 감소시키는 것인 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 피부 염증 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 조성물.
   

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