KR102597744B1

KR102597744B1 - 바실러스 인판티스 hb2 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도

Info

Publication number: KR102597744B1
Application number: KR1020210125223A
Authority: KR
Inventors: 허영목; 이동걸; 김미선; 강하빈; 강승현; 박명삼
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2021-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2023-11-03
Also published as: KR20230041509A

Abstract

신규한 바실러스 인판티스 HB2 균주 및 이의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따른 신규 바실러스 인판티스 HB2 균주에 의하면, 피부 재생, 상처 개선 및 피부 미백 효과가 있으므로, 피부 상태의 개선, 예방, 또는 치료 용도로 다양하게 응용될 수 있다.

Description

바실러스 인판티스 HB2 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도{Bacillus infantis HB2 strain and its use for improving skin conditions}

신규한 미생물, 그의 파쇄액, 배양액, 추출액 및 이들의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다.

피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 인간은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 이들은 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화 되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속 지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부 장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어있다. 표피는 일명 '벽돌과 몰탈 구조'라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화 과정의 마지막을 거친 비늘(squames)은 끊임없이 피부 조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익 작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.

이에, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있는 피부상재균의 개발이 필요한 실정이다.

Kwan et al., "Bacillus infantis sp. nov. and Bacillus idriensis sp. nov., isolated from a patient with neonatal sepsis", Int J Syst Evol Microbiol. 2006 Nov;56(Pt 11):2541-2544.

일 양상은 신규한 바실러스 인판티스(Bacillus infantis) 균주를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 유효량의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 바실러스 인판티스(Bacillus infantis) 균주를 제공한다.

상기 균주는 분리된 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "분리된(isolated)"이란 자연계에 존재하는 것이 아닌 인위적으로 분리하여 이용가능한 것을 의미한다. 상기 균주는 인간 피부로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 균주는 인간 피부 세포를 TSB(Tryptic Soy Broth) 또는 R2A(Reasoner's 2A) 배지에 접종하여 배양된 콜로니를 순수 분리 배양하는 방법에 의해 분리된 균주일 수 있다.

상기 균주는 바실러스 속(Bacillus sp.)에 속하는 균주일 수 있다.

상기 균주는 서열번호 1과 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 당업계에 공지된 방법에 따라 확인될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

상기 바실러스 인판티스(Bacillus infantis) 균주는 기탁번호 KCCM13021P로 기탁된 균주일 수 있다. 상기 기탁번호로 기탁된 균주는 바실러스 인판티스 HB2 균주일 수 있다.

상기 균주는 피부 상태 개선 효과를 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 상처 개선 및 피부 미백 중 1종 이상일 수 있다.

다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공한다.

상기 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 "용해물"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다. 상기 파쇄액은 파쇄액 자체, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 바실러스 인판티스 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 균주 자체를 의미하는 것으로, 샘플 등으로부터 분리하여 선별한 균주 자체 또는 상기 균주를 배양하여 배양액으로부터 분리한 균주를 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간 동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.

상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물 또는 동결건조물, 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.

상기 바실러스 인판티스 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 배양액은 배지(예를 들면, R2A 배지 또는 TSB 배지)에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 120시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리 또는 여과시켜 균체를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리 또는 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.

상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 생물학적으로 순수한 것일 수 있다. 상기 균주는 순수배양(pure culture)에 의해 얻은 것일 수 있다.

또 다른 양상은 바실러스 인판티스 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 바실러스 인판티스 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 용도 또는 조성물에 있어서, 상기 바실러스 인판티스 균주는 상기 일 양상에 따른 바실러스 인판티스 균주일 수 있다.

상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료를 포함할 수 있다.

상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 재생, 상처 개선 및 피부 미백 중 1종 이상일 수 있다.

상기 균주는 섬유아세포의 이동을 증가시키거나; 멜라닌 생성을 억제 또는 감소시키는 것일 수 있다.

용어 "상처"는 "창상"이라고도 하며, 생체의 손상을 의미한다. 상기 손상은 물리적 손상, 방사선, 화학물질에 의한 자극, 미생물의 증식 등 외부 요인, 스트레스 등의 내부 요인에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 상처는 절창, 자창, 할창, 좌창, 열창, 사창, 교창 등 모든 종류의 상처를 포함할 수 있다.

용어 "피부 재생"은 피부의 일부분이 소실되었거나 손상되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식 및 이동을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다. 피부가 재생됨에 따라 주름 개선 효과가 나타날 수 있다.

용어 "상처 개선"은 얼굴이나 신체의 상처를 옅어지게 하거나 정도를 감소시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.

용어 "상처 치유"는 상처를 회복하는 일련의 생체반응을 의미할 수 있다.

상기 피부 재생, 주름 개선, 상처 개선, 또는 생처 치유의 원인은 제한이 없으나, 예를 들어 피부 세포의 이동 또는 증식에 의한 것일 수 있다.

용어 "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미할 수 있다.

용어 "멜라닌 생성 억제"란 세포 등에서 멜라닌이 새롭게 생성되는 것을 억제하는 것을 의미할 수 있다.

용어 "멜라닌 분비 억제"란 세포 등에서 멜라닌이 분비되는 것을 억제하는 것을 의미할 수 있다.

용어 "멜라닌 감소"란 세포 등에 기존에 존재하는 멜라닌 함량을 감소시키는 것을 의미할 수 있다.

상기 피부 질환은 피부 상처, 피부 흉터, 또는 멜라닌 색소 과다 침착 질환일 수 있다.

용어 "멜라닌 색소 과다 침착"이란 다양한 원인에 의해서 발생한 멜라닌 색소 과다 침착을 모두 포함하는 광범위한 개념이며, 피부 또는 손톱, 발톱의 특정 부위에서 멜라닌 색소의 과도한 증가로 인해 다른 부위에 비해 어둡게 되는 것을 의미한다.

상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨(freckle); 기미(melasma); 간반(chloasma); 검버섯(liver spot); 모반(nevus); 일광흑자(solar lentigo); 흑피증(melanosis); 포이츠-예거 증후군(peutz-jegher's syndrome); 임신성 갈색반(chloasma gravidarum); 약물 사용 후 과다색소침착; 및 염증 후 과다색소침착(postinflammatory hyperpigmentation) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어 "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다. 용어 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

일 양상에 따른 조성물은 상기 바실러스 인판티스 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물을 포함함으로써, 섬유아세포의 이동을 증가시켜 피부 재생, 상처 개선, 상처 치유, 또는 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다.

일 양상에 따른 조성물은 상기 바실러스 인판티스 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물을 포함함으로써, 멜라닌 생성을 억제 또는 감소시켜, 피부 미백 효과, 또는 멜라닌 색소 과다 침착 질환 등의 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 피부 상태 개선 효과를 갖는 다른 균주, 예를 들어, 바실러스 속에 속하는 균주와 함께 사용되어 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 상기 바실러스 속에 속하는 균주는 예를 들어, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus atrophaeus, Bacillus thermolactis, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus aryabhattai, Bacillus aerius, Bacillus circulans, Bacillus flexus, Bacillus kokeshiiformis, Bacillus hisashii, Bacillus jejuensis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus thermocopriae, Bacillus velezensis, Bacillus siamensis, Bacillus altitudinis 등을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 상기 균주, 이의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물을 포함할 수 있다. 이때, 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 재생, 상처 개선, 또는 피부 미백 효과가 충분히 발휘되지 않을 수 있다.

본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 이의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화(formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.

상기 조성물은 액체 상태 또는 건조 상태인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 건조 분말 형태일 수 있다.

상기 조성물을 건조 상태로 제조하는 건조 방법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예는, 공기 건조 방법, 자연 건조 방법, 분무 건조 방법, 동결 건조 방법 등이 있다. 이들 방법은 단독으로 사용하거나 적어도 두 가지 방법을 함께 사용할 수 있다.

상기 조성물은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물의 열화(deterioration)를 감소시키기에 충분한 유효량의 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 예를 들어 결합제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 화장품학적으로, 약학적으로 또는 식품학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 담체와 함께 제형화되어 화장품, 약품, 식품 첨가제 등으로 제공될 수 있다.

상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 본 명세서에 개시된 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 기능성 첨가물 등을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 분산제, 유화제, 방부제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 특정 제형에 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 제형을 적절히 선택할 수 있다. 상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 가용화 제형, 유화 제형, 또는 분산 제형을 갖는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제; 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제; 비타민 C, 마그네슘아스코빌포스페이트, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산; 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 만니톨, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제 등일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 연고제 등일 수 있다.

상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다. 이 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물 단독을 사용하거나, 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.

상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 예를 들어, 피부 상처 또는 멜라닌 색소 과다 침착과 관련된 상태일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고, 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 피부에의 도포를 포함할 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부 개선을 필요로 하는 개체, 예를 들어 피부 재생, 상처 개선, 또는 피부 미백 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.

일 양상에 따른 신규 바실러스 인판티스 균주에 의하면, 피부 재생, 상처 개선, 또는 피부 미백 효과가 있으므로, 피부 상태의 개선, 예방, 또는 치료 용도로 다양하게 응용될 수 있다.

도 1은 시간에 따른 상대적 상처 밀도(%)를 나타낸 그래프 및 배양 접시에서의 세포 포화도를 확인한 사진이다. HB2: HB2 균주 배양액 첨가군; TSB(medium): 배지 첨가군; 및 None: 무첨가군.
도 2는 각 시험군이 멜라닌 생성 억제에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다. None: 무첨가군; Veh.: 비히클(100 nM α-MSH) 단독 첨가군; TSB: 배지 첨가군; HB2: HB2 균주 배양액 첨가군; 및 Arbutin: 양성대조군으로서 알부틴 첨가군.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

건강한 여성의 피부에서 바실러스 인판티스 균주를 분리 및 동정하였다.

구체적으로, 건강한 여성의 뺨, 코끝, 콧볼 경계부 등을 PBS(phosphate buffer saline)에 적신 멸균 면봉으로 2~3차례씩 스왑하였다. PBS가 담긴 튜브에 면봉을 넣고, 10초 동안 볼텍싱(vortexing)하였다. 샘플의 10배, 100배, 1,000배 희석액을 제작하고, 0.1X TSB(Tryptic Soy Broth), 0.5X R2A(Reasoner's 2A) 한천 배지에 각각 100 μL씩 가하여 스프레더로 도말하였고, 플레이트를 30℃ 또는 37℃에서 배양시키고 집락을 분리하였다. 배양이 완료된 집락은 16S rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안되었다(27F, 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (서열번호 2); 1492R, 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 (서열번호 3)). PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 미생물들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 결정된 16S rRNA 부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석하였을 때 상동성 99.78%의 신규 미생물 바실러스 인판티스(Bacillus infantis) 균주(이하 "HB2"라 함)를 선별하였다.

선별된 HB2 균주를 2021년 7월 20일자로 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM13021P를 부여 받았다. HB2 균주는 서열번호 1(complementary DNA)의 16S rRNA 서열을 갖는다.

실시예 2. HB2 균주 배양액의 제조

실시예 1의 HB2 균주를 TSB 배지에서 배양한 후, 원심분리를 통해 균체를 제거하고 상등액 회수 및 여과를 통해 HB2 균주 배양액을 제조하였다.

실험예 1. 피부 재생 및 상처 치유 효과 - 섬유아세포 이동 증가능 확인

HB2 균주 배양액이 피부 재생에 미치는 영향을 분석하기 위해, 섬유아세포 이동 실험을 하였다.

구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68)를 6-웰 플레이트에 3x10⁵로 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하여 100% 포화된(confluent) 상태를 만들어 주었다. 이후 세포 스크래퍼(cell scrapper)를 이용하여 배양된 세포 중심을 긁어 상처를 낸 후, 실시예 2의 HB2 균주 배양액(1%(w/w))을 포함하는 배지와 포함하지 않는 배지로 교체해 준 다음 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후 세포에 임의로 낸 상처가 어느 정도 회복 되었는지를 형광현미경으로 촬영하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1은 시간에 따른 상대적 상처 밀도(%)를 나타낸 그래프 및 배양 접시에서의 세포 포화도를 확인한 사진이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, HB2 균주 배양액은 손상 부위로의 섬유아세포 이동을 유의하게 증가시킴을 확인할 수 있었다.

따라서, 바실러스 인판티스 HB2 균주는 피부 재생 및 상처 치유 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 2. 미백 효과 - 멜라닌 생성 저해능 확인

HB2 균주 배양액의 피부 미백 활성을 분석하기 위해, 멜라닌 생성 저해능을 측정하였다.

구체적으로, 마우스의 색소 세포인 B16-F10(Murine Melanoma) 세포(ATCC)를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038) 2 ㎖에 현탁시켜 1x10⁵ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 상기 세포가 웰 바닥에 40~50% 부착될 때까지 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)를 100 nM 농도로 처리하여 멜라닌 생성을 유도하였다. 다음으로 실시예 2의 HB2 균주 배양액(1%(w/w))을 처리하여 3일 동안 추가 배양하였다. 이후, 배양액을 회수하여 1,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액을 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, Victor 3)로 490 ㎚에서 흡광도를 3회 측정하여 멜라닌 분비 억제능을 평가하였다. 멜라닌 함량은 하기 계산식에 의해 평가하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 양성대조군으로는 알부틴(Sigma Aldrich) 100 ppm 을 사용하였다.

[계산식]

멜라닌 함량(Melanin contents, %) = (각 시료 처리군의 평균 흡광도) / (α-MSH 처리군의 평균 흡광도) x 100(%)

도 2는 각 시험군이 멜라닌 생성 억제에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, HB2 균주는 α-MSH에 의해 증가된 멜라닌을 무처리 대조군 대비 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 바실러스 인판티스 HB2 균주는 피부 미백 효과가 있음을 알 수 있었다.

종합하면, 바실러스 인판티스 HB2 균주는 섬유아세포 이동을 증가시키며; 멜라닌 생성을 억제 또는 감소시킴을 확인하였다. 따라서, 바실러스 인판티스 HB2 균주는 피부 재생, 상처 개선(치유) 및 피부 미백 효과를 가짐을 알 수 있었다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM13021P

20210720

SEQUENCE LISTING <110> Cosmax, INC. <120> Bacillus infantis HB2 strain and its use for improving skin conditions <130> PN140320KR <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1395 <212> DNA <213> Bacillus infantis <400> 1 taccccaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 60 ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcatgc 120 aggcgagttg cagcctgcaa tccgaactga gaatggtttt atgggattcg cttaacctcg 180 cggtcttgca gccctttgta ccatccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg 240 catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag 300 tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 360 acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcatcctgt cccccgaagg 420 ggaacgccct atctctaggg ttgtcaggag atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt 480 gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt 540 tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgtttgctgc agcactaaag 600 ggcggaaacc ctctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 660 atcctgtttg ctccccacgc tttcgcgcct cagcgtcagt tacagaccag aaagtcgcct 720 tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg ctacacgtgg aattccactt 780 tcctcttctg cactcaagtc ccccagtttc caatgaccct ccacggttga gccgtgggct 840 ttcacatcag acttaagaga ccgcctgcgc gcgctttacg cccaataatt ccggacaacg 900 cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggtcag 960 gtaccgtcaa ggtgccggca gttactccgg cacttgttct tccctgacaa cagagtttta 1020 cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt cagactttcg tccattgcgg 1080 aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc 1140 gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt tgccttggtg agccgttacc tcaccaacta 1200 gctaatgcgc cgcgggccca tctgtaagtg atagccgaaa ccatctttca gcatarcctc 1260 atgagaggyt rtgcattatc cggtattagc tccggtttcc cgaagttatc ccagtcttac 1320 aggcaggttg cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctga cttcagggag caagctccca 1380 tccgtccgct cgact 1395 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1492R primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

기탁번호 KCCM13021P로 기탁된, 바실러스 인판티스(Bacillus infantis) HB2 균주.
청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 것인 균주.
청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 또는 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 상처 개선용 화장료 조성물.
청구항 3에 있어서, 섬유아세포의 이동을 증가시키는 것인 화장료 조성물.
청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 또는 배양액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
청구항 5에 있어서, 멜라닌 생성을 억제 또는 감소시키는 것인 화장료 조성물.
청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 또는 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 상처 개선용 피부외용제 조성물.
청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 또는 배양액을 포함하는 피부 미백용 피부외용제 조성물.
청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 또는 배양액을 포함하는 피부 재생 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물.
청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 또는 배양액을 포함하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물.