KR101869275B1

KR101869275B1 - 항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 칼리디폰티박터 속 r161 균주

Info

Publication number: KR101869275B1
Application number: KR1020170061092A
Authority: KR
Inventors: 김재수; 심동섭
Original assignee: 경기대학교 산학협력단; (주)이노진
Priority date: 2017-05-17
Filing date: 2017-05-17
Publication date: 2018-06-21

Abstract

본 발명은 항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양에서 분리한 항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 또는 이의 배양물은 항균, 항산화, 피부미백 및 피부주름개선 활성이 매우 뛰어나 항균 또는 피부미용 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 칼리디폰티박터 속 R161 균주{Novel Calidifontibacter sp. R161 having anti-bacterial, anti-oxidant, skin-whitening and anti-wrinkle effect}

본 발명은 항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양에서 분리한 항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

엘라스틴은 피부의 탄력성을 좌우하는 주요 섬유 조직으로서 그 양은 약 2%정도로 콜라겐과 비교하여 적은 양이지만 표피를 지탱하는 연결망 조직을 형성하고 있으므로 피부 탄력에 매우 중요한 역할을 한다. 엘라스타제(elastase)는 피부 탄력을 유지해주는 동물 결합조직의 불용성 탄성섬유단백질인 엘라스틴(elastin)을 분해하는 유일한 분해효소로 알려져 있다(Wiedow, O., Schroder, J. M., E. J. Biol. Chem., 265(5), p14791, 1990). 엘라스타제는 연령이 증가하거나 자외선 등의 외부피부자극에 의해 과잉생성 된다. 과잉 생성된 엘라스타제가 엘라스틴을 과도하게 분해하여 콜라겐 간 결합이 약화되고 피부에 주름이 생성된다. 특히 40대 이후에서 엘라스타제의 작용에 의해 피부의 탄력이 급격히 감소하게 되는데 이는 엘라스타제의 작용이 나이가 들어감에 따라 활발해져 엘라스틴 섬유가 일부 소멸되거나 응집현상이 나타나고, 콜라겐섬유가 감소하기 때문이다. 이러한 엘라스타제의 활성을 억제함으로써 피부 노화 및 피부의 주름생성을 억제할 수가 있다(Imokawa, G. (2001) The role of elastase secreted by fibroblasts in wrinkle formation; implication through selective inhibition of elastase activity. Photochem. Acd Phptobiol. 74:283-287; Bissett, D. L.,Photochem. Photobiol., 46, pp367-378, 1987 ; Bizot-Foulon V., Godeat G., W. Int. J. Cos. Sci., 17,pp255-264, 1995).

미백 성분으로서, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 있다. 이들은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써, 피부 미백을 실현하거나, 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능하다고 알려져 있다. 그러나 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적인 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

생체 외부로부터 유입되거나, 생체 내에서 발생하는 활성산소는 생체의 노화를 촉진시키거나, 암발생의 원인이 되기도 한다. 따라서 활성산소에 의한 산화를 억제하는 항산화 물질에 대한 연구가 진행되며, 항산화 물질은 페놀성 화합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C, 셀레늄 등이 알려져 있다. 그러나 천연에 존재하는 항산화 물질은 피부 적용할 때 실질적으로 충분한 효과를 기대할 수 없는 실정이다. 반면, 항산화력이 뛰어나고 저가의 합성 항산화제는 인체 부작용 등 안전성에 대한 우려로 그 사용이 제한되는 문제점이 있다.

또한, 방부 기능성 소재의 경우 기존 화학방부제의 유해성으로 인해 천연방부제가 개발되고 있으나, 생산단가, 제형의 상관성, 위해성 및 독성에 의한 부작용 등의 사용상 한계가 있다.

따라서, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 미백, 주름개선, 항산화, 및 항균효과가 있는 물질보다 효과가 우수한 미백, 주름개선, 항산화, 및 항균효과를 지닌 성분의 개발이 절실히 요망되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명자는 토양에서 유래된 미생물들의 다양한 생리학적 활성을 연구하던 중 신규 미생물인 칼리디폰티박터 속 R161 균주가 매우 우수한 항균, 항산화, 피부미백 및 피부주름개선 효과를 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 92173P로 기탁된 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주의 배양물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 주름개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 수탁번호 KACC 92173P로 기탁된 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주의 배양물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 주름개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백 또는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 수탁번호 KACC 92173P로 기탁된 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주를 제공한다.

본 발명자들은 토양으로부터 다양한 미생물들을 분리하고, 이들 미생물을 대상으로 항균 활성, 항산화 활성, 피부미백 활성 및 피부주름개선 활성을 평가하던 중, 종래에 보고된 바 없는 신규 미생물이 매우 우수한 항균, 항산화, 피부미백 및 피부주름개선 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다.

상기 선별된 균주를 유전학적 측면에서 동정하는 16S rRNA partial sequencing을 통해 분석하여 칼리디폰티박터 속 미생물과 유전자 염기서열의 상동성이 매우 높은 것을 확인하였고, 이에, 새롭게 분리 동정된 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) 미생물을 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주로 명명하고, 이를 국립농업과학원 KACC에 2017년 5월 4일자로 수탁하여, 수탁번호 KACC 92173P를 부여받았다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 신규한 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주의 배양물은 (i) 병원균으로 구분되는 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 에 대하여 매우 우수한 항균활성을 나타내었고, 타이로시나제(tyrosinase) 및 엘라스타제(elastase)를 저해하는 활성 및 활성산소 제거능이 매우 뛰어난 것으로 확인이 되었다.

따라서, 본 발명에서 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 또는 이의 배양물은 항균, 항산화, 피부 미백 또는 피부주름개선 활성을 나타내는 것을 균학적 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주의 배양물을 제공한다.

본 발명에서 상기 배양물이란 본 발명의 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻어지는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함한다. 또한, 상기 균주의 배양에 의해 수득된 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozime)을 처리하여 수득된 세포 파쇄액, 상기 배양액을 틴달화(tyndalization)한 틴달화물도 및 상기 정의한 배양물들의 건조분말 또한 본 발명의 배양물에 포함이 될 수 있다.

본 발명은 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

상기 항균용이란 유해 세균의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 의미한다. 바람직하게는, 생체 내 소화기관에 존재하면서 소화기관과 관련된 여러 질환을 유발하는 유해 세균의 생육을 저해 또는 억제하는 활성을 의미하거나, 피부 표면의 세균 및 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 가짐으로써 각종 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도 및 항생제 내성 완화 용도로 사용될 수 있는 것을 의미하거나 또는 동식물을 포함한 생명체의 외부에 일상적으로 노출이 되는 균의 활성, 성장 또는 생육을 저해하는 활성을 의미한다.

본 발명의 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 또는 이의 배양물은 그람 음성균 또는 그람 양성균을 구분하지 않고 광범위한 항균활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 항균용 조성물은 Staphylococcus epidermidis 및 Propionibacterium acnes 에 대하여 항균활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 항균용 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 의약외품 또는 의약품의 형태로 제공이 될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물이 의약품의 형태일 경우에는, 본 발명의 미생물 또는 이의 배양물 뿐만 아니라, 병원성 미생물 또는 내성균에 대한 항균활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 항균용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭하며, 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 항균용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 화학식 1 또는 2의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 항균용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 병원성 세균 및 내성균에 대한 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 바람직하게 의약외품 조성물일 수 있다. 본 발명의 상기 항균용 조성물이 의약외품의 형태일 경우에는, 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항균용 조성물은 기능성 식품의 형태일 수도 있으며, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 미생물 및 이의 배양물 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명에서 상기 기능성 식품은, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.

본 발명의 상기 균주 또는 이의 배양물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 항균용 조성물이 사료 첨가제의 형태일 경우에는, 상기 조성물을 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 방법으로 활용이 될 수 있다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주의 배양물은 DPPH 활성산소 소거능이 매우 우수한 것으로 확인되었고, 타이로시나제(tyrosinase) 및 엘라스타제(elastase) 저해 활성이 매우 뛰어나 피부미백 및 주름개선 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.

본 발명에서 상기 식품 조성물은 전술한 바와 같다.

본 발명은 또한, 상기 상기 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때, 상기 피부외용연고는 본 발명의 약재 추출물 이외에, 바셀린, 폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트 등을 함유할 수 있으며, 유연화장수는 본 발명의 약재 추출물 이외에 다가알콜류 (프로필렌글리콜, 글리세린 등) 및 계면활성제 (폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌, 경화 피마자유 등) 등을 포함할 수 있다. 또한, 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 상기 미생물 또는 이의 배양물 이외에 오일류 (스쿠알렌, 바셀린, 옥틸도데칸올 등) 및 왁스 성분 (스테아릴알콜, 밀납 등)을 포함할 수 있으며, 에센스는 본 발명의 상기 미생물 또는 이의 배양물 이외에 글리세린, 프로필렌글리콜 등 다가 알콜류를 포함할 수 있다. 마사지 크림은 본 발명의 약재 추출물 이외에 유동 파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일을 포함할 수 있으며, 팩 또는 일반유화형 화장료는 본 발명의 상기 미생물 또는 이의 배양물 이외에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 포함된 워시-오프 (wash-off) 팩의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 각각의 제형에 상기 기재한 성분들 이외에도 일반 피부화장료에 배합되는 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 또는 향료 등을 필요에 따라 적절히 배합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 효과는 하기 실시예에 잘 나타나 있다.

토양으로부터 분리한 본 발명의 신규한 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 또는 이의 배양물은 항균, 항산화, 피부미백 및 피부주름개선 활성이 매우 뛰어나 항균 또는 피부미용 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 배양물의 항산화 효과를 DPPH 활성산소 소거능을 통해 평가한 결과이고,
도 2는 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 배양물의 미백효과를 타이로시나제(tyrosinase) 저해 활성을 통해 평가한 결과이고,
도 3은 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주 배양물의 주름개선효과를 엘라스타제(elastase) 저해 활성을 통해 평가한 결과이다.

이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

이하 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다.

<실험방법>

1. 실험물질

모든 용매들은 분석 등급을 이용하였다. SpectraMax 340PC384 마이크로플레이트 리더(Molecular device Co, Sunnyvale, California USA)를 효소 저해 평가에 이용하였다. 버섯 타이로시나제(tyrosinase), 돼지 췌장 엘라스타제(elastase), L-타이로신, 아스코르브산, 알부틴, N-Succ-(Ala)3-p-나이트로아닐라이드, DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 및 올레아놀릭산은 시그마-알드리치에서 구매하였다.

2. 박테리아 균주

Staphylococcus epidermidis KACC 13234T를 KACC에서 구매하였고, Propionibacterium acnes KCTC 3314T는 KCTC에서 구매하여 사용하였다.

3. 균주의 분리

대한민국 화성에 위치한 개간된 풀밭에서 토양 샘플을 채취한 뒤, 체로 걸러서 불필요한 물질들을 제거하였다. 트랜스웰 플레이트를 이용한 변형된 배양 방법을 본 발명에 적용하였다(Trends Biotechnol. 2012;30:475-484).

각각의 트랜스웰 플레이트에 3g의 토양 샘플을 분주한 이후에, 3 mL의 R2A 배지 (MB Cell) 및 HV (Humic acid-vitamin)(1 g L1 Na₂HPO₄, 1.71 g L1 KCl, 0.05 g L1 MgSO₄.7H₂O, 0.01 g L1 FeSO₄.7H₂O, 0.02 g L1 CaCO₃, 50 mg L1 cycloheximide, 1 mL VB 스탁솔루션 [VB 스탁솔루션: 50 mg 각각의 thiamine HCl, riboflavin, niacin, pyridoxine HCl, inositol, Capantothenate, b-aminobenzoic acid 및 0.25 mg 의 biotin in 100 mL DW (distilled water, molecular grade)]; pH 7.2) 배지를 각각의 트랜스웰에 분주하였다.

이후에, 100 μL의 토양 현탁액(9 mL의 DW에 담긴 1g의 토양 현탁액)을 각각의 트랜스웰에 분주하였다. 이후, 상기 트랜스웰을 28℃에서 2주 동안, 120 rpm의 쉐이킹 인큐베이터에서 배양하였다.

2주가 경과한 후, 상기 배양물을 순차적으로 희석 한 후, 상기 순차적으로 희석된 각각의 배양물 100 μL를 R2A 및 HV 아가플레이트에 각각 분주하였다. 순수한 콜로니가 얻어질 때까지, 콜로니를 R2A 플레이터에서 배양하였다. 그리고, 균주를 20%(v/v)의 글리세롤이 포함된 R2A 브로스에 현탁액으로서 -70℃에서 보관하였다.

방선균(actinomycetes)를 선택적으로 분리하기 위하여, 토양 현탁액을 6% 효모 추출물 및 0.05% SDS(sodium dodecyl sulfate)로 처리하고, 40에서 20분간 배양을 한 후, 물로 희석하였다. 그 다음으로 상기 현탁액을 20 mg mL^-1의 날리딕산(nalidixic acid)이 포함된 HV 아가에 분주하였다. 28에서 1주일 동안 배양을 한 후, 순수한 콜로니를 분리하기 위하여 콜로니를 배양하였고, -70℃에서 20%(v/v) 글리세롤에 보존하였다.

4. 항균활성 평가

Spotting method를 이용하여 P.acnes 및 S.epidermidis 에 대한 저해 활성을 평가하였다. P. acnes 배양액(100 L) 10⁸ CFU mL^-1(콜로니 형성 유닛)을 분주하고, 혐기성 조건, 35℃에서 2~3일간 스케들러 아가 플레이트에서 배양하고, 순차적으로 상기 토양에서 분리된 균주를 적용하였다. 이후, 성장이 저해된 저해영역을 측정하였다.

이와 유사하게, 100 μL의 S. epidermidis 배양액을 분주하고, 35℃에서 TSA 플레이트에 2일간 호기적으로 배양한 후, 저해영역을 측정하였다. 혼탁도 측정을 위하여, OD600에서 흡수도 0.5를 유지하였다.

5. 항균활성을 나타내는 균주의 동정

항균활성과 효소 저해활성을 나타낸 균주를 확인하기 위하여 추가적인 실험을 진행하였다. 균주를 확인하기 위하여 게노믹 DNA를 종래 보고된 방법에 따라 분리하였다. 16S rRNA 유전자를 27F (5’-(AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)-3’, 서열번호 1) 및 1492R (5’-(TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T)-3’, 서열번호 2) 프라이머를 이용하여 증폭하고(Appl Environ Microbiol. 2008;74:2461-2470), BigDye Terminator 사이클 시퀀싱 키트 v.3.1(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 Applied Biosystems 3770XL DNA 분석기로 상기 증폭된 유전자를 시퀀싱하였다.

거의 완벽한 시퀀스를 SeqMan software(DNASTAR Inc.,Madison, Wisconsin, USA)로 조합하였다. 16S rRNA 유전자는 Macrogen Korea에서 시퀀싱하였다.

가장 근접한 서열 유사성을 EzTaxon-e-database(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)을 이용하여 확인하였다. 상기 서열은 NCBI에 축적되어 있고, 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank/EMBL/DDBJ accession number를 획득하였다.

6. 균주 배양 및 배양물 분말의 제조

상기 분리된 균주를 트립티카제 28에서 5일간소이 브로스에서 180 rpm으로 배양하였다. 이후 5 mL의 시드 배양액을 100 mL의 항생제-생산 배지(1% sucrose, 1% soluble starch, 0.25% 효모 추출물, 0.05% K₂HPO₄, 0.001% FeSO₄.7H₂O, 0.05% MgSO₄.7H2O, 0.002% NaCl, pH 7.2)가 담긴 500 mL 플라스크에 옮겨 넣은 후, 28, 250 rpm에서 7일간 배양하였다.

상기 배양된 균주의 배양액을 17920g에서 20분간 원심분리하고, 상등액을 분리한 후 0.2-μm 시린지 필터로 걸렀다. 과량의 물은 회전증발기로 제거하고, 남아있는 5 mL의 배양액을 동결건조하여 분말화 하였다.

7. 타이로시나제 ( Tyrosinase ) 저해활성 평가 (미백 활성)

버섯 타이로시나제 저해 활성은 종래 보고된 방법에 따라 평가하였다. 상기 방법에 따라 동결건조된 균주의 배양물 분말을 DW(distilled water)에 3000, 1000, 500 및 100 μg mL^- ¹ 의 농도가 되도록 희석하였다.

반응시약은 0.1 mol L^-1 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 6.8), 3 mmol L^-1 L-타이로신 용액(in DW) 및 2000 U mL^- ¹ 의 버섯 타이로시나제를 96-웰 플레이트에 준비하였다. 총 150 μL (120 μL의 포스페이트 버퍼; 10 μL의 L-타이로신; 15 μL의 시험 용액 및 5 μL의 버섯 타이로시나제)의 실험 혼합액을 10분간 37℃에서 배양한 후, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 반응 혼합액에 포함된 시험물질(균주 배양물)의 최종 농도는 300, 100, 50 및 10 μg mL^- ¹ 이었다.

표준물질은 시험물질이 포함되지 않은 용액으로 준비하였고; 대조군(control)은 L-타이로신이 포함되지 않은 용액으로 준비하였고; 블랭크(blank)는 L-타이로신과 시험물질이 포함되지 않은 용액으로 준비하였다(표 1).

각각의 실험은 트리플리케이트로 진행하였으며, 타이로시나제 저해율(%)은 하기 식에 따라 계산하였다. 균주가 포함되지 않은 배지를 음성대조군으로 사용하였다.

(상기 식에서, ODexp: 시험물질의 흡광도, ODcon: 대조군의 흡광도, ODstd: 표준물질의 흡광도, ODbln: 블랭크의 흡광도)

8. 엘라스타제 ( Elastase ) 저해활성 평가 (주름개선 활성)

돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 활성을 종래 보고된 방법에 따라 평가하였다. 상기 방법에 따라 동결건조된 균주 배양물의 분말을 DW(distilled water)에 3000, 1000, 500 및 100 μg mL^- ¹ 의 농도가 되도록 희석하였다. 0.2 mol L^-1 Tris-HCl 버퍼(pH 8.0), 0.5 mmol L^-1 N-Succ-(Ala)3-p-니트로아닐라이드(SANA, 기질), 돼지 췌장 엘라스타제(3.5 U mL^-1) 및 배양물 분말이 포함된 반응 혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물을 37℃에서 20분간 배양한 후 400 nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 150 μL 의 실험 혼합액을 하기 표 2와 같이 준비하였다. 반응 혼합액에 포함된 시험물질(균주 배양물)의 최종 농도는 300, 100, 50 및 10 μg mL^- ¹ 이었다.

각각의 실험은 트리플리케이트로 진행하였으며, 엘라스타제 저해율(%)은 하기 식에 따라 계산하였다. 균주가 포함되지 않은 배지를 음성대조군으로 사용하였다.

(상기 식에서, A는 균주 발효물 분말이 포함되지 않은 것의 OD 400 nm값을 의미하며, B는 균주 발효물 분말이 포함된 것의 OD 400 nm값을 의미한다.)

9. 항산화 활성 평가( DPPH free radical scavenging assay)

균주 발효물의 항산화 활성은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)를 이용하여 종래 보고된 방법에 따라 평가하였다. 구체적으로, DW에 균주 발효물 분말을 600, 200, 100, 20 및 4 μg mL^-1의 농도로 희석하여 시험물질을 제조하였다. 반응 혼합물 180 μL는 90 μL의 0.1 mmol L^-1 DPPH 및 각각의 농도에 따른 시험물질 90 μL로 이루어졌다. 시험물질의 조성은 하기 표 3과 같다.

상기 표에 기재된 각각의 반응혼합물을 96-웰 플레이트에 분주한 후 혼합하였고, 30분간 37℃에서 배양한 후 516 nm에서 흡광도를 측정하였다. 균주가 포함되지 않은 배지를 음성대조군으로 사용하였다.

각각의 실험은 트리플리케이트로 진행하였으며, 항산화 활성은 하기 식에 따라 평가하였다:

<실험결과>

1. 항균활성을 나타내는 균주의 분리 및 동정

상기 실험방법에 따라 토양에서 분리된 균주 13종에 대하여, 병원균인 P.acnes 및 S.epidermidis 에 대한 저해 활성을 평가하였다. 상기 병원균 각각이 도말된 아가 플레이트에 토양에서 분리한 균주를 처리한 후, 병원균의 성장이 저해되는 저해영역의 지름(mm)을 평가하였다. 또한, 분리된 13종의 균주에 대하여 16S rRNA 염기서열을 분석한 후, Genbank Database 검색 결과, 가장 유사한 상동성을 나타내는 균주를 확인할 수 있었다.

상기 13종의 균주의 항균활성 및 이들 각각의 염기서열에 근거한 균주의 동정을 하기 표 4에 나타내었다.

이들 균주들 중에서, 상기 R161는 칼리디폰티박터 인디쿠스(Calidifontibacter indicus)와 98.54%의 서열 상동성을 나타내었고, 따라서, 상기 R161 균주를 칼리디폰티박터 sp.에 속하는 것으로 동정하였으며, “칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161”으로 명명하였다. 상기, 칼리디폰티박터 속 (Calidifontibacter sp.) R161은 2017년 5월 4일자로 국제기탁기관인 국립농업과학원에 기탁하였다(기탁번호: KACC 92173P).

상기 동정된 칼리디폰티박터 속 (Calidifontibacter sp.) R161 의 16s rDNA 서열을 서열번호 3으로 나타내었다.

이하에서는, 상기 칼리디폰티박터 속 R161의 다양한 생리학적 활성을 평가하였다.

2. 칼리디폰티박터 속 R161 배양물의 항산화 활성( DPPH 소거능 )

상술한 실험방법에 따라, 칼리디폰티박터 속 R161 배양물의 항산화 활성을 음성대조군인 배지성분과 비교하였다.

이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 칼리디폰티박터 속 R161의 배양물은 음성대조군으로 사용된 배지성분보다 매우 높고 농도의 증가에 따라 매우 우수한 항산화 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

3. 칼리디폰티박터 속 R161 배양물의 미백활성( 타이로시나제 저해능 )

상술한 실험방법에 따라, 칼리디폰티박터 속 R161 배양물의 미백활성을 음성대조군인 농도별로 비교하였다.

이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 칼리디폰티박터 속 R161의 배양물은 음성대조군으로 사용된 배지성분 보다는 매우 높고 농도에 따른 매우 우수한 미백 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

4. 칼리디폰티박터 속 R161 배양물의 주름 개선효과( 엘라스타제 저해능 )

상술한 실험방법에 따라, 칼리디폰티박터 속 R161 배양물의 주름 개선활성을 음성대조군인 배지성분과 비교하였다.

이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 칼리디폰티박터 속 R161의 배양물은 음성대조군으로 사용된 배지성분보다 매우 높고, 농도증가에 따른 매우 우수한 미백 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

기탁기관명 : 농업생명공학연구원

수탁번호 : KACC92173

수탁일자 : 20170504

<110> Kyonggi University Industry & Academia Cooperation Foundation <120> Novel Calidifontibacter sp. R161 having anti-bacterial, anti-oxidant, skin-whitening and anti-wrinkle effect <130> NP17-04046 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calidifontibacter sp. R161 16s rDNA <400> 3 cgctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgaacgat gaagctgcag 60 cttgctgtgg tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagtaacct gcccctcact 120 ctgggataag ccttggaaac gaggtctaat actggatatg actgcgcatc gcatggtgtg 180 tggtggaaag atttattggt gggggatgga ctcgcggcct atcagcttgt tggtgaggta 240 gtggctcacc aaggctttga cgggtagccg gcctgagagg gtgatcggcc acactgggac 300 tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa 360 agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gaaggccttc gggttgtaaa cctctttcac 420 cagggacgaa gcgcaagtga cggtacctgg agaagaagca ccggctaact acgtgccagc 480 agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagcttgt 540 aggcggtttg tcgcgtctgc tgtgaaagac cggggcttaa ctccggttct gcagtgggta 600 cgggcaggct agagtatggt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca 660 gatatcagga ggaacaccga tggcgaaggc aggtctctgg gccattactg acgctgagaa 720 gcgaaagcat ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgttgg 780 gcgctaggtg tgggactcat tccacgagtt ccgtgccgca gctaacgcat taagcgcccc 840 gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900 ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca 960 ccggaagcat gcagagatgt gtgtgccttt tggctggtgt acaggtggtg catggttgtc 1020 gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgttccat 1080 gttgccagca cgttatggtg gggactcatg ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg 1140 tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgtcttggg cttcacgcat gctacaatgg 1200 ccagtacaga gggctgcgat accgtgaggt ggagcgaatc ccttaaaact ggtctcagtt 1260 cggattgggg tctgcaactc gaccccatga agttggagtc gctagtaatc gcagatcagc 1320 agtgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcaagt cacgaaagtt 1380 ggtaacaccc gaagccggtg gcctaaccct tgtgggggga gccgtcgaag gtgggattgg 1440 cgattgggac taagtcgtaa cag 1463

Claims

수탁번호 KACC 92173P로 기탁된 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대한 항균효과, 항산화, 피부미백 또는 피부주름개선 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항의 칼리디폰티박터 속(Calidifontibacter sp.) R161 균주의 배양물.
제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 및 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대한 항균용 조성물.
제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름개선용 식품 조성물.
제1항의 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 또는 피부주름개선용 화장료 조성물.