JP6934682B2 - 細胞培養培地中に有効成分として、アルブミン、ヒアルロン酸またはコラーゲンを含む化粧品組成物 - Google Patents

細胞培養培地中に有効成分として、アルブミン、ヒアルロン酸またはコラーゲンを含む化粧品組成物 Download PDF

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    • C12N2533/80—Hyaluronan

Description

本発明は、細胞培養培地中、有効成分として、アルブミン、ヒアルロン酸、またはコラーゲンを含む組成物に関する。
また、本発明は、有効成分として上記組成物を含む化粧品組成物およびそれを用いた皮膚状態を改善するための方法に関する。
また、本発明は、有効成分として上記組成物含む、皮膚疾患の予防または治療用医薬組成物、およびこれを用いた皮膚疾患の予防または治療方法に関する。
アレルギー性疾患は、産業化と都市化の激化や環境汚染に起因する化学物質や生物学的な有害物質の摂取による食生活や住居生活の変化により、さまざまな年齢層で著しく増加している。無害な外部環境に対する人体の敏感な反応は、喘息または鼻炎などの呼吸器疾患、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患によって現れる。
具体的には、空気や食物などを介して外部のアレルゲンと直接接触することにより、皮膚が過敏な免疫反応を示す。このようなアレルギー性皮膚疾患は、食物、細菌、ダニ、気候および環境因子などの外部抗原への一貫した曝露から生じる炎症性疾患であり、さまざまな環境因子に対するアレルギー反応の発現は、各人の遺伝的特徴によって人によって異なる。
ここで、アレルギーとは、免疫不均衡に起因する過敏反応の一種であり、アレルゲンと呼ばれる特異的抗原に対する反応である。アレルギー反応は、L-ヒスチジンデカルボキシラーゼによるヒスチジンの脱カルボキシル化によって形成されたヒスタミンが顆粒形態で貯蔵されている肥満細胞または好塩基球にアレルゲンを結合させ、次いで、細胞を脱顆粒してヒスタミンおよびβ-ヘキソサミニダーゼを分泌させることによって開始される。
アレルギー性疾患の一種であるアトピー性皮膚炎は、幼児期または小児期に主に始まる慢性かつ再発性の皮膚疾患であり、その蔓延は世界中で増加している。アトピー性皮膚炎の原因はまだ明確にされていないが、環境要因、遺伝的素因、免疫化学反応、皮膚バリア異常などが、この疾患の主要な原因であると考えられている。それは、そう痒、乾燥肌、湿疹などの様々な症状を示す。皮膚病変および応答パターンの分布も、患者の年齢によって異なる。
現在、アトピー性皮膚炎の治療に広く使用されている薬物として、一般に、局所ステロイド、局所免疫調節薬、全身性ステロイド、全身性免疫抑制薬、抗ヒスタミン剤などが挙げられる。しかしながら、これらの薬物の投与や経口摂取によるさまざまな副作用のリスクがあり、安全であり、乾燥肌や皮膚バリア異常の改善効果を示す有効成分の開発が求められている。
したがって、本発明者らは、皮膚の状態を改善し、皮膚疾患を治療する物質の調査および開発に努め、特定の物質と混合した組成物が細胞の創傷治癒能力を高めることを見出した。
本発明の1つの目的によれば、細胞培養培地、および有効成分として、アルブミン、ヒアルロン酸およびコラーゲンのいずれか1つを含む化粧品組成物が提供される。
本発明の別の目的によれば、上記化粧品組成物を、それを必要とする対象の皮膚に塗布することを含む、皮膚状態を改善するための方法が提供される。
本発明のさらに別の目的によれば、細胞培養培地、および有効成分として、アルブミン、ヒアルロン酸およびコラーゲンのいずれか1つを含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらに別の目的によれば、上記医薬組成物を、それを必要とする対象の皮膚に塗布することを含む、皮膚疾患を予防または治療するための方法が提供される。
発明の有利な効果
細胞培養培地、および有効成分として、アルブミン、ヒアルロン酸およびコラーゲンのいずれか1つを含む化粧品組成物または医薬組成物は、細胞の回復能力を高め、したがって、外的損傷、皮膚疾患、または皮膚状態からの皮膚創傷を改善、予防または治療するための化粧品組成物または医薬組成物として効果的に使用することができ、新規な化粧品または治療剤として使用することができる。また、それは、現在使用されている皮膚軟膏や機能性化粧品に利用することができ、添加剤として容易に開発されうる。
ヒト皮膚線維芽細胞における、調製された細胞培養培地、およびアルブミンまたはI型コラーゲンを含む組成物を含む組成物の創傷治癒効果を示す。 ヒト皮膚線維芽細胞における、調製された細胞培養培地、およびアルブミンまたはI型コラーゲンを含む組成物を含む組成物の創傷治癒効果を定量したたグラフである。 ヒト皮膚線維芽細胞における、調製された細胞培養培地、およびアルブミン、ヒアルロン酸またはI型コラーゲンを含む組成物を含む組成物の創傷治癒効果を示す。 ヒト皮膚線維芽細胞における、調製された細胞培養培地、およびアルブミン、ヒアルロン酸またはI型コラーゲンを含む組成物を含む組成物の創傷治癒効果を定量したたグラフである。 細胞培養培地およびアルブミンの混合組成物のアトピー改善効果を示す。 細胞培養培地およびアルブミンの混合組成物のアトピー改善効果を示す。 細胞培養培地およびアルブミンの混合組成物の角膜再生効果を示す。
発明を実施するための最良の形態
1つの態様では、本発明は、細胞培養培地；およびアルブミン、ヒアルロン酸、およびコラーゲンからなる群から選択されるいずれか1つを含む組成物を提供する。
本明細書で用いる用語「細胞培養培地」は、インビトロでの細胞増殖および生存に必要な成分、または細胞増殖および生存を補佐する成分を含有する。さらに詳しくは、成分は、ビタミン、必須または非必須アミノ酸、および微量元素であってもよい。培地は、細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは動物細胞を培養するために使用される培地であってもよい。
細胞培養培地の既知の例として、DMEM/F-12(ダルベッコ改変イーグル培地/栄養素混合物 F-12)、DMEM、MEMα(最小必須培地α)、BME(イーグル基礎培地)、GMEM (グラスゴー最小必須培地)、RPMI-1640培地が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、本発明の細胞培養培地は、無血清である。無血清培地は、ヒトなどの動物由来の血清(たとえば、動物由来血清)を補足されていない培養培地を意味する。動物由来血清は、培養されるべき細胞の増殖のための万能栄養を提供するが、未確認の微量成分が含まれているため分析が難しく、再現性のある試験および製造プロセスを確立することが難しく、人体における安定性を保証することができないという問題がある。しかしながら、本発明による細胞培養培地は無血清培地であり、人体における安定性を保証し、再現可能な試験および製造プロセスの確立を可能にする。
さらに、細胞培養培地は、細胞を培養する前の細胞培養培地を意味する。それは、細胞を培養する前の培地であるため、細胞培養培地の組成に変化がなく、したがって、商業的に均質な品質で使用することができる。
本発明の細胞培養液は、アミノ酸成分、ビタミン成分、無機塩成分、その他の成分、および精製水から構成され、ここで：
a)アミノ酸成分は、グリシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-トレオニン、L-セリン、L-システイン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-プロリン、β-アラニン、γ-アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、ホモセリン、トリヨードチロシン、チロキシンおよびジオキシフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸、またはそれらの組み合わせであり、好ましくは、グリシン、L-アラニン、L-アルギニン、L-システイン、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-リジン、L-メチオニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニンおよびL-バリンからなる群から選択される少なくとも1つ、またはそれらの組み合わせである；
b)ビタミン成分は、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、塩化コリン、i-イノシトールおよびアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも1つ、またはそれらの組み合わせのビタミンであり、好ましくは、i-イノシトール、塩酸チアミン、ナイアシンアミドおよび塩酸ピリドキシンからなる群から選択される少なくとも1つ、またはそれらの組み合わせである；
c)無機塩成分は、塩化カルシウム(CaCl2)(無水)、硫酸銅五水和物(CuSO4-5H2O)、硫酸第二鉄七水和物(FeSO4-7H2O)、塩化マグネシウム(無水)、硫酸マグネシウム(MgSO4)(無水)、塩化カリウム(KCl)、塩化ナトリウム(NaCl)、リン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)、リン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH2PO4-H2O)、硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4-7H2O)、硝酸第2鉄九水和物(Fe(NO3)3・9H2O)、および重炭酸ナトリウム(NaHCO3)からなる群から選択される少なくとも1つの無機塩、またはそれらの組み合わせであり、好ましくは、塩化ナトリウム(NaCl)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、塩化カリウム(KCl)、塩化カルシウム(CaCl2)(無水)およびリン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH2PO4-H2O)からなる群から選択される少なくとも1つの無機塩またはそれらの組み合わせである；
d)その他の成分は、D-グルコース(デキストロース)、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンNa、チミジン、リノール酸、リポ酸、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシシチジンHCl、2'-デオキシグアノシン、またはそれらの組み合わせの少なくとも1つであり、好ましくは、ピルビン酸ナトリウムである；および
e)精製水は、上記のアミノ酸、ビタミン、無機塩およびその他の成分を溶解するために用いられ、少なくとも単回蒸留によって得られた水であってもよいし、あるいはフィルターを介する精製によって得られた水であってもよい。
本発明の1つの実施態様によれば、細胞培養培地が、グリシン、L-アラニン、L-アルギニン塩酸塩、L-システイン塩酸塩一水和物、L-グルタミン、L-ヒスチジン塩酸塩一水和物、L-リジン塩酸塩、L-メチオニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-バリン、i-イノシトール、塩酸チアミン、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、塩化ナトリウム(NaCl)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、塩化カリウム(KCl)、塩化カルシウム(CaCl2)(無水)、リン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH2PO4-H2O)、およびピルビン酸ナトリウムから構成されるのが好ましい。
アミノ酸成分は、タンパク質合成のための原料として細胞増殖に用いられる。アミノ酸成分は、細胞培養培地に含まれる1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、0.2〜1.2重量部のグリシン、0.08〜0.3重量部のL-アラニン、2〜7重量部のL-アルギニン塩酸塩、0.2〜0.9重量部のL-システイン塩酸塩一水和物、10〜18重量部のL-グルタミン、0.8〜2.0重量部のL-ヒスチジン塩酸塩一水和物、1.0〜5.0重量部のL-リジン塩酸塩、0.2〜1.2重量部のL-メチオニン、0.2〜1.2重量部のL-プロリン、1.0〜5.0重量部のL-トレオニン、および1.0〜5.0重量部のL-バリンを含むことができる。
本発明の細胞培養培地中のアミノ酸成分および含有量の1つの特定の例は、0.5〜1.0重量部のグリシン、0.10〜0.2重量部のL-アラニン、5.0〜6.0重量部のL-アルギニン塩酸塩、0.4〜0.7重量部のL-システイン塩酸塩一水和物、12〜15重量部のL-グルタミン、1.0〜1.5重量部のL-ヒスチジン塩酸塩一水和物、2.0〜4.0重量部のL-リジン塩酸塩、0.4〜0.8重量部のL-メチオニン、0.4〜0.8重量部のL-プロリン、1.5〜2.5重量部のL-トレオニンおよび1.5〜2.5重量部のL-バリンでありうる。上記の含有量および範囲にしたがってアミノ酸成分を含有することにより、細胞の増殖および維持を補助し、製剤の製剤安定性を改善することが可能である。
細胞培養培地において、ビタミン成分は、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、細胞活性を維持する役割を果たし、0.2〜0.9重量部のi-イノシトール、0.04〜0.8重量部の塩酸チアミン、0.04〜0.8重量部のナイアシンアミドおよび0.04〜0.8重量部の塩酸ピリドキシンを含むことができる。
本発明の細胞培養培地中のビタミン成分および含有量の1つの特定の例は、0.4〜0.7重量部のi-イノシトール、0.06〜0.2重量部の塩酸チアミン、0.06〜0.2重量部のナイアシンアミドおよび0.06〜0.2重量部の塩酸ピリドキシンでありうる。上記の含有量および範囲にしたがってビタミン成分を含有することにより、細胞活性の維持を補助することが可能である。
無機塩成分は、細胞機能の発現を制御する役割を果たし、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、50〜200重量部の塩化ナトリウム(NaCl)、50〜120重量部の炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、2.0〜20重量部の塩化カリウム(KCl)、1.0〜10重量部の塩化カルシウム(CaCl2)(無水)および0.5〜5.0重量部のリン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH2PO4-H2O)を含むことができる。
本発明の細胞培養培地中の無機塩成分および含有量の1つの特定の例は、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、100〜150重量部の塩化ナトリウム(NaCl)、80〜100重量部の炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、8〜15重量部の塩化カリウム(KCl)、2.0〜8.0重量部の塩化カルシウム(CaCl2)(無水)および1.0〜4.0重量部のリン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH2PO4-H2O)でありうる。
その他の成分は、細胞培養培地などのpHを維持する成分を含むことができ、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、0.5〜5.0重量部のピルビン酸ナトリウムを含みうる。
本発明の細胞培養培地中のその他の成分および含有量の1つの特定の例は、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、1.0〜4.0重量部のピルビン酸ナトリウムでありうる。上記の含有量および範囲にしたがってビタミン成分を含有することにより、pHの維持を補助し、それによって製剤の安定性を改善することが可能である。
本発明の組成物を構成するアルブミンは、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンであってもよい。
ヒト血清アルブミンは、ヒト血液中に見出される血清アルブミンであり、ヒト血漿中に存在する最も豊富なタンパク質である。本発明において、ヒト血清アルブミンは、具体的には組換えヒト血清アルブミンであってもよい。さらに、ウシ血清アルブミンは、ウシで見出される血清アルブミンであり、しばしば実験においてタンパク質濃度標準として使用される。さらに、ウシ血清アルブミンは、ウシで見出される血清アルブミンであり、しばしば実験においてタンパク質濃度標準として使用される。
アルブミンは、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/mlまたは1000μg/mlの濃度で含まれうる。あるいは、アルブミンは、10〜1000μg/ml、50〜500μg/ml、または100〜250μg/mlの濃度で含まれうる。
さらに、本発明の組成物を構成するヒアルロン酸は、親水性物質である動物などの皮膚に多量に存在し、動物などの皮膚に潤いを与える役割を果たす生合成天然物である。
ヒアルロン酸は、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/mlまたは10mg/mlの濃度で含まれうる。ヒアルロン酸は、0.01〜1mg/ml、0.05〜0.5mg/ml、or 0.01〜0.1mg/mlの濃度で含まれうる。
一方、本発明の組成物を構成するコラーゲンに関しては、I型コラーゲン〜IV型コラーゲンを用いることができ、特定の例では、I型コラーゲンおよびIII型コラーゲンを用いることができる。コラーゲンが、III型コラーゲンであるのが最も好ましい。
人体には、約20種類のコラーゲンが存在する。I型コラーゲンは、人体に見出される最も豊富なコラーゲンであり、皮膚、髪、爪、臓器、骨および靭帯の約80〜85％を構成する。III型コラーゲンは、人体において2番目に豊富なコラーゲンである。それは、皮膚、骨、軟骨、腱およびその他の結合組織の約10〜15％を構成し、胎盤コラーゲンとしても知られている。
コラーゲンは、組成物中に、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/mlまたは200μg/mlの濃度で含まれうる。コラーゲンは、1〜200μg/ml、2〜100μg/mlまたは10〜80μg/mlの濃度で含まれうる。
本明細書において、I型コラーゲンは、組成物中に、1〜100μg/ml、5〜50μg/ml、または10〜25μg/ml、好ましくは、10μg/mlの濃度で含まれうる。さらに、III型コラーゲンは、2〜200μg/ml、10〜120μg/ml、および20〜70μg/ml、好ましくは、20μg/mlの濃度で含まれうる。
本発明の1つの実施態様は、細胞培養培地およびアルブミンを含む組成物でありうる。それは、細胞培養培地およびヒアルロン酸を含む組成物でありうる。それは、また、細胞培養培地およびコラーゲンを含む組成物でありうる。
さらに、組成物は、細胞培養培地、アルブミンおよびコラーゲンを含む組成物でありうる。また、組成物は、細胞培養培地、細胞培養培地、アルブミンおよびヒアルロン酸を含む組成物でありうる。さらに、組成物は、細胞培養培地、コラーゲンおよびヒアルロン酸を含む組成物でありうる。
組成物は、また、細胞培養培地、アルブミン、コラーゲンおよびヒアルロン酸を含む組成物でありうる。
実験の結果として、各成分の単独治療と比較して、成分を混合して治療に用いた場合、ヒト皮膚線維芽細胞の再生能力がさらに向上することが判明した。また、本発明の1つの実施態様では、
細胞培養培地、アルブミンおよびI型コラーゲン、または細胞培養培地、アルブミン、III型コラーゲンおよびヒアルロン酸のすべてを含む組成物が、優れた皮膚改善効果を有することが知られている、細胞培養培地およびEGFを含む組成物と比較して、優れた創傷治癒効果を示すことが見出された(図2および図4参照)。
本発明は、また、上記組成を含む化粧品組成物を提供する。組成物は、皮膚状態の改善の効果を有する。「皮膚状態の改善」は、皮膚細胞の機能の低下または喪失から皮膚を保護する作用、または皮膚状態を改善する作用、または皮膚障害を予防もしくは治療する作用を意味し、しわの発生の阻害、皮膚の老化の阻害、皮膚の弾力性の改善、皮膚再生、損傷または創傷治癒、角膜再生、皮膚刺激緩和、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー、皮膚湿疹、にきび、乾癬、掻痒、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されうる。
本発明による化粧品組成物は、皮膚状態を改善するための化粧品組成物の製造に使用することができる。
化粧品組成物は、従来技術で製造された化粧品製剤に配合することができる。化粧品組成物は、たとえば、溶液、懸濁液、エマルジョン、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、パウダーファンデーション、エマルジョンファンデーション、ワックスファンデーション、スプレーなどに製剤されるが、本発明はこれに限定されるものではない。より具体的には、化粧品組成物は、ソフトローション、栄養ローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたは粉末に製剤することができる。
本発明の化粧品組成物の製剤がペースト、クリーム、ゲルである場合、それは、動物油、植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛、およびそれらの混合物からなる群から選択される担体成分を含みうる。
本発明の化粧品組成物の製剤が溶液または乳濁液である場合、溶媒、溶媒和物、乳化剤およびそれらの混合物からなる群から選択される担体成分を含みうる。その例として、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチルグリコール油、グリセリン脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステルおよびそれらの混合物が挙げられる。
本発明の化粧品組成物の製剤が懸濁液である場合、液体希釈剤(水、エタノールまたはプロピレングリコールなど)、懸濁液(エトキシル化イソステアリルアルコール 、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルなど)、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカントおよびそれらの混合物からなる群から選択される担体成分を含みうる。
本発明は、化粧品組成物を用いて皮膚状態を改善するための方法を提供する。
皮膚状態を改善するための方法は、本発明による化粧品組成物を、それを必要とする対象の皮膚に塗布することを含みうる。対象は、哺乳動物、具体的にはヒトでありうる。
組成物を皮膚に塗布する工程は、その形態に応じて、本発明の化粧品組成物を皮膚に直接塗布するか、または噴霧する工程を含んでもよい。本明細書では、使用者の年齢、性別、目的、症状の重症度等に応じて、化粧品組成物の塗布量および毎日の使用回数を適宜調整することができる。たとえば、適量の化粧品組成物を1日に1〜6回皮膚に塗布することができる。
本発明は、また、有効成分として本発明組成物を含む、皮膚疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、上述の化粧品組成物と同じ有効成分を有する。
皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー、皮膚湿疹、にきび、乾癬、掻痒、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されうる。
医薬組成物は、さらに、医薬的に許容される単体を含みうる。
担体は、本発明の医薬組成物の総量に基づいて、約1%〜約99.99重量%、好ましくは、約90%〜約99.99重量%の量で含まれうる。
本発明の医薬組成物は、皮膚に塗布することができる。
本発明の医薬組成物の製剤は、軟膏、液剤、クリーム剤、スプレー剤、パッチ剤などの皮膚外用剤の形態であってもよい。
本発明の医薬組成物の適切な用量は、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病態、食物、投与時間、投与経路、排出速度、応答性の感度などのさまざまな因子を考慮して決定され、したがって、上記投与量は、いずれの態様においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本発明は、上記医薬組成物を用いる、皮膚疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明は、また、皮膚疾患を予防または治療するための医薬品の製造における、該医薬組成物の使用を提供する。
皮膚疾患の予防または治療方法は、それを必要とする対象の皮膚に本発明の医薬組成物を塗布することを含みうる。医薬組成物が塗布されうる対象は、哺乳動物、特にヒトでありうる。
皮膚に組成物を塗布するステップは、本発明の化粧品組成物をその形態に応じて皮膚に直接塗布することまたはスプレーすることを含んでもよい。本明細書において、化粧品組成物の塗布量および毎日の使用回数は、使用者の年齢、性別、目的、症状の重症度などに応じて適宜調整することができる。たとえば、化粧品組成物の適切量を1日1回〜6回皮膚に塗布することができる。
発明の態様
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに説明することを意図している。
製造例１：細胞培養培地の調製
第1表に記載した各成分を超純水に十分に溶解させ、全成分が溶解したことを確認した後、0.2μmのフィルターで濾過した。第1表に列挙された成分のすべては、Sigma-Aldrich、USAから購入した。以下に列挙された22の成分を含む混合組成物である細胞培養培地を調製した(以下BGと称する)。
[第1表]
Figure 0006934682
実施例１〜９：細胞培養培地、およびアルブミン、コラーゲンまたはヒアルロン酸を含む組成物の調製
アルブミン、コラーゲンまたはヒアルロリン酸を、調製例１で調製したBGと、第2表に示す含有量にしたがって混合して、組成物を調製した。
[第2表]
Figure 0006934682
実施例１０〜１６：細胞培養培地、およびアルブミン、コラーゲンまたはヒアルロン酸を含む組成物の調製
MEMα (Sigma-Aldrich、USA)を、アルブミン、コラーゲンまたはヒアルロン酸と、第3表に示す含有量にしたがって混合して、組成物を調製した。
[第3表]
Figure 0006934682
実験例１：細胞の回復能力の評価
10％FBS(ウシ胎仔血清)および1％P/S(ペニシリン-ストレプトマイシン)を補充した細胞培養培地DMEM(1X)を用い、ヒト皮膚線維芽細胞株(Hs27)を37℃の恒温恒湿器で5％CO2を維持して培養した。ヒト皮膚線維芽細胞をインサートウェルあたり5.2×104細胞で培養した6ウェルプレートに、イビディカルチャーインサート(ibidi Culture-insert)を付着させた。上記条件下でヒト皮膚線維芽細胞を24時間培養した後、細胞を無血清DMEM(1X)培養液中で18時間再培養して、本実験まで無血清状態を維持した。次いで、イビディカルチャーインサートを除去した。
1.1．BG、およびアルブミンまたはI型コラーゲンを含む組成物中の細胞の回復能力の検証
調製した細胞培養液を、BG(対照群)、BGおよび100μg/mlのアルブミンの混合組成物(実施例1)、BGおよび10μg/mlのI型コラーゲンの混合組成物(実施例2)、または100μg/mlのアルブミンおよび10μg/mlのI型コラーゲンの混合組成物(実施例3)で処理した。
処理の9時間後に、細胞を顕微鏡で撮影し、損傷によって生じた隙間の距離をTScratchプログラムを用いて測定し、対照群と比較した。結果を図１および図２に示す。
図１および図２に示すように、BGおよびアルブミンまたはI型コラーゲンの少なくとも1つを含む組成物を用いて細胞を処理した場合、対照群に比べて、ヒト皮膚線維芽細胞の増殖および移動が増加することが見出された。
具体的には、BGを含む細胞培養液をアルブミンおよびI型コラーゲンの組み合わせで処理すると、アルブミンまたはI型コラーゲンで単独処理した細胞培養液と比較して、ヒト皮膚線維芽細胞の増殖および移動が増加し、混合処理が創傷治癒に有効であることがわかった。すなわち、BGを含む細胞培養液をアルブミンおよびI型コラーゲンの組み合わせで処理した場合、アルブミンまたはI型コラーゲンの単独処理に比べて、ヒト皮膚線維芽細胞の回復能力がさらに上昇することが判明した。
1.2．細胞培養培地、およびアルブミン、ヒアルロン酸、またはIII型コラーゲンを含む組成物中の細胞の回復能力の検証
調製した細胞培養溶液を、BG(対照群)、BGおよび100μg/mlのアルブミンの混合組成物(実施例1)、BGおよび0.1mg/mlのヒアルロン酸の混合組成物(実施例4)、BGおよび20μg/mlのIII型コラーゲンの混合組成物(実施例5)、またはBG、100μg/mlのアルブミン、0.1mg/mlのヒアルロン酸および20μg/mlのIII型コラーゲンの混合組成物(実施例9)で処理した。対照群において、BG、100μg/mlのアルブミン、0.1mg/mlのヒアルロン酸、または20μg/mlのIII型コラーゲンを単独で加えた。
処理の9時間後に、細胞を顕微鏡で撮影し、損傷によって生じた隙間の距離をTScratchプログラムを用いて測定し、実験例を比較した。結果を図３および図４に示す。
図３および図４に示すように、成分を混合した後にBG、アルブミン、ヒアルロン酸、およびIII型コラーゲンの組み合わせで細胞を処理した場合、BG、アルブミン、ヒアルロン酸、またはIII型コラーゲンの単独処理と比較して、ヒト皮膚線維芽細胞の増殖および移動が増加することが見出された。すなわち、細胞培養液をBG、アルブミン、ヒアルロン酸、およびIII型コラーゲンの組み合わせで処理した場合、BG、アルブミン、ヒアルロン酸、またはIII型コラーゲンの単独処理に比べて、ヒト皮膚線維芽細胞の回復能力がさらに上昇することが判明した。
1.3．MEMα、およびアルブミン、ヒアルロン酸またはIII型コラーゲンを含む組成物中の細胞の回復能力の検証
実験例1.2と同様の方法で実験を行い、実施例10〜16における細胞の回復能力を調べた。結果として、成分を混合した後にアルブミン、ヒアルロン酸、およびIII型コラーゲンの組み合わせで細胞培養培地を処理した場合、各成分での単独処理と比較して、細胞の回復能力が優れていることが判明した。さらに、上記の3つの物質のすべてを組み合わせて添加すると、最良の回復能力が観察された。
実験例２：細胞培養培地およびアルブミンを含む組成物のアトピー改善の検証
製造例１で調製した細胞培養培地およびアルブミン500μg/mlを含む組成物が、皮膚疾患の一種であるアトピーに有効であるかどうかを調べた。
6ヶ月齢の男児のアトピー患者の患部(頭部)に、細胞培養培地およびアルブミンを含む組成物を2日間、1日2回塗布した。塗布の結果を図５に示した。さらに、24歳の女性のアトピー患者の患部(頚部)に、細胞培養培地およびアルブミンを含む組成物を10日間、1日2回塗布した。結果を図６に示した。
図５および図６に示すように、6ヶ月齢の男児の頭部にアトピーによって誘発された創傷は、2日間の塗布後に有意に減少し、24歳の女性患者の首にアトピーによって誘発された創傷は、10日間の塗布後に有意に減少した。これは、細胞培養培地およびアルブミンを含む混合組成物がアトピーの改善に有効であることを意味する。
実験例３：細胞培養培地およびアルブミンを含む混合組成物の角膜再生効果の評価
製造例１で調製した細胞培養培地(BG)およびアルブミン100μg/mlを含む組成物が、角膜びらんに有効であるかどうかを調べた。
難治性角膜びらんを有する32歳の韓国人女性患者の角膜に、1日2回、2週間点眼するために、細胞培養培地およびアルブミンを含む組成物を用いた。結果を図７に示す。
図７に示すように、難治性角膜びらん患者の損傷した角膜が、2週間の点眼後に治癒したことが判明した。これは、細胞培養培地およびアルブミンを含む混合培養培地が角膜再生に有効であることを意味する。

Claims (19)

  1. 細胞培養培地；および
    アルブミン、ヒアルロン酸、およびコラーゲンからなる群から選択される少なくとも1つ；を含む組成物であって、
    細胞培養培地が、アミノ酸成分、ビタミン成分、無機塩成分およびその他の成分から構成され、
    アミノ酸成分が、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、0.2〜1.2重量部のグリシン、0.08〜0.3重量部のL-アラニン、2〜7重量部のL-アルギニン塩酸塩、0.2〜0.9重量部のL-システイン塩酸塩一水和物、10〜18重量部のL-グルタミン、0.8〜2.0重量部のL-ヒスチジン塩酸塩一水和物、1.0〜5.0重量部のL-リジン塩酸塩、0.2〜1.2重量部のL-メチオニン、0.2〜1.2重量部のL-プロリン、1.0〜5.0重量部のL-トレオニン、および1.0〜5.0重量部のL-バリンを含み、
    ビタミン成分が、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、0.2〜0.9重量部のi-イノシトール、0.04〜0.8重量部の塩酸チアミン、0.04〜0.8重量部のナイアシンアミドおよび0.04〜0.8重量部の塩酸ピリドキシンを含み、および、
    無機塩成分が、塩化ナトリウム(NaCl)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO 3 )、塩化カリウム(KCl)、塩化カルシウム(CaCl 2 )(無水)およびリン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH 2 PO 4 -H 2 O)を含む、組成物。
  2. 細胞培養培地が、動物細胞培養培地である、請求項１に記載の組成物。
  3. その他の成分が、ピルビン酸ナトリウムである、請求項１に記載の組成物。
  4. 細胞培養培地が、グリシン、L-アラニン、L-アルギニン塩酸塩、L-システイン塩酸塩一水和物、L-グルタミン、L-ヒスチジン塩酸塩一水和物、L-リジン塩酸塩、L-メチオニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-バリン、i-イノシトール、塩酸チアミン、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、塩化ナトリウム(NaCl)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、塩化カリウム(KCl)、塩化カルシウム(CaCl2)(無水)、リン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH2PO4-H2O)、およびピルビン酸ナトリウムから構成される、請求項１に記載の組成物。
  5. 無機塩成分が、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、50〜200重量部の塩化ナトリウム(NaCl)、50〜120重量部の炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、2.0〜20重量部の塩化カリウム(KCl)、1.0〜10重量部の塩化カルシウム(CaCl2)(無水)および0.5〜5.0重量部のリン酸二水素ナトリウム一水和物(NaH2PO4-H2O)を含む、請求項１に記載の組成物。
  6. その他の成分が、1重量部のアミノ酸セリンに基づいて、0.5〜5.0重量部のピルビン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 細胞培養培地が、無血清培地である、請求項１に記載の組成物。
  8. アルブミンが、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである、請求項１に記載の組成物。
  9. アルブミンが、10〜1000μg/mlの濃度で含まれる、請求項１に記載の組成物。
  10. ヒアルロン酸が、0.01〜1mg/mlの濃度で含まれる、請求項１に記載の組成物。
  11. コラーゲンが、I型コラーゲンまたはIII型コラーゲンである、請求項１に記載の組成物。
  12. I型コラーゲンが、1〜100μg/mlの濃度で含まれる、請求項１１に記載の組成物。
  13. III型コラーゲンが、2〜200μg/mlの濃度で含まれる、請求項１１に記載の組成物。
  14. 有効成分として、請求項１に記載の組成物を含む、皮膚状態を改善するための化粧品組成物。
  15. 皮膚細胞の機能の低下または喪失から皮膚を保護するか、または皮膚状態を改善する、請求項１４に記載の組成物であって、皮膚状態の改善が、しわの発生の阻害、皮膚の老化の阻害、皮膚の弾力性の改善、皮膚再生、損傷または創傷治癒、角膜再生、皮膚刺激緩和、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、組成物。
  16. 有効成分として、請求項１に記載の組成物を含む、皮膚疾患を予防または治療するための医薬組成物。
  17. 皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー、皮膚湿疹、にきび、乾癬、掻痒、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
  18. 皮膚状態を改善するための化粧品組成物の製造における、請求項１４に記載の化粧品組成物の使用。
  19. 皮膚疾患を予防または治療するための医薬品の製造における、請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
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