CN113817046A

CN113817046A - 一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备修复敷料上的应用

Info

Publication number: CN113817046A
Application number: CN202111141580.2A
Authority: CN
Inventors: 殷世清; 赵学彩; 张凤龙; 蔡永刚; 魏静; 孙晖; 李倩; 张甲庆; 李鑫
Original assignee: Shandong Hantide Yimei Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Hantide Yimei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2021-12-21

Abstract

本发明公开了一种重组胶原蛋白、重组胶原蛋白修复敷料及其制备方法。所述重组胶原蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，该蛋白纯度高、热稳定性好。所述重组胶原蛋白修复敷料是通过将重组胶原蛋白、不同分子量的透明质酸、辅以其他保湿剂、抗炎成分配比后，通过特殊工艺的湿热灭菌处理获得。本发明的重组胶原蛋白修复敷料，无菌、无防腐剂，通过“外防内补”为伤口提供持续的湿润环境促进伤口愈合、保护创面新生组织，重建皮肤屏障功能，即可用于非慢性创面及小创口的辅助治疗，亦可用于因皮肤微环境失调引起皮肤损伤的修复，且生产工艺简单，具有极大的应用推广价值。

Description

一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备修复敷料上的应用

技术领域

本发明属于生物医疗领域，具体涉及一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备修复敷料上的应用。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最多的结构蛋白，具有很强的生物活性及生物功能，为细胞生长提供依附和支撑，能诱导上皮细胞、纤维细胞等进行黏附、增殖和迁移，使结缔组织具有机械强度；同时，具有止血、生物相容性和生物降解性；还能改善细胞生长微环境，促进皮肤组织新陈代谢，修复皮肤屏障，能够引导机体组织再生。基于这些特征，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、保健、美容、矫形、硬组织修复、创面止血、药物传递、缓释技术等医药卫生领域有着广泛应用。目前，常见的胶原蛋白是从动物组织中利用酸、碱、酶解等方法提取而来，存在病毒隐患、应用于人体时会产生排异反应且分子量不确定等缺点和不足。本公司的前期研究成果很好的克服了这些缺陷，利用基因重组技术生产的重组人胶原蛋白，具有纯度高、安全性好、重现性好、质量稳定等优点。

透明质酸（HA）是线型直链状高分子黏多糖，由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位重复连接而成的天然高分子聚合物。分子量分布为1-3000000Da。高分子量HA长链分子间的交错连接使其具有致密的三维网状结构，其良好的成膜性能增强了皮肤的屏障功能，减少皮肤水分的流失及紫外线对表皮细胞的损伤，并对外界污染物进行有效隔离；中分子量HA的长久保湿性，提供了良好的肤感；小分子量HA透皮吸收后，能够深层锁水，促进细胞的修复。此外，透明质酸具有良好的生物可吸收性，生物相容性，粘弹性，因此被广泛应用于医学、美容领域。人类皮肤含有大量的透明质酸，因此皮肤的成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，透明质酸可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老。

皮肤是人体最大的免疫屏障，阻止微生物及有害物质的入侵，能够维持人体内环境的稳定，对身体健康起着关键作用，而伤口会对人体皮肤的完整性及连续性造成破坏。研究表明，伤口表皮细胞的迁移速度在湿润的愈合环境下较暴露的创面环境快，而无菌修复敷料可以为皮肤的修复提供湿润环境，调节PH及油脂平衡，重建皮肤微环境，为小创口或非慢性伤口的修复提供辅助治疗及护理，亦可用于因皮肤微环境失调引起的干燥、脱屑、红血丝、红斑、痤疮等皮肤损伤的修复。

申请号为202011567101.9 的中国发明专利申请公开了一种含有重组胶原蛋白的医用敷料及其制备方法，具体包括基材及修复原液，修复原液中透明质酸分子量单一、保湿效果差，该发明的使用范围仅针对面部肌肤问题，适用范围窄。

申请号为202010045488.5的中国发明专利申请公开了一种医用重组胶原蛋白喷雾及其制备方法，具体由重组胶原蛋白、透明质酸（单一分子量）、氯化钠、甘油、及缓冲液、防腐剂混合而成，产品以喷雾形式呈现，用于面部肌肤问题。该发明中对羟基苯甲酸酯（防腐剂）的使用为导致肌肤过敏的根源，安全性低。

申请号为201810153395.7的中国发明专利申请公开了一种重组胶原蛋白水凝胶创伤敷料及其制备方法和应用，具体由重组胶原蛋白、氯化钠、增稠剂和去离子水复合，经灭菌制备而成的凝胶敷料，主要用于创面的治疗。该发明未使用明显保湿成分，不能给伤口提供长久的湿润环境，不利于伤口的愈合，且肤感欠佳。

上述专利中公开的重组胶原蛋白修复敷料都存在一定的不足，透明质酸分子量单一，保湿效果差；产品无法兼顾无菌、无防腐；产品形式单一、适用范围窄、应用价值低等。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，第一是提供一种重组胶原蛋白，第二是提供一种含有重组胶原蛋白的修复敷料及其无菌制备方法。

本发明提供的重组胶原蛋白，该重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1：

KREAEAGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG

本专利提供了设计长度为328氨基酸的人胶原蛋白（SEQ ID NO:1），并根据毕赤酵母密码子的偏好性设计相应核苷酸序列（SEQ ID NO:2），将该序列插入毕赤酵母的pPIC9K-COL表达载体，通过电转化法将该表达载体转化毕赤酵母宿主菌GS115，并通过抗生素筛选获得高拷贝菌株。最后经过高密度发酵、分离、纯化获得高纯度的重组人源胶原蛋白原料。本发明的重组胶原蛋白热稳定性好，纯度高，能够满足本发明专利的无菌工艺要求。

本发明提供的编码上述重组胶原蛋白氨基酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸的DNA序列如SEQ ID NO:2所示：

AAAAGAGAGGCTGAAGCTGGAAAAGATGGTCCTCCTGGTCCTGCTGGTAATACTGGTGCTCCTGGTAGTCCTGGTGTCAGTGGTCCTAAGGGTGACGCTGGTCAACCTGGTGAAAAGGGTTCTCCAGGTGCTCAAGGTCCACCTGGTGCTCCAGGTCCTTTGGGTATTGCTGGTATTACTGGTGCTAGAGGTTTGGCTGGTCCACCTGGTATGCCAGGTCCTAGAGGTTCTCCAGGTCCTCAAGGTGTTAAGGGTGAATCTGGTAAACCAGGTGCTAACGGTTTGTCCGGAGAGAGAGGTCCACCTGGACCACAAGGTTTGCCAGGTTTGGCTGGTACTGCTGGTGAACCTGGTAGAGATGGTAACCCAGGTTCTGATGGTTTGCCTGGTAGAGATGGTTCTCCAGGTGGTAAAGGAGATAGAGGTGAAAATGGTTCTCCAGGTGCTCCTGGTGCTCCAGGTCATCCTGGTCCACCTGGACCAGTTGGTCCTGCTGGTAAATCCGGAGATAGAGGTGAATCTGGTCCAGCTGGTCCTGCTGGTGCTCCAGGTCCTGCTGGTTCTAGAGGTGCTCCAGGTCCTCAAGGTCCAAGAGGAGATAAGGGTGAAACTGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGTATTAAAGGTCACAGAGGTTTTCCAGGTAACCCTGGTGCTCCAGGTTCTCCAGGTCCTGCTGGTCAACAAGGTGCTATTGGTTCTCCAGGACCAGCTGGTCCTAGAGGTCCAGTTGGTCCTTCTGGTCCACCTGGTAAAGATGGTACTTCTGGTCATCCAGGTCCTATTGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTAATAGAGGTGAAAGAGGTTCTGAGGGTTCTCCAGGTCACCCTGGTCAACCAGGTCCACCTGGTCCACCTGGAGCCCCAGGTCCTTGTTGTGGTGGTGTTGGTGCTGCAGCTATCGCAGGTATCGGAGGAGAGAAAGCAGGAGGTTTTGCCCCTTATTACGGTTAG

进一步的，利用本发明提供的胶原蛋白，本发明提供一种含有重组胶原蛋白的修复敷料及其无菌制备方法，工艺方案如下：

（1）称取一定比例的大、中、小分子量的透明质酸，于30℃～60℃去离子水中，搅拌混匀，充分溶涨。

（2）称取一定量的烟酰胺、甘油加入步骤（1），搅拌溶解。

（3）称取一定量的重组胶原蛋白，加入步骤（2），定容，获得修复敷料原液。

（4）向敷料原液中加入一定量的核黄素，调节敷料原液呈淡黄色。

（5）将步骤（4）获得的敷料原液进行过滤，除去可见异物，进行分装。

（6）将分装后的敷料液进行湿液灭菌，获得无菌的重组胶原蛋白修复敷料。

上述步骤（1）中，大分子透明质酸为分子量大于1500000Da;中分子量为500000Da～1500000Da；小分子量为100000Da～500000Da，透明质酸含量为0.5%～0.75%，其中大、中、小比例为(1-3):1:1。

上述步骤（2）中，烟酰胺含量为1%～3%，甘油含量为2%～5%。

上述步骤（3）中，所述胶原蛋白为微生物发酵技术获得的重组人胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白、重组类胶原蛋白，分子量为30～150kDa，含量为0.01%～0.5%。

上述步骤（4）中，核黄素的含量为0.5µg/mL～1.0µg/mL。

上述步骤（5）中，过滤采用直径10µm聚丙烯或聚醚砜滤膜除去可见异物，分装形式可以为液体敷料、喷雾、面膜敷料。

上述步骤（6）中，湿热灭菌条件为118℃、16min或者121℃、8min。

与现有技术相比，本发明创新点如下：

1、本发明采用的原料中，透明质酸采用大、中、小不同分子量的配比，小分子量HA通过表皮细胞的吸收对其进行补水、锁水，大分子量HA的良好的成膜性增强了皮肤的屏障功能，防止水分蒸发的同时减少细胞毒素产生，避免炎症损伤，达到“内补外防”，为伤口提供湿润环境，促进伤口修复。

2、重组人胶原蛋白改善细胞生长微环境，促进皮肤组织新陈代谢，修复皮肤屏障，能够引导机体组织再生，促进伤口愈合。本发明应用的重组胶原蛋白热稳定性好，为湿热灭菌工艺的开发提供了可能，实现了重组胶原蛋白敷料的无菌、无防腐剂工艺，产品更安全。

3、本发明的重组胶原蛋白修复敷料为伤口提供持续的湿润环境促进伤口痊愈，同时保护创面新生组织，重建皮肤屏障功能，即可用于非慢性创面及小创口的辅助治疗，亦可用于因皮肤微环境失调引起的干燥、脱屑、红血丝、红斑、痤疮等皮肤损伤的修复，具有极大的应用价值。

附图说明

图1为各实施例的重组胶原蛋白修复敷料产品实物图。

图2为实施例1中重组胶原蛋白对细胞的增殖作用。

图3为实施例3中受试人员使用重组胶原蛋白修复敷料前和使用后2周面部红血丝变化图。

具体实施方式

实施例1

（1）称取大分子量HA 0.45g、中分子量HA 0.15g、小分子量HA 0.15g于60℃去离子水中，搅拌混匀，充分溶涨。

（2）称取烟酰胺3.0g、甘油2.0g加入步骤（1），搅拌溶解。

（3）称取重组胶原蛋白0.5g，加入步骤（2），定容至100g，获得修复敷料原液。

（4）向敷料原液中加入50µg的核黄素，调节敷料原液呈淡黄色。

（5）将步骤（4）获得的敷料原液采用10µm聚丙烯滤膜进行过滤，除去可见异物，分装于7mL的西林瓶中，每瓶分装5mL，封口、压盖。

（6）将分装后的敷料液进行118℃、16min高压灭菌，获得无菌的重组胶原蛋白修复敷料，为小创口或非慢性伤口的修复提供辅助治疗及护理。

具体的产品见图1。

实施例2

（1）称取大分子量HA 0.167g、中分子量HA 0. 167g、小分子量HA 0.167g于50℃去离子水中，搅拌混匀，充分溶涨。

（2）称取烟酰胺1.0g、甘油3.0g加入步骤（1），搅拌溶解。

（3）称取重组胶原蛋白0.15g，加入步骤（2），定容至100g，获得修复敷料原液。

（4）向敷料原液中加入75µg的核黄素，调节敷料原液呈淡黄色。

（5）将步骤（4）获得的敷料原液采用10µm聚丙烯滤膜进行过滤，除去可见异物，分装于30mL的西林瓶中，每瓶分装25mL，封口、压盖。

（6）将分装后的敷料液进行121℃、8min高压灭菌，获得无菌的重组胶原蛋白修复敷料，配备喷雾头，做为面部肌肤问题使用。

实施例3

（1）称取大分子量HA 0.3g、中分子量HA 0.1g、小分子量HA 0.1g于40℃去离子水中，搅拌混匀，充分溶涨。

（2）称取烟酰胺2.0g、甘油5.0g加入步骤（1），搅拌溶解。

（3）称取重组胶原蛋白0.3g，加入步骤（2），定容至100g，获得修复敷料原液。

（4）向敷料原液中加入100µg的核黄素，调节敷料原液呈淡黄色。

（5）将步骤（4）获得的敷料原液采用10µm聚醚砜滤膜进行过滤，除去可见异物，分装于30mL装有无纺布的西林瓶中，每瓶分装20mL，封口、压盖。

（6）将分装后的敷料液进行118℃、16min高压灭菌，获得无菌的重组胶原蛋白修复敷料，作为面部肌肤问题使用。

实施例4

为了测试本发明的修复敷料的效果，发明人对实施例1、实施例3获得的重组胶原蛋白修复敷料进行了性能测试，具体测试如下。

1、细胞增殖实验

将实施例1制备的重组胶原蛋白修复敷料按照医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验GB/T 16886.5-2017，采用MTT法进行细胞增殖实验，培养成纤维细胞L929，48小时后检测敷料对成纤维细胞的增殖作用。实验组细胞增殖明显，增值率为70%，具体见附图1和2。

2、将实施例3制备的产品用于面部红血丝患者，第一周每天一贴，每次敷15-20分钟，第二周两天一贴，每次敷15-20分钟。两周后，患者红血丝症状明显缓解，具体见附图3。

序列表

<110> 山东汉肽医美生物科技有限公司

<120> 一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备修复敷料上的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> 人胶原蛋白(collagen protein)

<400> 1

Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

1 5 10 15

Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys Gly Asp

20 25 30

Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro

35 40 45

Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala Arg Gly

50 55 60

Leu Ala Gly Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro

65 70 75 80

Gln Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly Leu Ser

85 90 95

Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu

115 120 125

Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn

130 135 140

Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly

145 150 155 160

Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro

165 170 175

Ala Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro

180 185 190

Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly

195 200 205

Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala

210 215 220

Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro

225 230 235 240

Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly

245 250 255

Lys Asp Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro

260 265 270

Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro

275 280 285

Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys

290 295 300

Gly Gly Val Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu Lys Ala

305 310 315 320

Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly

325

<210> 3

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaagagagg ctgaagctgg aaaagatggt cctcctggtc ctgctggtaa tactggtgct 60

cctggtagtc ctggtgtcag tggtcctaag ggtgacgctg gtcaacctgg tgaaaagggt 120

tctccaggtg ctcaaggtcc acctggtgct ccaggtcctt tgggtattgc tggtattact 180

ggtgctagag gtttggctgg tccacctggt atgccaggtc ctagaggttc tccaggtcct 240

caaggtgtta agggtgaatc tggtaaacca ggtgctaacg gtttgtccgg agagagaggt 300

ccacctggac cacaaggttt gccaggtttg gctggtactg ctggtgaacc tggtagagat 360

ggtaacccag gttctgatgg tttgcctggt agagatggtt ctccaggtgg taaaggagat 420

agaggtgaaa atggttctcc aggtgctcct ggtgctccag gtcatcctgg tccacctgga 480

ccagttggtc ctgctggtaa atccggagat agaggtgaat ctggtccagc tggtcctgct 540

ggtgctccag gtcctgctgg ttctagaggt gctccaggtc ctcaaggtcc aagaggagat 600

aagggtgaaa ctggagagag aggtgctgct ggtattaaag gtcacagagg ttttccaggt 660

aaccctggtg ctccaggttc tccaggtcct gctggtcaac aaggtgctat tggttctcca 720

ggaccagctg gtcctagagg tccagttggt ccttctggtc cacctggtaa agatggtact 780

tctggtcatc caggtcctat tggtccacct ggtccaagag gtaatagagg tgaaagaggt 840

tctgagggtt ctccaggtca ccctggtcaa ccaggtccac ctggtccacc tggagcccca 900

ggtccttgtt gtggtggtgt tggtgctgca gctatcgcag gtatcggagg agagaaagca 960

ggaggttttg ccccttatta cggttag 987

Claims

1. 一种重组胶原蛋白，其特征在于，该重组胶原蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1所述的重组胶原蛋白在制备修复敷料上的应用。

4.重组胶原蛋白修复敷料的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）称取一定比例的大、中、小分子量的透明质酸，于30℃～60℃去离子水中，搅拌混匀，充分溶涨；

（2）称取一定量的烟酰胺、甘油加入步骤（1），搅拌溶解；

（3）称取一定量的权利要求1所述的重组胶原蛋白，加入步骤（2），定容，获得修复敷料原液；

（4）向敷料原液中加入一定量的核黄素，调节敷料原液呈淡黄色；

（5）将步骤（4）获得的敷料原液进行过滤，除去可见异物，进行分装；

5.根据权利要求4所述的重组胶原蛋白修复敷料的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，大分子透明质酸为分子量大于1500000Da；中分子量为500000Da～1500000Da；小分子量为100000Da～500000Da，透明质酸含量为0.5%～0.75%，其中大、中、小比例为(1-3):1:1。

6.根据权利要求4所述的重组胶原蛋白修复敷料的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，烟酰胺含量为1%～3%，甘油含量为2%～5%。

7.根据权利要求4所述的重组胶原蛋白修复敷料的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，权利要求1所述的重组胶原蛋白分子量为30～150kDa，含量为0.01%～0.5%。

8.根据权利要求4所述的重组胶原蛋白修复敷料的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，核黄素的含量为0.5µg/mL～1.0µg/mL。

9.根据权利要求4所述的重组胶原蛋白修复敷料的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，湿热灭菌条件为118℃、16min或者121℃、8min。