KR102599822B1 - 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법 - Google Patents
소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 화학적 합성법을 사용하지 않고, 바이오 합성법으로 소수성 특성을 부여한 히알루론산에 나이아신아마이드를 결합한 복합체를 제공한다. 상기 복합체는 피부의 보습력을 향상시키고, 끈적임을 감소시켜 사용감을 개선할 수 있다. 또한, 나이아신아마이드의 피부 흡수율을 향상시킴으로 인하여 나이아신아마이드가 가지는 미백, 장벽강화 및 트러블 억제 효과를 극대화할 수 있다.
Description
본 발명은 소수성 특성을 가지는 히알루론산 및 나이아신아마이드가 결합된 복합체를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
인간의 피부는 크게 표피와 진피, 피하지방으로 나누어지고 다시 표피는 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 기저층으로 세분화되어 있다. 피부의 최외각층인 각질층은 죽은 케라틴세포 덩어리로 이루어져 있으며, 주로 단백질로 이루어져 있는 각질 세포로 구성되고, 각질 세포 간의 사이를 세라마이드, 콜레스테롤, 유리지방산 등의 지질이 채우고 있는 구조를 가진다. 이 지질층은 체내 수분이 증발되는 것을 방지하며, 외부 침입에 대해 신체를 보호하는 건강학적 기능과 동시에, 피부를 윤택하고 매끄럽게 보이게 하는 심미적 기능을 가지고 있다. 피부에 유효 기능성 물질을 자연스럽게 통과시키기 위해서는 소수성 혹은, 친수성과 소수성이 결합된 담체를 이용해야 하며 특히, 수용성 활성물질을 피부에 전달하기 위해 미셀(micelle) 혹은 리포좀(liposome)과 같은 형태의 담체를 이용하는 것이 일반적이다.
그러나, 이러한 미셀 혹은 리포좀의 형태는 피부의 지질층을 통과시켜 활성물질을 흡수시키기에는 한계가 있다. 피부의 최외각층인 각질층은 각질세포들로 쌓여있고, 그 사이사이는 지질성분으로 이루어진 구조이기 때문에 구조적으로 친수성의 물질보다는 소수성의 물질이 각질세포 사이로 투과하는 것이 용이하기 때문이다.
한편, 히알루론산은 N-아세틸-글루코사민과 글루쿠론산이 β-1,3-글루코시드 결합으로 결합된 반복적인 이당류 단위들로 이루어진 선형 다당류이다. 친수성이 높아 수분과 쉽게 결합하며, 보습작용이 뛰어나지만, 피부를 침투하는데에는 한계가 있다. 또한, 히알루론산은 관절, 눈 등 신체 내에서 윤활제로서 작용할 수 있고, 세포외 기질의 일부로서의 역할을 할 수 있으므로 다양한 활용을 위하여 용해 정도를 조절할 필요가 있다.
또한, 나이아신아마이드는 비타민 B3의 일종으로 피부미백, 트러블 억제, 장벽개선의 효과가 알려져 있으나, 수용성 비타민으로 피부에 침투 및 흡수시키기 어렵다는 단점이 있다.
종래에는 히알루론산에 소수성 특성을 부여하기 위하여 화학적인 합성 방법으로 소수성 관능기를 결합시켰다. 예를 들면 에스테르화 반응을 통하여 히알루론산에 카르복시기를 결합하며, 2,4,6-트리클로로벤조산(TCBA), 알코올 등의 유기화합물을 사용하였다.
본 발명에서는 유기화합물을 사용하지 않고 미생물을 이용하여 소수성 히알루론산을 제조하고, 나이아신아마이드를 소수성 히알루론산에 결합하여 피부 개선 효과를 극대화하고자 한다.
본 발명의 목적은 미생물을 이용하여 히알루론산에 소수성 특성을 부여하고, 여기에 나이아신아마이드를 결합한 복합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물을 활성화하는 종균배양 단계;
종균배양한 미생물을 발효하여 1차 발효물을 제조하는 1차 발효 단계;
상기 1차 발효물을 발효하여 2차 발효물을 제조하는 2차 발효 단계; 및
상기 2차 발효물로부터 최종 발효물을 제조하는 분리 및 정제 단계를 포함하고,
상기 1차 발효 단계의 배지가 히알루론산을 포함하고,
상기 2차 발효단계의 배지가 나이아신아마이드를 포함하는, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 분리하는 단계는 상기 2차 발효물의 pH를 1 내지 5로 조정하고, 1 내지 20시간 동안 정치하여 수층, 중간층 및 유층으로 각각 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 정제하는 단계는 상기 최종 발효물에 1 내지 10중량 배수로 80 내지 100%(w/w) 에탄올을 첨가하고 1 내지 10℃에서 1 내지 20시간 동안 정치하는 단계; 및 여과, 농축 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 정제하는 단계는 상기 최종 발효물을 물에 현탁하고, pH를 4 내지 8로 조정하는 단계; 및 여과 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3 및 MgSO4를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 1차 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, 히알루론산 및 식물성 오일을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물 5 내지 30g/L, 글리세린 10 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L 및 MgSO4 0.5 내지 5g/L를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 1차 발효 단계는 이스트 추출물 0.1 내지 10g/L, 글리세린 1 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, MgSO4 0.5 내지 5g/L, 히알루론산 0.01 내지 20g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L을 포함하는 배지에 상기 종균배양한 미생물을 0.1 내지 10g/L 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 2차 발효 단계는 1 내지 50%(w/w) 나이아신아마이드를 0.01 내지 20중량% 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 15 내지 30℃에서 100 내지 500rpm 및 0.5 내지 2vvm, 호기 조건으로 40 내지 100시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 1차 발효 단계 및 상기 2차 발효 단계는 각각 독립적으로 15 내지 30℃의 온도에서 50 내지 200rpm으로 혼합하고, 1 내지 10일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명은 화학적 합성법을 사용하지 않고, 바이오 합성법으로 소수성 특성을 부여한 히알루론산에 나이아신아마이드를 결합한 복합체를 제공한다. 상기 복합체는 피부의 보습력을 향상시키고, 끈적임을 감소시켜 사용감을 개선할 수 있다. 또한, 나이아신아마이드의 피부 흡수율을 향상시킴으로 인하여 나이아신아마이드가 가지는 미백, 장벽강화 및 트러블 억제 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체 분말의 사진이다.
도 2는 소수성 히알루론산의 FT-IR 그래프이다.
도 3은 나이아신아마이드의 FT-IR 그래프이다.
도 4는 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 FT-IR 그래프이다.
도 5는 발효오일의 FT-IR 그래프이다.
도 6은 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 UV 스펙트럼 그래프이다.
도 7은 1% 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체 용액의 사진이다.
도 2는 소수성 히알루론산의 FT-IR 그래프이다.
도 3은 나이아신아마이드의 FT-IR 그래프이다.
도 4는 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 FT-IR 그래프이다.
도 5는 발효오일의 FT-IR 그래프이다.
도 6은 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 UV 스펙트럼 그래프이다.
도 7은 1% 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체 용액의 사진이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
히알루론산은 체내에서 윤활제 등의 역할을 하며, 피부 보습에 사용되는 등 다양한 분야에서 잠재적 효과를 가진다.
그러나, 높은 친수성 특성에 의하여 그 활용도가 제한된다는 단점이 있다. 종래에는 이러한 단점을 극복하기 위하여 화학적인 합성법으로 히알루론산에 지용성 특성을 부여하기도 하며, 예를 들면 에스테르화 반응을 유도하는 등 화학적인 방법으로 지용성 특성을 가지는 히알루론산을 제조한다.
본 발명에서는 화학적인 합성법이 아닌, 합성 생물학을 기반한 바이오 합성법으로 소수성 히알루론산을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 소수성 히알루론산에 나이아신아마이드를 결합하여 나이아신아마이드가 가지는 피부 개선 효과를 극대화하고자 한다.
구체적으로 본 발명은,
Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물을 활성화하는 종균배양 단계;
종균배양한 미생물을 발효하여 1차 발효물을 제조하는 1차 발효 단계;
상기 1차 발효물을 발효하여 2차 발효물을 제조하는 2차 발효 단계; 및
상기 2차 발효물로부터 최종 발효물을 제조하는 분리 및 정제 단계를 포함하고,
상기 1차 발효 단계의 배지가 히알루론산을 포함하고,
상기 2차 발효단계의 배지가 나이아신아마이드를 포함하는, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 분리하는 단계는 상기 2차 발효물의 pH를 1 내지 5, 예를 들면 pH 1 내지 4, 예를 들면 pH 2 내지 3으로 조정하고, 1 내지 20시간, 예를 들면 3 내지 15시간, 예를 들면 12 내지 16시간, 예를 들면 6 내지 10시간 동안 정치하여 수층, 중간층 및 유층을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 수층은 미생물 및 배지를 포함하고, 중간층은 발효물을 포함하고, 유층은 발효오일을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 정제하는 단계는 상기 발효물에 1 내지 10중량 배수, 예를 들면 1 내지 5중량 배수, 예를 들면 1 내지 3중량 배수로 80 내지 100%(w/w), 예를 들면 93 내지 98(w/w) 에탄올을 첨가하고, 1 내지 10℃, 예를 들면 3 내지 6℃에서 1 내지 20시간, 예를 들면 10 내지 16시간, 예를 들면 3 내지 15시간, 예를 들면 6 내지 10시간 동안 정치하는 단계; 및
여과, 농축 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, 상기 정제하는 단계는 상기 발효물을 물에 현탁하고, pH를 4 내지 8, 예를 들면 pH 6 내지 7로 조정하는 단계; 및
여과 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 물은 증류수, 정제수, 초순수 등을 포함할 수 있으나, 상기한 기재에 특별히 한정되지는 않는다.
정제단계에 적용되는 여과 방법으로는 일반적인 것이라면 크게 제한되지는 않으나, 예를 들면 200 내지 400메쉬(mesh)로 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 농축 단계는 일반적인 에탄올의 제거 및 건조 방법이라면 크게 제한되지는 않으나, 예를 들면 감압농축법을 적용할 수 있다. 예를 들면, 에탄올은 메탄올(methanol), 아세토니트릴(acetonitrile)과 같이 극성도(polarity)가 5 내지 6인 물질 중 하나 이상으로 대체 또는 상기 물질 중 하나 이상을 추가하여 사용할 수 있으나, 세포에 무해한 것이 바람직하다.
건조단계는 예를 들면 동결건조법을 적용할 수 있으나, 통상적인 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3 및 MgSO4를 포함할 수 있다.
또한, 상기 1차 발효 단계 및 상기 2차 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, 히알루론산 및 식물성 오일을 포함할 수 있다.
구체적으로 예를 들면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물 5 내지 30g/L, 예를 들면 5 내지 20g/L, 예를 들면 5 내지 15g/L, 글리세린 10 내지 40g/L, 예를 들면 10 내지 30g/L, 예를 들면 15 내지 25g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, 예를 들면 15 내지 40g/L, 예를 들면 20 내지 30g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, 예를 들면 5 내지 10g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L 및 MgSO4 0.5 내지 5g/L, 예를 들면 1 내지 3g/L를 포함할 수 있다.
또한, 상기 1차 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물 0.1 내지 10g/L, 예를 들면 0.5 내지 3g/L, 예를 들면 0.5 내지 2g/L, 예를 들면 0.5 내지 1.5g/L, 글리세린 1 내지 40g/L, 예를 들면 10 내지 40g/L, 예를 들면 10 내지 30g/L, 예를 들면 15 내지 25g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, 예를 들면 15 내지 40g/L, 예를 들면 20 내지 30g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, 예를 들면 5 내지 10g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L, MgSO4 0.5 내지 5g/L, 예를 들면 1 내지 3g/L, 히알루론산 0.01 내지 20g/L, 예를 들면 0.5 내지 20g/L, 예를 들면 1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L, 예를 들면 100 내지 800g/L, 예를 들면 300 내지 700g/L를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 1차 발효 단계는 배지에 상기 종균배양한 미생물을 0.1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L, 예를 들면 2 내지 3g/L 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 히알루론산은 소듐히알루로네이트(sodium hyaluronate)를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 2차 발효 단계는 상기 1차 발효물에 1 내지 50%(w/w), 예를 들면 5 내지 30%(w/w), 예를 들면 5 내지 15%(w/w) 용액으로 제조된 나이아신아마이드를 0.01 내지 20중량%, 예를 들면 0.1 내지 10중량%, 예를 들면 0.5 내지 5중량% 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 15 내지 30℃, 예를 들면 23 내지 28℃에서 100 내지 500rpm, 예를 들면 200 내지 400rpm 및 0.5 내지 2vvm, 예를 들면 0.5 내지 1.5vvm, 호기 조건으로 40 내지 100시간, 예를 들면 50 내지 80시간, 예를 들면 50 내지 70시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 종균배양 단계는 균의 지수생장 종말점 시점에서 종료할 수 있다. 구체적으로 상기 지수생장 종말점은 40 내지 120시간일 수 있으며, 예를 들면 50 내지 100시간, 예를 들면 배양 후 60시간이 되는 시점에서 종균배양을 종료할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 배양 종료 후, 배양을 완료한 배양액을 10,000 내지 10,000g, 예를 들면 13,000 내지 18,000g 및 10분 내지 1시간, 예를 들면 20분 내지 40분 동안 원심분리하여 균체를 침전시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 균체 침전 후 예를 들면 인산 버퍼로 수 회세척하여 균체를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 1차 및 2차 발효 단계는 각각 독립적으로 15 내지 30℃, 예를 들면 18 내지 28℃의 온도에서 50 내지 200rpm, 예를 들면 80 내지 150rpm으로 혼합하고, 1 내지 10일, 예를 들면 1 내지 5일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 식물성 오일은 예를 들면, 해바라기씨, 포도씨, 카놀라, 쌀눈, 올리브, 대두, 아르간, 현미, 들깨, 참깨, 아몬드, 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도, 마카다미아, 코코넛, 로즈힙, 비타민나무씨, 시어나무열매, 기름야자, 베르가모트열매, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 피마자씨, 녹차씨, 메도우폼씨, 아마씨 및 햄프씨 등으로 이루어지는 군으로부터 추출된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 상기한 기재에 제한되지는 않으며, 식용 또는 인체 친화적인 오일이라면 본 발명의 범위에 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 방법에 따라 형성되는 소수성 히알루론산은 히알루론산에 지용성 물질이 결합된 형태로서 소수성 특정을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 소수성 히알루론산의 예측되는 구조는 화학식 1과 같다.
R은 식물성 오일로부터 유래할 수 있는 다양한 지방산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올레익애씨드, 리놀레익애씨드, 에이코네노익애씨드, 팔미틱애씨드, 스테아릭애씨드 등의 불포화 및 포화 지방산을 포함할 수 있다.
또한, R은 상기 지방산이 무작위로 구성된 모노글리세라이드 또는 다이글리세라이드일 수 있다.
또한, R은 상기 기재한 물질 외에 식물성 오일로부터 유래하는 지용성 물질일 수 있다.
상기 구조와 같이 지용성 물질이 결합된 소수성 히알루론산은 히알루론산의 분자량과 관계없이 소수성 특성이 향상될 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1: 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체 분말 제조
종균배양
균체를 수득하기 위하여 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원)을 이스트 추출물(yeast extract) 10 g/L, 글리세린(glycerin) 20 g/L, K2HPO4 25 g/L, KH2PO4 7 g/L, NH4NO3 3 g/L, MgSO4 2 g/L 및 증류수 933 g/L로 구성된 배지에 접종하여 25℃, 300rpm, 1NL/min(1vvm)의 호기적인 조건에서 배양을 진행하였다. 배양은 분광광도계(Epoch2, BioTek)로 600nm에서 흡광도를 측정하여 균의 지수생장 종말점인 60시간 시점에서 종료하였다. 배양액을 원심분리(16,000g, 30분)하여 균체를 침전시키고 인산 버퍼로 수 회 세척하여 균체를 수득하였다.
1차 발효
표 1과 같은 조성으로 구성된 각각의 배지를 5 L 발효조에 25℃, 100rpm 조건으로 혼합 제조하였다. 상기 배지의 온도가 25℃일 때, 상기 균체 2.5 g/L를 투입하고, 2일 동안 발효를 진행하여 1차 발효물을 제조하였다.
| 배지 성분 | 함량 |
| 이스트 추출물 | 1 g/L |
| 글리세린 | 20 g/L |
| K2HPO4 | 25 g/L |
| KH2PO4 | 7 g/L |
| NH4NO3 | 3 g/L |
| MgSO4 | 2 g/L |
| 소듐히알루로네이트 | 3 g/L |
| 증류수 | 442 g/L |
| 고올레인산해바라기씨 오일 | 500 g/L |
2차 발효
상기 1차 발효물에 나이아신아마이드를 투입한 후, 20℃에서 100rpm으로 2일 동안 발효를 진행하여 2차 발효물을 제조하였다.
나이아신아마이드는 10%(w/w) 용액으로 제조하여 멸균 여과한 것을 첨가하였으며, 최종 1중량%가 되도록 투입하였다.
분리
상기 2차 발효물에 1N HCl로 pH를 2 내지 3으로 조정하고, 발효물을 4℃에서 오버나잇(O/N) 정치하여 수층(미생물 및 배지)과 중간층(발효물) 및 유층(발효오일)을 분리하고, 수층과 유층을 제거하였다.
최종 발효물 정제
중간층의 발효물로부터 소수성 히알루론산-나이아신아마이드 복합체를 수득하기 위하여 2차 발효물을 10%(w/w)의 농도로 증류수에 현탁하였다. 그 후, 1N NaOH로 pH를 6 내지 7로 조정하고, 95%(w/w) 에탄올을 2중량 배수로 첨가하였다. 오버나잇(O/N) 냉장(4℃) 정치하고, 원심분리(5,000rpm/30분)하여 발효물을 침전시킨 후, 침전물을 300메쉬로 여과하여 정제수에 혼탁시켰다. 회전감압농축기(EV-1001V, SciLab)를 이용하여 에탄올을 모두 증발시키고, 3~5일간 동결건조하여 분말을 제조하였다. 수득한 분말의 사진은 도 1에 나타내었다.
실험예 1: FT-IR 분석
실시예 1의 화학적 구조를 분석하기 위해 FT-IR(fourier-transform infrared spectroscopy) 분석을 진행하였다.
고분해능 FT-IR 분광광도계(VERTEX80v, BRUKER)를 이용하여 400 내지 6000cm-1의 범위에서 소듐히알루로네이트, 나이아신아마이드 및 실시예 1의 구조를 분석하였으며, 그 결과를 도 2 내지 5에 나타내었다.
도 2 내지 5의 FT-IR 결과에 따르면, 실시예 1은 발효오일(유층)과 3,000 내지 3,600cm-1의 히드록실기 및 2,800 내지 3,000cm-1의 C-H 결합, 1,700 내지 1,800cm-1의 카보닐기 부근에서 유사한 패턴을 나타내었고 소듐히알루로네이트와 1,500 내지 1,700cm-1의 아마이드 결합 및 1,200 내지 1,500cm-1의 메틸기, 950 내지 1,200cm-1의 C-O-C 결합 부근에서 유사한 패턴을 나타내므로, 결과적으로 소듐히알루로네이트와 발효유화물의 결합체임을 확인할 수 있다.
실험예 2: UV 스펙트럼 분석
실시예 1을 10%(w/w)의 농도로 정제수에 용해하고 4중량 배수의 95%(w/w) 에탄올을 첨가하였다. 오버나잇(O/N) 냉장(4℃) 정치하고 원심분리 (5,000rpm/30분)하여 침전물을 회수한 후 2일 동안 건조하였다. 상기와 같은 정제 과정을 1회 더 반복하여 최종 에탄올 세척하여 분말 및 상등액을 수득하였다.
발효유화물에 접합되어 있는 나이아신아마이드를 확인하기 위해, 상기 분말을 0.1%(w/w) 농도로 정제수에 용해하고 정제수로 10배 희석하여 최종 0.01% 농도의 샘플을 제조하였다.
Spectrophotometer(EPOCH2, BioTek)로 200~400nm 파장의 범위에서 샘플의 흡광도를 측정하였다. Blank는 정제수로 하였고 표준물질로서 나이아신아마이드를 10ppm으로 정제수에 용해하였다. 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6의 UV 스펙트럼 결과에 따르면, 분말로부터 260nm 부근에 나이아신아마이드가 검출되었고, 에탄올 상등액에서는 나이아신아마이드가 검출되지 않았다.
따라서, 실시예 1은 발효유화물과 나이아신아마이드의 접합체 구조를 가지는 것으로 확인하였다.
실시예 2: 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체 용액 제조
아지믹서를 이용하여 정제수 87g, 1,3-부틸렌글라이콜 10g, 1,2-헥산다이올 2g으로 구성된 용해액에 실시예 1에 따른 분말 1g을 용해하여 1%(w/w) 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체 용액을 제조하였다. 제조된 용액의 사진을 도 7에 나타내었다.
실시예 3: 로션 제형 제조
표 2의 조성에 따라 소듐히알루로네이트 또는 실시예 1을 포함하는 로션 제형을 제조하였다. 하기 표 2의 1번 원료에 2 내지 5번 원료를 순차적으로 투입하고, 교반하여 70℃로 가열 및 혼합하였다. 그리고 6 내지 9번 원료를 별도의 용기에 넣고, 70℃로 가열하여 용해시킨 후 상기 1 내지 5번 원료 반응 용기에 투입하여 교반하였다. 그 후 10번 원료를 투입 및 교반하고, 다시 11 내지 12번을 혼합 후 원료를 투입 및 교반하여 30℃까지 냉각시켰다.
| 구분 | 원료 | % 중량 |
| 1 | 정제수 | 43.5 |
| 2 | 1% 카보머 | 30.00 |
| 3 | 부틸렌글라이콜 | 7.00 |
| 4 | 글리세린 | 5.00 |
| 5 | 1,2-헥산다이올 | 2.00 |
| 6 | 아라키딜알코올, 베헤닐알코올, 아라키딜글루코사이드 | 1.00 |
| 7 | 스테아릭애씨드 | 0.50 |
| 8 | 글리세릴스테아레이트 | 1.00 |
| 9 | MCT오일 | 5.00 |
| 10 | 실시예 2 | 3 |
| 11 | 정제수 | 2.00 |
| 12 | 트로메타민 | 0.30 |
| 합계 | 100.00 | |
상기와 같은 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르면 화학적인 합성법이 아닌, 미생물을 활용한 생물학적 합성법으로 히알루론산에 소수성 특성을 부여할 수 있다. 또한, 소수성 히알루론산에 나이아신아마이드를 안정적으로 결합한 복합체를 제공할 수 있다.
따라서, 바이오합성을 기반으로, 인체 독성이 없는 성분으로 피부 침투력 및 유화안정성을 향상시키고, 피부 보습, 탄력, 피부장벽 강화 및 트러블 억제 효능을 극대화할 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 또한, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (11)
- Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물을 활성화하는 종균배양 단계;
종균배양한 미생물을 발효하여 1차 발효물을 제조하는 1차 발효 단계;
상기 1차 발효물을 발효하여 2차 발효물을 제조하는 2차 발효 단계; 및
상기 2차 발효물로부터 최종 발효물을 제조하는 분리 및 정제 단계를 포함하고,
상기 1차 발효 단계의 배지가 히알루론산을 포함하고,
상기 2차 발효단계의 배지가 나이아신아마이드를 포함하는, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 분리하는 단계가 상기 2차 발효물의 pH를 1 내지 5로 조정하고, 1 내지 20시간 동안 정치하여 수층, 중간층 및 유층으로 각각 분리하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 정제하는 단계가 상기 최종 발효물에 1 내지 10중량 배수로 80 내지 100%(w/w) 에탄올을 첨가하고 1 내지 10℃에서 1 내지 20시간 동안 정치하는 단계; 및
여과, 농축 및 건조하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 정제하는 단계가 상기 최종 발효물을 물에 현탁하고, pH를 4 내지 8로 조정하는 단계; 및
여과 및 건조하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3 및 MgSO4를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 1차 발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, 히알루론산 및 식물성 오일을 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물 5 내지 30g/L, 글리세린 10 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L 및 MgSO4 0.5 내지 5g/L를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 1차 발효 단계가 이스트 추출물 0.1 내지 10g/L, 글리세린 1 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, MgSO4 0.5 내지 5g/L, 히알루론산 0.01 내지 20g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L을 포함하는 배지에 상기 종균배양한 미생물을 0.1 내지 10g/L 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 2차 발효 단계가 1차 발효물에 대하여, 1 내지 50%(w/w) 나이아신아마이드를 0.01 내지 20중량% 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 종균배양 단계가 15 내지 30℃에서 100 내지 500rpm 및 0.5 내지 2vvm, 호기 조건으로 40 내지 100시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 1차 발효 단계 및 상기 2차 발효 단계가 각각 독립적으로 15 내지 30℃의 온도에서 50 내지 200rpm으로 혼합하고, 1 내지 10일 동안 발효하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산 및 나이아신아마이드 복합체의 제조방법.
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