CN115820547B

CN115820547B - 细胞培养方法及含有该细胞提取物的化妆品或药物

Info

Publication number: CN115820547B
Application number: CN202211547162.8A
Authority: CN
Inventors: 王祖祥
Original assignee: Shanghai Shangshui Heji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Shangshui Heji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-12-05
Also published as: CN115820547A

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及细胞培养方法及含有该细胞提取物的化妆品或药物，本发明通过改进成纤维细胞的培养条件，提高了成纤维细胞的增殖速率并且刺激其合成更多的I型胶原蛋白，所收获的成纤维细胞提取物非常适用于受损皮肤及创面的修复。

Description

细胞培养方法及含有该细胞提取物的化妆品或药物

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域。更具体地，涉及细胞培养方法及含有该细胞提取物的化妆品及药物。

背景技术

人成纤维细胞可通过自分泌或旁分泌的方式分泌细胞生长因子、胶原蛋白、应激蛋白及其他胞外蛋白，这些细胞分泌的营养物质可协同作用于皮肤，刺激皮肤组织中透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白的再生，修复受损细胞，促进创面愈合。

已知来源于植物的化合物能够调控成纤维细胞的增殖及其生物因子的表达，例如芦荟来源的乙酰甘露多糖能够促进成纤维细胞的增殖，促进TGF-α、TGF-β1、EGF、IL-1β、IL-6及TNF的分泌，调控I型胶原蛋白的合成；苦瓜来源的苦瓜苷能够促进成纤维细胞的增殖，促进成纤维细胞分泌和表达I型胶原蛋白；一定浓度范围内的苦参碱能够抑制成纤维细胞的增殖和I型胶原蛋白的分泌。

油橄榄为木犀科植物，以木质素、黄酮类和裂环烯醚萜类在油橄榄中分布最为广泛，研究表明，油橄榄叶50％酒精提取物对超氧自由基、DPPH自由基的消除EC₅₀分别为0.080mg/mL和0.039mg/mL，显示其具有抗氧化的性质。但到目前为止，未见报道使用油橄榄提取物来促进成纤维细胞的增殖及影响其胶原蛋白的表达水平，并进一步研究上述细胞提取物用于皮肤或者创面的修复。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种促进成纤维细胞增殖的方法，促进成纤维细胞高合成胶原蛋白，并且提供了含有该成纤维细胞提取物的化妆品或药物。

为了解决上述技术问题，本发明人经过长期研究发现，部分木犀科植物的提取物，特别是有机溶剂提取物具有刺激成纤维细胞生长的作用从而完成了本发明。

本发明其中一个发明目的是提供一种促进成纤维细胞增殖的培养基，所述培养基在含血清或血清替代物的基础培养基中添加了：木犀科植物叶子的甲醇提取物。

所述“含血清的基础培养基”中血清的质量分数优选为5-10％，进一步优选为10％。

本发明中所述木犀科植物可包括油橄榄、桂花、石山桂、香花木犀、柊树及厚边木犀，研发发现包含这些植物某一部分(花、果实、叶子、根或茎)的提取物均表现出不同的刺激成纤维细胞增殖的作用。而在众多植物中以桂花的提取物表现的效果最佳，但油橄榄叶子部分的提取物对I型胶原的产生促进效果比较令人满意，而这些提取物中，又以有机溶剂(甲醇)提取的浓缩物表现出的效果最令人满意。

因此，作为成纤维细胞增殖促进剂，选择桂花甲醇提取物取得的效果是最理想的。

虽然油橄榄叶提取物对成纤维细胞的增殖促进效果不如桂花提取物，但是其作为I型胶原合成促进剂的效果是最理想的，当作为I型胶原合成促进剂时，在所述基础培养基中添加较低浓度的油橄榄叶甲醇提取物即能起到理想的促进合成的效果，具体地，所述油橄榄叶子甲醇提取物的质量约为0.001％至0.1％、约0.001％至0.08％、约0.001％至0.05％、约0.001％至0.01％、约0.001％至0.006％、约0.001％至0.005％、约0.001％至0.003％之间的任意值。

而本发明人通过进一步研究意外发现，油橄榄叶甲醇提取物与某些成分配合取得的效果是令人惊讶的，同时添加油橄榄叶甲醇提取物和这些物质后，对成纤维细胞促增殖效果显著提高，且仍然可观察到高的促进胶原蛋白表达的能力。具体地，这些物质优选为抗坏血酸衍生物，进一步地，所述抗坏血酸衍生物为3-O-乙基-抗坏血酸。

当与油橄榄叶甲醇提取物配合使用时，在所述基础培养基中，3-O-乙基-抗坏血酸的浓度约为5至25ppm、约5至20ppm、5至15ppm、5至10ppm之间的任意值。

本发明中所述“油橄榄叶甲醇提取物”的制备方法具体步骤为：取干燥的油橄榄叶，超微粉碎，得细粉；往细粉中加入其重量5-10倍量的甲醇，55℃下提取1-3次，每次0.5～1h，除去残渣，过滤，收集滤液，除去溶剂，即得。

进一步地，所述基础培养基为高糖DMEM培养基。

本发明另一发明目的在于提供一种成纤维细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：

a.成纤维细胞的获得；

b.采用含有所述培养基培养上述成纤维细胞，离心，收集培养上清；

c.将步骤b收集的培养上清过滤，浓缩，除菌，冻干，得成纤维细胞提取物。

进一步地，步骤a具体步骤为：采集皮肤组织样本，采用含有青霉素和链霉素的平衡盐缓冲溶液冲洗，剪碎；胶原蛋白酶消化获得成纤维细胞；采用含5％血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，每3天补加新鲜的细胞培养液，待细胞生长至80～90％融合度时，消化，获得成纤维细胞。

进一步地，步骤b具体步骤为：将步骤a获得的生长状态良好的成纤维细胞接种到采用含有油橄榄叶甲醇提取物和3-O-乙基-抗坏血酸的高糖DMEM培养基中培养，收集培养上清，浓缩，除菌，冻干，即得。

本发明另一发明目的在于提供所述方法制备得到的成纤维细胞提取物。

本发明另一发明目的在于提供所述的成纤维细胞提取物在制备皮肤或创面修复产品中的用途。本发明制备所得成纤维细胞提取物含有更高含量的胶原蛋白，对于皮肤或者创面的修复具有积极的作用。

上述“产品”可以是化妆品或者药物，当被制成化妆品时，优先被制成冻干粉的形式，除了添加本发明所述成纤维细胞提取物作为活性成分外，还可以添加或者不添加其余的活性成分。具体地，含有本发明所述成纤维细胞提取物的化妆品还可以包括化妆品领域常用的助剂。该化妆品对于改善皱纹、增加皮肤弹性具有明显的效用。

本发明另一发明目的在于提供一种皮肤修复组合物，所述组合物包含所述成纤维细胞提取物。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过对成纤维细胞培养基进行改进，具体是在含血清或血清替代物的基础培养基中添加了木犀科植物叶子的甲醇提取物，结果显示，添加上述甲醇提取物联合3-O-乙基-抗坏血酸干预培养后，对成纤维细胞的增殖及合成I型胶原蛋白具有明显的刺激作用。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

油橄榄叶甲醇提取物的制备：取干燥的油橄榄叶，超微粉碎成60目，得细粉；往细粉中加入其重量6倍量的甲醇，55℃下提取2次，每次0.5h，除去残渣，过滤，滤液旋转蒸发除去溶剂，冻干，即得。

油橄榄叶水提取物的制备：取干燥的油橄榄叶，超微粉碎成60目，得细粉；往细粉中加入其重量6倍量的去离子水，85℃下提取2次，每次0.5h，除去残渣，过滤，滤液旋转蒸除去溶剂，冻干，即得。

油橄榄叶氯仿提取物的制备：取干燥的油橄榄叶，超微粉碎成60目，得细粉；往细粉中加入其重量6倍量的氯仿，55℃下提取2次，每次0.5h，除去残渣，过滤，滤液旋转蒸除去溶剂，冻干，即得。

按照上述提取方法，采用桂花替代油橄榄叶分别得到桂花甲醇提取物、桂花水提取物和桂花氯仿提取物，保存，备用。

试验一：

1.1皮肤成纤维细胞获得：采集经检验检疫合格后的皮肤组织样本，采用含有1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的PBS缓冲溶液反复漂洗，去除皮下脂肪，将皮肤组织样本剪成1mm²左右的组织块；加入含有2mg/mLⅣ型胶原蛋白酶的DMEM培养基消化6-8h，PBS缓冲液冲洗，收集成纤维细胞；采用含5％血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，每3天补加新鲜的细胞培养液，待细胞生长至80～90％融合度时，加入1mL含有质量分数为0.25％胰酶和0.02％EDTA的D-Hank消化液消化，收集并鉴定，获得成纤维细胞。

1.2成纤维细胞的培养：将步骤1.1获得的生长状态良好的成纤维细胞以1×10⁴cell/cm²的密度接种到试验组CE0-CE6培养基培养48h，收集培养上清，浓缩，除菌，冻干，得成纤维细胞提取物。

1.3对成纤维细胞的增殖作用：收集步骤1.1获得的处于对数生长期的成纤维细胞，采用含10％FBS的高糖DMEM培养基重悬，血细胞计数板计数，调整细胞浓度为3×10⁴cell/mL，按100μL/孔接种到96孔板中，每组做6复孔，96孔板四周用无菌PBS缓冲液填充，在37℃、5％CO₂下培养24h；

24h后吸去细胞孔上清液，每孔重新加入100μLDMEM培养基继续培养24h，吸去上清液，每孔分别加入试验组CE0-CE6培养基培养7d，分别于培养第1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d时往样品孔加入5mg/mLMTT溶液20μL孵育4h，倒出孔板中的液体，每孔加入二甲基亚砜200μL，于37℃避光震摇15min，检测各组样品波长492nm处的光密度值(OD)，以630nm为参比波长，结果如表2所示。

1.4对I型胶原蛋白合成的刺激作用：使用ELISA试剂盒检测采用CE0-CE6培养基培养获得的成纤维细胞提取物中I型胶原蛋白的量，并与CE0检测得到的I型胶原蛋白的量作对比，计算I型胶原蛋白的变化率，结果如表3所示。

表1：

2.结果

2.1对成纤维细胞增殖作用：由表2可知，在DMEM培养基中加入桂花甲醇提取物对成纤维细胞的增殖刺激作用最强，其次是桂花氯仿提取物，油橄榄叶甲醇提取物刺激成纤维细胞的增殖作用不明显。

表2：对成纤维细胞增殖的刺激作用(培养第4d)

试验组编号	成纤维细胞相对增殖率％
		CE1	101.29％
CE2	99.36％
		CE3	100.03％
CE4	117.19％
		CE5	110.77％
CE6	113.44％

注：以CE0组的OD值为100％增殖率，相对增殖率％＝OD_CEn/OD_CE0*100％。

2.2对I型胶原蛋白合成的刺激作用：由下表3可知，在DMEM培养基中加入油橄榄叶甲醇提取物培养成纤维细胞48h后，培养上清中I型胶原蛋白的量增加了193.76％，对I型胶原蛋白合成的刺激作用最强，其次是油橄榄叶氯仿提取物，但两者存在一定差距。

表3：CE1～CE6培养上清相对于CE0中I型胶原蛋白的含量变化

试验组编号	I型胶原蛋白变化(％)
		CE1	+193.76％
CE2	+59.72％
		CE3	+135.24％
CE4	+124.39％
		CE5	+85.14％
CE6	+112.58％

注：变化率％＝[(CEn-CE0)/CE0]*100％。

试验二：

2.1按照试验一方法考察下表4所述培养基1#～5#对成纤维细胞增殖及对I型胶原蛋白合成的刺激作用，结果如表5～6所示。

表4：

2.2结果

表5：对成纤维细胞增殖的刺激作用(培养第4d)

试验组编号	成纤维细胞相对增殖率％
		2#	102.68％
3#	120.09％
		4#	103.37％
5#	116.29％

注：以1#组的OD值为100％增殖率，相对增殖率％＝OD_n#/OD_1#*100％。

表6：2#～5#组培养上清相对1#组I型胶原蛋白含量的变化

注：变化率％＝[(n#-1#)/1#]*100％。

由表5和表6可知，在促进成纤维细胞增殖及刺激I型胶原蛋白合成方面，只有油橄榄叶甲醇提取物与3-O-乙基-抗坏血酸产生了比较明显的增益效果，虽然桂花甲醇提取物单独干预培养后，成纤维细胞增殖较快，但是与3-O-乙基-抗坏血酸联合干预后差别不大，在刺激I型胶原蛋白方面亦是如此。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.促进成纤维细胞增殖的培养基，其特征在于，在含10%血清的DMEM培养基中添加了0.001~0.1%油橄榄叶甲醇提取物和5~25ppm3-O-乙基-抗坏血酸。

2.一种成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.成纤维细胞的获得；

b.采用根据权利要求1所述培养基培养上述成纤维细胞，离心，收集培养上清；

3.根据权利要求2所述方法制备得到的成纤维细胞提取物。

4.根据权利要求3所述的成纤维细胞提取物在制备皮肤或创面修复产品中的用途。

5.一种皮肤修复组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求3所述成纤维细胞提取物。