KR20180089872A

KR20180089872A - 유근피 또는 유백피 파우더를 유효성분으로 포함하는 창상 치료 및 피부 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20180089872A
Application number: KR1020180012974A
Authority: KR
Inventors: 김선여; 안미정; 신명철; 채재경; 무스타타브 와헤디 후세인; 슈베디 라리타; 김혜진; 박우성
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; 경상대학교산학협력단
Priority date: 2017-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2018-08-09
Also published as: KR102026409B1; WO2018143692A1

Abstract

본 발명은 유근피 또는 유백피 파우더를 세포주 및 동물 모델에서 각질세포의 형성을 촉진시키고, 표피 및 진피조직을 증식시키고, 진피의 콜라겐 합성을 증가시키고, 상처의 삼출물을 흡수할 수 있는 수분 흡수력에서 높은 효율을 보임으로써, 창상의 치료 및 피부재생에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유근피 또는 유백피 파우더를 유효성분으로 포함하는 창상 치료 및 피부 재생용 조성물{Pharmaceutical composition comprising root bark or cortex powder of elm tree for wound healing and skin regeneration}

본 발명은 유근피 또는 유백피 파우더 또는 이를 유효성분으로 포함하는 피부재생용 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체 전체 질량의 15 내지 20%를 차지하는 조직으로 유해한 물질의 체내 침투에 대해 방어벽을 제공하는 동시에 신체 내의 필수 화학물질과 영양소를 유지시키며 태양이 방출하는 자외선의 해로운 영향으로부터 보호하는 역할을 하게 된다. 피부는 표피(epidermis)층과 진피(dermis)층의 두 층이 주요 구성 요소를 차지하며 여기에 피하(hypodermis)층까지 합쳐 3개 층으로 크게 나눌 수 있다.

표피는 피부의 맨 바깥쪽 층으로 비교적 방수성이 있고, 내부 조직 및 장기를 각종 외상으로부터 보호하며, 물리적 및 면역학적 측면에서 박테리아, 바이러스, 기타 외부 물질이 신체에 침투하는 것을 방지하는 역할을 수행한다. 표피에서 대부분의 세포는 각질형성세포들로 표피의 가장 깊은 층에 있는 기저층에 위치한 세포에서 시작하여 새 각질형성세포의 생성과 함께 천천히 표피 표면으로 이동하고, 피부 표면에 도달하면 떨어져 나가게 된다.

진피는 피부를 유지하는 탄력 조직 및 섬유조직으로 이루어지며 각종 감각의 감지를 위한 신경말단, 온도 조절을 위한 땀샘, 피지선을 포함한 각종 분비선 및 체내의 온도조절을 위한 혈관 등의 다양한 구조물이 위치하고 있다. 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질 중 콜라겐은 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질로서 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아에 포함되는 대부분의 유기 물질을 형성하는데, 특히 피부의 진피에 대부분이 존재한다. 콜라겐의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분화의 유도 등이 있다. 따라서 콜라겐은 상처 치유에서도 중요한 역할을 담당하며, 손상된 상피에서 콜라겐의 합성을 촉진시키면 상처를 흉터 없이 신속하게 회복시킬 수 있다.

창상은 생체가 손상된 상태로서, 생체의 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄하는 개념이다. 창상은 피부의 해부학적 구조가 유지되는지의 여부에 따라 폐쇄창(closed wound)과 개방창(open wound)으로 크게 나뉠 수 있으나, 일반적으로는 개방창이 대표적 유형이다. 창상의 발생시 피부의 개방 상태가 지속될 경우 통증과 불편 외에도 합병증의 발생이 커지므로 개방된 부위가 원래의 피부와 유사한 조직으로 치유되도록 하는 것이 중요하다. 창상 치유 과정은 크게 염증기(inflammation), 육아기 (granulation), 상피화기(epithelialization) 및 섬유증식기(fibroplasia)의 4단계로 나뉜다. 염증기에서는 필요한 세포들(섬유모세포, 상피세포 등)을 활성화시킨다. 이어 육아기에서는 섬유아세포가 콜라겐을 증착(deposit)시키며, 이에 콜라겐이 증가하게 되고 창상이 성숙(mature)하게 된다. 또한 창상 부위의 각질세포(keratinocyte) 변화가 일어나게 되고, 결손부위 표피(epidermis)가 두꺼워지고 표피 아래의 기저세포로부터 표피까지 상피세포(epithelial cells)가 이동하게 되는 상태로 점차 나아가게 되는데 이를 상피화기라고 하며, 상피화기를 거쳐 섬유 증식기로 나아가 콜라겐 섬유 (collagen fibers)들이 콜라겐 기질(collageneous matrix)를 형성하여 창상 결손부위를 메우게 되고, 이것이 장기간 이루어지다 종료되면 치유가 되는 것이다. 따라서 상피세포의 증식과 콜라겐의 생성 또한 상처 치료의 중요한 기전 중 하나라고 할 수 있을 것이다.

이를 위해 개발된 약물은 대부분 육아증식(肉芽增殖)의 촉진작용을 통해 창상을 치료한다. 그러나 이들 약물은 열-화상의 초기 단계와 같은 진행기의 창상에 적용하면 오히려 증상을 악화시킬 수 있으며, 요오드를 함유하는 창상 치료약은 요오드에 대한 과민증이나 요오드의 세포독성에 의해 창상 치료가 지연되는 등의 단점이 보고되고 있어 신규한 창상 치료제의 개발이 요구되고 있다.

느릅나무(elm tree)는 느릅나무과(Ulmaceae)에 속하는 낙엽교목으로서, 우리나라에 자생하는 종은 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai), 당느릅나무(Ulmus davidiana Planch.), 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq.) 또는 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa Hance)등이 있으며, 이들을 통칭하여 느릅나무라고 한다. 우리나라에 자생하는 한 종인 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai)는 진주, 경기 및 함북지역 등 우리나라 전국의 계곡 부근에 자란다. 일반적으로 높이는 15~25 m, 지름은 50~70 cm이고 나무껍질에 암갈색으로 세로 균열이 있다. 잎은 호생(互生)하며, 타원형 또는 장타원형으로 길이 3~10 cm, 폭 2~6 cm이고, 끝이 뾰족하면서 가장자리에 겹톱니가 있으며 잎의 표면은 거칠고 미모가 있으며 평활하고 뒷면 맥 위에 털이 있다. 꽃은 가지의 상단에 황록색의 작은 꽃이 4~5월에 잎이 나기 전에 피며, 수술은 4개이고 암술은 1개로 꽃자루는 매우 짧다. 열매는 시과(翅果)로 길이 1.0~1.5 cm이고 5~6월에 성숙하며 날개가 있다. 당느릅나무(Ulmus davidiana Planch .)는 느릅나무와 동일한 종에 속하는 다른 변종으로 분류되는데, 당느릅나무는 열매 표면에 털이 빽빽이 나있는 반면에 느릅나무는 열매에 털이 없거나 선단에만 있어 구분이 가능하다.

일반적으로, 느릅나무는 항염증 및 항암 활성을 갖는다고 알려져 있으며, 느릅나무 뿌리껍질은 여러 가지 궤양성 질환에도 뛰어난 효과가 있다. 한방에서는 느릅나무의 수피를 유백피(楡白皮), 근피를 유근피(楡根皮)라고 부르며 치습(治濕) 및 이뇨(利尿) 등의 치료에 사용했다.

이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1379657호는 유근피 에탄올 추출물을 이용한 비만의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개시하고 있다.

이에 본 발명자들은 창상을 치료할 수 있는 물질을 연구하던 중, 유근피 또는 유백피 파우더가 삼출물을 흡수할 수 있는 수분 흡수력이 우수하고 표피 및 진피 세포를 증식시키며, 동물모델에서 추출물보다 파우더의 상처 재생효과가 더 우수하고, 상세하게는 유근피 또는 유백피 파우더 중에서도 미세말의 치료 효과가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1379657호

본 발명의 목적은 유근피 또는 유백피 파우더의 창상 치료 및 피부 재생 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유근피 또는 유백피의 파우더를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 유근피 또는 유백피의 파우더를 유효성분으로 포함하는 피부재생용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 유근피 또는 유백피의 파우더를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 유근피 또는 유백피 파우더는 세포주 및 동물 모델에서 표피 및 진피조직을 증식시켜 상처를 치료함으로써, 상기 유근피 또는 유백피의 파우더를 유효성분으로 포함하는 조성물은 창상의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 의한 유근피 파우더를 주사전자현미경으로 관찰한 결과이다(조말: 355~850 ㎛, 중말: 150~355 ㎛, 세말: 75~150 ㎛, 미세말: 75 ㎛ 이하).
도 2는 유근피 파우더의 입자 크기에 따른 수분 흡수력을 비교한 결과이다.
도 3은 각질형성세포주인 HaCat 세포주에 대한 유근피 및 유백피의 세포 독성 결과를 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 HaCat 세포주에 대한 유근피 및 유백피의 스크래치 분석(scratch assay) 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 진피섬유아세포주인 NHDF 세포주에 대한 유근피 및 유백피의 스크래치 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 동물모델에서 유근피 파우더와 추출물에 의한 상처치료 효과를 확인한 도이다(Ctrl: 대조군, 마데카솔: 양성대조군).
도 7은 동물모델에서 유근피 파우더와 추출물의 상처치료 효과를 비교하여 나타낸 그래프이다(Ctrl: 대조군, 마데카솔: 양성대조군).
도 8은 동물모델에서 유근피 및 유백피 파우더의 상처 치료 효과를 날짜별 로 나타낸 결과이다(Ctrl: 대조군, 마데카솔: 양성대조군).
도 9은 동물모델에서 2일차와 8일차의 시료별 상처치료효과를 나타낸 도이다.
도 10은 유근피 파우더에 의한 조직의 재생효과를 보여주는 결과를 나타낸 도이다(Ctrl: 대조군, NED: 양성대조군).
도 11는 유근피 파우더에 의한 콜라겐 합성 증가 효과를 나타낸 도이다(Ctrl: 대조군, NED: 양성대조군).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 느릅나무(elm tree)의 뿌리 (유근피) 또는 줄기(유백피)의 파우더(Powder)를 유효성분으로 포함하는 피부재생용 조성물을 제공한다.

상기 느릅나무는(elm tree)는 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai), 당느릅나무(Ulmus davidiana Planch.), 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq.) 또는 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa Hance)일 수 있다. 유근피 또는 유백피는 일반적으로 상기 느릅나무(elm tree)의 뿌리 또는 줄기로부터 유래한 것일 수 있다. 또한 상기 유근피 또는 유백피는 국내 약재 시장으로부터 구매한 것, 국내 계곡 및 산악 지역에 자연발생적으로 자생하는 것, 또는 재배자에 의해 관리되는 시설에서 재배되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 파우더는 기계적 분쇄, 동결건조 후 분쇄 또는 기류식 분쇄의 방법으로 수득된 것 일 수 있다. 구체적으로는 기계적 분쇄에 의한 것일 수 있다.

상기 분쇄된 파우더는 특정한 크기의 눈을 갖는 체(mesh), 원심분리장치, 대전입자의 포획 장치 또는 콜로이드상의 설비를 이용하여 크기별로 분류될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 파우더는 체를 사용하여 입자 크기별로 분류될 수 있다.

상기 분쇄된 파우더의 입자 크기는 10-850 ㎛ 인 것이 바람직하다. 구체적으로는 355 ㎛ 이하, 구체적으로 150 ㎛ 이하, 더욱 구체적으로 75 ㎛ 이하일 수 있다.

상기 파우더는 창상을 치료하는 것일 수 있다.

상기 창상은 자창, 절창, 열창, 좌창, 할창 및 찰창으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 파우더는 창상 부위의 각질세포의 형성을 촉진시킬 수 있고, 피부 진피 조직을 증식시킬 수 있다. 또한, 상기 파우더는 진피의 콜라겐 합성을 증가시킬 수 있다.

상기 파우더는 삼출물을 흡수하는 것일 수 있다.

상기 파우더는 피부 외용제 또는 화장료일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 유근피 및 유백피를 각각 분쇄하여 유근피 파우더 또는 유백피 파우더를 제조하여 크기별로 분류하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명자들은 유백피 파우더는 유백피 추출물과 비교하여 세포 독성의 유의한 차이가 없고, 유근피 파우더는 고농도에서 유근피 추출물보다 상대적으로 약한 세포 독성을 나타냄을 확인하였다 (도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 in vitro상에서 유근피 또는 유백피의 파우더가 세포 재생효과를 갖는 것으로 나타내며(도 4 및 5), 동물모델을 이용한 in vivo 실험에서 파우더와 추출물의 상처치료 효과 비교시 파우더의 상처 재생효과가 더 우수한 것을 확인하였고(도 6 및 7), 상세하게는 유근피 또는 유백피의 파우더 중에서도 미세말이 종래 창상 치료제와 동등 내지는 버금가는 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 8 내지 11). 또한, 상처부위의 삼출물을 흡수하는 능력과 관련되는 수분흡수력을 측정한 실험에서 4종의 유근피 파우더 모두 상품화된 폴리우레탄 소재 습윤 드레싱의 흡수력보다 월등히 높은 흡수력을 보였으며 특히, 중말과 세말이 조말과 미세말보다 우수한 흡수력을 가지고 있는 것을 확인하였다(도 2 참조). 따라서 유근피 또는 유백피 파우더는 창상 치료용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 상기 비경구용 제제는 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 직접 도포용 분말, 건조 부착 코팅, 에어로졸, 건조 에어로졸, 펌프 스프레이, 의료용 압박붕대, 필름, 코팅된 깁스붕대, 스펀지, 수술용 패치, 지혈 플리스(fleece), 거즈, 드레싱제, 연고(salve), 세미-젤, 젤, 거품, 반죽, 현탁액, 연고(ointment), 유제, 주조 가능한 형태, 코 마개(nasal plug), 외과적 붕대, 상처 패킹, 붕대, 탈지면, 카테터, 광섬유, 주사기, 페서리, 좌약, 액체 또는 비-수분성 액체상태의 현탁액 드레싱제에 포함된 제형 일 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 상기 조성물의 유효용량은 0.01 내지 300 mg/cm²이고, 바람직하게는 10 내지 50 mg/cm²이며, 하루 1 내지 4회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

본 발명에 따른 유근피 또는 유백피 파우더는 상기 서술한 바와 같다. 일례로, 상기 파우더의 입자 크기는 10-850 ㎛ 인 것이 바람직하다. 구체적으로는 355 ㎛ 이하, 구체적으로 150 ㎛ 이하, 더욱 구체적으로 75 ㎛ 이하일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이드, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 겔, 패취, 미용액, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 비누, 분무제의 제형에 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.

본 발명에 따른 유근피 또는 유백피 파우더는 상기 서술한 바와 같다. 일례로 상기 파우더의 입자 크기는 10-850 ㎛ 인 것이 바람직하다. 구체적으로는 355 ㎛ 이하, 구체적으로 150 ㎛ 이하, 더욱 구체적으로 75 ㎛ 이하일 수 있다.

본 발명의 피부외용제는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제는 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제 및 완충제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 부형제는 유당, 덱스트린, 전분, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 사카로스, 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 혼합물일 수 있다.

상기 피부외용제 조성물은 스킨 겔, 크림, 로션, 파우더, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 비누, 피부외용 연고. 비누, 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 에어로졸에 포함될 수 있으며, 이외에도 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 적절히 제조될 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

유근피 파우더의 입자 크기별 분류

경동시장에서 구입한 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai) 유래 유근피 1 kg을 기계식 그라인더를 이용하여 분쇄시켰다. 분쇄된 유근피 파우더를 20호, 50호, 100호 또는 200호의 체를 사용하여 조말(355-850 ㎛), 중말(150-355 ㎛), 세말(75-150 ㎛) 또는 미세말(75 ㎛ 이하)로 분리하였다.

< 실시예 1-1> 유근피 파우더의 형태 관찰

상기 유근피 파우더의 입자 크기별 형태를 비교하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 얻어진 파우더를 분류별로 각 1mg씩 칭량하여 양면테이프를 부착한 받침대에 고정한 뒤, 백금(Pt) 코팅을 한 후, 주사전자현미경(JSM-7601F, JEOL)을 이용하여 50배 배율로 관찰하였다.

그 결과 조말은 입자가 크고 가늘고 긴 나뭇가지 모양을 하고 있으며, 중말과 세말은 조말에 비해 크기가 작으면서 대체로 더 둥근 형태를 띄었다. 미세말의 경우, 입자의 크기가 매우 작으며, 입자의 크기와 모양이 균일하지 않은 것으로 나타났다.(도 1).

< 실시예 1-2> 유근피 파우더의 밀도 및 흐름성 분석

상기 유근피 파우더에 대해 파우더상 물질의 물리학적 특징 지표로 이용되는 밀도 및 흐름성을 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 얻어진 파우더를 조말은 0.5g, 중말, 세말 및 미세말은 2g씩 칭량하여 각각 10 mL 매스 실린더에 넣어 부피를 측정해 겉보기 밀도(bulk density)를 얻었으며, 100회 태핑을 한 후 다시 부피를 측정해 탭 밀도(tapped density)를 얻었다. 하기와 같이 이들 값을 통해 입자간의 마찰에 의한 유동성을 확인하는 Hausner's Ratio와 입자의 흐름성을 나타내는 Carr's Compressibilty Index의 지표값 들을 구하였다.

[계산식 1]

겉보기 밀도(Bulk density; BD) = 파우더 중량/태핑되지 않은 파우더의 부피

[계산식 2]

탭밀도(Tapped density; TD) = 파우더 중량/태핑된 파우더의 부피

[계산식 3]

Hausner's Ratio(HR) = 태핑되지 않은 파우더의 부피/태핑된 파우더의 부피

[계산식 4]

Carr's Compressibility Index(CI) = (TD-BD)x100)/TD

	BD (g/mL)	TD (g/mL)	HR	CI
조말	0.084±0.001	0.17±0.003	2.034±0.034	50.838±0.833
중말	0.263±0.000	0.395±0.005	1.500±0.017	33.333±0.760
세말	0.296±0.003	0.484±0.014	1.638±0.032	38.923±1.191
미세말	0.278±0.000	0.561±0.005	2.019±0.016	50.463±0.401

탭밀도는 입자의 크기가 얼마나 균질한 지에 대한 정보를 제공하는 지표로 이용될 수 있으며, 입자의 균질도는 파우더의 흐름성에 영향을 미치게 되는데 각 파우더의 CI를 기준으로 비교하였을 때, 중말>세말>미세말>조말의 순으로 입자가 균질한 것으로 확인되었다. 상기 파우더들 모두 CI값이 15%를 초과하여 입자 크기에 관계없이 유근피 파우더의 흐름성이 좋지 않음을 확인하였다. 파우더의 흐름성이 좋지 않으므로, 창상 부위에 용이하게 처리할 수 있다.

< 실시예 1-3> 유근피 파우더의 안식각 분석

파우더의 물성을 측정하는데 널리 이용되는 안식각 분석을 통해 실시예 1에 의해 얻어진 유근피 파우더들의 특성을 비교하였다.

구체적으로, 지면에서 30 cm 높이로 맞춘 유리깔대기를 이용하여 낙하시킨 파우더가 지면에 쌓여서 이루는 높이가 변하지 않을 때의 원뿔의 반지름(r)과 원뿔의 높이(h)를 측정하였다. 측정값을 θ=tan^-1(h/r)의 식에 대입하여 지면과 원뿔 사면이 이루는 각(안식각, θ)을 측정하였다.

분류	1회(θ)	2회(θ)	3회(θ)	평균(θ)
조말	58.0	56.5	57.2	57.2±0.8
중말	52.2	53.7	52.9	52.9±0.7
세말	53.3	50.2	52.2	51.9±1.6
미세말	48.5	50.2	50.7	49.8±1.1

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 모든 파우더들에서 안식각이 30°이상으로 관찰되어 파우더의 흐름성이 좋지 않음을 확인하였으며, 미세말의 안식각이 평균 49.8°로 가장 작았다. 파우더의 흐름성이 좋지 않으므로, 창상 부위에 용이하게 처리할 수 있다.

< 실시예 1-4> 유근피 파우더의 수분 흡수력 분석

파우더를 특징짓는데에 있어서 입자의 직경, 표면적, 충전성, 흐름성과 함께 중요한 특성중 하나로 이야기되는 수분 흡수력을 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1-2와 같이 각각의 파우더를 칭량하여 1.8 ml 에펜도르프 튜브에 파우더 및 증류수 1 ml을 넣어 실온에서 1시간 가량 혼합한 후, 원심분리기(Eppendorf-5417)에서 12000 rpm, 10 min으로 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 시료가 담겨 있는 튜브의 무게를 칭량하고 이를 혼합전 튜브와 시료의 무게와 비교하여 각 파우더에 흡수된 총 물의 무게를 계산하였다.

그 결과, 모든 파우더들에서 시료 무게의 약 20 - 70배에 가까운 물을 흡수할 수 있는 것으로 나타났으며, 중말(74.64 배) > 세말(71.73 배) > 조말(20.73 배) > 미세말(20.65 배)의 순으로 수분 흡수력을 가지는 것으로 확인되었다. 창상피복재로 널리 활용되고 있는 폴리우레탄 소재 습윤 드레싱의 흡수율이 10배 정도인 것과 비교하여 조말, 중말, 세말 및 미세말 모두 우수한 수준의 흡수율을 나타내었으며, 특히 중말과 세말이 수분 흡수력이 매우 뛰어남을 확인하였다 (도 2).

유백피 파우더의 입자 크기별 분류

경동시장에서 구입한 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai) 유래 유백피 1 kg을 기계식 그라인더를 이용하여 분쇄시켰다. 분쇄된 유백피 파우더를 20호, 50호, 100호 또는 200호의 체를 사용하여 조말(355-850 ㎛), 중말(150-355 ㎛), 세말(75-150 ㎛) 또는 미세말(75 ㎛ 이하)로 분류하였다.

유근피 또는 유백피 추출물의 제조

유근피 및 유백피 각각 200 g에 메탄올 500 ml를 가한 후 상온에서 60분간 3회 초음파추출하고 추출액의 감압여과물을 감압진공농축기로 농축하여 메탄올 추출물을 얻었으며, 이를 증류수에 희석하여 실험에 사용하였다.

< 실험예 1> 유근피 및 유백피 파우더의 세포독성 평가

인간 피부 각질형성세포주인 HaCaT(Human keratinocyte) 세포에서 유근피 및 유백피 파우더가 세포 독성을 나타내는지 조사하였다.

구체적으로, 실시예 1에 의해 얻어진 유근피 미세말 및 실시예 2에 의해 얻어진 유백피 미세말을 각각 DMSO에 녹였으며, 여과지로 필터링하여 실험에 사용하였다. HaCaT 세포는 4x10⁴ cells/ml로 96웰 플레이트에 분주하고, 24시간후에 추출물 및 미세말 시료를 각각 1, 10, 50 및 100 ㎍/ml의 농도로 처리한 후 CO₂ 배양기에서 24시간 추가 배양하였다. 24시간 후 배양액을 제거하고, PBS로 교환한 후 MTT 시약 0.5 mg/ml을 가하여 4시간 동안 CO₂ 배양기에서 반응시켰다. 반응시킨 MTT 시약을 버린 후 DMSO를 가하여 30분 동안 CO₂ 배양기에서 정치한 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 10 ㎍/ml 이하의 농도에서는 메탄올 추출물 및 미세말 모두 두드러진 세포 독성을 나타내지 않았으나, 100㎍/ml의 농도에서 유근피의 메탄올 추출물 처리시 세포 생존율이 크게 감소되는 반면에 유근피 미세말 처리군 또는 유백피 추출물/미세말 처리군은 상대적으로 세포 독성이 약하게 나타났다(도 3).

< 실험예 2> in vitro 각질 형성세포에서의 상처 재생 효과 분석

피부에서 표피층을 구성하는 각질 형성세포에 대한 유근피 및 유백피 파우더의 상처 재생 효과를 확인하기 위해 스크래치 분석(scratch assay)을 수행하였다.

구체적으로, HaCaT 세포주를 4×10⁴cells/ml로 96웰 플레이트에 분주하고, 24시간 후, Wound Maker(Essen Bioscience)를 이용해 500 ㎛ 폭의 스크래치를 형성시켰다. 스크래치가 형성된 플레이트를 PBS로 세척한 후, 유근피 및 유백피의 메탄올 추출물 및 미세말 시료를 각 10㎍/ml씩 처리한 후, IncuCyte®(Essen Bioscience)을 이용하여 세포이동에 의한 스크래치의 복원 효과를 관찰하였다.

그 결과, 대조군에 비해 모든 처리군의 스크래치 폭이 좁아진 것으로 나타나상처 재생 효과가 있는 것으로 확인되었으며, 특히, 유근피 미세말 처리시 가장 상처 재생 효과가 우수한 것으로 나타났다(도 4).

< 실험예 3> in vitro 진피 섬유아세포에서 상처 재생 효과 분석

피부에서 진피층을 구성하는 진피 섬유아세포에 대한 유근피 및 유백피 파우더의 상처 재생 효과를 확인하기 위해 스크래치 분석(scratch assay)을 수행하였였다.

구체적으로, 진피섬유아세포주인 NHDF(Normal Human Dermal Fibroblasts) 세포주를 실험예 2에 기재된 방법과 동일하게 재생된 세포의 밀집도(cell confluence)를 비교하여 상처 재생 효과를 관찰하였다.

그 결과, 유백피 메탄올 추출물 및 미세말 처리군에서 스크래치 후 재생된 곳의 세포 밀집도가 대조군에 비해 높은 것으로 확인되었다(도 5).

< 실험예 4> in vivo 동물 모델에서 유근피 및 유백피 파우더의 상처 재생 평가

동물 모델에서 유근피 파우더의 상처 재생 효과를 추출물과 비교 분석하였다.

구체적으로, 실시예 1-3에서 얻어진 안식각 측정 결과를 바탕으로 효과가 낮을 것으로 예상되는 조말을 제외한 유근피 파우더를 창상 동물모델에 다음과 같은 방법으로 처리하였다. 먼저, HR-1(알비노) 무모 마우스(중앙실험동물)를 23±3℃의 온도, 60±10%의 습도, 12시간 낮/12시간 밤으로 광주기를 조절하였고, 자유롭게 식이와 식수를 섭취하도록 하여 준비하였다. 1주일간 순응시킨 상기 마우스를 그룹당 3 마리씩 나누고, 피부밑근육층(panniculsus carnosus) 위의 피부를 지름 6 mm의 원형으로 제거하여 2개의 대칭된 상처를 만들었다. 상기 마우스의 상처에 중말, 세말, 미세말 또는 유근피 메탄올 추출물을 각각 12 mg씩 하루에 한 번씩 7일 동안 도포하였다. 이때, 양성대조군으로는 NED를 에탄올, 프로필렌글라이콜 및 물의 혼합용매(50:20:30, v/v)에 0.1%가 되도록 녹인 액상 제제를 동일한 횟수로 도포하고 1일 단위로 7일 동안 상처부위의 면적을 측정하여 상처 표면의 손상 정도를 확인하였다. 한편, 무처리 대조군은 별도의 처리를 하지 않고 방치하였다.

그 결과, 유근피 파우더 미세말을 처리한 경우가 양성대조군의 치료결과와 비교해 상처의 면적이 유사하거나 더 축소되었으며, 상처부위의 손상정도가 현저하게 감소하였다. 한편, 중말 또는 세말을 처리한 경우는 상처 면적이 감소되는 속도가 느렸다. 또한 메탄올 추출물을 처리한 경우는 상처부위의 면적이 감소하지 않았다. 또한 미세말 처리군은 개체별로 상처 치료 효과에 있어 개체별 차이가 적으며 일정한 수준의 치료효과를 보이는 것으로 나타났다(도 6 및 7).

따라서 상기로부터 유근피 파우더가 유근피 추출물보다 동물모델에서 뛰어난 상처치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

< 실험예 5> in vivo 동물 모델에서 유근피 및 유백피 파우더의 입자크기별 상처 재생 효과 비교

동물 모델에서 유근피 또는 유백피 파우더의 입자크기에 따른 상처 재생 효과를 분석하였다.

구체적으로, 실험예 4에서 얻어진 결과를 바탕으로 효과가 가장 낮았던 중말을 제외하고, 세말과 미세말에 대하여 실험하였다. 동물 모델로는 무모(hairless) 마우스 모델인 SKH-1의 5주령 수컷을 1주일간 순응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험기간 동안 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 12시간 낮/12시간 밤으로 광주기를 조절하였고, 온도와 습도 역시 당업계에 일반적인 마우스 사육 조건을 유지시켰다. 순응이 끝난 상기 마우스들을 이소플루란으로 마취시킨 후 등 쪽에 지름 6mm의 원형으로 상처를 형성시킨 후, 2, 4, 6 및 8일째에 유근피 및 유백피 파우더 시료를 창상 부위에 도포하였다. 창상 부위를 사진으로 촬영한 후, Image J(National Institutes of Health) 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 창상 형성 직후의 면적을 기준으로 대조군으로는 무처리군 및 상처 치료용으로 사용되는 마데카솔 처리시와 결과를 비교하였다.

그 결과, 도포 처리 2일째에 유근피 미세말은 마데카솔과 거의 동등한 수준으로 상처를 재생하는 효과가 있는 것으로 나타났으며, 유백피 미세말은 마데카솔보다 우수한 재생 효과를 갖는 것으로 나타났다(도 9A). 또한 8일째에 유근피 및 유백피 파우더 처리군 모두 대조군보다 상처 크기가 작아진 것으로 나타나, 유근피 및 유백피 파우더가 상처 재생에 효과가 있으며, 입자크기별로는 미세말의 효과가 가장 우수함을 확인하였다(도 9B).

< 실험예 6> 유근피 파우더에 의한 피부 조직 재생 효과 평가

본 발명의 유근피 파우더에 의한 진피 재생 효과를 H&E 염색으로 확인하였다.

구체적으로, 실험예 4 및 5와 같이 마우스의 창상부위에 유근피 파우더를 중말, 세말 및 미세말을 도포하였으며, 무처리군, NED 처리군 및 메탄올 추출물 처리군을 대조군으로 하였다. NED 처리군은 에탄올, 프로필렌글라이콜 및 물의 혼합용매(50:20:30, v/v)에 0.1%가 되도록 녹인 액상 제제를 제조하여 사용하였으며, 메탄올 추출물 처리군은 실험예 1에 개시된 방법으로 제조한 것을 사용하였다. 7일 동안 처리한 동물 모델을 경추 탈골 방법으로 희생시키고, 상처부위의 조직을 채취하였다. 채취한 조직을 파라핀 필름에 고정하고, 5 ㎛ 두께로 잘라 절편을 수득하였다. 수득한 절편에 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색약을 첨가하여 상기 절편을 염색하고, 이를 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 유근피 파우더 미세말 처리군은 양성대조군과 유사하게 피부조직이 재생되는 것으로 확인되었다(도 10).

< 실험예 7> 콜라겐 생성 촉진 확인

피부의 진피층을 차지하는 콜라겐의 생성 촉진 여부를 확인하기 위해 실험예 5-1에서 수득된 마우스의 상처조직을 이용하여 메이슨 트라이크롬(Masson's trichrome) 염색을 수행하였다.

상기 실험예 6과 동일한 방법으로 수행되었으며, H&E 대신 메이슨 트라이크롬 염색에 사용되는 염색약으로 염색하였다.

그 결과, 유근피 파우더 미세말 처리군에서 양성 대조군과 유사하게 진피의 콜라겐 합성이 증가된 것이 확인되었다(도 11).

Claims

느릅나무(elm tree)의 뿌리(유근피) 또는 줄기(유백피)의 파우더(Powder)를 유효성분으로 포함하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 느릅나무(elm tree)는 느릅나무(Ulmus davidiana var. japonica (Rehder) Nakai), 당느릅나무(Ulmus davidiana Planch.), 참느릅나무(Ulmus parvifolia Jacq.) 또는 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa Hance)인 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 느릅나무 줄기나 뿌리를 분쇄하여 얻는 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 10-850㎛ 인 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 창상을 치료하는 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 창상은 자창, 절창, 열창, 좌창, 할창 및 찰창으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 창상 부위의 각질세포의 형성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 피부 진피 조직을 증식시키는 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 진피의 콜라겐 합성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 삼출물을 흡수하는 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 피부 외용제인 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 파우더는 화장료인 것을 특징으로 하는 피부재생용 조성물.