CN113528497B

CN113528497B - Fba8基因或fba8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用

Info

Publication number: CN113528497B
Application number: CN202110831435.0A
Authority: CN
Inventors: 国鹏; 张建国
Original assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113528497A

Abstract

本发明涉及FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用，属于多功能酶技术领域。FBA8基因或FBA8蛋白能够用于制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂，且本发明能够显著提升FBA8的醛缩酶活性；能够最大化FBA8的激酶活性，也可以关闭其所有活性；可以最大化FBA8的蛋白酶活性。

Description

FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用

技术领域

本发明涉及多功能酶技术领域，具体涉及FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有醛缩酶活性、磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用。

背景技术

FBA8(AT3G52930)是拟南芥中的一种果糖-1,6-二磷酸醛缩酶，是糖酵解过程中的关键酶。FBA8可以将果糖-1,6-二磷酸分解成磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸，甘油醛-3-磷酸可以被继续氧化成1,3-二磷酸甘油酸，并生成NADH。1,3-二磷酸甘油酸又可以通过底物水平磷酸化将高能磷酸键转移给ADP，从而生成甘油酸-3-磷酸和ATP。

1924年，德国生理学家Warburg发现癌细胞相比其它的邻近组织，会通过糖酵解途径消耗大量的葡萄糖，该效应也被称为Warburg效应(On the origin ofcancer cells，Warburg O，1956，Science，123(3191):309-314)。实际上，正在增殖的动物细胞中普遍存在增强的糖酵解现象。干细胞在产生新的子代细胞时，需要复制所有的细胞内容物，包括DNA，RNA，氨基酸和脂质等。因此，对于正在增殖的细胞，能量(ATP)、还原力(NADH/NADPH)和基本生物合成原件(甘油醛-3-磷酸、甘油酸-3-磷酸等)是必不可少的。而糖酵解恰恰是产生ATP、NADH/NADPH、甘油醛-3-磷酸等物质的重要生物学过程。因此，糖酵解过程对于干细胞的生长发育至关重要。

迄今关于FBA8功能的报道，仅限于其果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的属性，并无其它酶属性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用。FBA8蛋白具有醛缩酶活性、磷酸转移活性和/或蛋白水解活性，FBA8基因或FBA8蛋白能够用于制备具有醛缩酶活性、磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂。

本发明提供了FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用，所述FBA8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有醛缩酶活性和磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用，所述FBA8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种激活FBA8蛋白水解活性的方法，包括以下步骤：

使用含ATP的清洗液清洗结合在Ni-NTA亲和层析柱上的FBA8蛋白，得到水解活性激活的FBA8蛋白；

或，

将FBA8蛋白与BIN2蛋白混合，得到水解活性激活的FBA8蛋白；

所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述含ATP的清洗液包括50mM的NaH₂PO₄、300mM的NaCl、10mM的imidazol和1～5mM的ATP。

优选的是，所述混合后FBA8的终浓度为0.05～0.2mg/mL，BIN2蛋白的终浓度为0.1～0.2mg/mL。

本发明还提供了一种提高FBA8蛋白的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的方法，包括以下步骤：将FBA8蛋白与提高FBA8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂混合，孵育；所述提高FBA8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂包括EDTA；

所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述提高FBA8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂还包括ATP和/或BIN2蛋白。

优选的是，所述混合后，EDTA的终浓度为20～50mM。

优选的是，所述ATP在与FBA8蛋白混合后的终浓度为30～60μM；所述BIN2蛋白在与FBA8蛋白混合后的终浓度为0.05～0.2mg/mL。

本发明还提供了ATP在调节FBA8蛋白的磷酸转移活性中的应用。

本发明提供了FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有醛缩酶活性、磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用。根据本发明实验结果可知，FBA8不仅是一种果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(裂合酶)，而且还是一种激酶(转移酶)和蛋白酶(水解酶)，FBA8基因或FBA8蛋白能够用于制备具有醛缩酶活性、磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂。本发明对FBA8全面功能进行了更加详尽解读，且可以通过相应技术方案实现其不同功能的最优化；具体的，本发明能够显著提升FBA8的醛缩酶活性；能够最大化FBA8的激酶活性，也可以关闭其所有活性；可以最大化FBA8的蛋白酶活性。

附图说明

图1为本发明提供的重组FBA8的纯化结果图；

图2为本发明提供的FBA8醛缩酶活性检测结果图；

图3为本发明提供的FBA8蛋白磷酸化位点检测结果图；

图4为本发明提供的FBA8磷酸化模拟实验结果图；

图5为本发明提供的FBA8蛋白酶活性检测结果。

具体实施方式

本发明在实施例中构建了FBA8蛋白表达载体，所述FBA8蛋白表达载体包括FBA8基因和骨架载体，所述骨架载体优选包括pET41b，所述FBA8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还构建了含上述技术方案所述FBA8蛋白表达载体的宿主菌，所述宿主菌包括E.coliBL21。通过蛋白表达和纯化，本发明获得了FBA8蛋白，并验证了FBA8蛋白的功能。

本发明提供了FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性的试剂中的应用，所述FBA8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。对于FBA8的激酶(磷酸转移)功能，加入ATP(FBA8终浓度0.18mg/ml；ATP终浓度55.6μM)能够实现其激酶活性，因为FBA8需要ATP来帮助自己完成醛缩酶，激酶及蛋白酶活性，所以只要适度ATP(55.6μM)不使FBA8沉淀，可以最大化FBA8的激酶活性；加入大量ATP(FBA8终浓度0.24mg/ml；ATP终浓度1mM)除了能够实现其激酶活性还有很大的副作用，即促使其沉淀，使蛋白变性，失去活性。纯化后FBA8蛋白几乎全是四聚体，其活性状态与结合在Ni-NTA树脂上的FBA8完全不同，对于FBA8蛋白四聚体，ATP浓度一旦上升，S230残基立刻被磷酸化，进而马上沉淀形成包涵体，所有活性消失。

本发明还提供了FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有蛋白水解活性的试剂中的应用，所述FBA8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

或，

将FBA8蛋白与BIN2蛋白混合，得到水解活性激活的FBA8蛋白；

所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明使用含ATP的清洗液清洗结合在Ni-NTA亲和层析柱上的FBA8蛋白，得到水解活性激活的FBA8蛋白。在本发明中，所述含ATP的清洗液优选包括50mM的NaH₂PO₄、300mM的NaCl、10mM的imidazol和1～5mM的ATP，更优选5mM的ATP。NaH₂PO₄、NaCl和imidazol是Ni-NTA亲和层析纯化的必要组分，能够使FBA8蛋白孤立结合在Ni-NTA树脂上，很难形成四聚体，从而对其活性变化起到很好的控制作用。FBA8孤立结合在Ni-NTA树脂上，不能相互接触，所以一个FBA8分子没有机会去磷酸化另一个FBA8分子，所以无论ATP清洗液中ATP浓度为多少，FBA8不会沉淀。使用ATP清洗后，纯化后的FBA8蛋白不断大幅度自身降解。具体的，对于FBA8的蛋白酶(水解)功能，在FBA8蛋白纯化过程中加入ATP清洗步骤(50mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，10mM imidazol，5mMATP)，即可激活其蛋白酶活性。

本发明将FBA8蛋白与BIN2蛋白混合，得到水解活性激活的FBA8蛋白。将FBA8蛋白与BIN2蛋白混合后，FBA8的水解活性被激活，FBA8自身发生降解，且能够将FBA8溶液中的所有杂质蛋白都降解。在本发明中，所述混合后FBA8的终浓度优选为0.05～0.2mg/mL，更优选为0.09mg/mL，BIN2蛋白的终浓度优选为0.1～0.2mg/mL，更优选为0.11mg/ml。具体的，正常纯化后的FBA8(终浓度0.09mg/ml)，加入BIN2蛋白(终浓度0.11mg/ml)24小时后，可以激活其蛋白酶活性。

本发明还提供了一种提高FBA8蛋白的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的方法，包括以下步骤：将FBA8蛋白与提高FBA8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂混合，孵育；所述提高FBA8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂包括EDTA；所述FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，所述提高FBA8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂优选还包括ATP和/或BIN2蛋白。在本发明中，所述混合后，FBA8的终浓度优选为0.18mg/ml。在本发明中，所述混合后，EDTA的终浓度优选为20～50mM，更优选为27.8mM。在本发明中，所述ATP在与FBA8蛋白混合后的终浓度优选为30～60μM，更优选为55.6μM。在本发明中，所述BIN2蛋白在与FBA8蛋白混合后的终浓度优选为0.05～0.2mg/mL，更优选为0.06mg/mL。根据实施例可知，EDTA可以使FBA8的活性增长接近1倍；在有EDTA的前提下，BIN2可以进一步显著增长FBA8的活性；在有EDTA和BIN2的前提下，ATP可以进一步显著增长FBA8的活性。即，对于FBA8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶功能，加入EDTA(FBA8的终浓度是0.18mg/ml；EDTA的终浓度是27.8mM)能其实现活性接近增加1倍，同时再加入ATP和BIN2蛋白(ATP的终浓度是55.6μM，BIN2的终浓度是0.06mg/ml)能进一步显著增加FBA8的醛缩酶功能。

本发明还提供了ATP在调节FBA8蛋白的磷酸转移活性中的应用。具体实施例结果表明，加入ATP能够实现FBA8蛋白的激酶活性；加入大量ATP除了能够实现其激酶活性还有很大的副作用，即促使其沉淀，具体的，含有S230D突变的FBA8蛋白在大肠杆菌中诱导后，几乎全部沉淀变成包涵体，无法纯化。在本发明中，为了实现FBA8蛋白的激酶活性，并不使其沉淀，ATP的终浓度优选控制在60μM以下，更优选为55.6μM；当实验的目的是促使FBA8蛋白沉淀时，优选将ATP的终浓度设置为1mM以上，更优选为1mM。

下面结合具体实施例对本发明所述的FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

多功能酶FBA8的克隆表达及纯化

1、拟南芥材料的获取

拟南芥培养在温度23℃，湿度50％，光周期16小时光/8小时暗的培养室。

2、拟南芥花序轴茎RNA的提取及反转录成cDNA

当植物高度接近20厘米，截取没有花的花序轴茎。将材料用液氮研碎后，用RNA提取试剂盒(艾德莱公司植物RNA快速提取试剂盒RN38-EASYspinPlus)提取总RNA。利用反转录试剂盒(艾德莱公司第一链反转录试剂盒PC18-TRUEscript 1st Strand cDNASynthesis Kit)将提取的总RNA反转录成cDNA。

3、目的基因克隆

(1)引物设计

FBA8(AT3G52930)基因序列编码358个氨基酸，其CDS和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：

CDS序列(SEQ ID NO.1)：ATGTCTGCCTTCACAAGCAAATTCGCCGATGAGTTGATCGCCAACGCTGCCTACATCGGCACACCTGGAAAAGGTATTTTGGCTGCTGATGAGTCCACTGGTACCATTGGAAAGCGTCTTGCGAGCATCAACGTCGAGAACGTTGAGACCAACAGACGTAACCTCCGTGAGCTTCTCTTCACCGCCCCTGGTGCTCTTCCATGCCTCAGTGGTGTCATCCTTTTCGAAGAGACTCTGTACCAAAAGAGTTCCGATGGTAAGCTTTTCGTTGATATCTTGAAGGAAGGAGGAGTTCTTCCCGGTATCAAGGTTGACAAGGGTACCGTTGAGCTAGCTGGAACCGACGGTGAGACCACCACTCAAGGTCTTGACGGTCTCGGTGACAGATGCAAGAAGTACTACGAAGCTGGTGCTCGTTTCGCCAAGTGGCGTGCAGTCCTCAAGATCGGAGAGAACGAGCCATCTGAGCATTCCATTCATGAGAACGCTTACGGATTAGCTAGATACGCTGTTATCTGCCAAGAGAACGGTCTTGTACCAATTGTCGAGCCTGAGATCCTAGTCGATGGATCCCATGACATCCAGAAGTGTGCTGCCGTGACTGAGCGTGTCCTTGCAGCTTGCTACAAGGCTCTTAGCGACCACCACGTCTTGCTCGAGGGTACACTCTTGAAGCCTAACATGGTTACTCCCGGATCTGACAGCCCCAAGGTTTCACCTGAAGTCATCGCTGAGCACACCGTCCGTGCCCTTCAGAGAACCGTCCCAGCAGCTGTTCCAGCCATTGTCTTCTTATCTGGAGGACAGAGCGAGGAAGAAGCTACCAGGAACTTGAACGCCATGAACCAGTTGAAGACCAAGAAGCCATGGTCATTGTCTTTCTCATTCGGACGTGCGTTGCAGCAGTCTACCTTGAAGACATGGGCAGGTAAAGAGGAGAATGTCAAGGCAGCTCAAGAGGCGTTGTATGTGAGGTGCAAGGCTAACTCTGAAGCCACACTCGGAACCTACAAGGGTGACGCTAAGCTTGGTGATGGAGCAGCTGAGAGCCTTCACGTGAAGGATTACAAGTACTGA。

氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：MSAFTSKFADELIANAAYIGTPGKGILAADESTGTIGKRLASINVENVETNRRNLRELLFTAPGALPCLSGVILFEETLYQKSSDGKLFVDILKEGGVLPGIKVDKGTVELAGTDGETTTQGLDGLGDRCKKYYEAGARFAKWRAVLKIGENEPSEHSIHENAYGLARYAVICQENGLVPIVEPEILVDGSHDIQKCAAVTERVLAACYKALSDHHVLLEGTLLKPNMVTPGSDSPKVSPEVIAEHTVRALQRTVPAAVPAIVFLSGGQSEEEATRNLNAMNQLKTKKPWSLSFSFGRALQQSTLKTWAGKEENVKAAQEALYVRCKANSEATLGTYKGDAKLGDGAAESLHVKDYKY。

根据该基因的序列特点，设计两端带有限制性酶切位点的引物，用于连接到pET41b载体上，并用于产生C端His标签。

上游引物AGGAGATATACATATGTCTGCCTTCACAAGCAAATTC(SEQ ID NO.3)，划线部分为NdeI酶切位点；

下游引物GTGCGGCCGCAAGCTTGTACTTGTAATCCTTCACGTG(SEQ ID NO.4)，划线部分为HindIII酶切位点；

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成这一对引物用于克隆该多功能酶FBA8基因，克隆基因采用PCR扩增的方法。

(2)目的基因的PCR扩增和纯化

在50μl PrimeSTARMax(TAKARA公司，配置方法参见试剂说明书)反应体系中，以步骤2中获得的cDNA为模板，上述引物作为扩增引物，通过PCR的方法进行扩增，PCR反应条件：

预变性98℃2分钟；热循环98℃30秒，55℃15秒，72℃10秒，反应30个循环；72℃延伸10分钟。

(3)通过PCR扩增的该基因全长为1102bp，用1％琼脂糖凝胶电泳证实得到目的基因的DNA扩增产物后，使用PCR产物纯化回收试剂盒(艾德莱公司DR02-PCR)回收，纯化扩增产物。

4、重组质粒的构建

将载体pET41b(购于Thermo Fisher公司)，用NdeI和HindIII(购于NEB公司)进行双酶切，然后将得到的骨架片段和步骤3纯化的DNA片段用无缝克隆试剂盒(碧云天公司D7010S)进行同源重组。

将连接产物转入大肠杆菌E.Coli DH5α(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，在含有30μg/mL的卡那霉素的固体LB培养基上涂布，37℃过夜倒置培养，挑选单菌落在含有30μg/mL的卡那霉素的液体LB培养基中37℃，220rpm过夜震荡培养。用质粒提取试剂盒(艾德莱公司PL02)提取菌液中的重组质粒。质粒PCR验证该重组质粒中含有目的片段。构建好的重组质粒pET41b-FBA8-His委托北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。测出序列与FBA8的CDS进行比对，完全匹配。说明重组质粒pET41b-FBA8-His构建成功。

5、重组质粒在宿主菌的表达

将重组质粒pET41b-FBA8-His转入宿主菌E.coli BL21(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，挑选单菌落在含有30μg/mL的卡那霉素的液体LB培养基中37℃，220rpm过夜震荡培养，次日以1：50的接种量接入新鲜含有30μg/mL的卡那霉素的液体LB培养基，培养至OD₆₀₀为0.4至0.6之间，加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM。在37℃，220rpm培养6小时，离心收集菌体(8000rpm，10分钟)。

6、重组FBA8的纯化

用Ni-NTA裂解液(50mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，10mM imidazol)重悬菌体。超声破碎(40apt；超声5秒停25秒；超声3分钟)后，离心(12000rpm，30分钟)取上清。首先，用8个柱体积的Ni-NTA裂解液平衡Ni-NTA亲和层析柱(碧云天公司P2233)；再将收集的上清过层析柱。用4个柱体积的Ni-NTA裂解液清洗层析柱；再用4个柱体积的Ni-NTA清洗液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，25mM imidazol)清洗层析柱。用1个柱体积的Ni-NTA洗脱液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazol)洗脱层析柱。将洗脱产物进行10％的SDS-PAGE检测，显示可以通过上述方法得到高纯度目的蛋白，如图1所示(-IPTG诱导前；+IPTG诱导后；S上清；FT流穿液；W1第一次清洗后液体；W2第二次清洗后液体；E洗脱产物)。

7、其他该多功能酶FBA8的表达方法

除了用上述的方法得到有醛缩酶活性的FBA8之外，可以采取其它的生物手段进行表达和纯化，比如酵母或者昆虫细胞等等。

实施例2

异源表达的FBA8具有果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性及影响因素。

将从实施例1获得的FBA8蛋白溶液用醛缩酶检测试剂盒(索莱宝公司BC2000)进行醛缩酶活性检测，FBA8的终浓度是0.18mg/mL，孵育时间1小时。图2显示通过上述异源表达系统可以得到有醛缩酶活性的FBA8。

应用醛缩酶检测试剂盒来检测ATP、EDTA、CaCl₂、BIN2蛋白(FBA8的一种互作蛋白，AT4G18710)对FBA8醛缩酶活性的影响。FBA8的终浓度是0.18mg/mL，ATP的终浓度是55.6μM，EDTA的终浓度是27.8mM，CaCl₂的终浓度是0.56mM，BIN2的终浓度是0.06mg/mL。如图2所示，EDTA可以使FBA8的活性增长接近1倍；ATP、CaCl₂和BIN2单独对FBA8醛缩酶活性无影响。但是在有EDTA的前提下，BIN2可以进一步显著增长FBA8的活性；在有EDTA和BIN2的前提下，ATP可以进一步显著增长FBA8的活性(two-sided Student’s t-test，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005)。

实施例3

异源表达的FBA8具有激酶活性及影响因素。

将从实施例1获得的FBA8蛋白溶液(终浓度0.24mg/mL)加入激酶反应体系(25mMTris-HCl，pH 7.5，0.5mM DTT，10mM MgCl₂，1mMATP)，在37℃孵育1小时，然后委托北京青莲百奥生物科技有限公司进行LC-MS/MS质谱检测，检测到FBA8蛋白自身有许多磷酸化位点。如图3所示(pep含该位点的多肽没被磷酸化；pep-Pi含该位点的多肽在该位点被磷酸化；2pep表示质谱检测到2个含该位点但没被磷酸化的多肽，其它数字+pep以此类推；1pep-Pi表示质谱检测到1个含该位点被磷酸化的多肽，其它数字+pep-Pi以此类推；2pep+1pep-Pi表示质谱同时检测到2个含该位点但没被磷酸化的多肽以及1个含该位点被磷酸化的多肽，其它组合以此类推)。由于大肠杆菌几乎没有磷酸化修饰，所以异源表达的FBA8具有自体磷酸化的能力(即自激活的能力)，是一个激酶。在激酶反应体系的孵育过程中，反应体系中的FBA8不断沉淀。图4为FBA8磷酸化模拟实验结果图(+I诱导后；S上清；P沉淀)。如图4所示(FBA8^A＝FBA8^S32D，FBA8^B＝FBA8^T35D，FBA8^C＝FBA8^S230D，FBA8^D＝FBA8^S266D，FBA8^E＝FBA8^S303D，FBA8^F＝FBA8^T5D，FBA8^5N＝FBA8^{S32A,T35A,S230A,S266A,S303A}；FBA8^ABC＝FBA8^{S32D,T35D,S230D}，其它磷酸化模拟突变组合以此类推)，磷酸化模拟实验发现，所有含有S230D突变的FBA8蛋白在大肠杆菌中诱导后，几乎全部沉淀变成包涵体，无法纯化。虽然FBA8激酶活性的行使需要ATP，但是高浓度ATP对FBA8的影响极其巨大。如图2试验中，适当浓度ATP(55.6μM)可以不致FBA8的沉淀而保持其可溶性状态。

实施例4

异源表达的FBA8具有蛋白酶活性及影响因素。

如果在实施例1纯化FBA8蛋白过程中，在用Ni-NTA清洗液清洗层析柱之后，增加ATP清洗过程(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazol，5mMATP)，将得到的FBA8在37℃孵育，分别在0小时、2小时、16小时和24小时取样。可以看到在孵育过程中，FBA8不断大幅度自身降解。

用同样的试验体系检测ATP、EDTA、CaCl₂、BIN2对FBA8蛋白酶活性的影响。FBA8的终浓度是0.09mg/mL，ATP的终浓度是50μM，EDTA的终浓度是25mM，CaCl₂的终浓度是0.5mM，BIN2的终浓度是0.11mg/mL。如图5所示，按步骤实施例1的纯化步骤得到的FBA8自身并不会降解，ATP、EDTA和CaCl₂也无法激活FBA8蛋白酶活性。然而，在FBA8+BIN2组合中，经过24小时孵育，反应体系中绝大多数FBA8降解，而且可以将之前FBA8溶液中的所有杂质蛋白都降解。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林业研究所

<120> FBA8基因或FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctgcct tcacaagcaa attcgccgat gagttgatcg ccaacgctgc ctacatcggc 60

acacctggaa aaggtatttt ggctgctgat gagtccactg gtaccattgg aaagcgtctt 120

gcgagcatca acgtcgagaa cgttgagacc aacagacgta acctccgtga gcttctcttc 180

accgcccctg gtgctcttcc atgcctcagt ggtgtcatcc ttttcgaaga gactctgtac 240

caaaagagtt ccgatggtaa gcttttcgtt gatatcttga aggaaggagg agttcttccc 300

ggtatcaagg ttgacaaggg taccgttgag ctagctggaa ccgacggtga gaccaccact 360

caaggtcttg acggtctcgg tgacagatgc aagaagtact acgaagctgg tgctcgtttc 420

gccaagtggc gtgcagtcct caagatcgga gagaacgagc catctgagca ttccattcat 480

gagaacgctt acggattagc tagatacgct gttatctgcc aagagaacgg tcttgtacca 540

attgtcgagc ctgagatcct agtcgatgga tcccatgaca tccagaagtg tgctgccgtg 600

actgagcgtg tccttgcagc ttgctacaag gctcttagcg accaccacgt cttgctcgag 660

ggtacactct tgaagcctaa catggttact cccggatctg acagccccaa ggtttcacct 720

gaagtcatcg ctgagcacac cgtccgtgcc cttcagagaa ccgtcccagc agctgttcca 780

gccattgtct tcttatctgg aggacagagc gaggaagaag ctaccaggaa cttgaacgcc 840

atgaaccagt tgaagaccaa gaagccatgg tcattgtctt tctcattcgg acgtgcgttg 900

cagcagtcta ccttgaagac atgggcaggt aaagaggaga atgtcaaggc agctcaagag 960

gcgttgtatg tgaggtgcaa ggctaactct gaagccacac tcggaaccta caagggtgac 1020

gctaagcttg gtgatggagc agctgagagc cttcacgtga aggattacaa gtactga 1077

<210> 2

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ala Phe Thr Ser Lys Phe Ala Asp Glu Leu Ile Ala Asn Ala

1 5 10 15

Ala Tyr Ile Gly Thr Pro Gly Lys Gly Ile Leu Ala Ala Asp Glu Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Ile Gly Lys Arg Leu Ala Ser Ile Asn Val Glu Asn Val

35 40 45

Glu Thr Asn Arg Arg Asn Leu Arg Glu Leu Leu Phe Thr Ala Pro Gly

50 55 60

Ala Leu Pro Cys Leu Ser Gly Val Ile Leu Phe Glu Glu Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Gln Lys Ser Ser Asp Gly Lys Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Glu Gly

85 90 95

Gly Val Leu Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Thr Val Glu Leu Ala

100 105 110

Gly Thr Asp Gly Glu Thr Thr Thr Gln Gly Leu Asp Gly Leu Gly Asp

115 120 125

Arg Cys Lys Lys Tyr Tyr Glu Ala Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp Arg

130 135 140

Ala Val Leu Lys Ile Gly Glu Asn Glu Pro Ser Glu His Ser Ile His

145 150 155 160

Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Val Ile Cys Gln Glu Asn

165 170 175

Gly Leu Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu Val Asp Gly Ser His

180 185 190

Asp Ile Gln Lys Cys Ala Ala Val Thr Glu Arg Val Leu Ala Ala Cys

195 200 205

Tyr Lys Ala Leu Ser Asp His His Val Leu Leu Glu Gly Thr Leu Leu

210 215 220

Lys Pro Asn Met Val Thr Pro Gly Ser Asp Ser Pro Lys Val Ser Pro

225 230 235 240

Glu Val Ile Ala Glu His Thr Val Arg Ala Leu Gln Arg Thr Val Pro

245 250 255

Ala Ala Val Pro Ala Ile Val Phe Leu Ser Gly Gly Gln Ser Glu Glu

260 265 270

Glu Ala Thr Arg Asn Leu Asn Ala Met Asn Gln Leu Lys Thr Lys Lys

275 280 285

Pro Trp Ser Leu Ser Phe Ser Phe Gly Arg Ala Leu Gln Gln Ser Thr

290 295 300

Leu Lys Thr Trp Ala Gly Lys Glu Glu Asn Val Lys Ala Ala Gln Glu

305 310 315 320

Ala Leu Tyr Val Arg Cys Lys Ala Asn Ser Glu Ala Thr Leu Gly Thr

325 330 335

Tyr Lys Gly Asp Ala Lys Leu Gly Asp Gly Ala Ala Glu Ser Leu His

340 345 350

Val Lys Asp Tyr Lys Tyr

355

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagatata catatgtctg ccttcacaag caaattc 37

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgcggccgc aagcttgtac ttgtaatcct tcacgtg 37

Claims

1.大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白在制备具有磷酸转移活性或蛋白水解活性的试剂中的应用，编码所述大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白中的FBA8蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述磷酸转移活性的行使需要ATP，ATP的终浓度控制在60μM以下；

所述蛋白水解活性的行使需要使用含ATP的清洗液清洗结合在Ni-NTA亲和层析柱上的大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白；或所述蛋白水解活性的行使需要将大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白与BIN2蛋白混合；

所述含ATP的清洗液包括50mM的NaH₂PO₄、300mM的NaCl、10mM的imidazol和5mM的ATP。

2.一种激活大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白水解活性的方法，包括以下步骤：

使用含ATP的清洗液清洗结合在Ni-NTA亲和层析柱上的大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白，得到水解活性激活的大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白；

所述含ATP的清洗液包括50mM的NaH₂PO₄、300mM的NaCl、10mM的imidazol和5mM的ATP；

或，

将大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白与BIN2蛋白混合，得到水解活性激活的大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白；

所述大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白中的FBA8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合后大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的终浓度为0.05～0.2mg/mL，BIN2蛋白的终浓度为0.1～0.2mg/mL。

4.一种提高大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的方法，包括以下步骤：将大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白与提高大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂混合，孵育；所述提高大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂包括EDTA；所述混合后，所述大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的终浓度为0.18mg/mL；所述混合后，EDTA的终浓度为20～50mM；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提高大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶活性的试剂还包括ATP和/或BIN2蛋白；所述ATP在与大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白混合后的终浓度为30～60μM；所述BIN2蛋白在与大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白混合后的终浓度为0.05～0.2mg/mL。

6.ATP在调节大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的磷酸转移活性中的应用；为了实现大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白的激酶活性，并不使其沉淀，ATP的终浓度控制在60μM以下；为了促使大肠杆菌异源表达的C端添加有His标签的FBA8蛋白沉淀，将ATP的终浓度设置在1mM以上。